CN102604940B - 转基因玉米事件ie034外源***片段旁侧序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种转基因抗虫玉米事件IE034外源***片段旁侧序列及其应用。本发明提供的抗虫转基因玉米事件IE034经Southern blot鉴定有一个***位点，这个***位点的外源***片段的5’端旁侧序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供了用于检测该旁侧序列的引物，如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。本发明的转基因抗虫玉米IE034外源***片段旁侧序列的鉴定适用于对抗虫转基因玉米IE034(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。

Description

转基因玉米事件IE034外源***片段旁侧序列及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种转基因玉米IE034外源***片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物，本发明还涉及利用该引物进行转基因玉米检测的方法和试剂盒。

背景技术

虫害(尤其是玉米螟害)会造成玉米的严重减产，抗虫转基因玉米是世界上最早开展的研究性状之一。抗虫基因主要来源于苏云金芽孢杆菌的Bt杀虫蛋白，其作用机理是使昆虫胃肠产生穿孔，从而使昆虫代谢紊乱而死亡。美国孟山都公司是转基因抗虫玉米研发与应用的领跑者，其开发的抗虫转基因玉米MON810和MON863都已经进入商品化生产多年。在MON810转基因玉米中表达的Cry1Ab蛋白能有效防治玉米螟，在MON863中表达的Cry3Bb对危害玉米根部的害虫有很好的防治效果。先正达公司也开发了表达Cry1Ab蛋白的转基因抗虫玉米BT11和BT176。先锋公司和陶氏公司共同开发了含Cry34和Cry35的抗玉米根部害虫的转基因玉米。我国在上世纪90年代初期就开展了转基因抗虫玉米的研究工作，丁群星等(1993)首次报道了用子房注射法将Bt毒蛋白基因导入玉米；王国英等(1995)用玉米悬浮细胞、愈伤组织和幼胚作受体，通过基因枪轰击法成功地将Bt毒蛋白基因转入玉米细胞，并获得了大量转基因植株；周逢勇等(1998)将Bt杀虫蛋白导入玉米自交系P9-10，外源基因能稳定遗传到转基因植株后代。张艳贞等(2002)对根癌农杆菌介导法将Bt杀虫基因导入优良玉米自交系进行了较为***的研究。但相对于国外公司开发的抗虫玉米，我国科学家得到的抗虫玉米材料对玉米螟的抗性较低，需进一步得到大量转化体并从中筛选到抗性优良的事件。

抗虫转基因玉米的商业化种植增加了玉米产量，降低了杀虫剂等农药的使用，带来巨大的社会和经济效益。但是，抗虫玉米的长时间种植有可能使昆虫对玉米螟产生抗性。研究发现，种植Bt176玉米地里的玉米螟滞育和滞育后发育延长，这些将加快昆虫对Bt蛋白产生抗性(Christou等，2006)。延缓害虫对转Bt作物产生抗性的策略很多，比如高剂量/庇护所策略、新毒素策略、多基因策略等。最初高剂量/庇护所策略在农业生产中曾成功应用多年，但由于它需要大面积的庇护所，所以对于可用耕地相对匮乏的我国来说该策略还难以推广。因此寻找新型Bt基因对减缓害虫抗性产生具有重要意义。应对昆虫产生抗性好的策略是向玉米中导入不同类型的杀虫基因，或导入多个具有不同作用机制的同类基因。孟山都公司已经研制成功转基因抗虫玉米事件MON89034，在玉米中表达两个相互补充的蛋白Cry2Ab和Cry1A.105，用于防治鳞翅目害虫(James，2010)。孟山都公司和陶氏公司联合开发出的具有更广谱抗性转基因玉米SmartStaxTM含有防治鳞翅目害虫的Cry1F，Cry1a.105和Cry2Ab2基因，防治玉米根虫的Cry34Ab1，Cry35Ab1和Cry3Bb1基因(Gatehous等，2008)。

Cry1Ie是中国农业科学院植物保护研究所发现一新型的Bt基因，能表达一种新型的Bt蛋白。我国科学家的研究结果表明通过多代筛选获得的抗Cry1Ac蛋白的亚洲玉米螟系对Cry1Ah和Cry1Ab有低水平的交互抗性，而对Cry1Ie没有交互抗性(韩海亮等，2009)，在烟草中共表达人工改造的Cry1Ac和Cry1Ie基因对抗性棉铃虫有更好的杀虫活性(练云等，2008)。这些结果表明在转基因玉米中共表达Cry1Ac和Cry1Ie将有可能延缓玉米螟产生抗性。

