CN102590516A - 同时检测泰乐菌素和替米考星残留分析的免疫胶体金试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了同时检测泰乐菌素和替米考星多残留快速检测试纸条及其制备方法，硝酸纤维膜(4)上包被有兔抗鼠的IgG质控线(5)和DES-BSA检测线(6)；结合垫(8)上包被有的抗TYL和TIL药物单克隆抗体-胶体金标记物。本发明应用免疫学技术筛选出抗TYL和TIL药物的单克隆抗体，通过胶体金的制备及胶体金标记条件的探索研究，在应用抗TYL和TIL药物单克隆抗体和胶体金技术研究建立同时检测TYL和TIL药物残留的胶体金试纸条，并对其性能进行测定。试纸条检测样品范围较宽，假阳性低，检测灵敏、准确、可靠，适用于动物可食性组织如肌肉、肝脏和肾脏等组织中TIL和TYL药物残留的多残留检测。

Description

同时检测泰乐菌素和替米考星残留分析的免疫胶体金试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于食品药物残留免疫学快速检测技术领域。具体涉及同时检测泰乐菌素和替米考星多残留胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)半合成大环内酯类畜禽专用抗生素，具有很强的抗菌活性，耐药性低，抗菌谱广，对所有的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌、霉形体、螺旋体等均有抑制作用，尤其是对多种支原体及螺旋体也具有很强的抑制作用。在畜牧生产上，泰乐菌素还用作饲料添加剂，促进动物生长。近年来，由于动物疾病流行，泰乐菌素和替米考星在畜牧兽医上应用最多的药物，在兽用的抗生素中占有重要的地位。在生产中，由于不合理的使用剂量和不遵守休药期造成泰乐菌素和替米考星残留，其残留对消费者可产生毒性作用。我国和欧盟分别对泰乐菌素和替米考星在组织中残留也制定了最高残留限量(MRL)。为了控制泰乐菌素和替米考星残留，保障消费者健康，有必要建立一种快速、有效的残留检测方法对其残留进行监测。

现有的泰乐菌素和替米考星残留检测的方法主要为高效液相色谱(HPLC)分离，紫外和质谱检测的仪器方法。虽然仪器方法在鉴定药物种类和定量分析上表现出良好的性能，但由于其操作复杂、分析费用昂贵，而不适用于对大量样品进行残留筛选。ELISA方法灵敏度高、成本低，在药物残留检测中应用也很广泛，但该方法需要酶标仪等实验室设备，分析时间长，在应用中有局限性。

发明内容

为解决以上技术问题，为解决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供一种特异性强、灵敏度高、且操作简单，对样品简单处理即可检测TYL、TIL药物残留的免疫胶体金试纸条。

本发明目的之二在于提供一种制备同时检测泰乐菌素和替米考星多残留胶体金免疫层析快速检测试纸条的方法。

本发明目的之一是这样实现的：一种检测喹恶林-2-羧酸药物残留的免疫胶体金试纸，包括背板(2)，该背板(2)上设置手控区、测试区和样品端，所述测试区位于背板(2)中部，所述手控区和样品端位于背板(2)两个端部，其关键在于：所述手控区由吸水垫(3)和手控区封膜(1)组成，所述吸水垫(3)粘附在背板(2)，该吸水垫(3)上表面及外端面和背板(2)外端面粘附手控区封膜(1)，所述测试区为粘附在背板(2)上的硝酸纤维素膜(4)，所述硝酸纤维素膜(4)上包被有兔抗鼠的IgG质控线(5)和包被有DES-BSA检测线(6)，所述样品端由结合垫(7)、样品垫(8)和样品端封膜(9)组成，所述背板(2)上由测试区到外端依次粘附结合垫(7)和样品垫(8)，该样品垫(8)搭在结合垫(7)上，所述样品垫(8)上表面及外端面和背板(2)外端面粘附样品端封膜(9)。

本发明目的之二是这样实现的：检测喹恶林-2-羧酸药物残留的免疫胶体金试纸的制备方法，按如下步骤进行：

1)将半抗原去碳霉糖泰乐菌素与牛血清白蛋白偶联合成偶联物DES-BSA；

2)将步骤1)合成的2种偶联物免疫原免疫小鼠，通过细胞融合筛选得到抗TYL和TIL药物单克隆细胞株，分别将得到单克隆细胞株注射小鼠腹腔，得到抗TYL和TIL药物单抗体，该抗体与TYL和TIL有较高的交叉反应；

