CN102633715B - 一种丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂及其制备方法和应用，该抑制剂为氨基烟酰胺类、氨基异烟酰胺类化合物。制备方法主要包括：6-羟基烟酸经硝化生成5-硝基-6-羟基烟酸，5-硝基-6-羟基烟酸经三溴氧磷处理转化为5-硝基-6-溴烟酸再经Suzuki偶联反应生成5-硝基-6-芳基烟酸，5-硝基-6-芳基烟酸与草酰氯反应生成5-硝基-6-芳基烟酰氯，5-硝基-6-芳基烟酰氯与胺反应得到5-硝基-6-芳基烟酰胺，再经氢化还原硝基获得5-氨基-6-芳基烟酰胺。本发明的丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂，是一种小分子抑制剂，能有效阻止体内TNF-α的合成，具有大分子TNF抑制剂对疾病所具有的疗效，生产成本低，能够实现口服，从而让病人使用方便具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂及其制备方法。
背景技术
TNF-α（肿瘤坏死因子α）是引起炎症反应的主要细胞因子，它在类风湿性关节炎，效喘等疾病的发病机制中起着至关重要的作用。过去十数年来，对TNF的研究取得了突破性的进展。应用生物制剂如可容性的TNF受体或者TNF单克隆抗体来抑制TNF的作用引发了对炎症领域疾病如类风湿性关节炎的划时代的治疗方法。该类药物如Enbrel，Remicade，Humira年销售量都在30亿美元以上。
肿瘤坏死因子α在体内的形成受到一系列的激酶的调控。丝裂原蛋白激酶（mitogen activated protein kinase）p38在细胞合成TNF-α和其它助炎细胞因子的信息传递过程中起着十分重要的作用。抑制p38可以阻止细胞产生TNF-α和其它助炎细胞因子，从而对类风湿性关节炎起到治疗作用。p38的调控机制是：当细胞受到刺激，p38被激活从而对下游的激酶磷酸化，引起下游的连锁反应从而带动合成一系列的细胞因子包括TNF。
实验证实对p38的抑制能够阻滞TNF的体内合成，目前有一些p38的小分子抑制剂分别在不同阶段的临床测试中。这些试验已经证明p38抑制剂能够有效地治疗一些炎症疾病如类风湿性关节炎等。
类风湿性关节炎是一种普发性自身免疫疾病，它影响全世界1%的人口，而且发病率在以每年0.04%的速度递增。已经证明细胞因子(cytokines)如TNF-α的过量形成是导致类风湿性关节炎的主要原因，TNF-α刺激其它助炎细胞因子(proinflammatory cytokines)的合成和引诱基质金属蛋白酶（MMP）的释放并攻击骨关节。大分子药如Enbrel、Humira、Remicade能够抑制TNF-α，从而取得了对类风湿性关节炎的治疗作用。尽管这些生物制剂取得了巨大的成功，然而它们作为大分子药，具有与生俱来的巨大缺陷，即是生产成本昂贵，使用不很方便（无法口服）。因此我们将开发小分子的TNF抑制剂作为抗炎症新药，这类药有望保持大分子TNF抑制剂对疾病所具有的疗效，它将对生产成本大幅度降低从而极大地降低病人和社会的负担，同时我们开发的小分子药将具有口服疗效，从而让病人使用方便。这种低成本和便利性将使我们的新药迅速占领市场。
丝裂原蛋白激酶（mitogen activated protein kinase）p38在细胞合成TNF-α和其它助炎细胞因子的信息传递过程中起着十分重要的作用，抑制p38可以阻止细胞产生TNF-α和其它助炎细胞因子。实验证实对p38的抑制能够阻滞TNF-α的体内合成。我们的目标是发明一种新型的p38抑制剂以阻止体内TNF-α的合成，从而发现一种能像大分子药物如Enbrel、Humira、Remicade等对类风湿性关节炎有治疗作用的小分子新药。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂，以实现对阻止体内TNF-α的合成进行阻止。本发明的另一目的是提供上述丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂的制备方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂，为氨基烟酰胺类、氨基异烟酰胺类化合物，结构通式包括通式I（氨基烟酰胺类）和通式II（氨基异烟酰胺类）；
通式I、II的结构为：
式中，R1，R2代表H、卤素、CnH2n+1、CF3、羧基、羟基、CnH2nNH，OCnH2n+1；R3代表CnH2n+1NH、氨基、羟基、NHR(R代表芳基)、芳基，n=1~10的整数。
氨基烟酰胺类的制备方法为：6-羟基烟酸经硝化生成5-硝基-6-羟基烟酸，5-硝基-6-羟基烟酸经三溴氧磷处理转化为5-硝基-6-溴烟酸再经Suzuki偶联反应生成5-硝基-6-芳基烟酸，5-硝基-6-芳基烟酸与草酰氯反应生成5-硝基-6-芳基烟酰氯，5-硝基-6-芳基烟酰氯与相应的胺反应得到5-硝基-6-芳基烟酰胺，再经氢化还原硝基获得5-氨基-6-芳基烟酰胺。
