CN102613082A - 促进铁皮石斛茎段增殖扩繁的改良培养基及增殖扩繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进铁皮石斛茎段增殖扩繁的改良培养基及增殖扩繁方法，该培养基包括MS基本培养基+蔗糖20g/l+琼脂6g/l+6-BA(苄氨基嘌呤)2mg/l+NAA(α-萘乙酸)0.2～0.5mg/l+香蕉泥15～20g/l+土豆泥15～20g/l，采用普通自来水代替蒸馏水配制定容。本发明选择有腋芽的铁皮石斛茎段采用改良MS培养基来增殖扩繁，石斛生物碱类成分、多糖含量显著提高，铁皮石斛的生长状况正常。本发明方法不但减少了蔗糖的使用量，而且直接用自来水代替蒸馏水，使得铁皮石斛的组织培养技术更加方便、高效的同时节约资源。

Description

促进铁皮石斛茎段增殖扩繁的改良培养基及增殖扩繁方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种促进铁皮石斛茎段增殖扩繁的改良培养基及利用该培养基进行增殖扩繁方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale)为多年生草本植物，属附生兰类，俗名铁皮枫斗，因其老茎外呈黑色，又名为黑节草，石斛是常用的名贵中药，应用历史悠久，在《神农本草经》中被列为上品，现已证实它具有滋阴清热、生津益胃、止咳润肺、润喉明目、提高人体免疫功能、防治肿瘤和心血管疾病以及改善睡眠、防治白内障、延年益寿等功效。但由于生长环境特殊和分布局限，以及长期采挖，自然资源日趋枯竭，已被国家列为重点保护的野生药材。

铁皮石斛主要分布在亚热带地区，我国分布在西南和南方沿海各省，铁皮石斛种子极小，无胚乳，自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，很难用实生苗栽培，而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低，加上人为地过度采挖，已濒临灭绝，为了保持品种的优良性状，又能快速大量繁殖，通过茎尖组织培养技术产生原球茎，在原球茎阶段进行增殖培养，再使原球茎繁育成小植株，再通过不断地继代培养获得生产用苗，但是这样的过程至少得花费1年的时间才能通过炼苗直接栽种。为了提高生产效益，节约生产成本和生产时间，我们采用直接通过铁皮石斛茎段(选择有腋芽的茎段)的增殖扩繁来得到生产用苗，以茎段为外植体的繁育途径相对简单，从茎段→丛生芽→完整植株只需30～50天，叶浓绿，苗木生长健壮，不需经过壮苗可以直接用于生根。这样不但节约时间，而且炼苗后的栽培成活率更高，更适合大规模的工厂化生产。

由于铁皮石斛具有巨大的药用价值，导致了长期无节制的采摘，致使资源濒临枯竭。1987年国家已将铁皮石斛列为重点保护野生珍稀药材品种，国家第一批《中国珍稀濒危保护植物名录》也将其列入其中。为了更好地保护铁皮石斛野生资源，变野生为家种，应大力发展规模化人工栽培，切实保障铁皮石斛资源的可持续利用。从20世纪70年代起，国内外有关机构便开始了铁皮石斛的研发工作，尤其在铁皮石斛的组织培养技术领域，但是组织培养过程中培养基的配制需要大量蒸馏水和蔗糖，蒸馏水的配制和蔗糖的制取都需要专门的仪器并且耗电量很大，增加成本负担，造成了很大的浪费。

发明内容

针对现有技术上存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种更加节约、省时、方便的促进铁皮石斛茎段增殖扩繁的改良培养基及其增殖扩繁方法。本发明培养基减少材料浪费和时间消耗，更加环保，更加高效的组培生产，为大规模的组培生产提供有利条件。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种促进铁皮石斛茎段增殖扩繁的培养基，该培养基包括以下组分：MS基本培养基(又称MS培养基，市售常规)，蔗糖20g/l，琼脂6g/l，6-BA(苄氨基嘌呤)2mg/l，NAA(α-萘乙酸)0.2～0.5mg/l，香蕉泥15～20g/l，土豆泥15～20g/l；pH5.6～5.8，该培养基由自来水定容。

所述的土豆泥和香蕉泥均为新鲜土豆和新鲜香蕉捣碎成泥获得，更加天然，营养成分更加丰富，促进铁皮石斛茎段的增殖扩繁。

利用上述培养基进行铁皮石斛增殖扩繁的方法包括以下步骤：取有腋芽的铁皮石斛茎段，在上述培养基中，在培养温度23～27℃、光照度1500～2000lx、光照时间12h/d条件下培养30～50天，优选培养30～35天。茎段选择有腋芽的茎段，这样可以使得诱导率达到95％以上。

