CN102586120B - 棉花内生真菌cef08111及其在棉花黄萎病防治中的应用 - Google Patents
棉花内生真菌cef08111及其在棉花黄萎病防治中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及植物病理学，具体地涉及棉花的内生真菌CEF08111及其在棉花黄萎病防治中的应用。本发明从棉花的内生真菌入手，通过分离、筛选、鉴定、温室的生物测定，获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的菌株CEF08111(Gibellulopsis nigrescens)，其保藏编号为：CGMCC No.5610。CEF08111能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，以利于工厂化生产和推广应用。对黄萎病控制效果好，先接种CEF08111，4天后接种大丽轮枝菌，对棉花黄萎病的防治效果达到97.2％，对黄萎病有显著的控制作用，与生产上应用较多的枯草芽孢杆菌相比，防治效果提高50％左右，对人畜、昆虫和作物安全，环境友好。
Description
技术领域
本发明涉及植物病理学，具体地涉及棉花的内生真菌CEF08111及其在棉花黄萎病防治中的应用。
背景技术
由大丽轮枝菌引起的黄萎病是世界性的棉花重要病害之一，由于缺乏真正有效的抗病品种或者是抗病品种的抗病性极易丧失，使得最经济有效的防治措施不能发挥其主导作用。90年代以来，该病在我国各大棉区爆发成灾，年发生面积为300万公顷左右，产量损失约1亿公斤皮棉，成为发展棉花生产的主要限制因子之一。由于轮作倒茬难，缺乏抗病品种，化学药剂防治效果差，缺乏具有较好防治效果的农药，致使目前生产上对黄萎病的防治几乎是空白。
利用有益微生物控制植物病害的发生危害具有经济、环境友好的特点。目前利用拮抗微生物防治棉花黄萎病研究较多的是枯草芽孢杆菌，作用机理是产生杆菌肽等多种抗菌物质来抑制病原菌，对黄萎病的防治具有一定的效果，但是在生产应用中存在不少问题，其中最主要的问题是防治效果较低，国内登记的枯草芽孢杆菌剂型对棉花黄萎病的防治效果在50％左右，且在不同年份效果不稳定。例如2008年和2009年，由中国农业科学院棉花研究所承担国家农药登记试验中(任务来源于农业部农药鉴定所)，黑龙江强尔生化技术开发区有限公司生产的1000亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对棉花黄萎病的防治效果为46.0-52.9％，但在2010年大面积试验中防治效果只有32.7％。
植物内生真菌资源是个巨大的宝库，目前对内生真菌的研究还处于早期阶段，所研究的植物类群不过数百种，仅涉及到很小的一部分。近年来，由于内生真菌在病虫害的生物防治、医药工业上的用途和范围逐渐增大，因此有关内生真菌的研究逐渐受到重视。
棉花黄萎病是一种土传维管束真菌病害，从棉花的内生真菌入手，分离筛选对黄萎病菌具有抑制活性的菌株，获得对该病控制效果好的生防菌株，是值得探讨的棉花黄萎病防治的新途径。本发明的发明人经多年的研究，从健康棉花的茎杆中获得一株内生真菌，经温室苗期试验对棉花黄萎病的防治效果达97.2％，对棉花黄萎病的防治具有巨大的潜能。
发明内容
因此，本发明的发明人为解决现有的利用拮抗微生物防治棉花黄萎病防治效果较差的问题提出并完成本发明。
本发明从棉花的内生真菌入手，通过分离、筛选、鉴定、温室的生物测定，获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的菌株CEF08111(Gibellulopsis nigrescens)，其保藏编号为：CGMCC No.5610。
该菌株是一株棉花的内生真菌，由于其对棉花不致病、无毒害作用。因此在分离时，首先要选择健康的棉株，最重要的是，在分离过程中，一定要保证样品的表面消毒彻底，确保分离到的是棉花的内生真菌。
该菌株经鉴定是一株变黑轮枝菌。从棉花中可以分离到丰富的内生真菌。由于微生物的培养性状容易受培养条件的影响，传统的以形态学为基础的分类鉴定有时候会受到限制。分子生物学的发展给微生物的分类鉴定提供了新的有效措施，因此，以传统的形态学鉴定为基础，结合分子生物学的手段，对筛选到的菌株进行鉴定，最后获得目的菌株。
用于病害防治的菌株能否在植物根际定殖是生防菌株筛选的一个重要指标。棉花黄萎病是一种维管束真菌病害，病原菌从棉株的根尖侵染，通过维管束向上运输、扩展蔓延，危害棉花。内生真菌是一类生活在植物体内，对植物不致病、无毒害作用、与植物互惠共生的真菌。由于棉花黄萎病是一种土传维管束病害，因此，利用该生防菌株来控制棉花黄萎病，首先要选择合适的接种方法，确保生防菌株能顺利在棉花植株内定殖，以达到控制棉花黄萎病的作用。本发明获得的内生真菌来自棉株体内，通过蘸根接种分生孢子悬浮液，生防菌株CEF08111易在棉花植株根际及植株内定殖，且与黄萎病菌具有相同的微生态环境，能直接作用于棉花黄萎病菌。
