CN1026248C

CN1026248C - 电化学测定被分析物和氧化还原酶的方法和敏感电极***

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Publication number: CN1026248C
Application number: CN92100931A
Authority: CN
Inventors: 约阿希姆·霍恩斯; 于尔根·谢夫勒
Original assignee: Mannheim Bollinger AG
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1990-02-03
Filing date: 1991-02-02
Publication date: 1994-10-19
Anticipated expiration: 2006-02-02
Also published as: IL97121A0; PT96636A; EP0441222B1; AU638899B2; US5122244A; NO910394D0; FI910498A0; CA2035630A1; IL97121A; BG93747A; HU910367D0; ES2097767T3; NO910394L; HUT59756A; CS26191A2; BG60694B1; ATE146524T1; YU17191A; AU2108692A; EP0441222A3

Abstract

本发明的主题是一种在氧化还原酶和可还原物质存在的情况下电化学测定被分析物的方法，所述可还原物质将测量反应过程中产生的电子从氧化还原酶处传送到电极上，从而产生一个作为要测定的被分析物的量度的信号，由此，可还原物质被酶催还原，并在电极上被氧化，该方法的特征在于，在电极上被氧化形成的物质不同于最开始时使用的可还原物质。本发明还包括相应的敏感电极***和适当的化合物的应用。最后，新的亚硝基苯胺衍生物及其制备方法也是本发明的内容。

Description

本发明涉及在存在有一种氧化还原酶和一种可还原物质的条件下电化学测定被分析物的方法，所述可还原物质将测试反应过程中产生的电子从氧化还原酶处传送到电极上，从而产生一个信号，该信号成为待测定的被分析物的量度，通过上述过程，可还原物质被酶催还原并在电极上被氧化;或者本发明涉及在有酶的底物和上述可还原物质存在的情况下电化学测定氧化还原酶的相应方法。

此外，本发明涉及用于电化学测定样品中的被分析物的敏感电极***，它至少含有二种导电装置，各导电装置彼此隔离，借助于一个导电表面可使导电装置与被检测的样品电接触，在该电极***中至少有一个导电装置接触氧化还原酶和可还原物质，所述的可还原物质可以在氧化还原酶和导电装置之间传送电子;或者本发明涉及相应的、用于测定氧化还原酶的敏感电极***，其中，至少一个导电装置接触氧化还原酶和上述特征的可还原物质。

最后，本发明还涉及将某些化合物用在电化学***中作为在氧化还原酶与电极之间的电子载体。

用比色法测定液体中的被分析物是通过目视或光度来做出评定的，与此相比，相应的电化学测定法的优点是，电化学反应直接产生出可以被换算成浓度的电流。反之，比色法的测试途径是间接的，要经过电池→电流→光→剩余光（减弱或透射）→电流→测量值。

对于电化学测定法来说，必须使待测定的被分析物氧化或者使其转变成一种可以利用化学方法或酶催法使之氧化的物质。使被分析物或由其得到物质在电极表面上直接氧化要求高的过电压即电位。这种方法是没有什么选择性的。采用这种方法，在待检测的样品中存在的许多其它物质也被氧化了。因此这种方法几乎不能用于分析。

上述可以氧化的被分析物或由它所得到的可以氧化的物质，通常与相应的氧化还原酶和可还原物质反应，经过还原后的上述可还原物质在电极上可以再次被氧化。在这种情况下，这种可以氧化的被分析物或由其得到的可以氧化的物质被酶有选择性地氧化。这样被还原的酶又被所存在的可还原物质所氧化，而被还原的可还原物质在电极上被氧化。从而，这种可还原物质起到了电子载体的作用，它把电子从酶那里传送到电极上。因此，其先决条件是，所选择的可还原物质应当迅速地、特定地被酶和被电极所转变。

P.W.Carr等人描述了利用葡糖氧化酶进行酶催化的、葡萄糖与氧（作为可还原物质）的反应以及检测在电极上形成的过氧化氢（参见：“Theory and application of enzyme electrodes in analytical and clinical chemistry”，Publisher Wiley，New York（1980），Papes 197-310。这种方法的缺点是，本身为强氧化剂的过氧化氢的副反应以及由于使用高的正电位的结果在电极表面上发生的副反应。因此这一方法要求预先进行特定的分离，以除去待检测样品中的干扰成分。另外一个缺点是需要氧。空气中的氧扩散进入样品里并在样品里成为决定反应速度的因素，特别是在高的葡萄糖浓度下，从而在某些情况下可以使得这一方法的结果不真实。

在欧洲专利EP-A-0125137中描述了一种用于测定多种物质混合物中某一组分的敏感电极***，该***至少具有二种导电介质，它们彼此隔离，借助一个导电的表面可使它们与待检测的样品电接触，从而这些导电表面中的一个接触氧化还原酶和所谓的“媒质化合物”，该化合物在该酶与导电表面之间传送电子。一种有机金属物质被用来作为媒质化合物，它至少具有二个有机环，每个环至少有二个共轭双键，其中金属原子与这些环中的每一个共用其电子。正如EP-A-0078636中那样，二茂铁或二茂铁衍生物被用来作为优选的媒质化合物。就这一点来说，应当考虑到，这些化合物必须首先被氧化，例如氧化成为二茂铁（ferrocinium）离子，然后它们才可以接受来自氧化还原酶的电子。这导致产生所谓的“起始电流”，在不存在被分析物的情况下就已经有了这种“起始电流，当然就干扰了以所产生的电流作为待测定的被分析物含量的量度的电流测定分析方法。此外，这种金属有机化合物缺乏溶解性也是一缺点，这是因为，例如在使用氧化酶（如葡糖氧化酶）作为氧化还原酶时这将导致氧的优先选择，从而导致产生很小的电流并导致对氧的依赖性，特别是在较低的酶作用物浓度下。如果以被还原的形式使用这些电子载体，那么为了得到可以接受的起始电流，缺乏溶解度和/或使用低的浓度是必要的。

一般地说，人们所熟知的现有技术电化学测定方法中使用的电子载体的特点是，在有待检测的被分析物存在情况下它们被氧化还原酶所还原并在电极上被重新氧化成为原来的化合物。如果起到电子载体作用的可还原物质的浓度大大小于待测定的被分析物的浓度，那么只有动态方法可以被实现。对于终点测定来说，为了使待测定的被分析物完全反应，起电子载体作用的可还原物质相对于待测定的被分析物来说必须以过量溶解的形式存在。在这种方法中，进行反应的可还原物质的数量与待测定的被分析物成正比。与动态测量相比，其突出优点是：扩大了电流测定法中电流/浓度的线性范围，以及在使用氧化酶作为氧化还原酶时，与氧相比提高了较高浓度的可还原物质的竞争能力。但其缺点是：为了实现完全反应必须使用某种可还原物质即氧化剂作为电子载体，其电位显著高于酶作用物的电位，此外，在电化学测量中必须使用过量的氧化剂，这进一步提高了所需要的电位。但是，高的工作电位有利于非特定的电极反应，特别是在所要检测的样品中除了待测定的被分析物外还含有许多其它成分时。

在这方面，迄今还没有用于通过酶催氧化还原反应电化学测量被分析物的令人满意的解决办法。缺少满足下列条件的起到电子载体作用的可还原物质;该物质能普通适用，能与氧化还原酶迅速反应，并且在低电位下在电极表面上显示出不受抑制的反应。

本发明的目的是解决这一问题。特别是要找到在电化学***中可以在氧化还原酶和电极之间起到电子载体作用的可还原物质。本发明实现了这一目的，本发明的特征概述于权利要求中。

本发明提供了一种在有氧化还原酶和可还原物质存在的情况下电化学测定被分析物的方法，所述的可还原物质将测量反应过程中产生的电子从氧化还原酶那里传送到电极上，从而产生一个作为待测定的被分析物的量度的信号，通过这一过程，上述可还原物质被酶催还原并在电极上被氧化，这一方法的特征是，在电极上氧化形成的物质不同于一开始时使用的可还原物质。

本发明还提供了一种在有相应的酶的底物和可还原物质存在的情况下电化学测定氧化还原酶的方法，所述的可还原物质能够将电子由氧化还原酶处传送到电极上，从而产生一个作为待测定的酶的量度的信号，通过这一过程，上述氧化还原酶被酶催还原并在电极上被氧化，这一方法的特征在于，在电极上氧化形成的物质不同于一开始时使用的可还原物质。

