CN102598980B

CN102598980B - 苏云金芽孢杆菌发酵液对高羊茅保护酶的调节方法

Info

Publication number: CN102598980B
Application number: CN 201210051984
Authority: CN
Inventors: 多立安; 赵树兰; 程田
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2032-03-02
Also published as: CN102598980A

Abstract

本发明公开了一种苏云金芽孢杆菌发酵液对高羊茅保护酶的调节方法，它是在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土中加入150μl不同浓度的含有苏云金芽孢杆菌的堆肥微生物发酵滤液，对照组加入无菌液体培养基，每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，待种子萌发后测定各项萌发指标。实验结果表明：堆肥微生物发酵滤液的施用整体上降低了草坪植物叶片POD、SOD和CAT的活性、丙二醛含量及草坪植物体内积累的游离脯氨酸含量，说明堆肥微生物对植物在逆境中的生长有一定的缓解作用。

Description

苏云金芽孢杆菌发酵液对高羊茅保护酶的调节方法

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌种的应用。更具体的说是一种堆肥发酵液（苏云金芽孢杆菌发酵液）对高羊茅保护酶的调节方法。

背景技术

堆肥化（Composting）是指在有控制的条件下，使有机废弃物在微生物（主要为细菌）作用下，发生降解，并同时使有机物向稳定的腐殖质方向转化的过程。堆肥化后的产物称之为堆肥（Compost）。堆肥过程可以将混合物的体积有效地减少40%-50%，并且可以依靠在高温阶段中代谢产生的热量杀死垃圾中的病原物质。堆肥不是一项新的技术，但用这种方法处理城市固体垃圾，符合环境的利益，因为在堆肥过程中清除或者减少了城市固体垃圾中的毒性并使得最终的产物可以被用来进行再利用。堆肥的程序包括原料的预处理、原料发酵和后处理，堆肥过程受水分、氧含量、C/N比、温度、pH和通风情况等因素的影响。

堆肥化过程的实质是微生物在适宜条件下的代谢作用，在堆肥化过程中，生活垃圾中的可溶解有机物质透过微生物的细胞壁和细胞膜而被微生物所吸收，而微生物通过自身的生命活动过程，把吸收的有机物转化成无机物。微生物在堆肥过程中扮演着重要角色，与堆肥周期和堆肥质量密切相关。因此，堆肥中微生物的研究对开发堆肥微生物资源，加速堆肥过程，减短堆肥周期，提高堆肥质量都具有重要的意义。

微生物种类繁多，自然界中仅有极少数的微生物得到鉴定，能够存活、培养的种类更是少之又少，至多为微生物总量的l%。目前，国内外对于堆肥中的微生物进行了一系列理论和实践的研究。对于应用堆肥可能出现的环境问题也已经引起了人们的重视，但如何解决这些问题还缺少细致深入的研究，目前，如何提高城市生活垃圾堆肥的质量，解决堆肥应用过程中可能产生的环境问题一直是相关科研人员研究关注的热点。对于堆肥中的微生物组成及堆肥过程中的微生物变化的研究已有诸多报道，但对于将堆肥中微生物分离、应用于其他基质的研究却少有报道。

将生活垃圾堆肥用作草坪基质，不但可以避开食物链，同时又解决了垃圾的出路问题。但垃圾堆肥中含有重金属等物质可能对环境造成不利的影响，这一直是堆肥应用中的重要问题，从垃圾堆肥中分离和提取有益的微生物菌种，配制成不同的微生物菌剂接种到草坪建植体系中，既可以提高堆肥的利用效率，同时又解决了堆肥重金属等可能构成的环境威胁，体现生物制剂的优越性，符合可持续发展的要求，通过研究不同的堆肥微生物菌剂对草坪植物保护酶的影响，目的是为了筛选适合的微生物菌剂，提高草坪植物的质量和抗逆性，改善草坪土壤基质的质量提供理论依据。