我们将Cry1Ie基因通过农杆菌介导法转入到玉米基因组中，获得了一个抗虫转基因玉米事件IE034并在进行环境释放阶段的安全评价，今后有可能进入商业化种植。对转基因玉米进行转化事件特异性检测，能更好的对转基因玉米进行监督管理。而外源***片段的旁侧序列和依据此旁侧序列建立的检测方法，是进行监督管理的一个重要指标。因此需要获得转基因玉米IE034的旁侧序列，并建立鉴定体系以备对此事件的监督管理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因玉米事件IE034外源***片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物。

本发明另一目的在于提供一种转基因玉米的PCR检测方法和试剂盒。

本发明的抗虫转基因玉米事件IE034按如下方式获得：

根据玉米密码子偏好性原则设计Cry1Ie序列如SEQ ID NO.2所示，由上海生物工程有限公司合成，连接到载体pUC57上构建载体pUC57Ie。用PstI酶切质粒pAHC17，回收2.0kb ubiquitin启动子片段，并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。同时用SalI酶切质粒pUC57Ie，回收4.9kb片段并补平。两个片段进行连接，构建载体pUbi-cry1Ie，从而使ubiquitin启动子连到Cry1Ie基因前面。BamHI酶切载体pUbi-cry1Ie，回收6.9kb片段并补平，然后用HindIII部分酶切，回收4.2kb片段。同时，用BstEII酶切质粒p3301，回收11kb片段，并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。然后用HindIII酶切这11kb片段，回收9kb片段。将4.2kb片段和9kb片段进行连接，构建成农杆菌转化载体p3301UbiIe，其T-DNA结构图如图1所示。

将载体p3301UbiIe通过冻融法转入农杆菌EHA105中。剥取授粉12天大小为1-1.5mm左右的玉米自交系综31的幼胚，用农杆菌进行侵染。然后再共培养3天，恢复7天后分别用含1.5mg/L，3mg/Lbialaphos的培养基上筛选四轮。筛选得到的愈伤分化成苗，转入土中使转基因植株生长并进行授粉结实。对转基因植株进行PCR鉴定得到抗虫转基因玉米IE034。对转基因玉米进行温室及田间喷施草铵膦以选择阳性苗。

经Southern blot杂交实验及转基因后代基因分离鉴定实验，鉴定所得该转基因阳性植株IE034为一个拷贝。Southern blot杂交结果如图2。对转基因玉米进行温室及田间接玉米螟，表明获得的转基因玉米具有很好的玉米螟抗性。该抗虫转基因玉米事件IE034已于2011年12月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为玉米，Zea mays，保藏号为CGMCCNo.5578。

本发明提供了抗虫转基因玉米事件IE034(Zea mays)***位点的外源***片段的5’端旁侧序列，其具有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段。

本发明提供了SEQ ID NO.1所示的旁侧序列在检测转基因玉米中的应用。

特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，因此，应用旁侧序列可以特异地检测转基因事件。如用包含至少部分旁侧序列和至少部分外源***片段的探针进行杂交，或设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源***片段的引物，进行PCR扩增，检测特异条带等。可以根据在5’旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源***片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段；或可以根据外源***片段设计上游特异性引物，根据3’旁侧序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段。

本发明还提供了用于扩增SEQ ID NO.1所示序列的特异性引物。

在本发明的一个实施例中，提取抗虫转基因玉米IE034叶片基因组DNA，利用特异性引物和随机引物进行TAIL-PCR反应，获得外源基因在玉米基因组整合位点的左边界982bp长的序列，包括第1-776共776bp的玉米基因组序列和第777-982共206bp的载体序列，如SEQID No.1所示。分析外源片段整合位点的左边界序列，根据玉米基因组序列信息分别设计特异性上游引物IE034F：5’-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3’(SEQ ID No.4)，根据载体p3301UbiIe中T-DNA区5’端CaMV35S polyA序列设计下游鉴定引物IE034R：5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’(SEQ ID No.5)。通过普通PCR扩增可得到312bp特异性片段，包括第1-111共111bp的玉米基因组序列和第112-312共201bp的载体序列(SEQ ID No.3)。