另外，本发明还提供了，将一种能从氧化还原酶那里接受电子、形成富集电子的芳香胺的物质在电化学***中作为氧化还原酶与电极之间的电子载体的应用。

本发明还提供了一个用于测定液体样品中的被分析物的敏感电极***，它至少含有二种导电装置，它们彼此隔离，借助于导电的表面可以使它们与待检测的样品电接触，在该***中，至少有一个导电装置接触氧化还原酶和可还原物质，该可还原物质能在氧化还原酶与导电装置之间传递电子，这一电极***的特征在于，使用一种化合物作为可还原物质，该化合物在被氧化还原酶还原之后在导电表面上被氧化成为一种与开始时使用的可还原物质不同的物质。

此外，本发明提供了一种用于电化学测定液体样品中氧化还原酶的敏感电极***，它至少含有二种导电装置，它们彼此隔离，借助于一个导电表面可使每一导电装置与待检测的样品电接触，在该电极***中，至少有一个导电装置接触氧化还原酶的底物和一种可还原物质，该可还原物质能在氧化还原酶与导电装置之间传递电子，这一***的特征在于，使用一种化合物作为可还原物质，该化合物在被氧化还原酶还原之后在导电装置上被氧化成为一种与开始时使用的可还原物质不同的物质。

最后，本发明提供了，一种能从氧化还原酶那里接受电子、形成富电子的芳香胺的物质用于制造本发明的敏感电极***的应用。

业已证明，已知的在有氧化还原酶和可还原物质存在的条件下电化学测定被分析物的现有技术方法因必须用高电位而带来的缺点-特别是在相对于待测定的被分析物而使用过量的起电子载体作用的可还原物质时-通过不可逆反应可以基本上被避免。由于在电极上形成的被氧化的物质与一开始时用作可还原物质的那种物质不同，因此电化学测定可以在特别低的电位下进行，从而免除了干扰反应的危险。在下述情况时也可以利用这一低电位的优点，即与待测定的被分析物相比仅使用少量的起电子载体作用的可还原物质的时候，也就是说在开始时使用的可还原物质及在电极上氧化形成的物质被电化学方法所必需的氧化还原酶所还原的时候。如果开始时使用的可还原物质以及在电极上氧化形成的物质被氧化还原酶还原成为同样的物质，那么初始使用的可还原物质对于次生的可还原物质来说就起到了累积形式的作用，该次生的可还原物质在电极和酶之间重新循环，它与初始时使用的可还原物质不同。

本发明方法的优点归因于下述事实：可以被选择作为可还原物质的那些物质通过酶催还原形成了一种化合物，该化合物在电极上在低电压下即可以被氧化。在电极上氧化的过程中，只有其浓度微不足道的这种新氧化的物质存在。迄今为止，经过酶催还原的化合物都不得不在电极上被氧化回到初始时使用的、已经以高浓度存在的可还原物质。为此必须提高正电位。

在本发明的意义上可以有利地用来作为可还原物质的化合物是这样的一些化合物，它们在氧化还原酶所适用的作用物氧化过程中接受由酶产生的电子，并在这一过程中形成富电子的芳香胺。就这一点而言，富电子的芳香胺被理解为一种化合物，它富集了比苯胺更多的电子，由于电子的富集，它在电极上可以在低电位下被氧化。例如，下述所有苯胺衍生物都在考虑之列，这些苯胺在芳环上或在苯胺的氮上带有一个或几个+I或/和+M取代基，例如羟基、烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、一烷基氨基和二烷基氨基残基。

烷基、烷氧基、烷硫基、一烷基氨基和二烷基氨基残基是这样一些残基，其中烷基相当于具有 1-6个碳原子的、本身可被下列基团取代的烃基残基;羟基、氨基（如果需要，被具有1-6个碳原子的烷基一次或多次取代）、PO₃H₂、SO₃H或CO₂H。酸性残渣PO₃H₂、SO₃H和CO₂H可以就这样存在也可以以盐的形式存在，例如以铵盐、碱金属盐或碱土金属盐的形式存在。

芳氧基和芳硫基残基是具有6-10个碳原子的芳族残基，其中特别优先选用苯氧基和苯硫基残基。

铵盐是含有铵离子NH⁺ ₄的盐，或者是含有被烷基、芳基或芳烷基残基一次或多次取代的铵阳离子的盐。在烷基残基和芳烷基残基中的烷基指的是带有1-6个碳原子的烃基残基。芳基残基和芳烷基残基中的芳基是具有6-10个碳原子的芳族环状***，其中最为理想的是苯基。优先选用的芳烷基残基是苄基。

碱金属盐最好是锂、钠或钾的盐。碱土金属盐最好是镁或钙的盐。

此外，苯胺衍生物被理想为包括下述化合物：它们在芳族环状***上带有一个未被取代的氨基基团或一个被+I或/和+M取代基（如烷基）一次或多次取代的氨基基团，上述芳环***与一个或几个芳族或/和脂环族环稠合。就这一点而言，烃-芳族***以及杂芳族化合物都被认为是芳族环。其例子有稠合的苯环或萘环，或者稠合的吡啶环。

脂环族环被理解为带有5-7个碳原子（最好是5或6个碳原子）的、饱和的或不饱和的环脂族化合物。

氨基基团的可以允许的烷基取代基可以是带有1-6个碳原子的烃基残基，它们本身可以被羟基、氨基（如果需要，被具有1-6个碳原子的烷基一次或多次取代）、PO₃H₂、SO₃H和CO₂H所取代。酸性残基PO₃H₂、SO₃H和CO₂H可以就这样存在或以盐例如铵盐、碱金属盐或碱土金属盐的形式存在，上面给出的定义也适用于这些盐。

上文中举出的+I或/和+M取代基的例子是不完全的。本专业的技术人员应该知道某种给定的取代基是不是+I或/和+M取代基，所有这些取代基都应认为是在本发明中使用的富电子芳香胺中的可以接受的取代基。

可还原物质在从氧化还原酶那里接受电子时导致产生富集电子的芳香胺，随后该芳香胺在电极上可以在低电位下被氧化。作为这样的可还原物质优先选用下列通式Ⅰ的化合物组中的化合物以及通式Ⅱ的化合物：

式中，R表示富集电子的芳族残基，X表示NO或NHOH，

式中，Y表示一个醌型***，该***在还原之后在芳族状态中是富电子的。

就这一点而言，富电子的芳族残基被理解为上面所列的富电子芳香胺的替代物。

本发明的这些可还原物质在接受来自氧化还原酶的电子时被还原成为芳族胺，并且在电极上氧化时它们不是被氧化成为原来的可还原物质。本专业的技术人员都知道，在富电子的芳香胺发生电化学氧化时，电子从芳基残基上脱离，导致形成一些原子团或醌型***。但是不形成醌型肟、羟胺和亚硝基化合物。

经过电化学氧化的化合物常常可以再次接受来自氧化还原酶的电子，从而被还原回去成为富电子的芳香胺。因此，与待测定的被分析物相比可以以低的浓度使用本发明的可还原物质。这样，它们起到了由氧化还原酶处接受电子时形成的富电子芳香胺的累积形式的作用，并且可以作为电子载体在氧化还原酶与电极之间反复循环。

业已证明，本发明的电子载体的突出例子有;

N-（2-羟乙基）-N′-对亚硝基苯基-哌嗪，

N，N-双-（2-羟乙基）-对亚硝基苯胺，

邻-甲氧基-[N，N-双-（2-羟乙基）]-对亚硝基苯胺，

对-羟基亚硝基苯，

N-甲基-N′-（4-亚硝基苯基）-哌嗪，

对醌二肟，

N，N-二甲基-对亚硝基苯胺，

N，N-二乙基-对亚硝基苯胺，

N-（4-亚硝基苯基）-吗啉，

N-苄基-N-（5′-羧戊基）-对亚硝基苯胺，

N，N-二甲基-4-亚硝基-1-萘胺，

N，N，3-三甲基-4-亚硝基苯胺，

N-（2-羟乙基）-5-亚硝基二氢吲哚，

N，N-双-（2-羟乙基）-3-氯-4-亚硝基苯胺，

2，4-二甲氧基-亚硝基苯，

N，N-双-（2-甲氧基乙基）-4-亚硝基苯胺，

3-甲氧基-4-亚硝基苯酚，

N-（2-羟乙基）-6-亚硝基-1，2，3，4-四氢喹啉，

N，N-二甲基-3-氯-4-亚硝基苯胺，

N，N-双-（2-羟乙基）-3-氟-4-亚硝基苯胺，

N，N-双-（2-羟乙基）-3-甲硫基-4-亚硝基苯胺，

N-（2-羟乙基）-N-（2-（2-甲氧基乙氧基）-乙基）-4-亚硝基苯胺，

N-（2-羟乙基）-N-（3-甲氧基-2-羟基-1-丙基）-4-亚硝基苯胺，

N-（2-羟乙基）-N-（3-（2-羟基乙氧基）-2-羟基-1-丙基）-4-亚硝基苯胺，

N-（2-羟乙基）-N-（2-（2-羟基乙氧基）-乙基）-4-亚硝基苯胺。

本发明中优先选用的可还原物质是N，N-双-（2-羟乙基）-对亚硝基苯胺，最理想的是N-（2-羟乙基）-N-（2-（2-羟基乙氧基）-乙基）-4-亚硝基苯胺。

根据本发明可以被使用的通式Ⅰ的许多化合物是人们所熟知的。通式Ⅲ的亚硝基苯胺衍生物或这衍生物的盐是新的：

式中，R¹表示氢、卤素、烷氧基或烷硫基;

