CN102628872A - 25羟基维生素d检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种25羟基维生素D检测试剂盒及其制备方法,主要包括有:包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的微孔板,所述微孔板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为0.1~0.5μg;浓度为0.1μg/ml的生物素标记的25羟基维生素D,用量为每微孔25μl。本发明25羟基纤维素D检测试剂盒灵敏度约为5nmol/L,线性范围大于同类试剂盒,精密度和准确度均在试剂盒要求范围内,并且血清样本不需要稀释即可直接加样,操作方法比同类试剂盒简单,一般技术人员即可操作,操作时间比同类试剂盒减少一半。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒,特别是涉及25羟基维生素D检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
人体和动物每天必需从食物中摄取适量的维生素D,才能维持正常的发育和健康。成人的建议每日摄取量是5μg,妊娠期和哺乳期女性应当增加1倍左右的摄入量,每天手脚露30厘米,在阳光下晒30分钟,有效的防止维生素D的缺乏。但维生素D摄食过量会引起中毒,一些学者认为长期每日摄入25μg维生素D可引起中毒,这其中可能包括一些对维生素D敏感的人,但长期每天摄入125μg维生素D则肯定引起中毒。我国制定维生素D可耐受最高摄入量为20μg。
25(OH)VD是最主要的血清VD的存在形式,其血清浓度反应了机体中可利用的VD的状态,其结果的可靠性要优于检测血清1,25(OH)VD水平。血清25(OH)VD浓度随年龄而降低。老年人日照相对减少,老化皮肤产生VD数量下降,及不充分的饮食摄入,造成老年人普遍缺乏VD,增加了患骨质疏松症的风险。因此,检测25(OH)VD血清浓度可以辅助临床对VD缺乏状态的评估,也可用于检测患者非正常血清钙水平的原因。
目前25羟基维生素D检测试剂盒主要是以进口产品为主,稳定性较好的产品主要是酶联免疫法和放射性免疫法类产品。放射性免疫法检测25羟基维生素D试剂盒存在需操作经验丰富的检验员,存在放射性污染的问题,使用范围受到限制。目前通常使用的利用酶联免疫法检测25羟基维生素D的试剂盒的血清 样本需要稀释才可加样,操作时间比较长,操作方法步骤比较繁琐。
发明内容
基于此,有必要提供一种敏感度高、特异性强、操作简便、稳定性好,无污染、重复性好的25羟基维生素D检测试剂盒。
一种25羟基维生素D检测试剂盒,主要包括有:
(A)包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的微孔板,所述微孔板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为0.1~0.5μg;
(B)浓度为0.1μg/ml的生物素标记的25羟基维生素D,用量为每微孔25μl。
在其中一个实施例中,所述25羟基维生素D检测试剂盒还包括工作浓度为0.5~2.0μg/ml的辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白;
在其中一个实施例中,所述包被板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为0.2μg/ml。
在其中一个实施例中,所述辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白的工作浓度为1.0μg/ml。
本发明还提供了上述25羟基维生素D检测试剂盒的制备方法。
一种25羟基维生素D检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备包被高特异性鼠25(OH)D单克隆抗体的微孔板
按0.1~0.5μg的包被浓度将高特异性鼠25(OH)D单克隆抗体包被至微孔内,4℃过夜,洗涤,封闭,密封,得到包被高特异性鼠25(OH)D单克隆抗体的微孔板;
(2)按常规方法制备生物素标记的25羟基维生素D,所述生物素标记的25羟基维生素D的浓度为0.1μg/ml。
本发明的25羟基维生素D检测试剂盒是采用竞争法原理定量测定人血清或血浆中的25羟基维生素D和其他羟基化代谢产物。将标准品、质控品和样本加入至预包被高特异性鼠25(OH)D单克隆抗体的微孔板的微孔中,再加入生物素标记的25(OH)D抗原室温下孵育30分钟,之后冲洗。加入辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白,选择地与生物素结合,接着冲洗,再利用底物显色。终止反应后,在酶标仪下450nm处读取吸光度,25(OH)D浓度与颜色强度成反比。
