CN102608178A - 采用电化学生物传感器测定牛乳中乳糖含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用电化学生物传感器测定牛乳中乳糖含量的方法，包括以下步骤：(1)按照酶的固定方法处理铂电极和玻碳电极；(2)配制空白溶液；(3)打开微电流测定仪，预热10min；(4)根据空白溶液调整微电流测定仪零点；(5)待微电流测定仪调零后打开样品杯盖，把待测溶液加入样品杯中；(2)加入待测溶液后电流即发生变化，盖上样品杯盖，待电流稳定时止；(3)读出微电流的值x，带入标准曲线y＝15.153x+1.5131，乳糖含量为y，电流值为x，绘制标准曲线；即可得到乳糖的含量。建立了快捷有效的电化学生物传感器测定牛乳中乳糖的方法，达到鉴别牛乳中是否掺假或掺杂，同时可进行多个样品测定。
Description
技术领域
本发明涉及乳品质量检测技术领域，尤其涉及的是一种采用电化学生物传感器测定牛乳中乳糖含量的方法。
背景技术
我国目前的乳业与乳制品加工业的产品质量和卫生状况不容乐观。乳中掺假、疫情控制、卫生管理等方面存在的诸多问题，使乳类食品安全性存在重大隐患。由于缺乏有效的控制和检测技术，乳制品质量安全事件屡屡发生，空壳奶粉、回收奶、形形色色的乳制品掺假事件的发生，严重损害了消费者对于乳制品安全的信任，大大的削弱了市场需求。因此，为了保证乳制品的质量，出现了各种各样的检测方法。
目前我国检测乳制品中乳糖的标准方法有GB/T5413.5-2010《婴幼儿配方食品和乳粉乳糖、蔗糖和总糖的测定》以及SN/T 0871-2000《进出口乳及乳制品中乳糖的测定方法》。GB/T 5413.5-2010方法中规定了两种针对乳糖的测定方法：高压液相色谱法和莱因-埃农氏法，SN/T 0871-2000采用分光光度法直接测定乳粉中乳糖的含量。莱因-埃农氏法与分光光度法，一次只能测定小批量的样品，不适合多个样品的测定。高效液相色谱法也只能检测出牛奶中是否掺假或掺杂，如果想要确定掺假、掺杂物质，还是需要联用质谱或者是用试剂盒等化学方法来确定具体掺假、掺杂物质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种采用电化学生物传感器测定牛乳中乳糖含量的方法。
本发明的技术方案如下：
一种采用电化学生物传感器测定牛乳中乳糖含量的方法，包括以下步骤：(1)按照酶的固定方法处理铂电极和玻碳电极；
(2)把空白溶液配好，放置到样品杯中；
(3)打开微电流测定仪，预热10min；
(4)根据空白溶液调整微电流测定仪零点；
(5)待微电流测定仪调零后打开样品杯盖，把待测溶液加入样品杯中，其液面高度不低于电极的裸露部分；
(6)加入待测溶液后电流即发生变化，盖上样品杯盖，待电流稳定时止；
(7)从微电流测定仪显示器中读出微电流的值x，带入标准曲线y＝15.153x+1.5131，乳糖含量为y，电流值为x，绘制标准曲线；即可得到乳糖的含量。
所述的方法，所述酶的固定方法为：将适量的混合液A沉积于玻碳电极的探头部位后将该电极置于戊二醛蒸汽中放置1h，使其与酶和壳聚糖形成网状物，之后，取等量的混合液B沉积于玻碳电极的探头部位并将传感器置于戊二醛蒸汽中放置1h，使其与酶和壳聚糖形成网状物；将适量的混合液A沉积于铂电极的探头部位并将其置于戊二醛蒸汽中放置1h，使其与酶和壳聚糖形成网状物；混合液A：取2.5μL的葡萄糖氧化酶GOD，2.5mgBSA和5μL甘油，40μL pH为7.5的磷酸盐缓冲液混匀；混合液B：取2.5μL的β-半乳糖苷酶，2.5mg壳聚糖和5μL甘油，40μL pH为7.5的磷酸盐缓冲液混匀。
在自然界里乳糖只在哺乳动物的奶液中存在，即乳糖是原料乳中的特有成分，只要乳源一定，乳糖的含量只在一定范围之内有微量的变化，加入掺假物后原料中乳糖的含量也会随之变化，通过测定原料乳中乳糖的含量，可以直接判断原料乳是否掺假。本发明对比目前原料牛乳中乳糖测定方法，首次推出一种电化学生物传感器在原料乳质量监测中最优测定条件以及方法的可靠性。
本发明的目的即采用电化学生物传感器测定牛乳中乳糖，将该方法应用于低乳糖牛乳生产过程中乳糖的测定，首次研究了电化学生物传感器的最优测定条件以及方法的可靠性，从而建立了快捷有效的电化学生物传感器测定牛乳中乳糖的方法，达到鉴别牛乳中是否掺假或掺杂，同时可进行多个样品测定。
附图说明