R²表示烷基残基;

R³表示羟烷基残基;或者

R²和R³是相同的或不同的，它们各代表

一个二烷基氨基烷基残基、一个羟基烷氧基烷基或烷氧基烷基残基（如果需要，在烷基部分中被OH取代）或一个聚烷氧基烷基残基（如果需要，在烷基部分中被一个羟基残基取代）;或者

R²和R³形成一个被硫或氮间断的亚烷基残基，其中氮被烷基、羟烷基、羟基烷氧基烷基、烷氧基羟烷基、二噁烷基某基一烷基或聚烷氧基烷基残基所取代，如果需要，它们每一种在烷基部分中被羟基残基取代;或者

若R¹相对于NR²R³来说处在邻位上，那么R²同R¹一起表示一个亚烷基残基，从而R³表示一个羟烷基残基;若亚烷基残基含有3个碳原子，那么根据需要它还表示一个烷基残基;若R¹不是氢，那么R²和R³是相同的或不同的，各表示一个羟烷基残基。

就这方面而言，卤素指的是氟、氯、溴或碘，特别是氟和氯最为理想。烷基、烷氧基或烷硫基是具有1-6个碳原子的残基，其中具有1-3个碳原子的最理想。上面对烷基所下的定义也适用于下列残基中的烷基部分：羟烷基、二烷基氨基烷基、羟基烷氧基-烷基、烷氧基烷基、聚烷氧基烷基、烷氧基-羟烷基和二烷基某基-烷基残基。

二噁烷基某基残基是这样一种残渣，其中一个二噁烷环状***被键联到一个烷基残基上。它最好是一个1，4-二烷环状***，即

聚烷氧基烷基残基是一个-烷基-（烷氧基）_n-烷氧基残基，式中的n＝1-10，n＝1-4更为可取，最理想的是n＝1-3。亚烷基残基是一个直链或支链的（最好是直链）、饱和或不饱和的（最好是饱和的）烃链，它由2-5（最好是2-4个）碳原子带有二个自由接合点组成。在上述R²和R³的被硫或氮间断的亚烷基残基的含义范围内，优先选择通过包含通式Ⅲ的氮原子而形成的硫代吗啉或哌嗪残基，特别是哌嗪残基。

在由R¹和R²形成的亚烷基残基的含义范围内，优先选择通过包含通式Ⅲ的芳环而形成的二氢吲哚或1，2，3，4-四氢喹啉残基。

作为通式Ⅲ的本发明亚硝基苯胺衍生物的盐，优先选择强酸特别是矿物酸（如盐酸、硫酸，硝酸和磷酸）的盐。氢氯化物特别理想，它们是盐酸的盐。

根据本发明，特别优先选择下列新的亚硝基苯胺衍生物及它们的盐：

a）2，2′-[（3-氟-4-亚硝基苯基）亚氨基]双-乙醇，

b）2，2′-[（3-氟-4-亚硝基苯基）亚氨基]双-乙醇，

c）2，2′-[（3-甲氧基-4-亚硝基苯基）亚氨基]双-乙醇，

d）2，2′-[（3-甲氧基-4-亚硝基苯基）亚氨基]双-乙醇，

e）2-[（2-羟基乙氧基）乙基-（4-亚硝基苯基）氨基]乙醇，

f）2-[（2-甲氧基乙氧基）乙基-（4-亚硝基苯基）氨基]乙醇，

g）1-[N-（2-羟乙基）-（4-亚硝基苯胺基）]-3-甲氧基-2-丙醇，

h）1-[N-（2-羟乙基）-（4-亚硝基苯胺基）]-3-（2-羟基乙氧基-2-丙醇，

i）1-甲基-4-（4-亚硝基苯基）-哌嗪，

j）4-（4-亚硝基苯基）-1-哌嗪基-乙醇，

k）5-亚硝基-1-二氢吲哚乙醇，

l）1-甲基-6-亚硝基-1，2，3，4-四氢喹啉，

m）6-亚硝基-3，4-二氢-1（2H）喹啉乙醇。

其中，优先选择化合物a）、d）、e）、f）、g）和h）及其盐，化合物e）或它的盐-特别是氢氯化物-最为理想。

通式Ⅲ的化合物可以通过使通式Ⅳ的化合物与亚硝酸盐反应来制备

式中，R¹、R²和R³的含义与通式Ⅲ的化合物相同。由J.J.D′Amico等人的论文（见J.Amer.Chem.Soc.81，5957（1959））获知一种类似的方法。

作为亚硝酸盐最好是使用碱金属亚硝酸盐，其中的碱金属可以是锂、钠、钾、铷或铯，优先选用亚硝酸钠和亚硝酸钾，特别是亚硝酸钠。反应最好是在酸性介质中于低温下进行。温度低于10℃特别是在-10和+5℃之间时比较有利。

通式Ⅳ的化合物与亚硝酸盐的反应在水介质中进行比较有利。pH应低于3，最好是低于2。

在上述反应的一个最佳实施方案中，首先向含水的酸性介质中加入通式Ⅳ的化合物或它的盐，最好是矿物酸（如盐酸、硫酸、硝酸或磷酸）的盐，使之冷却，然后将该反应混合物保持在低温，与此同时加入亚硝酸盐，最好是溶解形式的亚硝酸盐。若也使用水介质作为亚硝酸盐的溶剂则更为有利。加入亚硝酸盐后，将反应混合物保持在低温直至反应完毕。为了处理该反应混合物，最好用有机溶剂萃取，由萃取液中分离出产物。

根据本发明可用于作为电子载体的化合物可以被氧化的形式贮存和使用。用这种方法避免初始电流，终点测定可以用过量的电子载体进行。按本发明可用作电子载体的化合物在贮存过程中是稳定的，它们可以与氧化还原酶迅速反应。最重要的是，在使用氧化酶时，它们能够与氧竞争，并可以以超过待测定的被分析物最高浓度的量使用。由于本发明的电子载体在水介质中具有良好的溶解性，使得上述后一性能成为可能。

在电化学测定体液中的被分析物时，按照本发明可用于作为电子载体的化合物的突出优点是，它们不会被体液中具有还原作用的物质非酶催还原，或者说这种还原的程度微不足道。本发明的电子载体在电极表面上迅速地被氧化，并且，处于还原形式的这种电子载体对氧是不敏感的。对于这些化合物，可以使用低电位在电极上进行氧化。

在本发明中，把待测定的物质称为被分析物。它通常是若干种物质构成的混合物中的某一成分。就这方面来说，当测定体液例如血液、血浆、血清或尿液中的某一被分析物时，本发明的方法具有特殊的优点，因为就这方面而言，最重要的是只与该生物多组分***中的一种组分发生特定反应。

本发明的电化学测定被分析物的方法是建立在下述事实的基础上，即被分析物本身被氧化还原酶氧化并因而构成了相应的酶的底物，或者被分析物在一个或几个预先的反应中-最好是酶催反应-被转变成一种可以被氧化还原酶氧化的化合物。在这一氧化过程中产生的电子与待测定的被分析物的量成正比。如果这些电子被本发明的可还原物质传送到电极上，就会产生一个作为待测定的被分析物的量度的信号。可以采用电流测定方法也可采用电位测定法，前者是测定电流，后者是测定电压。

本发明的方法所使用的氧化还原酶优先选用氧化酶、非NAD（P）依赖性的脱氢酶或心肌黄酶。例如，根据本发明，可以用葡糖氧化酶测定葡萄糖，用乳酸氧化酶测定乳酸，用甘油磷酸酯氧化酶测定甘油磷酸酯，用胆甾醇氧化酶测定胆甾醇。作为非NAD（P）依赖性脱氢酶，例如可以使用葡萄糖-染色氧化还原酶来测定葡萄糖。心肌黄酶也可以表示成NADH：染色氧化还原酶，它非常适合用来检测NADH。