利用棉花的内生真菌CEF08111来控制棉花黄萎病在以下三方面产生有益效果。
1、CEF08111能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，用于生物防治的菌株必须能够在人工培养基上培养，以利于工厂化生产和推广应用。CEF08111是一株棉花的内生真菌，在土壤中广泛存在，能侵染多种作物，尤其是在南方高温高湿的夏季，更容易从棉花上分离获得。该菌株在PDA、查氏及棉籽培养基上生长良好，有利于大量繁殖和推广应用。
2、CEF08111对黄萎病控制效果好，先接种CEF08111，4天后接种大丽轮枝菌，对棉花黄萎病的防治效果达到97.2％，对黄萎病有显著的控制作用，与生产上应用较多的枯草芽孢杆菌相比，防治效果提高50％左右。
3、CEF08111为环境友好型生防菌株，CEF08111分离自棉花，土壤中广泛存在，对多数的作物不致病，对少数农作物具有极弱的致病性，解决了具有生防潜力的微生物可能转变为致病菌的问题，因此对人畜、昆虫和作物安全，环境友好。
附图说明
图1为CEF08111在PDA上的菌落形态、厚壁孢子及分生孢子；
图2为基于CEF08111的ITS核酸序列及来自GeneBank的轮枝孢属菌不同种的ITS序列构建的N-J***发育树；
图3CEF08111对棉花黄萎病的控制作用，1-1，冀棉11播种后18天接种CEF08111，4天后接种大丽轮枝菌强毒力菌株CVd-AYb；1-2，鲁棉研21播种后18天接种CEF08111，4天后接种大丽轮枝菌强毒力菌株CVd-AYb；2-1，冀棉11播种后22天接种大丽轮枝菌强毒力菌株CVd-AYb；2-2，鲁棉研21播种后22天接种大丽轮枝菌强毒力菌株CVd-AYb；4-1，冀棉11播种后22天接种清水；4-2，鲁棉研21播种后22天接种清水。
内生真菌CEF08111(Gibellulopsis nigrescens)，于2011年12月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCC No.5610。
具体实施方式
实施例1 菌株的分离
(一)样品采集
于7-8月份，在南方的湖北、四川、江苏等棉区，最好在雨后，选择健康棉株，取主茎的中上部及果枝15cm。
(二)菌株的分离
先将采集到的样品(棉花茎杆)用清水洗净，去皮，置于直径为9cm的灭菌的培养皿中，用75％的酒精消毒1min。再用5.0％的次氯酸钠进行消毒60s，用灭菌水洗3次，每次时间不少于3min。然后用灭菌的吸水纸沾干表面的水分，用消毒的剪刀剪成0.4cm长的小段，置于9cm的培养皿中，25℃培养。用最后一遍清洗液为对照，检查消毒是否彻底。每天检查内生真菌的生长情况，发现有菌落长出，及时转移至直径为6cm的培养皿中培养，然后观察其菌落大小、颜色、表面特征、质地。
(三)CEF08111的特征
1、形态特征在PDA平板上，CEF08111的菌落起初为白色，10天后，随着厚壁孢子的产生变为灰褐色，边缘整齐，表面致密，气生菌丝不发达，有同心轮文。显微镜下观察，菌丝宽约为1.9μm，产生轮枝状分生孢子，每轮2-3个分枝，分生孢子为卵圆形，大小为(长×宽)2.3-5.9μm×1.3-3.5μm，平均4.01×2.13μm(长×宽)。厚壁孢子褐色，大小为(长×宽)4.4-7.0μm×3.4-5.8，平均5.9μm×4.9μm(图1)。
2、生理特征CEF08111在5-35℃条件下均能生长，最适生长温度是30℃。在5、10、15、20、25、30、35℃条件下的菌落直径分别为0.0，6.8，9.7，25.1，46.9，49.2和22.8mm。30℃下，菌落直径最大。
3、分子特征CEF08111的ITS序列见(SEQ ID No.1)，将CEF08111的ITS序列与下载轮枝孢属菌rDNAITS序列共同进行了比对，利用ClustalX软件将序列匹配排列，构建***发育树(图2)，结果表明，CEF08111菌株与变黑轮枝菌DQ266224.1和EF543850.1的同源性为100％。
依据CEF08111形态特征、生理特征和分子鉴定结果，将CEF08111归属为Gibellulopsis nigrescens。
SEQ ID No.1
ccgagtacta taactcataa ccctttgtga acctttatac ctgttgcttc ggcggcgcgc 60