本发明提供了上述引物在制备检测转基因玉米试剂盒中的应用。

本发明提供了一种检测转基因玉米事件IE034的方法，其是以样品总DNA为模板，利用本发明提供的引物进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。

上述检测转基因玉米事件IE034的方法，20μL PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μl的taq酶0.4μL，玉米总DNA模板1.0μL，10μmol/L上游引物0.4μL，10μmol/L下游引物0.4μL，ddH₂O15.4μL；

PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃7min。

PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳进行分离，EB染色后鉴定是否存在特异性条带。如存在特异性扩增产物312bp特异性片段，表明样品中含有IE034来源的成分。

本发明还提供了一种检测转基因玉米事件IE034的检测试剂盒，该试剂盒含有下列引物：

IE034F：5’-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3’，

IE034R：5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’。

本发明提供了上述引物或检测试剂盒在检测转基因玉米中的应用。

本发明通过TAIL-PCR扩增得到了抗虫转基因玉米事件IE034的5’旁侧序列，根据这两个旁侧序列的序列信息，设计两对新的PCR引物并建立针对IE03***的鉴定方法，通过普通PCR扩增得到了新的即包含载体片段又包含玉米基因组信息的序列。本发明提供的旁侧序列和引物适用于对转基因玉米IE034(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。

附图说明

图1是转化载体p3301UbiIe示意图。

图2是转基因玉米IE034基因组DNA Southern blot图片；1，非转基因玉米基因组DNA用EcoRI酶切；2，非转基因玉米基因组DNA用HindIII酶切；3，转基因玉米IE034基因组DNA用EcoRI酶切；4，转基因玉米IE034基因组DNA用HindIII酶切；5，质粒p3301UbiIe用HindIII酶切。

图3是IE034 T3代植株的PCR检测，其中M，DL2000 plus DNAmarker；1-18，转基因植株；19，水；20，非转基因植株；21，质粒p3301Ubile。

图4是转基因玉米IE034 T2代植株Western鉴定图，WT：非转基因玉米；1-3：转基因玉米。

图5是转基因玉米IE034 5’端旁侧序列TAIL-PCR扩增电泳图，M，DL2000 plus DNA marker；1-2，简并引物LAD1-1与35S-0第一轮TAIL-PCR扩增的产物做模板，用巢式引物AC与特异性引物35S-1进行第二轮Tail-PCR产物；1为非转基因玉米，2为转基因玉米。3-4，分别以泳道1和2对应的PCR产物做模板，用巢式引物AC与特异性引物35S-2进行第三轮Tail-PCR产物；3为非转基因玉米，4为转基因玉米。5，泳道为空白。6-7，简并引物LAD1-2与35S-0第一轮TAIL-PCR扩增的产物做模板，用巢式引物AC与特异性引物35S-1进行第二轮Tail-PCR产物；6为非转基因玉米，7为转基因玉米。8-9，分别以泳道6和7对应的PCR产物做模板，用巢式引物AC与特异性引物35S-2进行第三轮Tail-PCR产物，箭头所指为982bp的条带；8为非转基因玉米，9为转基因玉米。

图6是转基因玉米IE034后代植株定性PCR扩增图，M：DL2000 plusDNA marker；1，水；2，质粒p3301UbiIe；3，非转基因玉米综31(实验室保存)；4-5为IE034植株T1代亲本叶片基因组DNA；6，IE034植株亲本T2代叶片基因组DNA；7，IE034植株亲本T3代叶片基因组DNA；8，IE034植株亲本T2代种子DNA；9，IE034植株亲本T3代种子DNA；10，IE034植株杂种F1代基因组DNA。

图7是转基因玉米IE034 PCR检测的敏感性检测结构图，M，DL2000plus DNA marker；1，水；2，质粒p3301UbiIe；3，非转基因玉米综31；4，1μg IE034基因组DNA；5，50ng IE034基因组DNA；6，10ngIE034基因组DNA；7，1ng IE034基因组DNA；8，0.1ng IE034基因组DNA；9，0.01ng IE034基因组DNA。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1抗虫转基因玉米IE034的获得