铁皮石斛组织培养过程中培养基的配制非常重要，培养基不但要求在无菌条件下，最重要的是要给铁皮石斛的生长提供所需的元素及适宜的生长环境。更重要的是培养基在满足植物生长的条件下，能够降低生产成本，更加环保，适应于生产需求。传统MS培养基的配制需要大量元素、微量元素、有机物、铁盐、蔗糖、琼脂和蒸馏水。而蒸馏水的制取需要专业的设备，不但耗电，而且要浪费更多的专业设备、电资源和时间才能得到蒸馏水。本发明培养基用普通的自来水代替了需要专业设备制备的蒸馏水，不但对铁皮石斛茎段增殖扩繁没有任何影响，而且大大的降低生产成本，节约生产时间，达到了中药材生产过程中高效、安全、可控的要求。而且，本发明采用促进铁皮石斛茎段增殖扩繁的改良培养基将蔗糖含量30g/l从降低到20g/l，在铁皮石斛茎段增殖扩繁的组培过程中，铁皮石斛生长并未变化，石斛多糖和生物碱的含量依然稳定。

与现有技术比较本发明的有益效果：本发明直接采用自来水配制的改良MS培养基代替蒸馏水配制的一般培养基，降低了蔗糖含量，选择适合的茎段在改良培养基中的增殖扩繁更加便于生产需要，在组培技术上成熟可行，经济上效益可观，利国利民，采用这项技术使得铁皮石斛的组织培养技术更加方便、高效的同时节约资源。

附图说明

图1为采用自来水配制的改良MS培养基和蒸馏水配制的MS培养基的铁皮石斛茎段增殖扩繁比较图。

其中，右瓶为本发明采用自来水配制的改良MS培养基的铁皮石斛茎段增殖扩繁，左瓶为采用蒸馏水配制的MS培养基的铁皮石斛茎段增殖扩繁。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1在无菌条件下取长有3～4节茎段的长度为1.5～2cm的有腋芽的铁皮石斛茎段作为外植体(来源于铁皮石斛的无菌苗)，将配制好的改良培养基(pH5.8)进行高温灭菌后，将该铁皮石斛茎段在自来水配制的改良培养基中，在温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d的条件下培养30天，测定并记录普通自来水配制的改良培养基中铁皮石斛多糖含量，培养30天后进行下一次继代培养后进行炼苗移栽。

自来水配制的改良培养基组分(自来水定容至1L)：

组成成分	数量(mg/l)	组成成分	数量(mg/l)
				硝酸铵	1650	钼酸钠	0.25
硝酸钾	1900	硫酸铜	0.025
				氯化钙	440	氯化钴	0.025
硫酸镁	370	硫酸铁	27.8
				磷酸二氢钾	170	琼脂	6000
碘化钾	0.83	蔗糖	20000
				硼酸	5.2	6-BA(苄氨基嘌呤)	2
硫酸镁	22.3	NAA(α-萘乙酸)	0.5
				硫酸锌	3.6	香蕉泥	20000
		土豆泥	20000

实施例2在无菌条件下取长有3～4节茎段的长度为1.5～2cm的有腋芽的铁皮石斛茎段作为外植体(来源于铁皮石斛的无菌苗)，将配制好的改良培养基(pH5.6)进行高温灭菌后，将该铁皮石斛茎段在自来水配制的改良培养基中，在温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d的条件下培养35天，分别测定并记录普通自来水配制的改良培养基中铁皮石斛多糖含量，培养30天后进行下一次继代培养后进行炼苗移栽。

自来水配制的改良培养基组分(自来水定容至1L)：

实施例3将有腋芽的铁皮石斛茎段采用蒸馏水配制的培养基按照实施例1的方法进行组织培养，培养时间40～50天。

蒸馏水配制的MS培养基组分(蒸馏水定容至1L)：

铁皮石斛多糖的提取方法：取组织培养后的铁皮石斛茎段干燥样品，精密称定适量，经石油醚(60～90℃)回流脱脂1h，过滤，挥去溶剂，以80％乙醇回流提取1h，乘热过滤，将滤渣加水回流提取1h，乘热过滤，滤液浓缩，加入0.1％活性炭脱色，过滤，加入95％乙醇使溶液含醇80％，静置过夜，过滤，以无水乙醇，丙酮依次洗涤8次，所得多糖于60℃烘干备用。精密吸取0.5ml按标准曲线项下操作，求出各多糖液中葡萄糖浓度，按下式计算多糖含量：