在必须电化学测定某种被分析物，而该被分析物本身不能作为氧化还原酶的作用物的情况下，可以通过一个或几个预先的反应一特别是酶催反应-将该被分析物转变成一种被氧化还原酶接受作为作用物的化合物。例如，甘油三酯是可以测定的，因为它们借助于酯酶被解离成为甘油和酸性残渣，再用甘油激酶使甘油转变成甘油磷酸酯和腺苷三磷酸（ATP），最后利用甘油磷酸酯氧化酶使其氧化，在这后一步骤中产生的电子被本发明的电子载体传送到电极上从而产生一个电流，这一电流与被测定的样品中的甘油三酯的量成正比。

采用类似的方法也可以测定总胆甾醇量，用胆甾醇酯酶使胆甾醇酯解离，再借助于胆甾醇氧化酶测定这样所形成的胆甾醇。在这种情况下，所形成的胆甾醇的量和在借助于胆甾醇氧化酶而氧化的过程中释放出的电子也与要测定的总胆甾醇的量成正比，上述电子借助于本发明的可还原物质被传送到电极上。

心黄肌酶可以用来测定NADH。来自心肌黄酶的电子也可以借助于本发明的可还原物质被转移到电极上。许多生物物质都可以被酶催反应、生成NADH，因此用这种方法可以通过酶催反应序列使许多被分析物转变成NADH，最后再借助于心肌黄酶和本发明中用的可还原物质测定它。

根据以上所述不言而喻，按照本发明如果使用一种被认为是酶作用物的相应的化合物以及一种本发明的可还原物质，那么当然也可以测定氧化还原酶。这样，如果在有相应的敏感电极***存在的情况下使葡萄糖和本发明的电子载体与要测定的样品接触，就可以电化学测定葡糖氧化酶。

本发明方法的一个突出特征是，用来将电子从氧化还原酶处转移到电极上的可还原物质在以被氧化的形式贮存时是稳定的，此外它易溶于水，这一点对于测定体液例如血液、血浆、血清和尿液中的被分析物特别重要。本发明可以使用的可还原物质与氧化还原酶迅速反应，并能有力地与氧竞争，特别是在与氧化酶的反应中。由于它们的溶解性，它们可以用于测定电流的终点法，在这种方法中要求可还原物质的量要超过待测定的被分析物最高浓度。由于本发明能够使用的可还原物质被体液中存在的还原剂非酶催还原的程度是微不足道的，它们在电极表面上迅速被氧化，并且在还原的形式时对氧极不敏感，因此这些物质非常适用于特定地、无干扰地电化学测定被分析物。此外，这种无干扰地、特定地电化学测定被分析物首先是建立在下述事实基础上：根据本发明能使用的可还原物质只需要小的电极电位。

本发明的电化学测定被分析物的方法不局限于特定的电化学装置。例如，可以使用现有技术的敏感电极***。原则上说，下述敏感电极***可适用于测定液体样品中的被分析物：它们至少含有二种导电介质作为电极，这些导电介质彼此隔离，借助于一个导电表面可以使每一导电介质与要检测的样品电接触。就这一敏感电极***而言，可以设想只使用二个电极，即一个工作电极和一个参比电极。没有参比电极即只有工作电极和反电极的测量装置也是可以的。在这种情况下，电压只在外表上保持恒定。也可以使用三个电极，即一个参比电极、一个工作电极和一个反电极。由现有技术中可以获知相应的敏感电极***，例如参见G.Henze and R.Neeb，“Elekt rochemische Analytik”（电化学分析），Springer-Verlag（1986）。

对于电化学测定被分析物来说，重要的是，（至少）一个电极-即导电表面-接触到氧化还原酶和能在氧化还原酶与导电表面之间传递电子的可还原物质。在这一点上，可以设想：所需要的所有试剂与要检测的样品一起处在溶液中;或者这些试剂中的一部分-最好是氧化还原酶和/或传送电子的可还原物质-被固定在电极上，其余的处在溶液中;或者测量所必需的所有试剂都固定在电极上。原则上说，工作电极是否接触氧化还原酶和以被溶解的形式起到电子载体作用的可还原物质，或者这些物质是否是以固体物质形式被涂于电极上，以及，根据需要它们在与要检测的液体样品接触时溶解，抑或在与待检测的液体样品接触后仍保持固定在电极上，这一切对于敏感电极***的功能都不是至关重要的。

不言而喻，以上所述同样适用于氧化还原酶的测定。必须注意的是，敏感电极***接触氧化还原酶和本发明的可还原物质。除此之外，对于测定被分析物所作的描述都可相应地应用于这种情况。

附图进一步描述了本发明：

图1-a）部分：电子载体浓度大于或等于要测定的被分析物浓度时在本发明方法中可以使用的可还原物质的作用及敏感电极***的示意图。

图1-b）部分：在现有技术方法中载运电子的物质的作用及现有技术敏感电极***的示意图。

图2-a）部分：传送电子的物质的浓度远小于要测定的被分析物浓度时在本发明方法中能使用的可还原物质的作用和敏感电极***的示意图。

图2-b）部分：在现有技术方法中传递电子的物质的作用和现有技术敏感电极***的示意图。

图3：用于实施本发明方法的敏感电极***，其中，所需要的物质存在于溶液中。

图4：用于实施本发明方法的敏感电极***，它设计成一次性使用的可置换的敏感元件。

图5：按本发明电化学检测葡萄糖时用N，N-双（2-羟乙基）-对-亚硝基苯胺作为传递电子的物质由循环电压电流图（Cyclovoltammograms）得到的在不同葡萄糖浓度下阳极电流密度畸峰值的曲线图。

图6：是一个曲线图，它表明在按本发明测定NADH时的电流密度与NADH浓度之间的关系。

图7：N-（2-羟乙基）-N′-对亚硝基苯基-哌嗪和N，N-双（2-羟乙基）-对亚硝基苯胺的循环电压电流图（Cyclovoltammogramms）。

图8：按照本发明的方法在有和没有大气氧存在的情况下用N-甲基-N′-（4-亚硝基苯基）哌嗪作为传递电子的物质时电流密度对葡萄糖浓度的关系曲线图。

图9：按照现有技术方法在有和没有大气氧存在的情况下用四硫富瓦烯作为传递电子的物质时电流密度对葡萄糖浓度的关系曲线图。

图10：按照本发明方法用N，N-双-（2-羟乙基）-对亚硝基苯胺作为传递电子的物质在用乳酸脱氢酶启动测试反应后各不同时间的电流密度对乳酸脱氢酶（LDH）浓度的关系曲线图。

图11：根据本发明的方法用图4所示的一次性电极测定葡萄糖时的电流-时间曲线。

图12：按照本发明的方法使用图4所示的一次性电极在10秒钟反应时间后的电流对葡萄糖浓度的关系曲线图。

在图1和图2中分别表示了，使用的传递电子的物质的量超过要测定的被分析物时（图1）以及与被分析物浓度相比使用很少量的传递电子的物质时（图2）本发明方法与现有技术方法之间的区别。按照图1b）的现有技术方法，在有待测定的被分析物或由其衍生的物质（Sred）存在的情况下，传递电子的物质（Eox1）被转变成还原的形式（Ered），而被分析物或由其衍生的物质被酶催氧化成为（Sox）。被还原的电子载体（Ered）在电极上释放出电子从而被氧化回到一开始时使用的可还原物质（Eox1）。

反之，按照图1a）的本发明方法，在要测定的被分析物或由其衍生得到的物质（Sred）酶催氧化成为（Sox）的过程中，起电子载体作用的可还原物质（Eox1）转变成被还原的形式（Ered）。随后在电极上阳极氧化过程中，形成了被氧化形式的电子载体（Eox2），它与一开始时使用的可还原物质（Eox1）是不同的。由于在开始电化学氧化时根本不存在Eox2的结果，Ered在特别低的电位下就可以被氧化。在选择本发明的传递电子的可还原物质时，应满足：较低的电位就足以使酶催形成的被还原形式（Ered）发生阳极氧化。用这种方法可以避免伴随发生干扰反应，在较高的电位被施加到电极上时要检测的样品中的伴生物质被氧化从而发生这些干扰反应，并导致产生一个电流，使所得结果不真实。在图1b）的现有技术方法中，由于过量的Eox1因而需要比开始时用的可还原物质（Eox1）的电位更高的电位来使酶催形成的电子载体的被还原形式（Ered）重新氧化。

如果起电子载体作用的可还原物质（Eox1）的量少于要测定的被分析物或由其衍生而得到的物质（Sred），那么根据现有技术的方法（图2b），由于被还原的形式（Ered）被阳极氧化成为开始时使用的可还原物质（Eox1），因此这种可还原物质可以在电极与酶之间反复地循环。