氨基异烟酰胺类的制备方法：2-羟基异烟酸经硝化生成5-硝基-2-羟基异烟酸，5-硝基-2-羟基异烟酸经三溴氧磷处理转化为5-硝基-2-溴异烟酸再经Suzuki偶联反应生成5-硝基-2-芳基异烟酸，5-硝基-2-芳基异烟酸与草酰氯反应生成5-硝基-2-芳基异烟酰氯，5-硝基-2-芳基异烟酰氯与相应的胺反应得到5-硝基-2-芳基异烟酰胺，再经氢化还原硝基获得5-氨基-2-芳基异烟酰胺。
丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂在制备用于阻止体内TNF-α的合成的药物中的应用。
丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂在制备用于治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂在制备用于治疗抗炎药物中的应用。
有益效果：本发明的丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂，是一种小分子抑制剂，能有效阻止体内TNF-α的合成，具有大分子TNF抑制剂对疾病所具有的疗效，生产成本低，能够实现口服，从而让病人使用方便具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。
实施例1 5-氨基-6-苯基烟酰胺
在500mL圆底烧瓶中加入6-羟基烟酸（13.90g，100mmol），再加入冰醋酸（100mL）。在搅拌下，发烟硝酸（5mL）通过恒压滴液漏斗滴加到反应瓶中。反应加热到60℃并维持到原料消耗完毕，反应液冷却后倒入冰水中，过滤收集固体，粗产品通过柱层析提纯后得产物5-硝基-6-羟基烟酸（7.92g），MS：m/z=185（M+H）。
将5-硝基-6-羟基烟酸（7.90g）加入到含有三溴氧磷（50mL）的封管中，体系加热到120℃并维持过夜，反应液冷却后倒入冰水中，过滤收集固体，粗产品通过柱层析提纯后得产物5-硝基-6-溴烟酸（8.82 g），MS：m/z=248（M+H）。
在100mL圆底烧瓶中加入5-硝基-6-溴烟酸（2.48g）、苯硼酸（1.25g）、1，4-二氧六环（30mL）、碳酸钠水溶液（2M，15mL）。混合体系通过真空除氧、氮气保护后，加入四(三苯基膦)钯（80mg）。反应加热到90℃并维持到原料消耗完毕，反应液浓缩后冷却后倒入水中，过滤收集固体，粗产品通过柱层析提纯后得产物5-硝基-6-苯烟酸（2.05g），MS：m/z=245（M+H）。
在50mL圆底烧瓶中加入5-硝基-6-苯烟酸（2.05g），草酰氯（20mL），DMF（1滴），反应搅拌3h，反应液浓缩后冷却后倒入冰水中，过滤收集固体得产物5-硝基-6-苯烟酰氯（2.25g）。
在盛有氨水（5mL）的15mL圆底烧瓶中加入5-硝基-6-苯烟酰氯（0.26g），反应搅拌0.5h，反应液倒入冰水中，用1M氢氧化钠溶液调节pH至12，过滤收集固体得产物5-硝基-6-苯烟酰胺（0.15g）。MS：m/z=244（M+H）。
5-硝基-6-苯烟酰胺（0.15g）容于乙酸乙酯（20mL）中并加入10%Pd-C(25mg)，反应置于氢化装置中在60 psi压力下氢化5h，过滤去除催化剂，滤液浓缩后粗产品通过柱层析提纯后得产物5-氨基-6-苯烟酰胺（95mg），MS：m/z=214（M+H）。
实施例2 5-氨基-N-(4’-氯苯基)-6-苯基烟酰胺
在15mL圆底烧瓶中加入5-硝基-6-苯烟酰氯（0.13g），二氯甲烷（5mL）。往反应体系中加入4-氯苯胺（0.13g）和Hunig’s碱。反应搅拌0.5h，反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，萃取液经0.1M稀盐酸洗后、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥、过滤浓缩得产物5-硝基-N-(4’-氯苯基)-6-苯基烟酰胺（0.18g）。MS：m/z=355（M+H）。
5-硝基-N-(4’-氯苯基)-6-苯基烟酰胺（0.18g）容于乙酸乙酯（20mL）中并加入10%Pd-C(25mg)，反应置于氢化装置中在60 psi压力下氢化5h，过滤去除催化剂，滤液浓缩后粗产品通过柱层析提纯后得产物5-氨基-N-(4’-氯苯基)-6-苯基烟酰胺（135mg），MS：m/z=325（M+H）。
实施例3 5-氨基-N-苯基-6-苯基烟酰胺
在15mL圆底烧瓶中加入5-硝基-6-苯烟酰氯（0.13 g），二氯甲烷（5mL）。往反应体系中加入苯胺（0.10g）和Hunig’s碱。反应搅拌0.5h，反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，萃取液经0.1M稀盐酸洗后、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥、过滤浓缩得产物5-硝基-N-苯基-6-苯基烟酰胺（0.13g）。MS：m/z=320（M+H）。