上述25羟基纤维素D检测试剂盒与目前通常使用的同类检测试剂盒相比,可提高工作效率,并大幅节约成本。本发明采用单克隆抗体包被板条,灵敏度约为5nmol/L,线性范围大于同类试剂盒,精密度和准确度均在试剂盒要求范围内,并且血清样本不需要稀释即可直接加样,操作方法比同类试剂盒简单,一般技术人员即可操作,操作时间比同类试剂盒减少一半。且无污染,可以作为同类放射性免疫分析试剂盒的替代产品。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
本实施例所述的25羟基维生素D检测试剂盒的主要组成成份如下:
1、包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的微孔板
所述微孔板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为0.2μg;条形微孔板(12条×8孔),置于框架中。
2、25羟基维生素D标准品0.1.2.3.4.5
可直接使用,共6瓶,每瓶300ul,标准品溶液的线性浓度分别为:A:0;B:6.5;C:26;D:60;E:180;F:360ng/ml,分别对应标准品0.1.2.3.4.5。
3、25羟基维生素D质控品1.2
可直接使用,共2瓶,每瓶300ul,浓度分别为30ng/ml和100ng/ml。
4、生物素标记的25羟基维生素D
可直接使用,浓度为0.1μg/ml,1瓶,每瓶3ml。
5、酶结合物
可直接使用的辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白(溶于含去污剂、防腐剂和BSA缓冲溶液中),工作浓度为1.0μg/ml,1瓶,6.0mL。
6、底物溶液
可直接使用的四甲基联苯胺(TMB)底物(溶于酸性溶液中),1瓶,12.0mL。
7、终止液
可直接使用的盐酸溶液(HCl、100ml/L;工艺用水、900ml/L)。1瓶,12.0mL。
8、浓缩洗液(20×)
含有去污剂和防腐剂的浓缩清洗缓冲液。1瓶,50.0mL。
9、封口膜
孵育时密封微孔板的粘性薄膜。
所述试剂盒的制备如下:
(一)标准品与质控品
(1)标准品的配制
是由浓度为1mg/ml的25羟基VD母液及人工血清、proclin300配制而成。
配制1000人份标准品,具体配制过程如下(从高浓度配起):
F:取25羟基VD 1mg/ml的母液252μl+699.048ml人工血清+0.7mlproclin300;分装;
E:取配制好的标准品溶液F150ml+149.7ml人工血清+0.3ml proclin300; 分装;
D:取配制好的标准品溶液F50ml+249.7ml人工血清+0.3ml proclin300;分装;
C:取配制好的标准品溶液F21.65ml+278.05m人工血清+0.3mlproclin300;分装;
B:取配制好的标准品溶液F5.4ml+294.3ml人工血清+0.3ml proclin300;分装;
A:加入300ml人工血清,分装。
(2)质控品的配制
质控品1(100ng/ml):25羟基VD标准品F(360ng/ml)83.35ml+216.35ml人工血清+0.3ml proclin300,分装;
质控品2(30ng/ml):25羟基VD标准品F(360ng/ml)25ml+274.7ml人工血清+0.3ml proclin300,分装。
(二)包被高特异性鼠25(OH)D单克隆抗体的微孔板
外购高特异性鼠25(OH)D单克隆抗体。
按100μL/孔将包被液(包被液:抗体2.0mg+包被缓冲液1000ml;包被缓冲液为:Na2CO30.423g/L,NaHCO31.344g/L)加入酶标板的微孔内,4℃过夜(>17h);采用稀释后的25(OH)VD浓缩洗液(×20:Na2HPO4.12H2O116g/L、NaH2PO4.2H2O 11.84g/L、NaCl 180g/L、Tween-2010ml/L、proclin3001ml/L)进行洗涤,200μL/孔,洗两次;按200μl/孔往微孔中加入封闭液(Na2HPO4.12H2O 5.8g/L、NaH2PO4.2H2O 0.592g/L、NaCl 9.0g/L、蔗糖50g/L、乳糖50g/L、BSA 10g/L、proclin3001ml/L,过滤),室温放置(18~26℃),4℃过夜进行封闭;在干燥房(18-26℃)抽干后,真空密封(2-8℃),得到包被高特异性鼠25(OH)D单克隆抗体的 微孔板,干燥保存。
(三)酶结合物
配方如下:Na2HPO4.12H2O、2.9g/L;KH2PO4、0.4g/L;NaCL、8g/L;KCL、0.4g/L;BSA、10g/L;proclin300、1ml/L;辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白(外购原料)、1g/L;过滤。
(四)其他
生物素标记的25羟基维生素D、底物溶液、终止液、浓缩洗液(20×)、封口膜均由其他商业公司提供。
实施例2 运用实施例1的试剂盒对样本中的25羟基维生素D进行检测
被测样本的要求