苏云金芽孢杆菌是目前国际上生产量最大并成功地用于防治农、林、贮粮害虫和一些卫生害虫的微生物杀虫剂，苏云金芽孢杆菌在形成芽孢的同时，可以形成一种由杀虫晶体蛋白组成的伴孢晶体，它的主要杀虫活性成分是伴孢晶体蛋白。研究发现，这种蛋白对多种农林害虫具有特异性杀伤作用。昆虫取食芽孢晶体混合物后，晶体在昆虫体内的中肠碱性环境和蛋白酶的作用下被降解形成杀虫活性蛋白，研究结果表明这些毒蛋白单独作用或不同蛋白间协同作用对昆虫具有不同程度的毒杀作用，进一步加强苏云金芽孢杆菌在防治和控制害虫危害方面的研究，对于保护人类生存环境实现可持续发展具有重大意义。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前产量最大、使用最广的生物杀虫剂。关于采用苏云金芽孢杆菌发酵滤液用来调节高羊茅保护酶的方法尚为见文献报道。

发明内容

本发明采用的苏云金芽孢杆菌（拉丁名：Bacillus thuringiensis）菌种保藏号:CFCC10206,保藏单位：中国林业微生物菌种保藏管理中心，对外可以提供。

生理生化特性：细胞呈革兰氏阳性，杆状，大小为1.0-1.2×3-5μm。形成半孢晶体，对***糖甘露醇不产酸产淀粉酶，硝酸盐还原到亚硝酸盐。

苏云金芽孢杆菌毒性：对人、畜低毒，大鼠口服急性LD₅₀ 852.7-856.7毫克/公斤，对家禽、鸟类、鱼、畜等低毒。

本发明将配制成不同浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液接种到草坪建植体系中。通过研究不同浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液对对高羊茅保护酶的调节方法，为草坪植物的建植提供依据。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种堆肥发酵液对高羊茅保护酶的调节方法，其特征在于按如下的步骤进行：

(1)苏云金芽孢杆菌的分离：苏云金芽孢杆菌本身有市售；也可以分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥；本发明从生活垃圾堆肥所得到的苏云金芽孢杆菌生理生化性质与市售的苏云金芽孢杆菌相同，分离的方法如下：

1）将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取lml母液，加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为l0^-1浓度的稀释溶液，按此方法分别稀释成l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6几种浓度的堆肥稀释液；分别用移液枪吸取0.1毫升浓度为l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6稀释液，注入到牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上，每一稀释度重复三次，无菌水为空白对照；用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整牛肉膏蛋白胨固体培养基上，使微生物均匀分布，将含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养1天；

2）苏云金芽孢杆菌发酵液的制备：

A.将分离出的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养2代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养；选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；根据生长曲线获得微生物生长至稳定期的时间，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数；其中的纯化培养2代培养指的是：用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养1天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代。本发明所制备的苏云金芽孢杆菌与从生活垃圾堆肥所所制备的苏云金芽孢杆菌生理生化性质与市售的相同，故未保藏。

B.取纯化苏云金芽孢杆菌菌种，接入装有50mL高氏一号液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养8～12 h至稳定期，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液进行抽滤，抽滤后将菌液通过孔径为0.22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液；其中苏云金芽孢杆菌的菌落数（个）

结论：通过在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的苏云金芽孢杆菌的菌落数情况可以看出，堆肥中的苏云金芽孢杆菌菌落数高于土壤对照，由于l0^-4倍浓度下的土壤中和l0^-5、l0^-6的浓度下堆肥和土壤中的菌落数均少于30，因此无法进行统计计数。

3）稀释苏云金芽孢杆菌发酵液：

取一部分过滤液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用；

4）对高羊茅保护酶的调节方法：

在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土壤中加入150μl 不同浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液，然后每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，实验时室温平均为18℃，湿度平均为40%，待种子萌发后测定各项萌发指标；

关于苏云金芽孢杆菌的鉴定结果：

在牛肉膏蛋白胨培养基上挑取与苏云金芽孢杆菌相似的菌落，发现在培养基上形成的菌落为圆形，白色，边缘光滑，不透明，革兰氏染色为阳性，菌体在显微镜下观察呈椭圆形杆状，芽孢为椭圆形，用溴酚蓝和番红染液进行伴胞晶体染色，镜下观察到有红色菌体，无色芽孢以及蓝色伴孢晶体，初步鉴定其为苏云金芽孢杆菌（与市售的相同）。