3)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

4)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗体；

5)将步骤2)制成的抗TYL和TIL单克隆抗体加入步骤3)制备的胶体金中，得到抗TYL和TIL单克隆抗体-胶体金标记物；

6)将抗TYL和TIL单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫上；

7)将步骤1)合成DES-BSA分别包被在硝酸纤维素膜(4)得到检测线(6)；

8)将步骤4)兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(4)得到质控线(5)；

9)将手控区封膜(1)、吸水垫(3)、硝酸纤维素膜(4)结合垫(7)、样品垫(8)和样品端封膜(9)依次粘贴在背板(2)上。

试纸条其反应原理为竞争法：将样品液滴加到试纸条样品垫上，样品在毛细管作用下沿试纸条泳动，当泳动至金标垫时，固态化的金标抗单抗迅速溶解释放，随样品一起沿试纸条泳动至检测线，若样品中含有TYL和TIL，药物首先与金标抗TYL和TIL单抗发生免疫反应，形成免疫复合物，抑制金标单抗与检测线(T)包被的DES-BSA偶联物的结合，使检测线截获的金标抗体的量减少，T线颜色变浅，当样品中TYL、TIL的量足够大时，检测线将无颜色出现，金标单抗穿过检测线与被包被于C线的兔抗鼠IgG截获C线出现红色条带；反之，若样品中不含TYL和TIL，金标单抗与包被于NC膜上的DES-BSA偶联物发生特异性免疫反应而被截获，在检测线位置(T)形成红色条带，即阴性结果，部分金标单抗穿过检测线与被包被于C线的兔抗鼠IgG截获，形成红色条带。

有益效果：本发明应用免疫学技术筛选出抗TYL和TIL药物的单克隆抗体，通过胶体金的制备及胶体金标记条件的探索研究，在应用抗TYL、TIL药物单克隆抗体和胶体金技术研究建立抗TYL、TIL药物单克隆抗体快速检测试纸条，并对其性能进行测定。试纸条检测样品范围较宽，假阳性低，检测灵敏、准确、可靠，适用于动物可食性组织如肌肉、肝脏和肾脏等组织中TIL、TYL药物残留的检测。

说明书附图

图1为本发明检测试纸条的结构示意图；

图2为结果判定示意图；

图3：本发明检测试纸条标准曲线示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例

1免疫原与包被原的制备

本发明免疫原及试纸条检测线上的包被原(DES-BSA)合成方法。称取O-羧甲基羟胺半盐酸盐(AOAA)21.9mg、碳酸氢钠8.4mg溶解于三蒸水4mL中。将上述液逐滴加入到DES溶液中(154mg DES溶解于4mL甲醇中)，室温磁力搅拌反应3h。反应后，减压旋转蒸发至含少量水，加入二氯甲烷4mL、无水乙醇2mL重新溶解，加入无水硫酸钠5g，振摇后静置过夜。过滤后，60℃减压旋转。称取上述蒸干物44.2mg、N，N-二环已基碳二亚胺(DCC)12.4mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)6.9mg溶解于DMF 3mL中，室温下磁力搅拌反应12h。将上述反应液逐滴加入17mL BSA溶液中(110mg BSA溶解于0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH8.0)中，边加边搅拌，置室温下磁力搅拌反应过夜。离心后取上清，4℃生理盐水中透析3d，每天更换透析液2次，即得偶联物DE-BSA。2000rpm离心5mim后，取上清液分装，冷冻干燥后，-20℃冰箱保存。在上述反应中，将BSA换成OVA后，得到反应偶联物DES-OVA，该偶联物作为ELISA检测时作为包被原使用。

2抗TYL和TIL单克隆抗体制备

2.1动物免疫

用实施例1制备的免疫原(DES-BSA)分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100μg/0.2mL。首次免疫，用无菌0.01mol/L pH7.4PBS溶解免疫原，再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，颈背部皮下分2～3点注射；加强免疫，用0.01mol/L pH7.4PBS溶解免疫原与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次间隔14～21d，第3次免疫后7～10d开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清，用ELISA检测小鼠血清效价。末次免疫后间隔4周以上，在细胞融合前3～4d，腹腔注射DES-BSA抗原100μg/0.2mL/只，注射后每天注意观察，保证融合前小鼠状态良好。