ctcccgggcg tgcccgccgg cattatcaga atctctgttc gaacccgacg atacatctga 120
gtgttctaag cgaactgtta aaactttcaa caacggatct cttggctcca gcatcgatga 180
agaacgcagc gaaacgcgat atgtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct 240
ttgaacgcac atggcgcctt ccagtatcct gggaggcatg cctgtccgag cgtcgtttca 300
accctcgagc ccccgtggcc cggcgttggg gatctgccca ggcagtcccc gaaaaccagt 360
ggcggacccg ttgggccctt cctttgcgta gtaacatctg cctcgcatcg ggagctgcgg 420
gctatccggc ctctaaaccc ccctcaagcc gctccggcgg caccagg 467
(四)培养基及培养条件
1.PDA培养基 马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，水1升，自然pH。称取削皮的200g马铃薯，切成小块置于锅中加水煮烂(煮沸20-30分钟)，用纱布过滤后，滤液中加入葡萄糖和琼脂继续加热搅匀，稍冷却后再补水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后120℃灭菌20分钟。
2.查彼(Czapek)液体培养基KNO3，2.00g；K2HPO4，1.00g；KCI，0.50g；MgSO4.7H2O，0.50g；FeSO4.7H2O，0.01g；蔗糖，30.00g；加水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后120℃灭菌20分钟。
3.棉籽培养基将带短绒的棉籽煮5分钟，浸泡6小时使棉籽吸足水分，捞出淋干水分，放入克氏瓶中，120℃灭菌30分钟。
28℃，黑暗培养15d。液体培养需要置摇床150rpm，震荡培养。
实施例2 CEF08111对棉花黄萎病的控制作用
1.、试验方法以耐病品种鲁棉研28和感病品种冀棉11为供试品种，采用蛭石沙土定量蘸菌液法。将灭菌后的蛭石和沙子按6∶4混合，做直径6cm的无底纸钵，放置45cm×35cm的塑料盘内，每钵播种棉花种子8粒，出苗后留苗5株，每品种15个钵，每5个钵为一个重复，3次重复。棉花播种后，将塑料盘置温室中，待棉苗长一片真叶，根据试验设置接种孢子悬浮液10ml，孢子浓度为1×107个孢子/ml。接种方法为，将10ml孢子悬浮液倒入直径10cm的培养皿中，将纸钵从塑料盘中取出放置在培养皿中40s，待孢子悬浮液被吸干后，将纸钵放回塑料盘中。棉苗置18℃-28℃的温室中，按5级分级标准进行病害的分级调查。计算病株率、病情指数和防治效果。
2、试验结果先接种CEF08111，4天后再接种强致病力的大丽轮枝菌菌株CVd-AYb，在冀棉11和鲁棉研28上平清指数分别为1.0和2.1，极显著低于直接接种大丽轮枝菌强致病力菌株CVD05(74.0和49.3)，平均防治效果达97.2％。只接种CEF08111处理的棉苗，没有表现任何病状，且由于显著减轻黄萎病的危害，使棉苗的株高也较直接接种CVd-AYb处理的棉苗显著高。表明CEF08111对棉花黄萎病有很好的防治效果(图3，表1a、及1b，经4个不同处理的冀棉11及鲁棉研21)。
表1a CEF08111对棉花黄萎病的控制作用
表1b CEF08111对棉花黄萎病的控制作用
a：4个不同的处理。1，播种后18天接种CEF08111，4天后接种大丽轮枝菌强毒力菌株CVd-AYb；2，播种后22天接种大丽轮枝菌强毒力菌株CVd-AYb；3，播种后22天接种CEF08111；4，播种后22天接种清水。
b，c：棉花品种。
d：病情指数和株高后面的不同字母，表示不同处理之间差异达极显著水平(LSD，P＜0.01)。
Claims (3)
1.棉花的内生真菌CEF08111，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC No.5610。
2.权利要求1所述内生真菌CEF08111用于防治棉花黄萎病的应用。
3.一种培养权利要求1所述内生真菌CEF08111的方法，其特征在于，在PDA培养基、查彼液体培养基或棉籽培养基28℃黑暗培养15天。
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