1、转化载体p3301UbiIe的构建

根据玉米密码子偏好性原则设计Cry1Ie序列如SEQ ID NO.2所示，由上海生物工程有限公司合成，连接到载体pUC57上构建载体pUC57Ie。用PstI酶切质粒pAHC17，回收2.0kb ubiquitin启动子片段，并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。同时用SalI酶切质粒pUC57Ie，回收4.9kb片段并补平。两个片段进行连接，构建载体pUbi-cry1Ie，从而使ubiquitin启动子连到Cry1Ie基因前面。BamHI酶切载体pUbi-cry1Ie，回收6.9kb片段并补平，然后用HindIII部分酶切，回收4.2kb片段。同时，用BstE II酶切质粒p3301，回收11kb片段，并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。然后用HindIII酶切这11kb片段，回收9kb片段。将4.2kb片段和9kb片段进行连接，构建成农杆菌转化载体p3301UbiIe，其结构图如图1所示。

2、农杆菌转化玉米幼胚获得转基因植株

将载体p3301UbiIe通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米幼胚为材料，将幼胚放到D-inf溶液中一个小时后，用D-inf洗一次，再浸入添加100μM乙酰丁香酮的D-inf的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，放到D-AS培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。幼胚洗涤去菌后，放至含1.5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后转到含3mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养，每三周继代一次，筛选培养至两个月，有一些愈伤生长状态良好，为抗性愈伤。将以上实验选择到的抗性愈伤组织转到诱导胚状体培养基上，3周即可出现胚状体。再转入到分化培养基上进行分化，培养条件为28℃，每日3000Lux光强，光照16小时，很快就会有再生小苗出现。再生的小植株长到3片叶时，可将幼苗移植到罐头瓶中，并在室内培养。待小苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1∶3)的小花盆中。当玉米又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中，自交获得种子。

3、转基因植株的PCR鉴定

3.1植物总DNA的提取，采用CTAB法快速提取玉米叶片总DNA，具体步骤如下：

(1)取30-50ml离心管，加入7.5ml CTAB提取缓冲液(Tris100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，2％CTAB，0.1％巯基乙醇)，在60℃恒温水浴中预热30min；

(2)取适量玉米叶片置于2ml离心管中，在液氮速冻下利用2000GENO/GRINDER组织磨碎仪将叶片磨成粉末状；

(3)打开离心管，加入700μl CTAB提取缓冲液(Tris 100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，2％CTAB，0.1％巯基乙醇)。60℃水浴中保温30min，其间轻摇几次；

(4)取出离心管，每管中加入1ml饱和酚，摇动均匀后再加700μl氯仿/异戊醇(24∶1)轻微而彻底地混合，放置10min以上，待蛋白质变性后离心；室温下以12000r/min离心10min；

(5)将上清液转移到新的离心管中，加三分之二体积的异丙醇，混匀，使核酸沉淀成絮状，12000r/min离心5min，弃上清。

(6)在沉淀中加入1ml70％乙醇，用手指轻弹几下，放置20min以上；

(7)12000r/min离心2min，弃上清；

(8)在超净台上吹干沉淀，溶于适量无菌水(100-200μl)中。

(9)将提取的DNA于-20℃下冷藏备用。

3.2鉴定引物设计

根据Cry1Ie人工改造基因序列信息，设计扩增引物如下

上游引物5’-AACAGCCAGATCAGCACCTT-3’(SEQ ID No.6)

下游引物5’-CTGTACACCAGGGCCTTCAC-3’(SEQ ID No.7)

扩增片段长度为830bp。

3.3PCR扩增体系及反应程序

PCR反应体系：

PCR反应程序：

95℃               5分钟

72℃               7分钟

25℃               保温

以上述体系及程序进行PCR反应，获得转基因阳性植株，结果如图3所示。

4、转基因植株的Western杂交鉴定

4.1玉米叶片总蛋白的提取

1)称取少量叶片于研钵中，加入液氮充分研磨；

2)将粉末转入1.5ml的离心管，加入等体积的1×SDS样品Buffer[50mM Tris·HCl(pH6.8)，2％SDS，0.02％溴酚蓝，10％甘油，100mM DTT(现用现加)]，振荡；