2.2TYL和TIL单克隆抗体制备

取1只用DES-BSA免疫的Balb/c小鼠，从眼眶放血分离血清，处死。小鼠用75％酒精中浸泡5min，进行整体消毒。将小鼠四肢固定，然后用镊子夹住小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，再用镊子撕开皮肤，露出腹膜，在腹膜上用剪刀(操作时要换一套镊子和剪刀)剪一小口(在腹部中央)。剪开腹膜(换1套镊子和剪刀)，露出脾脏，用镊子夹住脾脏(再换1套器械)，用剪刀将脾脏外膜剪破，然后放入事先灭菌的匀浆器中。加适量基础培养基(RPMI-1640)于匀浆器中，进行研磨，挤压出脾细胞，取出匀浆器的匀浆棒，再补加适量基础培养基(RPMI-1640)，静置2min，将上层细胞悬液吸取后，放入腹腔巨噬细胞离心管中，重复上述操作1次。1200r/min离心10min，除去上清。将10⁸个免疫脾细胞与1～2×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞按照1∶10或1∶5的比例加入50mL离心管中，进行混匀，然后于1500r/min水平离心10min，弃去上清。将离心管倒扣在灭菌的吸水纸上，把管中液体吸干。用手指或桌面轻轻敲击管底，让沉淀的细胞松动，再把离心管置于37℃水浴锅中。在1min内缓慢将50％PEG 0.8mL滴入离心管中，边加边轻轻用吸管尖搅拌沉淀细胞。再继续搅拌30sec后，静置1min，然后慢慢加入40mL 1640基础培养基(事先进行37℃预温)。加基础培养基方法为：第1min内逐滴滴入1mL，第2min内加2mL，第3min内加3mL，第4min内加其余的4mL，在每次加培养基时需缓慢加入，并轻轻地搅拌培养基，最后将剩余的1640培养基慢慢加入。1000r/min离心5min，除去上清。然后用HAT培养基悬浮混合的细胞，再加入饲养脾细胞。根据需要补加适量的HAT培养基，混合均匀，再将含有饲养细胞的细胞融合液滴加到96孔细胞培养板上，滴加量约为150μL/孔。将培养板置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中，进行培养。用建立的间接ELISA筛选阳性细胞克隆。选择强阳性集落生长的孔，用有限稀释法进行克隆。并对其他阳性孔，进行24孔扩大培养，用间接ELISA和间接竞争ELISA对扩大培养孔的上清液进行检测，对间接ELISA和间接竞争ELISA均为阳性孔的细胞进行液氮冷冻保存。通过融合检测，并进行3次亚克隆后获得杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株经过多次传代、冻存、复苏，杂交瘤细胞分泌抗体稳定。进行杂交瘤细胞染色体的计数，将每株杂交瘤细胞随机选择20个细胞，进行细胞染色体条数的计数，再计算细胞染色体条数的平均值。取细胞株细胞分泌的培养上清液，进行1∶10稀释后，用夹心ELISA方法测定抗体亚型。通过上述方法分别制备了抗TYL和TIL单克隆抗体细胞株(4.1.6/5A2)。采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化。该单克隆抗体可用于制备胶体金。

2.3兔抗鼠IgG抗体的制备

用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG。利用兔抗鼠IgG作为质控线。

3抗TYL和TIL单克隆抗体-胶体金标记物的制备

3.1胶体金的制备

量取去离子水100mL，移入500mL的平底烧瓶中，将烧瓶置于磁力搅拌器的加热套内，打开搅拌旋钮和加热旋钮，加热至沸腾。加入1％HAuCl₄溶液1.0mL，继续加热2min，然后一次性迅速加入1％柠檬酸三钠溶液，继续加热。待溶液变为亮红色或橙红色后，再继续加热搅拌15min。关掉加热旋扭，冷却至室温，过滤备用。