细菌的生理生化实验结果

将初步鉴定为苏云金芽孢杆菌的菌株定为待测菌株，对其进行生理生化实验的检测，得到结果如下表：

细菌的生理生化实验结果

对待测菌株进行了生理生化测试，结果如上表所示。待测菌株为革兰氏阳性，过氧化氢酶阳性，V.P反应阳性，葡萄糖发酵产酸，水解淀粉、明胶，都能利用柠檬酸盐。

待测菌株的显著特点是：待测菌株对D-木糖不发酵产酸，对D-甘露醇不发酵产酸，不产气。根据以上实验结果，进一步鉴定待测菌株为苏云金芽孢杆菌（与市售的相同）。将菌株纯化保存，以备后续实验使用。

本发明更加详细的试验方法如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

生活垃圾堆肥来自天津小淀垃圾堆肥处理厂，草坪植物选择高羊茅（Tall fescue），供试土壤取自天津师范大学校园内深度为5-15cm表层土壤，土壤质地为砂质粘土，其性质为：pH 7.44，有机质含量4.68％，全氮0.21％，有效磷22.03mg·kg^-1，饱和含水量0.58ml·g^-1。

1.2 实验方法

实验用苏云金芽孢杆菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥（所得到的苏云金芽孢杆菌生理生化性质与市售的相同，故未保藏），将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线。根据生长曲线获得微生物生长至稳定期的时间，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液通过孔径为0.22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液。其中的纯化培养2代培养指的是：用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养1天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代。

微生物的生长曲线

由图1可知， 0～2 h 为苏云金芽孢杆菌的生长延迟期，2～8 h 为对数生长期，8～12 h 为稳定期，12 h 以后为衰亡期，应采用8～12 h时的菌液作为菌种。

微生物发酵滤液的浓度

取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算出的每mL菌液中的活菌数作为微生物发酵滤液的浓度（见表1）。

表1苏云金芽孢杆菌发酵滤液的浓度（CFU/mL）

取一部分原液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用。

在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土中加入150 μl 不同浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液，对照组加入无菌液体培养基，每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，待种子萌发后测定各项萌发指标。实验时室温平均为18℃，湿度平均为40%。

1.3 草坪植物生长生理指标的测定

13.1 草坪植物生物量测定

地上鲜重和干重、株高：发芽后每5d测定1次株高；播种75d后刈割，将草坪植物齐根剪下，测定其地上部分和地下部分生物量。

1.3.2 叶绿素含量测定

1.3.3 保护酶含量测定

粗酶液提取：准确称取0.5 g样叶，用磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）冰浴研磨提取，定容25 ml，取10 ml于离心管中，10000 r·min^-1 EPPENDOFF离心机离心20 min，上清液为粗酶提取液。

POD活性测定：采用愈创木酚法，取3 ml反应混和液于比色皿中，对照以pH=7.8磷酸缓冲液代替，向比色皿中加0.1 mL粗酶提取液，立即开启秒表计时，于470 nm下测量吸光值，每分钟读1次数，共读3次。以每分钟△A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位。反应混和液成分为50 mL pH=6.0的磷酸缓冲液加28 μL愈创木酚和19μL过氧化氢。

SOD活性测定：采用NBT法。3 ml反应混和液包括：pH=7.8的磷酸缓冲液，0.1 mMEDTA，13 mM蛋氨酸，75μMNBT，2 μM核黄素和0.1mL的酶提取液，不加酶液的为对照。在人工气候箱中照射15 min，不加酶液和无光照的作为空白对照。然后迅速在560 nm下测定吸光值。以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位。

CAT活性测定：采用紫外分光光度法。于试管中加入1.5 ml pH=7.8磷酸缓冲液、1 ml蒸馏水、0.2 ml酶提取液，对照用缓冲液代替酶液。然后在测定管中加0.3 ml浓度为0.1 mol·L^-1过氧化氢，同时立即计时，迅速在240 nm下测量吸光值，每分钟读1次数。以每分钟△A₂₄₀变化0. 1为一个过氧化氢酶活性单位。