3)将样品于100℃加热10min，立即置于冰上冷却至室温；

4)12000r/min，4℃离心10min；取上清，-20℃保存备用或直接进行SDS-PAGE电泳。

4.2Western杂交

1)根据凝胶大小，剪一张大小适中的NC膜和6张3M滤纸；

2)将凝胶、NC膜、滤纸在转移缓冲液中浸泡5min；

3)按说明安装好转移装置，赶尽凝胶、滤纸和NC膜之间的气泡，NC膜朝正极方向。

4)20V，室温转移45分钟；

5)转好的NC膜在ddH₂O中洗一下；

6)将NC膜正面朝上放入封闭液(TBST+5％脱脂牛奶)中，置摇床上轻轻摇动，于室温下封闭2-3小时；

7)将NC膜转到10ml的TBST溶液中，再加入20μl的一抗(1∶1000)，混匀，室温下轻摇1-2hr；

8)用TBST洗膜三次，每次10min；

9)加10ml TBST和二抗1.33μl(1∶7500)，混匀，室温轻摇1-2hr；

10)用TBST洗膜三次，每次10min；

11)加10ml辣根过氧化物酶反应缓冲液，混匀，轻轻晃动，显色5min；与X光片一起放到X光片夹中曝光5分钟；

12)X光片在显影液中显色5分钟，用水冲洗后放到定影液中定影。

以上方法对转基因植株进行Western杂交鉴定，结果如图4。

5、转基因植株的Southern blot鉴定

5.1玉米叶片总DNA的提取，采用CTAB法提取高纯度的DNA

1)取30-50ml离心管，加入7.5ml CTAB提取缓冲液(Tris 100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，2％CTAB，0.1％巯基乙醇)，在60℃恒温水浴中预热30min；

2)称取1.0g玉米叶片，在研钵中加液氮研磨成粉末状；

3)将叶片粉末小心刮入离心管的液体中，搅动混匀。在60℃水浴中保温30min，其间轻摇几次；

4)取出离心管，每管中加入1ml饱和酚，摇动均匀后再加入6.5ml氯仿/异戊醇(24∶1)轻微而彻底地混合，放置5min以上，待蛋白质变性后离心；室温下以3000-4000r/min离心10min；

5)将上清液转移到新的离心管中，加三分之二体积的异丙醇，混匀，使核酸沉淀成絮状。

6)将絮状沉淀转移到另一离心管中，加入5-10ml洗液，放置30min以上。

7)弃上清(或低速离心后弃上清)，让核酸沉淀在超静台上吹干或用真空泵抽干。

8)用0.5ml TE溶解沉淀后，转移到1.5ml离心管中，用酚/氯仿(1∶1)和氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次。每次在加入变性液(苯酚等)后要柔和而彻底地混合，放置10min以上后，用12000r/min离心10min，吸出上清。操作时要特别小心，以防吸上蛋白质沉淀；

9)加入RNaseA至终浓度10μg/ml，37℃保温1h；

10)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提一次，吸出上清；

11)在上清中加入7.5mol/L乙酸铵至终浓度2.5mol/L，然后加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，低温下放置10min以上，12000r/min离心10min，弃上清；

12)在沉淀中加入1ml70％乙醇，用手指轻弹几下，放置20min以上；

13)12000r/min离心10min，弃上清；

14)在超净台上吹干沉淀，溶于适量TE或无菌水(50-100μl)中。

15)取2μl DNA溶液，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量，并对照分子量Marker估测DNA含量。

将提取的DNA于-20℃下冷藏备用。

5.2基因组酶切

将基因组DNA用紫外分光光度计进行定量后，每个样品取80μg进行酶切。

1)EcoRI酶切反应体系：

2)HindIII酶切反应体系：

37℃反应12-16h；然后取5μL进行电泳，电泳缓冲液为1×TAE，EB染色，凝胶成像仪照相，检测酶切是否充分及各样品间亮度是否一致，检测通过后，浓缩酶切产物。

5.3基因探针的标记

将基因片段回收后，用分光光度计进行定量，取1μg回收DNA，定容到16μL，沸水浴煮10min，快速放到冰中，然后快速离心10秒，再放回冰浴中10min，然后加入4μL 5×标记反应液，混匀，37℃反应20h。标记结束后，沸水浴10min，冰上速冻，然后放入-20℃冰箱备用。