3.2抗TYL和TIL单克隆抗体-胶体金标记物的制备与纯化

于50mL的小烧杯中加入30mL的胶体金，用0.1mol/L K₂CO₃适量调pH达到最佳标记pH值，在搅拌的状态下，缓慢加入一定量稀释好的抗TYL和TIL单克隆抗体，继续搅拌30min；加10％BSA使其终浓度为1％，搅拌30min；4℃放置2h后，将以上胶体金标记物分装，以2000r/min离心15min，取上清，弃去沉淀；以10000r/min离心30min，弃上清，加入标记洗涤液到原体积；再次以10000r/min离心30min，弃上清，加入标记洗涤液到原体积；以10000r/min离心30min，弃上清，沉淀用1.0mL标记洗涤液进行重悬，然后置4℃冰箱。

3.3金标垫的制备

分别剪取规格为20×4mm的玻璃纤维棉，然后将上述4种金标抗体复合物溶液用ZX1000喷点平台***均匀喷洒于玻璃纤维棉上，置于37℃干燥1h，加入干燥剂密封保存，后置于4℃冰箱。

3.4硝酸纤维素膜(NC膜)的制备

将NC膜置于ZX1000喷点平台***上，将浓度为0.2mg/mL的完全抗原DES-BSA放于贮存池A，浓度为0.4mg/mL的GaMIgG放于贮存池B。将NC膜展平，放上压条，质控线与检测线位于膜的中间相距0.5cm，其距膜的边距为0.75cm。开机后，喷点平台***将完全抗原DES-BSA和兔抗鼠IgG分别点射于NC膜上，形成2条检测线和1条质控线，置室温自然干燥后，加入干燥剂密封，置于4℃保存，备用。

3.5检测试纸条的组装

将背板(2)、样品端封膜(9)、结合垫(7)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(3)和手控区封膜(1)按一定的工艺组装到一起。将组装的半成品试纸条放入试纸条切割机槽内进行切割，然后将制备成品的试纸条注明生产时间和批次，置4℃保存(密封)。

4同时检测TYL和TIL的免疫胶体金试纸条的使用方法

4.1组织样品预处理

将猪肌肉、肝脏、肾脏等待检组织样品匀浆，取2g加入4mL乙酸乙酯振荡2min，室温3000r/min离心5min，取300μL上层液体于1.5mL离心管中80℃水浴蒸干(大约30min)或在氮气流下吹干，用150μL稀释液溶解残留物。

4.2检测结果判定

如图1、图2所示，一种同时泰乐菌素和替米考星多残留胶体金免疫层析快速检测试纸条，包括背板2，该背板2上设置手控区、测试区和样品端，所述测试区位于背板2中部，所述手控区和样品端位于背板2两个端部，其特征在于：所述手控区由吸水垫3和手控区封膜1组成，所述吸水垫3粘附在背板2，该吸水垫3上表面及外端面和背板2外端面粘附手控区封膜1，所述测试区为粘附在背板2上的硝酸纤维素膜4，所述硝酸纤维素膜4上包被有兔抗鼠的IgG质控线5和包被有DES-BSA检测线6，所述样品端由结合垫7、样品垫8和样品端封膜9组成，所述背板2上由测试区到外端依次粘附结合垫7和样品垫8，该样品垫8搭在结合垫7上，所述样品垫8上表面及外端面和背板2外端面粘附样品端封膜9。

将样品液滴加到试纸条样品垫上，样品在毛细管作用下沿试纸条泳动，当泳动至金标垫时，固态化的金标抗单抗迅速溶解释放，随样品一起沿试纸条泳动至检测线，若样品中含有TIL或TYL首先与金标抗TYL和TIL单抗发生免疫反应，形成免疫复合物，抑制金标抗TYL和TIL单抗与检测线(T)包被的DES-BSA偶联物的结合，使检测线截获的金标抗体的量减少，T线颜色变浅，当样品中TIL或TYL量足够大时，检测线将无颜色出现，金标单抗穿过检测线与被包被于C线的兔抗鼠IgG截获C线出现红色条带；反之，若样品中不含TIL或TYL，金标抗TYL和TIL单抗与包被于NC膜上的DES-BSA偶联物发生特异性免疫反应而被截获，在检测线位置(T)形成红色条带，即阴性结果，部分金标单抗穿过检测线与被包被于C线的兔抗鼠IgG截获，形成红色条带。