数据分析采用Excel 2003和SPSS 17.0统计分析软件进行处理。

2 结果与分析

2.1堆肥微生物发酵滤液对草坪植物保护酶含量的影响

表1不同堆肥微生物发酵滤液对草坪植物保护酶活性的影响

注：表中*表示p < 0.05, * *表示 p < 0.01，下同

由表1可知，用苏云金芽孢杆菌发酵滤液处理的草坪植物叶片中POD活性、SOD活性、CAT活性均明显小于对照，且差异均达到显著水平。测定结果表明，用苏云金芽孢杆菌发酵滤液处理的草坪植物叶片中POD活性与对照相比降低了37.1%，SOD活性与对照相比降低了102.5%。，CAT活性与对照相比降低了74.94%。

研究表明，植物保护酶活性及体内渗透物质积累的多少与与其遭受的逆境胁迫程度强弱有关系。本实验中堆肥微生物发酵滤液的施用整体上降低了草坪植物叶片POD、SOD和CAT的活性，说明堆肥微生物对植物在逆境中的生长有一定的缓解作用。

3 研制结论

加入苏云金芽孢杆菌发酵滤液的草坪植物高羊茅的保护酶（CAT、SOD、POD）活性均明显低于对照，说明苏云金芽孢杆菌发酵滤液可以提高草坪植物高羊茅的抗逆性。

附图说明：

图1为苏云金芽孢杆菌的生长曲线；

图2为苏云金芽孢杆菌菌落照片。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中苏云金芽孢杆菌有市售，也可以根据实施例1的方法加以获得，从生活垃圾堆肥所得到的苏云金芽孢杆菌生理生化性质与市售的相同。所采用的牛肉膏蛋白胨固体培养基有市售。平板培养基为：高氏一号的培养基也有市售。

实施例1

(1)苏云金芽孢杆菌的分离：

2）苏云金芽孢杆菌发酵液的制备：

A.将分离出的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养2代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养，选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，根据生长曲线获得苏云金芽孢杆菌生长至稳定期的时间；

其中苏云金芽孢杆菌的菌落数（个）

B.取纯化苏云金芽孢杆菌菌种，接入装有50mL高氏一号液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养8～12 h至稳定期，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液进行抽滤，抽滤后将菌液通过孔径为0.22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液；

3）稀释苏云金芽孢杆菌发酵液：

取一部分过滤液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用；

4）对高羊茅保护酶的调节方法：

在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土壤中加入150μl 不同浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液，然后每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，实验时室温平均为18℃，湿度平均为40%，待种子萌发后测定各项指标；

其中的纯化培养2代培养指的是：用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养1天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代。

实施例2

1）苏云金芽孢杆菌发酵液的制备：

A.将购买的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养2代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养，选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，根据生长曲线获得苏云金芽孢杆菌生长至稳定期的时间；其中的纯化培养2代培养指的是：用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养1天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代。

B.取纯化苏云金芽孢杆菌菌种，接入装有50mL高氏一号液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养12 h至稳定期，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液进行抽滤，抽滤后将菌液通过孔径为0.22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液；

3）稀释苏云金芽孢杆菌发酵液：

取一部分过滤液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用；

4）对高羊茅保护酶的调节方法：

在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土壤中加入150μl 不同浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液，然后每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，实验时室温平均为18℃，湿度平均为40%，待种子萌发后测定各项指标。

本发明在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。

Claims

1.一种苏云金芽孢杆菌发酵液对高羊茅保护酶的调节方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）苏云金芽孢杆菌的分离：

将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取lml母液，加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为l0^-1浓度的稀释溶液，按此方法分别稀释成l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6几种浓度的堆肥稀释液；分别用移液枪吸取0.1毫升浓度为l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6稀释液，注入到牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上，每一稀释度重复三次，无菌水为空白对照；用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个牛肉膏蛋白胨固体培养基上，使微生物均匀分布，将含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养1天；

（2）苏云金芽孢杆菌发酵液的制备：

A.将分离出的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养2代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养，选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，根据生长曲线获得苏云金芽孢杆菌生长至稳定期的时间；其中的纯化培养2代培养指的是：用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养1天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代；

（3）稀释苏云金芽孢杆菌发酵液：

取一部分过滤液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用；

（4）发酵滤液对高羊茅保护酶的调节：

在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土壤中加入150μl 不同浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液，然后每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，实验时室温平均为18℃，湿度平均为40%，待种子萌发后测定各项萌发指标。