采用血清或血浆(EDTA、枸橼酸钠或肝素)样本。样本采集后应尽快分离,样本在15-25℃放置不超过4小时;2-8℃放置时不超过12小时;-20℃或以下放置时可保存2个月,-80℃下可长期保存,应避免样品的反复冻融,最多只能冻融一次。溶血样本、微生物污染样本不能用于测定。
实施例1的试剂盒的操作步骤如下:
1)按照所需测定的样本数量及布局在板条上放好微孔板条。
2)加入生物素标记的25羟基维生素D25μl。
3)加入25羟基维生素D标准品、25羟基维生素D质控品和样本各25μl至待测孔中。
4)用封口膜将微孔板板孔封好,置于室温下30分钟。
5)用稀释好的浓缩洗液洗板五次。
a.自动洗板:设置洗板机分配每孔至少300μl冲洗液。重复洗5次。
b.手动洗板:迅速颠倒倒出孔内物。每孔加入250μl冲洗液。重复洗板5次。
在进入下一步之前,于吸水纸上用力拍打倒置的板以去除多余的洗液。
6)每孔加入酶结合物50μl,置于室温30分钟。
7)重复步骤5。
8)每孔加入TMB底物溶液100μl,封上封口膜,避光温育15分钟。
注:TMB底物溶液易受到污染。移取所需要的量,用后的液体请勿再倒回瓶内。
9)每孔加入终止液100μl。
10)加入终止液30分钟内在450nm波长(参考波长是650nm)处读取吸光度。
表1-3为运用实施例1的试剂盒随即抽取大人和小孩血清样本中的25羟基维生素D的检测结果。大人和小孩的正常值为50-150nmol/L。
表1
表2
表3
实施例3 实施例1的25羟基维生素D检测试剂盒的性能评估A灵敏度评估
分别取10份“0”标准品,检测并记录450nm处OD值,计算均值和SD值,用均值-2SD的OD值,从剂量-应答曲线上计算出对应的剂量,该剂量值为该方法的最低检测限。检测结果计算平均值为2.7164,标准偏差为0.1778,其 灵敏度为5.03nmol/L。
B线性范围
将标准品溶液稀释成浓度为400nmol/L,200nmol/L,100nmol/L,50nmol/L,26nmol/L,12.5nmol/L,6.25nmol/L,0nmol/L的标准品,每个标准品检测450nm处的OD值两次,检测结果如表4所示。
表4标准品的OD值
根据表4结果绘制标准曲线,并计算线性范围,测量范围定为5-400nmol/L是合理的。
C批内差
使用三套同一批号的试剂盒对25(OH)VD的高值质控品和低值质控品于450nm波长处进行重复检测各12次,分别测定质控品的吸光度平均值、标准差、CV值。
表5批内差检测结果
由表5可以看出,高值质控和低值质控总变异系数均小于10%,批内差符合要求。
D批间差
用连续三个批号的试剂盒分别对25(OH)VD检测高值质控和低值质控各12次,分别计算连续三个批号试剂盒的高值质控吸光度和低值质控吸光度的CV值。如果检测所得的CV值在10%的范围以内,则说明批间精密度可以达到要求。结果见表6。
表6批间差检测结果
由表6结果可知,高值质控和低值质控的批间变异系数均小于10%,可以达到试剂盒精密度的要求。
E稳定性
将微孔板真空密封后,置于37℃生化培养箱7天,然后取出,平衡至室温;取同一批号微孔板真空密封后,保存在4℃,然后取出,平衡至室温;使用两块微孔板做免疫分析实验,测OD值结果如表7。
表7稳定性实验结果
表7结果表明,37℃放置7天取出平衡至室温后的试剂盒,与4℃保存的试剂盒相比,样品测定值在误差允许的范围内符合的很好,结果比较稳定。
F特异性
分别将25-羟基维生素D3;25-羟基维生素D2;24,25-二羟基维生素D3;维生素D3和钙化醇D2五种25羟基维生素D相关物质稀释至100nmol/L。同时检测6个标准品和这些相关物质,平行检测2次,记录450nm波长处的OD值并计算交叉反应率,结果如表8所示。
表8特异性实验结果
表8结果表明,25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2是本发明试剂盒的检测目标,所以交叉反应大。而24,25-羟基维生素D3因在血清中含量极少,所以即使有交叉反应也不会影响本发明试剂盒的特异性。而维生素D3、钙化醇D2则无交叉。
G血样中其他物质的干扰
(1)抗凝剂的干扰
检测时分别在血清中加入柠檬酸钠的浓度为0mmol/L,50mmol/L,100mmol/L,200mmol/L,350mmol/L;加入EDTA的浓度为0mmol/L,3mmol/L,4mmol/L,5mmol/L,6mmol/L,7mmol/L;加入肝素的浓度分别为0U/ml,10U/ml,20U/ml,40U/ml,50U/ml,100U/ml。根据检测结果判断在所检测的范围内三种抗凝剂是否对检测有所干扰。检测结果如表9-11所示。
表9 柠檬酸钠的干扰
表10 EDTA的干扰
表11 肝素的干扰
临床上一般使用10.9mmol/L左右的柠檬酸钠作为抗凝剂使用,表9结果表明,柠檬酸钠在0-350mmol/L的范围内。对本发明试剂盒的检测方法无明显干扰;临床上一般使用3.4-4.8mmol/LEDTA作为抗凝剂使用,表10结果表明,血样中EDTA浓度在3-5mmol/L的范围内,对本发明试剂盒的检测方法无明显干扰;临床上采静脉血,肝素作为抗凝剂的使用量一般为25.330-30U/ml的全血,表11结果表明,血样中的肝素在10-100U/ml范围内,对本发明试剂盒的检测方法无明显干扰。因此,三种抗凝剂柠檬酸钠、肝素和EDTA的存在对本发明试剂盒的检测方法基本上没有干扰。