根据本发明的方法（图2a），如果在电极上形成的氧化形式的电子载体（Eox2）被经过还原的酶以及开始时用的可还原物质（Eox1）所还原，那么对于Eox2/Ered电子载体***来说（Eox1）可以起到稳定的累积形式（Storage form）的作用。

原则上说，适用于现有技术方法的所有敏感电极***都可以用于本发明的方法。因此图3的敏感电极***可以被使用，该***参见：G.Henze and R.Neeb，“Electrochemische Analytik”，Springer Verlag（1986）。

在这一***中，工作电极（1）、反电极（2）和参比电极（3）浸在要检测的液体样品（4）中。这些电极可以使用常用的物质。例如，工作电极和反电极（1，2）可以由贵金属或者用于制造这些电极的那些金属构成。优先选择用于工作电极和反电极（1，2）的材料例如是金和铂。参比电极（3）也可以由用于此目的常规***构成。例如优先选用银/氯化银***。参比电极（3）通过一个盐桥-例如氯化钾溶液-与要检测的液体样品中的其余的电极***（1，2）相接。

本发明方法的氧化还原酶或氧化还原酶***（取决于要测定的是一种被分析物还是一种氧化还原酶）以及起电子载体作用的可还原物质，可以被溶解在要检测的样品（4）中，抑或将它们全部或部分固定在工作电极（1）上。这些电极彼此电连接的方式取决于要测量的电信号以及它们必须被控制的方式，本专业的技术人员都很熟悉连接的方式。

图4中显示了一种可用于测定葡萄糖的一次性电极的结构。所需的电极及其附带的引线被安装在一种绝缘的载体材料（8）例如聚碳酸酯箔上。适用的方法例如有网板印刷法、喷墨法、蒸发涂敷法或薄膜法。图4中，（5）是工作电极，（55）是附带的导电引线，（6）是带有引线（66）的参比电极，（7）是带有相应引线（77）的反电极。这些电极和引线可以使用惯用的导电材料。例如可以使用商品石墨印染浆来制造连接到电极上的导电引线。这些电极主要含有贵金属如银、金或铂。在图4的本发明敏感电极***中，工作电极含有一些电化学测定被分析物或氧化还原酶所必需的试剂。例如，对于测定葡萄糖来说这些试剂是葡糖氧化酶、本发明的传递电子的可还原物质、使要测定的样品的pH值对于酶催反应达到最佳值的缓冲物质，根据需要还可以有洗涤剂和溶胀剂，以获得用使得该混合物导电的物质制造电极所必需的稠度以及使得这一混合物可以被加工成糊。例如可以加入石墨粉作为使其导电的材料。参比电极（6）和反电极（7）及相应的引线（66）和（77）例如可以用含氯化银粉末的商品银导电糊制备。图4的敏感电极***可以按约10×30mm的尺寸制造。可将要检测的溶液涂于电极表面上或者可以将试验样品载体浸入待检测的液体中，使电极表面为液体所覆盖。在电流测定时，向电极上加一个电压;测量与要测定的被分析物成正比的电流。为此，测量反电极（7）和工作电极（5）之间的电流，对其进行调节使参比电极（6）和工作电极（5）之间保持预定的电压。为了使引线的电阻不产生影响，测量工作电极（5）和参比电极（6）之间的电压要在零电流下进行。如果对电极电位的精度要求很低，可以免去在零电流下测量电压，或者参比电极（6）可以同时作为反电极（7）工作。

下面通过实施例进一步说明本发明。

实施例1：葡萄糖检测

使用图3的敏感电极***。工作电极（1）由面积0.1cm²的金丝构成。反电极（2）是面积为0.1cm²的铂丝，而参比电极（3）是由Orion Research Inc.Company（Boston，Massachusetts，USA）生产的银/氯化银系电极。

0.1摩尔/升磷酸钾缓冲液和0.1摩尔/升氯化钾（pH7.0）;10毫摩尔/升N，N-双-（2-羟乙基）-对亚硝基苯胺和浓度在0～100毫摩尔/升之间的葡萄糖的溶液在反应容器中。

通过向反应混合物中添加葡萄糖氧化酶（EC1.1.3.4）及随后混合，启动测量反应。添加葡萄糖氧化酶的量应使在反应混合物中的浓度为0.5mg/ml（125U/ml）。添加葡萄糖氧化酶一分钟后，用恒电位器（Mod.273EG&G，Princeton Applied Research，Princeton，New Jersey，USA）以100mV/S的扫描速度测定循环电压电流曲线（cyclovoltammogram）。第一个最大的氧化电流估计为150mV。获得的结果示于图5中。添加葡萄糖氧化酶5分钟后，或当氧被排除时（在氩气下），相应的测量值没有产生显著的变化。结果是阳极电流密度最大值与葡萄糖浓度的线性关系一直保持到葡萄糖浓度达到约30毫摩尔/升，这由图5的曲线可以看出。在葡萄糖浓度高于30毫摩尔/升时，用作传递电子的物质的N，N-双-（2-羟乙基）-对亚硝基苯胺完全转变成相应的苯二胺。所以高于30毫摩尔/升的葡萄糖浓度并不导致电流进一步的增加。由于产生一个苯二胺分子需要二个葡萄糖分子，并且葡萄糖总量中三分之二是以β形式存在、从而可以被葡萄糖氧化酶转变，因此，实验发现10毫摩尔/升电子载体物质被30毫摩尔/升葡萄糖完全转变正好与理论计算相符。

用葡萄糖-染色-氧化还原酶（EC1.1.99.17）取代葡糖氧化酶（EC1.1.3.4）在0.1摩尔/升三羟甲基氨基甲烷缓冲液、0.1摩尔/升氯化钾（pH7.0）并添加1%牛血清清蛋白中获得类似的结果。

实施例2：NADH检测

结构和测量装置如实施例1所述。反应容器中装有0.1摩尔/升磷酸钾缓冲液、0.1摩尔/升氯化钾（pH7.0）、10毫摩尔/升N，N-双-（2-羟乙基）-对亚硝基苯胺和浓度在0-10毫摩尔/升的NADH。添加并混合由微生物制造的心肌黄酶（NADH：染色-氧化还原酶），并将酶同反应混合物混合，从而开始测量。酶的添加量应使反应混合物中的酶浓度为0.2mg/ml（3U/ml）。反应1分钟后测量电流密度，得到图6中所示的线性的电流密度-浓度关系的曲线。

实施例3：测定乳酸

使用与实施例1同样的试验结构及同样的电子载体还可以测定乳酸。使用乳酸氧化酶（EC1.1.3.2）作为酶，并使用0.1摩尔/升柠檬酸缓冲液、0.1摩尔/升氯化钾（pH5.5）作为缓冲液。

实施例4：测定甘油磷酸盐

如果用甘油磷酸盐氧化酶（EC1.1.3.21）取代实施例1中的葡萄糖氧化酶、缓冲液用0.1摩尔/升三羟甲基氨基甲烷缓冲液、0.1摩尔/升氯化钾（pH8.0）代替，则可以相似地测定甘油磷酸盐。

实施例5：测定胆固醇

用由链霉菌（Streptomyce）制造的胆甾醇氧化酶（EC1.1.3.6）代替实施例1中的葡萄糖氧化酶，用10毫摩尔/升N-甲基-N′-（4-亚硝基苯基）-哌嗪取代其中的电子受体，用0.1摩尔/升磷酸钾缓冲液、0.1摩尔/升氯化钾（pH5.5）带有2%Triton×100^R代替其中的缓冲液，可以与实施例1相似地测定胆固醇。

实施例6：本发明的传递电子的可还原物质

下面表1中所列化合物以10毫摩尔/升的浓度在0.1摩尔/升磷酸钾缓冲液、0.1摩尔/升氯化钾（pH7.0）中同50毫摩尔/升葡萄糖和0.5mg/ml葡萄糖氧化酶（125U/ml）反应。在这种情况下采用实施例1中所述的测量方案。相应的循环电压电流曲线图产生了用葡萄糖氧化酶和葡萄糖还原的电子载体对标准氢电极的峰电位（单位mV）。

表1中列出1分钟后和10分钟后在最高氧化峰的电位上的氧化电流比作为转化率的量度。

表1见文后

a：用葡萄糖氧化酶和葡萄糖还原的电子载体的第一峰电位（单位mV，与Ag/Agcl相对）。

b：与反应时间为10分钟时的电流相比，反应时间为1分钟时循环电压电流曲线图中的第一最大值电流（%）。

c：浓度5×10^-4摩尔/升。

N-（2-羟乙基）-N′-对亚硝基苯基-哌嗪和N，N-双-（2-羟乙基）-对亚硝基苯胺的循环电压电流曲线示于图7中。为了避免受残余葡萄糖反应干扰，用10毫摩尔/升葡萄糖测量循环电压电流曲线，同时记录该曲线。