图1为实验装置示意图(1铂电极；2玻碳电极；3微电流测定仪)；
图2为标准曲线；
图3为恒电位仪电路原理图；
图4微电流测定仪电路原理图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
(1)酶的固定方法
在仪器中测定乳糖浓度变化是因为随着葡萄糖氧化酶(GOD)和β-半乳糖苷酶的活性来测定乳糖浓度的的双酶生物传感器，本仪器采用壳聚糖交联戊二醛来固定酶，具有均一稳定性，受外界影响因素小。
将适量的混合液A(混合液A：取2.5μL的葡萄糖氧化酶GOD，2.5mgBSA和5μL甘油，40μL pH为7.5的磷酸盐缓冲液混匀。)沉积(将玻碳电极浸泡在混合液A中30min即可)于玻碳电极的探头部位后将该电极(图1中两电极1为铂电极，电极2为玻碳电极)置于戊二醛蒸汽中放置1h，使其与酶和壳聚糖形成网状物。之后，取等量的混合液B(混合液B：取2.5μL的β-半乳糖苷酶，2.5mg壳聚糖和5μL甘油，40μL pH为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)混匀。)沉积(将玻碳电极浸泡在混合液B中30min即可)于玻碳电极的探头部位并将传感器置于戊二醛蒸汽中放置1h，使其与酶和壳聚糖形成网状物。为了排除葡萄糖的干扰，将适量的混合液A沉积(将铂电极浸泡在混合液A中30min即可)于铂电极的探头部位并将传感器置于戊二醛蒸汽中放置1h，使其与酶和壳聚糖形成网状物。
(2)突变电压的确定
取pH值为7.5的磷酸盐缓冲液置于电解池中，放入已固定好酶的玻碳电极及铂电极，接通电源，再取pH值为7.5磷酸盐缓冲液、乳糖标准液置于电解池中，放入已固定好酶的玻碳电极及铂电极，接通电源，调节电压为0.1-2.0V，待输出电流稳定后，记录对应的电流值，得出突变电压为1.2V。
(3)测定电流条件实验
在突变电压确定的情况下，选取反应温度、酶固定量、pH值3个因素进行单因素试验。单因素试验设计。根据单因素的水平条件，测定突变电压。并在在单因素试验结果基础上，设计正交试验。
根据单因素的水平条件，测定突变电压。并在在单因素试验结果基础上，设计正交试验，实验结果见表1。
表1正交试验设计方案及结果
表2直观分析
由表2可知，根据R值得出影响电流大小的因素依次是A＞B＞C，从主次顺序看A为主要因素，因为k2A＞k1A＞k3A，故取A的最优水平A1；类似的，取B、C的最有水平B2、C2，电流测定的最佳条件是：反应温度为55℃，酶固定量为0.4μL，pH值为6.5，最佳结果是3.976μA。
表3方差分析
| 方差来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F | 临界值 |
| A | 8.466 | 2 | 4.233 | 4233.000*** | F(0.10)＝9 |
| B | 0.001 | 2 | 0.0005 | 0.500 | F(0.05)＝19 |
| C | 0.017 | 2 | 0.0085 | 8.500 | F(0.01)＝99 |
| 误差 | 0.002 | 2 | 0.001 | ||
| 总和 | 8.486 | 8 |
由表3可知，因素A对于实验结果的影响是高度显著的，因素B、C对于实验结果的影响是不显著的。
(4)标准曲线的绘制
在突变电流及反应温度、酶固定量、pH值3个因素确定的情况下，分别取乳糖标准工作液加入到反应池中进行测定，待电流稳定后记录电流值，以不添加乳糖标准工作液的电流值做空白，以电流值为横坐标，乳糖含量为纵坐标绘制标准曲线(见图2)。在乳糖含量为0～50mg时，随着乳糖含量的不断上升，测得的相应的电流值会不断增大，且呈直线上升趋势。以乳糖含量为纵坐标y，电流值为横坐标x绘制标准曲线。其线性回归方程为y＝15.153x+1.5131，其线性相关系数R2＝0.9925，曲线的相关性很好，因此在实际测定过程中，只需要通过微电流测定仪仪(图4)读出电流数据，带入该标准曲线，即可得到乳糖的含量。
(5)精密度实验
用本实验方法测定乳糖含量的RSD值小于2％，说明方法精密度高，稳定性好，且相对误差小，可以用于实验的测定。
(6)重复性实验
用本实验方法测定乳糖含量的RSD值小于3％，说明方法稳定性好，且相对误差小，可以用于实验的测定。
(7)加标回收率