5本发明药物检测试纸条的应用

5.1同时检测TYL和TIL多残留试纸条的灵敏度测定

将DES、TIL和TYL分别配成浓度为0，1，5，10，20，40，60，80、100μg/L的标准品溶液，分别加到试纸条的样品垫上，测试重复8次，静置试纸条反应10min，然后用BioDot-TSR3000读条仪扫描检测线的相对光密度值(G/Peak-ROD值)以不同浓度标准品与空白标准品相对光密度值的百分率(B/B₀％)为纵坐标，以标准品不同浓度的常用对数值作为横坐标，绘制检测试纸条的标准曲线，求回归方程，进行相关回归分析，标准曲线结果见图3。通过对检测线的G/Peak-ROD值进行统计学分析，确定试纸条的检测限。通过计算得到机读最低检测线为：TYL标准曲线最低检测线10ng/mL，TIL标准曲线最低检测线20ng/mL。

目测检测方法建立：在有红色质控线出现的情况下，当试纸条与阴性对照试纸条检测线颜色相似红色条带时判为阴性；当试纸条检测线颜色明显浅于阴性对照试纸条检测线颜色时判为弱阳性；当试纸条检测线位置无红色条带出现时判为阳性。在试纸条没有出现红色质控线的情况下，说明试纸条已失效，此时不管检测线颜色的深浅和有无，检测结果都判为无效，应更换另一批次的试纸条重新检测，TYL药物目测检测临界值(cut-off值)为40ng/mL；TIL药物目测检测临界值为60ng/mL。

5.2多残留检测试纸条的特异性试验

将胶体金免疫层析快速检测试纸条与大环内酯类化合物的交叉反应率见表1。从表中可以看出，抗体对泰乐菌素和替米考星有高的交叉反应率，对其他药物的无交叉反应，该抗体可用于泰乐菌素和替米考星多残留胶体金试纸条方法的建立。

表1试纸条与大环内酯类化合物的交叉反应率

5.3胶体金免疫层析快速检测试纸条的样品添加回收试验

试纸条样品添加回收率、批间批内变异系数结果见表2。结果表明，TYL在不同样品中回收率在71.5％-103.2％范围内，TIL为72.6％-101.5％，变异系数均小于14.1％，完全符合产品化试剂盒的要求。

表2纸条法检测TIL和TYL在动物源性食品中的回收率对比试验

Claims (2)

1.一种同时检测泰乐菌素和替米考星残留分析的免疫胶体金试纸条，包括背板(2)，该背板(2)上设置手控区、测试区和样品端，所述测试区位于背板(2)中部，所述手控区和样品端位于背板(2)两个端部，其特征在于：所述手控区由吸水垫(3)和手控区封膜(1)组成，所述吸水垫(3)粘附在背板(2)，该吸水垫(3)上表面及外端面和背板(2)外端面粘附手控区封膜(1)，所述测试区为粘附在背板(2)上的硝酸纤维素膜(4)，所述硝酸纤维素膜(4)上包被有兔抗鼠的IgG质控线(5)和包被有DES-BSA检测线(6)，所述样品端由结合垫(7)、样品垫(8)和样品端封膜(9)组成，所述背板(2)上由测试区到外端依次粘附结合垫(7)和样品垫(8)，该样品垫(8)搭在结合垫(7)上，所述样品垫(8)上表面及外端面和背板(2)外端面粘附样品端封膜(9)。

2.一种如权利要求1所述同时检测泰乐菌素和替米考星多残留胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

1)将半抗原去碳霉糖泰乐菌素与牛血清白蛋白偶联合成偶联物DES-BSA；

2)将步骤1)合成的2种偶联物免疫原免疫小鼠，通过细胞融合筛选得到抗TYL和TIL药物单克隆细胞株，分别将得到单克隆细胞株注射小鼠腹腔，得到抗TYL和TIL药物单抗体，该抗体与TYL和TIL有较高的交叉反应；

3)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

4)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗体；

5)将步骤2)制成的抗TYL和TIL单克隆抗体加入步骤3)制备的胶体金中，得到抗TYL和TIL单克隆抗体-胶体金标记物；

6)将抗TYL和TIL单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫上；

7)将步骤1)合成DES-BSA分别包被在硝酸纤维素膜(4)得到检测线(6)；

8)将步骤4)兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(4)得到质控线(5)；

9)将手控区封膜(1)、吸水垫(3)、硝酸纤维素膜(4)结合垫(7)、样品垫(8)和样品端封膜(9)依次粘贴在背板(2)上。

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