(2)溶血和脂血的影响
称血红蛋白溶于正常人血清中,以质控血清稀释此血红蛋白溶液,得到血红蛋白的浓度分别为0mg/L,0.25mg/ml,0.5mg/ml,1mg/ml,1.5mg/ml和2mg/ml,以质控血清为空白对照。检测6种血红蛋白浓度的血清,结果如表12所示。
表12血红蛋白的干扰
结果表明,血红蛋白含量小于1.5mg/ml时对本发明试剂盒检测无影响。临床上血清中血红蛋白含量很微量,但溶血样本血清中含一定量的血红蛋白,所以溶血样本不能采用本发明试剂盒检测方法进行检测。
称胆红素溶于正常人血清中,以质控血清稀释此胆红素溶液,得到胆红素的浓度分别为0mg/L,25mg/l,50mg/l,100mg/l,200mg/l,以质控血清为空白对照。检测6种胆红素浓度的血清,结果如表13所示。
表13胆红素的干扰
临床上血清胆红素正常值约为3-10mg/L,因此我们在正常人血清中加入15mg/L胆红素至少可以使其含量超出正常值上限两倍以上,结果表明血样中胆红素的存在(0-200mg/L),不对本发明试剂盒的检测方法产生干扰。但如果胆红素浓度增加,就会产生影响。
称胆固醇溶于二氧六环中,用二氧六环将溶液稀释系列浓度,分别取40ul系列的胆固醇二氧六环到2ml血清样本,得到实验系列浓度为0g/L,0.625g/L,1.25g/L,2.50g/L,5.0g/L和10.0g/L的浓度。检测6种胆固醇浓度的血清,检测结果如表14所示。
表14胆固醇的干扰
临床上血清中胆固醇正常高限为2.29g/L,实验结果表明,血清中胆固醇加入量为0-10g/L,测定值没有明显的趋势性变化,因此,血清中胆固醇对本发明试剂盒的检测影响不大。
称甘油三酯溶于二氧六环中,用二氧六环将溶液稀释系列浓度,分别取40ul系列的甘油三酯二氧六环加入到2ml血清样本,得到实验系列浓度为0g/L,5g/L,8g/L,10g/L,15g/L,20g/L和35g/L的浓度。检测6种甘油三酯浓度的 血清,检测结果如表15所示。
表15甘油三酯的干扰
临床上血清中甘油三酯正常高限为2.29mmol/L,本实验结果表明,血清中甘油三脂的含量从0-15mmol/L时无干扰,因此,血清中甘油三脂高于正常对本发明试剂盒的检测没有影响。
由表12-表15可以看出,脂血样本基本上不会影响测定结果。胆红素的存在一般不会影响干扰检测。临床上血清中血红蛋白的样本含量很微量,但溶血样本中含一定量的血红蛋白,所以溶血样本对检测有干扰。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种25羟基维生素D检测试剂盒,其特征在于,主要包括有:
(A)包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的微孔板,所述微孔板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为0.1~0.5μg;
(B)浓度为0.1μg/ml的生物素标记的25羟基维生素D,用量为每微孔25μl。
2.根据权利要求1所述的25羟基维生素D检测试剂盒,其特征在于,所述25羟基维生素D检测试剂盒还包括工作浓度为0.5~2.0μg/ml的辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白。
3.根据权利要求2所述的25羟基维生素D检测试剂盒,其特征在于,所述辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白的工作浓度为1.0μg/ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的25羟基维生素D检测试剂盒,其特征在于,所述包被板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为0.2μg。
5.一种25羟基维生素D检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备包被高特异性鼠25(OH)D单克隆抗体的微孔板
按0.1~0.5μg/孔的包被量将高特异性鼠25(OH)D单克隆抗体包被至微孔内,4℃过夜,洗涤,封闭,密封,得到包被高特异性鼠25(OH)D单克隆抗体的微孔板;
(2)按常规方法制备生物素标记的25羟基维生素D,所述生物素标记的25羟基维生素D的浓度为0.1μg/ml。
6.根据权利要求5所述的25羟基维生素D检测试剂盒的制备方法,其特征在于,还包括按0.5~2.0μg/ml的浓度将辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白溶于含去污剂、防腐剂和BSA的缓冲溶液中,制备得到酶结合物。
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