5.4酶切产物的电泳

取1μL DNA ladder稀释到20μL，然后加入4μL 6×loadingbuffer混匀后上样，酶切好的样品也依次上样，上样结束后让样品充分沉降3min，然后开始电泳，30V，7h。

5.5转膜

1)电泳结束后，将胶小心从电泳槽中取出，用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪，然后将胶放入0.25N HCl中脱嘌呤10min，

2)将胶从HCl溶液中取出，用ddH₂O涮洗两次，然后放入碱变性液(0.5mol/L NaOH)中处理45min可以延长至90min，然后浸到10×SSC中备用。

3)按照胶的大小剪出一张Hybond N+尼龙膜，先用ddH₂O充分浸润约10min，再浸泡到10×SSC中，10min以上。

4)将真空转印仪充分洗涤，往多孔载板上泼倒10×SSC，然后将尼龙膜铺到载板中央位置，此步骤应检查尼龙膜与多孔载板间是否存在气泡，如有应小心排除。

5)将带窗口硬塑料纸铺到载板上，使窗口的位置正好与下方尼龙膜的位置一致。

6)往尼龙膜上泼倒10×SSC，然后将胶用手掌小心托起，缓慢移放至完全尼龙膜窗口完全盖住，此步中胶比较脆弱，应小心用力操作。

7)将带窗口硬塑料纸与多孔载板卡紧，往胶上泼倒10×SSC至没过胶，在到10×SSC时，另一只手应轻按胶块以防胶块发生移动。

8)打开真空泵，将真空度调至5inch，转膜70min或者是：一开始2inch一小时后调整至3inch，一小时后调整至55inch 30min。期间按需要补加10×SSC

9)转膜结束后，将尼龙膜浸到2×SSC中轻轻涮洗两次。

10)将湿膜放到紫外交联仪中交联50s，紫外交联仪应是Energy 1500降至600的时间。取出后用干净滤纸包裹备用，如不用可置于4℃保持，建议不要超出一周。

5.6预杂交和杂交

1)预杂交：将试剂盒中的预杂交液65℃水浴化开，取10mL加入到杂交管中，对尼龙膜进行预杂交，42℃，90min；

2)配制杂交液：取1.6μL标记反应液(200ng探针)，加入到8mL新预杂交液中，用0.45uM或0.22uM滤膜过滤备用；

3)弃预杂交液，将过滤好的杂交液加入杂交管中，42℃，20h。

5.7洗涤尼龙膜

1)杂交结束后，将杂交液倒出，-20℃冻存。往杂交管中加入50mL2×SSC/0.1％SDS，室温洗涤30min，重复一次；

2)往杂交管中加入66℃预热的50mL 0.5×SSC/0.1％SDS，66℃洗涤60min，重复一次。

5.8尼龙膜的封闭及与抗体反应

1)洗涤结束后，将尼龙膜小心从杂交管中取出，放入盛有wash buffer(马来酸buffer/0.3％Tween20)的大培养皿中，浸泡5min；

2)将尼龙膜放回杂交管中，加入100mL blocking buffer，室温，1h；

3)配制抗体溶液，取1.6μL试剂盒中的抗体，加入到20mL blockingbuffer中，混匀；

4)倒掉杂交管中的blocking buffer，加入抗体溶液，室温，1.5h。

5.9尼龙膜的洗涤及检测

1)抗体反应结束后，将抗体溶液倒掉，往杂交管中加入50mL washbuffer，室温，2h-过夜；

2)将尼龙膜从杂交管中取出，放入盛有detection buffer(Tris，NaCl，pH9.5)的大培养皿中，浸泡5min；

3)将尼龙膜铺到一张大保鲜膜上，均匀滴加800μL CSPD溶液，将另一侧的尼龙膜平整地覆盖到膜上，轻轻挤走气泡；

4)37℃，温育10min；

5)将尼龙膜铺到暗匣中，在暗室中压上X光胶片，压片2h；

6)洗片：暗室中，依次将胶片放入显影液3min，定影液1min。然后用自来水将胶片充分涮洗后晾干。

实施例2通过TAIL-PCR方法获得抗虫转基因玉米IE034外源基因整合位点5’端旁侧序列

1、抗虫转基因玉米事件IE034总DNA的提取

方法参见实施例1中的5.1。

2、引物设计

根据CaMV35S polyA终止子序列设计特异性引物

35S-0：5’-CGACAAGCTCGAGTTTCTCCATAATAAT-3’；(SEQID No.8)