实施例7：

本发明电子载体和现有技术的电子载体的比较

a）按照实施例1中所述的试验设计，使用浓度为10^-4摩尔/升在磷酸盐缓冲液（pH7.0）中的N-甲基-N′-（4-亚硝基苯基）-哌嗪。在葡萄糖浓度为0-3毫摩尔/升之间测量循环电压电流曲线，得到如图8所示的电流密度与葡萄糖浓度的关系曲线。在低浓度下可以看出，大气氧具有某种影响，通过在氩气下测量可以避免这一影响。以较高浓度（10^-2摩尔/升）使用电子载体时获得了与使用氩气作为保护气体相同的结果。使用葡萄糖脱氢酶代替葡萄糖氧化酶也可以避免氧对测量的影响。

b）当按现有技术使用四硫富瓦烯作为电子载体而不是按本发明用N-甲基-N′-（4-亚硝基苯基）-哌嗪作电子载体时，电流密度与葡萄糖浓度的关系如图9所示。四硫富瓦烯显示出受氧的干扰程度明显高于用本发明电子载体的情况。另外还有测得低得多的电流浓度。

四硫富瓦烯溶解度很低。为了获得在磷酸盐缓冲液（pH7.0）中浓度为10^-4摩尔/升，必须使用2.5%Tween20^R作为洗涤剂。由于缺乏溶解性因而不可能将四硫富瓦烯浓度明显地调整提高以减小氧的干扰，而这在本发明的电子载体情况下是可以办得到的。

实施例8：测定酶

a）乳酸脱氢酶检测

按照类似于实施例1的试验安排制备下列溶液：

0.1摩尔/升磷酸钠缓冲液，0.1摩尔/升氯化钾（pH9.0）

10毫摩尔/升N，N-双-（2-羟乙基）-对亚硝基苯胺

0.1摩尔/升D，L-乳酸盐（钠盐）

1U/ml由微生物制取的心肌黄酶

10毫摩尔/升NAD⁺。

在强力搅拌（磁搅拌器，1000转/分）的同时，在75mV对银/氯化银的恒定电位下测量电流。通过添加乳酸脱氢酶（EC1.1.1.27）开始这一过程。添加不同量的乳酸脱氢酶，在每种情况下在100、200、300、400、500和600秒后进行测量。获得的电流/时间曲线如图10所示。纵坐标的LDH活性是按照通常的丙酮酸盐还原试验测定。

b）葡萄糖脱氢酶检测

与NAD相关的葡萄糖脱氢酶的检测可以类似地按a）中的描述在下述溶液中进行：0.1摩尔/升磷酸钾缓冲液、0.1摩尔/升氯化钾（pH7.0）带有10毫摩尔/升NAD⁺、10毫摩尔/升本发明电子载体、1U/ml，心肌黄酶和0.1摩尔/升葡萄糖。

可以相应地测定氧化酶、心肌黄酶或不依赖于NAD的脱氢酶。

实施例9：用于测定葡萄糖的一次性电极***

采用网板印刷法使用适当的印染浆将工作电极（5）、参比电极（6）、反电极（7）和引线（55，66，77）安装在聚碳酸酯箔（8）上，制成图4所示的敏感电极***。引线由商品石墨印染浆（Acheson 421SS，Deutsche Acheson Coltoids，Ulm，German Federal Republic）构成。参比电极（6）和反电极（7）由混合有20%（重量）粉末氯化银的商品银导电糊构成（Acheson SS 24566，Deutsche Acheson Coltoids Ulm，German Federal Republic）。

对于工作电极（5），将3毫摩尔/升N，N-双-羟乙基-对亚硝基苯胺、每100g混合物500KU葡萄糖氧化酶（葡萄糖氧化酶，纯度等级Ⅱ，Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，German FederalRepublic）、30%（重量）石墨粉（UF296/97，Graphitwerke Kropfmuhl，German Federal Republic）和4%（重量）1，2-亚乙基二醇均匀分布于2%（重量）的羟乙基纤维素在0.05摩尔/升磷酸钠缓冲液（pH7.0）中的溶胀混合物中（Natrosol 250G，Hercules BV，Rijswijk，Netherlands）。这些电极的面积是：

工作电极（5）：4×6mm²＝24mm²，

参比电极（6）：1×1.5mm²＝1.5mm²，

反电极（7）：1×1.5mm²＝1.5mm²。

将网板印刷制造的敏感电极***浸入测量溶液中，该溶液含0.05摩尔/升磷酸钠缓冲液（pH7.0）、0.1摩尔/升氯化钠和0-45毫摩尔/升葡萄糖，浸入的方式应使电极表面被要检测的液体所覆盖。图11所示的电流/时间曲线是对于集成的银/氯化银参比电极（6）在200mv电位下记录的。在10秒钟测量时间后，标绘电流值得到图12所示的校准曲线，该曲线表明电流与葡萄糖浓度的关系。

实施例10：制备2，2′-[（4-亚硝基芳基）亚氨基]双-乙醇

在一个带搅拌器、温度计和滴液漏斗的4升三颈烧瓶中，分批地将2摩尔N，N-双-（β羟乙基苯胺）（或其芳基取代的类似物）添加到200ml水和400ml浓盐酸的混合液中，同时强力地搅拌。用冷槽将所得溶液冷却到0℃，在0-2℃于20分钟内滴加148g（2.1摩尔）亚硝酸钠在200ml水中的溶液，同时进行搅拌。然后在0℃进一步搅拌30分钟，将大部分黄色到绿色的结晶亚硝基化合物吸出，用200ml冰冷却的、半浓缩的盐酸将滤饼洗涤二次。为了提纯，将粗制品溶解到900ml水中，添加400ml浓盐酸，同时用力搅拌，在室温下搅拌30分钟，然后在冰冷却的同时再搅拌30 分钟。随后将获得的晶体溶解到580ml水中，添加265ml浓盐酸，在室温下搅拌30分钟，再在冰上冷却的同时搅拌30分钟。吸出所形成的晶体，每次用150ml冰冷丙酮冲洗三次，再每次用200ml二***冲洗二次，在室温下于真空中干燥。用这种方法可获得下列化合物：

a）2，2′-[（4-亚硝基苯基）亚氨基]双-乙醇-氢氯化物。

理论产率的32.8%，绿色晶体;熔点160℃（分解）。使用相应的芳基取代的类似物可类似地获得下列化合物：

b）2，2′-[（3-氟-4-亚硝基苯基）亚氨基]双-乙醇-氢氯化物

理论产率的26.5%，黄色晶体;闪点140℃（分解）。TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶乙酸醇乙酯/甲醇＝5∶1，R_f＝0.59。

由3-氟-N，N-双-[2-羟乙基]苯胺（Chem.Abstr.57，13922[1962]）制备。

c）2，2′-[（3-氯-4-亚硝基苯基）亚氨基]双-乙醇-氢氯化物

理论产率的21%，黄色晶体;熔点154℃（分解）。TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶二氯甲烷/甲醇＝5∶1，R_f＝0.72。

由3-氯-N，N-双-[2-羟乙基]苯胺（M.Freifelder，G.R.Stone，J.Org.Chem.26，1499（1961））制备。

d）2，2′-[（3-甲氧基-4-亚硝基苯基）亚氨基]双-乙醇-氢氯化物。

理论产率的32%，赭色晶体;熔点145-146℃（分解）。TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶二氯甲烷/甲醇＝5∶1，R_f＝0.4。

由3-甲氧基-N，N-双[2-羟乙基]苯胺（M.Freifelder，etal.J.Org.Chem.26，1499（1961））制备。

e）2，2′-[（3-甲基巯基-4-亚硝基苯基）亚氨基]双-乙醇-氢氯化物。

理论产率的59.3%，红褐色晶体;熔点148℃（分解）。TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶乙酸乙酯/甲醇＝5∶1，R_f＝0.53。

由3-甲基巯基-N，N-双-[2-羟乙基]苯胺制备（可由下述方法获得：将0.1摩尔3-甲基巯基苯胺溶解到50ml4N乙酸和0.35摩尔环氧乙烷中，在室温下搅拌12小时。添加过量NaHCO₃溶液，用二氯甲烷萃取，用柱色谱法在硅胶60（Merck）上提纯一流动相∶甲苯/丙酮＝5∶2，R_f＝0.18，产率25%，无色油）。

f）2-[甲基（3-氯-4-亚硝基苯基）氨基]乙醇-氢氯化物。

理论产率的15%，黄色晶体;熔点147℃（分解）。TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1，R_f＝0.34。