多糖含量％＝Cs.D.f/W×1000

式中Cs为供试品溶液葡萄糖浓度(ug/ml)，D为供试品溶液的稀释因素，f为换算因素，W为供试品重量。

石斛多糖成分、生长发育状况比较结果见表1

表1实施例1-3培养物多糖含量和生长状况的比较表

实验结果表明：普通自来水配制的改良培养基和普通的蒸馏水培养基中的铁皮石斛的多糖含量有很大差距，这种差距主要来源于在铁皮石斛生长状况正常的条件下，蔗糖含量的降低和茎段增殖系数的增加能够更好的促进光合作用并且提高了植物的光合碳同化速率，使其石斛多糖含量增加。

实施例4测定并记录实施例1-3培养物中总生物碱含量。

铁皮石斛总生物碱的含量测定方法：将材料用蒸馏水洗净，置于烘箱中105℃，杀青30min，60℃过夜，烘干至恒重。用研钵研磨(过60目筛)备用。称取经干燥粉碎的样品0.400g于250ml磨口三角烧瓶中，用适量浓氨水润湿，密塞30min，加氯仿10.0ml，称重，置水浴中加热回流2h，冷却后补充氯仿至原重。过滤，取续滤液2.0ml，加氯仿，摇匀，即为待测液。吸取上述待测液于分液漏斗中，用氯仿稀释至10.0ml，加入pH4.6的缓冲液5.0ml，再加1.0ml0.04％的嗅甲酚绿，剧烈振摇，静置。过滤，取续滤液6.0ml，加0.01molL^-1，NaoH溶液，摇匀。另取10.0ml氯仿作同上平行操作，作为空白对照。在630nm波长处测吸光度。实验重复测定3次。

样品中的生物碱含量：生物碱含量(％)＝C×D/W×10^-6×100％

式中C为根据标准曲线计算得到的样品生物碱浓度(ug/ml)；D为样品溶液的稀释倍数；W为样品的重量(g)。

色谱峰相对积分面积和总生物碱含量比较结果见表2

表2实施例1-3培养物总生物碱含量的比较表

实验结果表明：采用普通自来水改良培养基和蒸馏水培养基组织培养后的培养物总生物碱含量有很大的差别。这与铁皮石斛的生长条件有关，低浓度的蔗糖含量更适宜于铁皮石斛的光合作用并且提高了植物的光合碳同化速率，使其石斛多糖含量增加，而改良培养基更有利于植物总生物碱的积累是因为铁皮石斛茎段本身的总生物碱量就大于其它部位，而普通自来水相对于蒸馏水来说可以提供更多的矿质元素，使得铁皮石斛的总生物碱量含量增加。

实施例5实施例1-3培养物茎段增殖扩繁系数的比较。

经比较，在增殖培养基中添加适量的土豆泥和香蕉泥的效果很好，使得增殖系数高，无菌苗生长正常，不出现茎粗短、玻化、黄化及水渍状等情况，茎节间长而粗壮。

铁皮石斛茎段在自来水配制的改良培养基和蒸馏水配制的一般培养基中增殖扩繁系数的比较结果见表3

表3实施例1-3培养物茎段增殖扩繁系数的比较表

结果表明：茎段在普通自来水改良培养基中生长更快，增殖系数更高，更有利用根的生长和形成，这样铁皮石斛能通过茎段上长出的根来吸收更多的养分，从而积累更多的多糖，同时可以通过提高增殖扩繁技术来缩短生产时间，提高生产效率。

Claims (4)

1.一种促进铁皮石斛茎段增殖扩繁的改良培养基，其特征在于该培养基的组成为：MS基本培养基，蔗糖20g/l，琼脂6g/l，苄氨基嘌呤2mg/l，α-萘乙酸0.2～0.5mg/l，香蕉泥15～20g/l，土豆泥15～20g/l；pH5.6～5.8，该培养基由自来水定容。

2.根据权利要求1所述的促进铁皮石斛茎段增殖扩繁的改良培养基，其特征在于所述的香蕉泥和土豆泥分别为新鲜土豆和新鲜香蕉捣碎成泥。

3.一种利用权利要求1所述的培养基进行铁皮石斛增殖扩繁的方法，其特征在于取有腋芽的铁皮石斛茎段，在权利要求1所述的培养基中，在培养温度23～27℃、光照度1500～2000lx、光照时间12h/d条件下培养30～50天。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的培养时间为30～35天。

Images