35S-1：5’-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCA-3’；(SEQ ID No.9)

35S-2：5’-GGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATA-3’；(SEQ ID No.10)

设计TAIL-PCR随机引物：

LAD1-1：5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(T/A/C)N(A/G/C)NNNCCAC-3’(SEQ ID No.11)；

LAD1-2：5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)(G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAA’(SEQ ID No.12)；

设计巢式引物

AC：5’-ACGATGGACTCCAGAG-3’(SEQ ID No.13)

3、PCR反应

第一轮扩增PCR反应体系：

第二轮扩增PCR反应体系：

第三轮扩增PCR反应体系：

第一轮扩增PCR反应程序

93℃2分钟，95℃1分钟，(94℃30秒，60℃1分钟，72℃3分钟)重复11次；94℃30秒，25℃2分钟，72℃3分钟，(94℃20秒，58℃1分钟，72℃3分钟)重复26次，72℃5分钟。

第二轮扩增PCR反应程序

(94℃20秒，65℃1分钟，72℃3分钟)重复2次；(94℃20秒，68℃1分钟，72℃3分钟，94℃20秒，68℃1分钟，72℃3分钟，94℃20秒，50℃1分钟，72℃3分钟)重复14次，72℃5分钟。

第三轮扩增PCR反应程序

(94℃20秒，68℃1分钟，72℃3分钟，94℃20秒，68℃1分钟，72℃3分钟，94℃20秒，50℃1分钟，72℃3分钟)重复8次，72℃5分钟。

提取抗虫转基因玉米IE034叶片基因组DNA，利用特异性引物和随机引物LAD1-1或LAD1-2进行TAIL-PCR反应。用LAD1-2和特异性引物扩增得到约1kb大小的扩增片段(图5)。将此片段连接到Promega公司的T-easy vector上进行测序，获得外源基因在玉米基因组整合位点的左边界982bp长的序列(SEQ ID No.1)，包括第1-776共776bp的玉米基因组序列和第777-982共206bp的载体序列。

实施例3抗虫转基因玉米IE034旁侧序列的应用

利用抗虫转基因玉米IE034的旁侧序列及外源片段中的CaMV35S polyA序列针对两个不同的***位点分别设计一对引物，建立IE03***及其衍生产品的定性PCR鉴定方法。依据其中一个外源片段中整合位点5’端玉米基因组设计的引物为5’-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3’(SEQ ID No.4)，依据CaMV35SpolyA终止子序列设计的引物为5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’(SEQ ID No.5)。

玉米基因组DNA的提取及PCR反应体系依实施例1中的方法。PCR反应程序为95℃5min，(94℃30s，58℃30s，72℃1min)35个循环，72℃7min。用此特异性引物进行PCR扩增时，水、非转基因植株或质粒均无扩增条带，只有转基因植株IE034亲本、杂种F1和后代及其叶片、种子的DNA扩增序列有特异性312bp目的条带(图6)，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。此方法最低检测到的IE034基因组DNA量为1ng(图7)，表明该检测方法灵敏度高。试验说明利用转基因玉米事件IE034旁侧序列进行PCR检测，可以特异性地检测转基因玉米事件IE034的亲本、杂种F1和后代及其制品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.抗虫转基因玉米事件（Zea mays）IE034***位点的外源***片段的5’端旁侧DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的DNA在检测转基因玉米中的应用。

3.用于检测权利要求1所述DNA的特异性引物，其核苷酸序列为：

IE034F:5’-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3’，

IE034R:5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’。

4.权利要求3所述的引物在制备检测转基因玉米试剂盒中的应用。

5.一种检测转基因玉米事件IE034的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求书3所述的引物进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果；若扩增得到312bp的片段，则结果为阳性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，20μL PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2μL，10mmol/L dNTP0.4μL，5U/μl的taq酶0.4μL，玉米总DNA模板1.0μL，10μmol/L上游引物0.4μL，10μmol/L下游引物0.4μL，ddH₂O15.4μL。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃7min。

8.一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的引物。

9.权利要求3所述引物在检测转基因玉米中的应用。

10.权利要求8所述的试剂盒在检测转基因玉米中的应用。

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