由2-[甲基（3-氯苯基）氨基乙醇（可由下述方法获得：在10%NaOH存在下用甲基碘将2-[（3-氯苯基）氨基]乙醇沸煮3小时;用柱色谱法在硅胶60（Merck）上提纯-流动相∶甲苯/丙酮＝5∶2，R_f＝0.39，产率25%，无色油）制备。

实施例11：2-[（2-羟基乙氧基）-乙基-（4-亚硝基苯基）氨基]乙醇氢氯化物

A）2-[（2-羟基乙氧基）乙基-（苯基）氨基]乙醇

将146g（0.8摩尔）2-（2-苯胺基乙氧基）乙醇（利用苯胺与2.-（2-氯乙氧基）乙醇反应获得，产率54%，无色油，沸点131-133℃）溶解到500ml4N乙酸中，用冷槽冷却到0℃，同时进行搅拌，在0-10℃下于5分钟内滴加70.5g即约79ml（1.6摩尔）环氧乙烷。在室温下将其静置12小时后，添加500ml水，在搅拌的同时进行中和，一小部分一小部分地小心地添加总量200g的NaHCO₃，然后用500ml二氯甲烷萃取释出的碱，每次用250ml二氯甲烷再摇动三次，合并有机相，用硫酸钠干燥，吸出并在真空中浓缩。获得178.2g产物。TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶甲苯/丙酮＝5∶2，R_f＝0.18。

B）2-[2-羟基乙氧基）-乙基-（4-亚硝基苯基）氨基]乙醇氢氯化物

将280ml浓盐酸和140ml水的混合液注入一个2升的带搅拌器、滴液漏斗和温度计的三颈烧瓶中，用干冰冷槽冷却到-5℃，在恒温下于10分钟内滴加178g（0.79摩尔）上述A）中获得的物质，再搅拌15分钟。在0℃添加60g（0.87摩尔）亚硝酸钠在120ml水中的溶液，由此，溶液变成血红色到褐色，在0℃再搅拌30分钟。随后添加500ml水稀释（反应混合物pH值为1.4），在最高15℃冰冷的同时滴加218ml浓氨水溶液直到pH9。用400ml正丁醇萃取释出的亚硝基碱5次，在旋转式汽化器中蒸出溶剂。获得212.8g深绿色油。为了除去无机产物，将其与250ml的甲苯/丙酮＝1∶1的混合液混合，吸出不溶解的部分并用50ml甲苯/丙酮＝1∶1洗涤。剩下18.4g无机物质残余物。将滤液在硅胶60柱（直径7.5cm，填充平面90cm，分离液体甲苯/丙酮＝1∶1）上用色谱法提纯。获得155g亚硝基碱（深绿色油）。将其溶解在600ml丙酮中，并同滴入的250ml饱和盐酸醚液反应。在冰冷却的同时搅拌30分钟，然后将所形成的晶体吸出，用100ml丙酮洗涤三次，在室温下于真空中用五氧化二磷干燥。获得159.9g（＝理论产率69.6%）的标题化合物;熔点118℃，TLC：硅胶60（Merck）一流动相∶甲苯/丙酮＝1∶1，R_f＝0.24。

实施例12

用类似于实施例11的方法制备下列化合物：

a）1-[N，N-（2-羟乙基）-（4-亚硝基苯胺基）]-3-（2-羟基乙氧基）-2-丙醇氢氯化物

理论产率的10.5%，橙黄色晶体;熔点104℃（分解）。TLC-硅胶60（Merck）-流动相∶甲苯/甲醇＝5∶1，R_f＝0.13。

由1-[N，N-（2-羟乙基）苯胺基）]-3-（2-羟基乙氧基）-2-丙醇

（它由1-[N-（苯胺基）]-3-（2-羟基乙氧基）-2-丙醇制备

它由苯胺和1-氯-3-（2-羟基乙氧基）-2-丙醇获得-产率：21.5%，无色油，TLC：硅胶60（Merck）-流动相：甲苯/丙酮＝5∶2，R_f＝0。

6）在4N乙酸存在下与环氧乙烷反应而制备。产率71%，无色油，TLC：硅胶60（Merck）-流动相：甲苯/丙酮＝5∶2，R_f＝0.43。

b）1-[N-（2-羟乙基）-（4-亚硝基苯胺基）]-3-甲氧基-2-丙醇氢氯化物

产率：44.5%，浅黄色晶体，熔点122℃（分解）。TLC：硅胶60（Merck）-流动相二氯甲烷/甲醇＝49∶1，R_f＝0.55。

由（±）-3-（N-（2-羟乙基）苯胺基]-1-甲氧基-2-丙醇（Deutsches Reichspatent 603808（1933）-Friedlander 21，295），（沸点₁₁212-214℃）制备

c）2-[（2-甲氧基乙氧基）乙基-（4-亚硝基苯基）氨基]乙醇

理论产率的25%，深褐色树脂。TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1，R_f＝0.49;二氯甲烷/甲醇＝5∶1，R_f＝0.77（经过非晶形收湿的氢氯化物和NH₃）;

由2-[（2-甲氧基乙氧基）乙基-（苯基）-氨基]乙醇

（A）制备

它由苯胺和2-甲氧基乙氧基-氯乙烷获得（加热到90℃1小时，在硅胶60（Merck）上用甲苯/乙酸乙酯＝5∶1进行柱色谱分离。这样形成的N-（2-甲氧基乙氧基-乙基）苯胺（R_f＝0.69，无色油状）

与环氧乙烷和4N乙酸一起结果产生（A）。无色油，TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶甲苯/丙酮＝5∶1，R_f＝0.31，

d）2-[2-（2-（2-（2-甲氧基）乙氧基）乙氧基）乙基）-4-（亚硝基-苯基）氨基]乙醇

理论产率的63%，绿色油，TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶甲苯/丙酮＝1∶5，R_f＝0.64

由2-[2-（2-（2-2甲氧基）乙氧基）乙氧基）乙基）-4-（苯基）氨基]乙醇制备

起始化合物按下述方法制备：

理论产率的20.5%的黄色油，R₈＝0.5

由苯胺和二乙基甘醇-双-（2-氯乙基醚）（Perry.Hibbert Can.J.Res.1481（1936）通过加热到140℃4小时，随后在硅胶60（Merck）上用甲苯/乙酸乙酯＝2∶1进行柱色谱分离而获得。

它同环氧乙烷在4N乙酸中反应几乎定量地得到

米黄色油，TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1，R_f＝0.61。

使用在甲醇中的NaOCH₃（在回流下加热24小时，蒸发，加水，溶解到乙酸乙酯中，随后将粗制品在硅胶60（Merck）上用甲苯/丙酮＝5∶2进行柱色谱提纯），获得理论产率51.3%的产物，无色油，R_f＝0.21。

实施例13

N-（4-亚硝基苯基）-N-[（2-二乙氨基）-乙基]-N，N′-二乙基-1，2-乙烷-二胺-三氢氯化物

熔点125℃（分解），TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶异丙醇/乙醇正丁酯/水/浓NH₃水＝50∶30∶15∶5，R_f＝0.56。

由N-[二-（2-二乙氨基）乙基]苯胺制备。

实施例14

制备1-N-取代的4-（4-亚硝基苯基）-哌嗪

a）1-甲基-4-（4-亚硝基苯基）-哌嗪-二氢氯化物

由0.3摩尔1-苯基哌嗪通过与0.2摩尔磷酸三甲酯一起加热到150℃4小时、添加NaOH离析并且二***萃取以及在硅胶60（Merck）上用二氯甲烷/甲醇＝5∶1进行柱色谱提纯（根据Stewart et al，J.Org.Chem.13，134（1948）），，得到17.62g（0.1摩尔）1-甲基-4-苯基-哌嗪（40.1%的理论产率，沸点_0.0582-84℃，R_f＝0.31），无色液体。将其溶解到20ml浓盐酸和10ml水的混合液中，然后在0-2℃下于15分钟内滴加8g（0.12摩尔）亚硝酸钠在16ml水中的溶液，在10℃下搅拌30分钟。在同一温度下添加60ml浓氨水，同时进一步冷却，添加100ml水加以稀释，每次用100ml二氯甲烷靠摇动将红褐色溶液（pH9）萃取三次，用Na₂SO₄干燥有机相，将其吸出并蒸发。将残余物（20.6g苔藓绿晶体）溶解到40ml甲醇中，同20ml饱和盐酸醚液反应，同时冷却。在吸出及用20ml***洗涤二次后，获得15.8g（56.8%理论产率）的苔藓绿标题化合物晶体，熔点187-189℃（分解），TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶二氯甲烷/甲醇＝5∶1，R_f＝0.72。类似地制备下列化合物：