5-硝基-N-苯基-6-苯基烟酰胺（0.13g）容于乙酸乙酯（20mL）中并加入10%Pd-C(25mg)，反应置于氢化装置中在60 psi压力下氢化5h，过滤去除催化剂，滤液浓缩后粗产品通过柱层析提纯后得产物5-氨基-N-苯基-6-苯基烟酰胺（105mg），MS：m/z=290（M+H）。
实施例4 3-氨基-2-苯基异烟酰胺
在500mL圆底烧瓶中加入2-羟基异烟酸（13.90g，100mmol），再加入冰醋酸（100mL）。在搅拌下，发烟硝酸（5mL）通过恒压滴液漏斗滴加到反应瓶中。反应加热到60℃并维持到原料消耗完毕，反应液冷却后倒入冰水中，过滤收集固体，粗产品通过柱层析提纯后得产物3-硝基-2-羟基异烟酸（2.02g），MS：m/z=185（M+H）。
3-硝基-2-羟基异烟酸（2.02g）加入到含有三溴氧磷（50mL）的封管中，体系加热到120℃并维持过夜，反应液冷却后倒入冰水中，过滤收集固体，粗产品通过柱层析提纯后得产物3-硝基-2-溴异烟酸（2.32g），MS：m/z=248（M+H）。
在100mL圆底烧瓶中加入3-硝基-2-溴异烟酸（1.32g），苯硼酸，1，4-二氧六环，碳酸钠水溶液。混合体系通过真空除氧、氮气保护后，加入四(三苯基膦)钯（40mg）。反应加热到90℃并维持到原料消耗完毕，反应液浓缩后冷却后倒入水中，过滤收集固体，粗产品通过柱层析提纯后得产物3-硝基-2-苯异烟酸（1.01g），MS：m/z=245（M+H）。
在50mL圆底烧瓶中加入3-硝基-2-苯异烟酸（1.01g）、草酰氯（20mL）、DMF（1滴），反应搅拌3h，反应液浓缩后冷却后倒入冰水中，过滤收集固体得产物3-硝基-2-苯异烟酰氯（1.05g）。
在盛有氨水（5mL）的15mL圆底烧瓶中加入3-硝基-2-苯异烟酰氯（0.16g），反应搅拌0.5h，反应液倒入冰水中，用1M氢氧化钠溶液调节pH至12，过滤收集固体得产物3-硝基-2-苯异烟酰胺（0.11g）。MS：m/z=244（M+H）。
3-硝基-2-苯异烟酰胺（0.11g）容于乙酸乙酯（20mL）中并加入10%Pd-C(25mg)，反应置于氢化装置中在60 psi压力下氢化5h，过滤去除催化剂，滤液浓缩后粗产品通过柱层析提纯后得产物3-氨基-2-苯异烟酰胺（76mg），MS：m/z=214（M+H）。
实施例5
如实施例1~4所得化合物通过下面的生物活性测试检测它们对p38激酶和TNF生成的抑制活性，实验结果显示，通式I、II所示的化合物对p38激酶的抑制活性在IC50=1 nM~20uM之间，对TNF生成的抑制活性在IC50=10 nM~40uM之间。
p38激酶抑制活性测试
测试在V-形底的96-孔板中进行，酶、底物（髓鞘碱性蛋白和三磷酸腺苷）、被测化合物分别溶于缓冲溶液中（50 mM Tris pH 7.5，10 mM MgCl2，50 mM NaCl 和1 mM DTT）。p38激酶在加入底物前先与被测化合物预孵10min，反应在25℃环境中进行45min，然后通过加入5mL 0.5M EDTA淬灭。反应混合物用Skatron Micro96 Cell Harvester （Skatron）吸入预湿的过滤装置，并用PBS缓冲液冲洗。滤饼通过微波干燥1min和MeltilLex A scintillation wax（Wallac）处理，然后用Microbeta scintillation counter Model1450（Wallac）计量。
对脂多糖（LPS）诱导TNF合成抑制测试
人体单核细胞THP-1细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中保存，在平底的96-孔板中加入这样的细胞样（40,000细胞每80mL），然后再加入被测化合物（10mL）。最后加入LPS（10mL/well）并让其达到1ug/mL的浓度。体系在37℃和5%CO2环境下孵化过夜。取出上清液并经过ELISA测量。
Claims (4)
1.一种丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂，其特征在于：为5-氨基-6-苯基烟酰胺、5-氨基-N-(4’-氯苯基)-6-苯基烟酰胺和5-氨基-N-苯基-6-苯基烟酰胺。
2.权利要求1所述的丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂在制备用于阻止体内TNF-α的合成的药物中的应用。
3.权利要求1所述的丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂在制备用于治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
4.权利要求1所述的丝裂原蛋白激酶p38的抑制剂在制备用于治疗抗炎药物中的应用。
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