用本实验方法测定原料乳中乳糖含量的平均加标回收率为100.258％，RSD值为0.772％，重复性好。
(8)乳糖盲样的测定
用本方法测定盲样乳糖的含量，与实际模拟乳糖量相比较，最大绝对误差不超过2％。说明此方法与实际情况相符。
实施例2
操作方法：
整个实验过程在恒温下进行。
1.准备工作
(1)按照实施例1中所述酶的固定方法处理铂电极1和玻碳电极2。
(2)把空白溶液(例如，蒸馏水，或者其他任意物质溶液)配好，放置到样品杯中；样品杯外盖有两口，一个口***生物传感器的阳极(铂电极1)、一个口***生物传感器的阴极(玻碳电极2)，两电极分别与微电流测定仪正极(铂电极1接正极)、负极(玻碳电极2接负极)相连(图4所示J4)，空白溶液液面高度不低于电极的裸露部分不致影响观察和测定。
(3)打开微电流测定仪，预热10min，待微电流测定仪显示器(图4中数码管)数据稳定后方可使用，开始使用之后，两个电极的位置要保持不变；
(4)根据空白溶液调整微电流测定仪零点(ICL7135管脚17\18\19\20)，如不为零，校零或把误差值在测量过程中加减之。
2.测定工作
(1)待微电流测定仪调零后打开样品杯盖(不关闭电源，电源由图3所示恒电位仪提供)，把待测溶液加入样品杯中，其液面高度不低于电极的裸露部分不致影响观察和测定；
(2)加入待测溶液后电流即发生变化，盖上样品杯盖，待电流稳定时止；
(3)从微电流测定仪显示器中读出微电流的值，带入图2所示的标准曲线，即可得到乳糖的含量。
实施例3
参考图3，为本发明的恒电位仪电路图，用于为微电流测定仪提供电源。运放U1A、和U1B组成增益为100的差动输凡单端输出放大电路，该电路均采用宽带双路JFET运放LF353，取样电阻R及其他***电阻均为高精度(误差为±1％)金属膜电阻。
参考图4，为本发明的微电流测定仪电路原理图：ICI7135是4位双积分A/D转换芯片，可以转换输出±20000个数字量，有STB选通控制的BCD码输出，与微机接口十分方便，ICL7135具有精度高(相当于14位A/D转换)，价格低的优点。其转换速度与时钟频率相关，每个转换周期均有：自校准(调零)，正向积分(被测模拟电压积分)，反向积分(基准电压积分)和过零检测四个阶段组成，其中自校准时间为10001个脉冲，正向积分时间为10000个脉冲，反向积分直至电压到零为止(最大不超过20001个脉冲)。故设计者可以采用从正向积分开始计数脉冲个数，到反向积分为零时停止计数。将计数的脉冲个数减10000，即得到对应的模拟量。根据ICL7135的时序，当BUSY变高时开始正向积分，反向积分到零时BUSY变低，所以BUSY可以用于控制计数器的启动/停止。通过差分放大电路，可以精确采集到μA级甚至更小电流的变化。
Claims (2)
1.一种采用电化学生物传感器测定牛乳中乳糖含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)按照酶的固定方法处理铂电极和玻碳电极；
(2)把空白溶液配好，放置到样品杯中；
(3)打开微电流测定仪，预热10min；
(4)根据空白溶液调整微电流测定仪零点；
(5)待微电流测定仪调零后打开样品杯盖，把待测溶液加入样品杯中，其液面高度不低于电极的裸露部分；
(6)加入待测溶液后电流即发生变化，盖上样品杯盖，待电流稳定时止；
(7)从微电流测定仪显示器中读出微电流的值x，带入标准曲线y＝15.153x+1.5131，乳糖含量为y，电流值为x，绘制标准曲线；即可得到乳糖的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶的固定方法为：将适量的混合液A沉积于玻碳电极的探头部位后将该电极置于戊二醛蒸汽中放置1h，使其与酶和壳聚糖形成网状物，之后，取等量的混合液B沉积于玻碳电极的探头部位并将传感器置于戊二醛蒸汽中放置1h，使其与酶和壳聚糖形成网状物；将适量的混合液A沉积于铂电极的探头部位并将其置于戊二醛蒸汽中放置1h，使其与酶和壳聚糖形成网状物；混合液A：取2.5μL的葡萄糖氧化酶GOD，2.5mgBSA和5μL甘油，40μL pH为7.5的磷酸盐缓冲液混匀；混合液B：取2.5μL的β-半乳糖苷酶，2.5mg壳聚糖和5μL甘油，40μLpH为7.5的磷酸盐缓冲液混匀。
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