b）4-（4-亚硝基苯基）-1-哌嗪-乙醇-二氢氯化物

由2-（4-苯基-哌嗪基）-乙醇制备（Kremer，J.Amer.Chem.Soc58，379（1963）），浅灰色晶体;从甲醇/水＝7∶1再结晶提纯，熔点170-173℃（分解），TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶二氯甲烷/甲醇＝5∶1，R_f＝0.67。

c）3-[4-（4-亚硝基苯基）-1-哌嗪基]-1，2丙二醇-二氢氯化物

由1-苯基-4-（2，3-二羟基丙基）-哌嗪制备（H.Howell等人，J.Org.Chem.27，1711（1962）），呈绿色晶体，熔点163℃（分解）-TLC：硅胶60（Merck），流动相∶乙酸乙酯/甲醇＝2∶1，R_f＝0.41

d）4-（4-亚硝基苯基）-α-（甲氧基甲基）-哌嗪-1-乙醇-二氢氯化物

由1-苯基-4-（2-羟基-3-甲氧基丙基）-哌嗪制备（H.Howell等人，J.Org.Chem.27，1711（1962）），呈黄色晶体，熔点162℃（分解）-TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1，R_f＝0.51

e）2-[2-（4-（4-亚硝基苯基）-1-哌嗪基）乙氧基]-乙醇-二氢氯化物

由2-[2-（4-（苯基）-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇制备（由2摩尔1-苯基哌嗪和1-[2-氯乙氧基]-2-甲氧基乙烷获得（后者根据美国专利2，837，574）），呈绿色晶体，熔点134℃（分解）-TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶乙酸乙酯/甲醇＝5∶1，R_f＝0.31。

f）1-（1，4-二噁烷基某基）甲基-4-（4-亚硝基苯基）-哌嗪-二氢氯化物

由1-（1，4-二噁烷基某基）甲基-4-（苯基）-哌嗪制备（该化合物由1-氯-3-（β-羟基乙氧基）-2-丙醇（M.S.Kharash，W.Nudenberg，J.Org.Chem.8，189（1943）），同1-苯基哌嗪加热到130℃5小时、用乙酸乙酯萃取并蒸发，在硅胶60（Merck）上一流动相∶甲苯/丙酮＝5∶2，用柱色谱提纯来获得），黄绿色晶体，熔点1.66℃（分解），TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶甲苯/甲醇＝5∶1，R＝0.69。

实施例15

亚硝基杂环

a）5-亚硝基-1-二氢吲哚乙醇氢氯化物

这一亚硝基化合物由1-二氢吲哚乙醇制备（该化合物按下述方法得到：在1摩尔细粉K₂CO₃存在下在回流下将1摩尔二氢吲哚同1摩尔2-氯乙醇加热，得到理论产率的63.8%的无色油，沸点_0.1128-130℃，TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶甲苯/丙酮＝5∶2，R_f＝0.42，添加氨同二氯甲烷后以碱的形式被分离出。以盐酸醚液转变成氢氯化物。获得浅褐色晶体，熔点180℃，TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶二氯甲烷/甲醇＝5∶1，R_f＝0.51

b）1-甲基-6-亚硝基-1，2，3，4-四氢喹啉氢氯化物

制备标题化合物，原料为1-甲基-1，2，3，4-四氢喹啉（靠加热1，2，3，4-四氢喹啉和三甲基磷酸酯（根据Huisgen等人，Chem，Ber.92，203（1959）获得）用类似例10和11的普通方式制备粗制品，在硅胶60（Merck）上用异丙醇/乙酸正丁酯/水＝5∶3∶2提纯。添加盐酸醚液后将其溶解在丙酮中，获得标题化合物，熔点123-124℃（分解），TLC：硅胶60，流动相∶异丙醇/乙酸正丁酯/水＝5∶3∶2，R_f＝0.7。

c）6-亚硝基-3，4-二氢-1（2H）-喹啉-乙醇氢氯化物

由2-（3，4二氢-2H-喹啉-1-基）乙醇（Zaheer等人，Indian J.Chem，1，479（1963），沸点₅140-144℃）获得标题化合物。粗制品的提纯靠柱色谱法在硅胶60（Merck）上，流动相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1。从异丙醇和盐酸醚液沉淀出氢氯化物并从乙醇中再结晶获得标题化合物，10.5%的理论产率，赭色晶体，熔点193-195℃（分解），TLC：硅胶60（Merck）-流动相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1，R_f＝0.36。

表1

电子载体峰电位^a转换率^b

N-（2-羟乙基）-N′-对亚硝

基苯基哌嗪 340 97

N，N-双-（2-羟乙基）-对亚硝

基苯胺 210 94

邻甲氧基-[N，N-双-（2-羟乙基）]

-对亚硝基苯胺 170 35

对亚硝基苯酚 220 62

对醌二肟^c250 35

N，N-二甲基-4-亚硝基-1-萘胺 175 25

N，N，3-三甲基-4-亚硝基苯胺 220 56

N-（2-羟乙基）-5-亚硝基二氢吲哚 80 86

N，N-双-（2-羟乙基）-3-氯-4-

亚硝基苯胺 315 72

2，4-二甲氧基-亚硝基苯 130 95

N，N-双-（2-甲氧基乙基）-4-亚硝

基苯胺 245 68

3-甲氧基-4-亚硝基苯酚 140 30

N-（2-羟乙基）-6-亚硝基-1，2，3

4-四氢喹啉 95 82

N，N-二甲基-3-氯-4-亚硝基

苯胺 275 27

N，N-双-（2-羟乙基）-3-氟-4

亚硝基苯胺 260 74

N，N-双-（2-羟乙基）-3-甲硫基-

4-亚硝基苯胺 195 21

N-（2-羟乙基-N-2-（2-甲氧基乙

氧基）-乙基）-4-亚硝基苯胺 210 59

N-（2-羟乙基）-N-（3-甲氧基-2-

羟基-1-丙基）-4-亚硝基苯胺 225 65

N-（2-羟乙基）-N-（3-（2-羟基乙

氧基-2-羟基-1-丙基）-4-亚

硝基苯胺 210 54

Claims

1、在氧化还原酶或其底物和一种可还原物质存在下电化学测定被分析物或氧化还原酶的方法，此方法包括如下步骤：

使含有所述被分析物或氧化还原酶的样品，与氧化还原酶(当测定被分析物时)或氧化还原酶底物(当测定氧化还原酶时)，和传送电子的可还原物质接触，此处传送的电子是所述氧化还原酶经氧化作用在一电极上产生的电子；

用所述氧化还原酶，氧化所述被分析物或被分析物经过预先反应而得到的化合物(当测定被分析物时)，或氧化所述酶底物(当测定氧化还原酶时)，以产生被还原的酶；

用所述的被还原酶对所述的可还原物质进行酶还原，产生被还原物质和所述的氧化还原酶；

在电极上氧化所述的被还原物质，从而传送所述氧化还原酶的氧化作用在所述电极上产生的电子或酶底物被氧化在电极上产生的电子；

其特征在于，所述被还原物质在电极上氧化形成的物质不同于一形始作用的可还原物质。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，开始时使用的可还原物质以及在电极上氧化形成的物质被氧化还原酶还原。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，作为可还原物质使用的化合物是这样的化合物，它接受在测量反应中产生的来自氧化还原酶的电子、形成一个富电子的芳香胺。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，作为可还原物质使用的化合物是通式Ⅰ的化合物组中的化合物和通式Ⅱ的化合物

式中

R表示富电子的芳族残基，

X表示NO或NHOH，

式中，Y表示由于还原而形成的芳族状态富电子的醌型***。

5、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于使用氧化酶、不依赖NAD（P）的脱氢酶或心肌黄酶作为氧化还原酶。

6、在氧化还原酶或其底物和一种可还原物质存在下，电化学测定液体样品中的被分析物或氧化还原酶的敏感电极***，包括至少两个导电装置，所述导电装置彼此隔离，其中至少一个导电装置与氧化还原酶（当测定被分析物时）或与氧化还原酶底物（当测定氧化还原酶时），和可在氧化还原酶和一个导电装置之间传送电子的可还原物质接触，其中，作为可还原物质使用的化合物在被氧化还原酶还原后再在导电装置上被氧化而生成一种物质，此物质不同于一开始时使用的可还原物质。

7、根据权利要求6所述的敏感电极***，其特征在于最开始时使用的可还原物质以及在导电装置上氧化形成的化合物被氧化还原酶还原。