CN102584933A - 一种利用亲和双水相***提高凝血因子ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法 - Google Patents

一种利用亲和双水相***提高凝血因子ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102584933A
CN102584933A CN2012100311961A CN201210031196A CN102584933A CN 102584933 A CN102584933 A CN 102584933A CN 2012100311961 A CN2012100311961 A CN 2012100311961A CN 201210031196 A CN201210031196 A CN 201210031196A CN 102584933 A CN102584933 A CN 102584933A
Authority
CN
China
Prior art keywords
blood coagulation
coagulation factor
factor viii
peg
phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012100311961A
Other languages
English (en)
Inventor
汪志友
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN2012100311961A priority Critical patent/CN102584933A/zh
Publication of CN102584933A publication Critical patent/CN102584933A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种提高凝血因子VIII及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的简单、快捷方法。此方法基于应用亲和双水相技术，即将特征亲水高分子化合物，优选聚乙二醇(PEG)，与磷酸盐、或葡聚糖、或其它第二组份在水溶液中形成稳定亲和双水相，其核心技术之一是：实现PEG与凝血因子VIII特异性亲和小肽配位体共价连接。凝血因子VIII优先地定位于连接了亲和小肽配位体的特征亲水高分子化合物相中，而来自细胞提取物的大部分蛋白(或称杂蛋白)倾向于移动至另一相。本发明通过改变目的蛋白或多肽在一相或另一相中的存在，从而得以高效和高纯度纯化所述蛋白或多肽。

Description

一种利用亲和双水相***提高凝血因子Ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法
发明领域
本发明涉及一种提高分离、纯化凝血因子VIII及其类似物效率及其生物活性的方法，属于生物制药领域，其关键是使用共价连接凝血因子VIII特异性亲和小肽配位体的特征亲水高分子化合物，优选聚乙二醇(PEG)，使得特征亲水高分子化合物表面具有凝血因子VIII特异性亲和结合位点。此特异性亲和结合位点不但使凝血因子VIII与特征亲水高分子化合物发生很强的亲和吸附相互作用，而且决定了凝血因子VIII可以富集分散在亲和双水相中的特征亲水高分子化合物相(上相)。本发明方法可以将凝血因子VIII从含凝血因子VIII的体系，包括表达基因重组凝血因子VIII的含成千上万种蛋白质的复杂细胞体系或含凝血因子VIII的人血浆中简单、快捷、特异性地分离出来，且纯度、生物比活性、回收率均大幅度提高。 
背景技术
凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口。这个过程被称为凝血。凝血因子VIII基因位于X染色体长臂末端(Xq28)，长为186kb，由26个外显子组成，其中第14号外显子为3.1kb，是目前发现的人类最大的外显子之一。凝血因子VIII mRNA长9kb，编码一条由2351氨基酸组成的前体 多肽.去除N端19个残基的个信号肽后，成熟蛋自由2332氨基酸组成.氨基酸顺序分析表明，凝血因子VIII蛋白由3个A结构域，一个B结构域及2个C结构域组成。各区的排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2，从血浆中及从重组细胞培养上清中分离纯化得到的凝血因子VIII是由两条肽链所组成，重链由A1-A2-B或A1-A2组成，分子量为90～200kDa不等；轻链由A3-C1-C2所组成，分子量为80kDa，二条肽链间由Ca2+连接。目前的研究表明，B结构域对凝血因子VIII的凝血活性并非必需。 
凝血因子VIII为血友病病人的救命药。然而，不论是以血浆为原料的凝血因子VIII生产法还是以表达基因重组凝血因子VIII细胞为原料的生产法，由于目前生产过程复杂，并且全部使用十分昂贵的抗体，即采用小鼠源单克隆抗体亲和柱层析技术以纯化凝血因子VIII，致使其价格居高不下，且存在很多安全隐患(Clonis YD，Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools develop.J Chromatogr A.2006，1101(1-2)：1-24；Lowe CR，Lowe AR，Gupta G.，New developments in affinity chromatography with potential application in the production of biopharmaceuticals.J Biochem Biophys Methods.2001，49(1-3)：561-74)。尤其在中国，基因重组凝血因子VIII生产法技术迟迟未过关(拜耳属于进口技术除外)，而血浆制品市场来源有限，长期供应紧张，中国又限制血液制品进口，致使凝血因子VIII产品不但价格奇贵，而且总是缺货、断货。总体来说，全球凝血因子VIII药品目前主要的开发方向是，优化凝血因子VIII分离效率、纯化效率与生物比活性的方法，以便在保障其安全性的前提下，降低其生产成本。其中一个主要目标是研发替代生产用小鼠源单克隆抗体亲和柱层析的纯化技术。小鼠源单克隆抗体亲和柱层析纯化法除成本高外，另有其它潜在问题或风险：例如，抗体或其片断在产品洗脱 过程中会从固定相脱落、进入流动相、进入人体，或是凝血因子活性降低，或带来潜在免疫原或由该抗体生产过程所带来的病毒以及未知病原体等(Mejan O，Fert V，Delezay M，Delaage M，Cheballah R，Bourgois A.，Immunopurification of human factor VIII/vWF complex from plasma.Thromb Haemost.1988，59(3)：364-71；Gomperts E，Lundblad R，Adamson R.，The manufacturing process of recombinant factor VIII，recombinate.，Transfus Med Rev.1992，6(4)：247-51)。全球各地科学家努力寻找可以替代上述抗体的小分子。可是，到目前为止，没有成功。 
发明内容
本发明公开了一种提高凝血因子VIII及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的简单、快捷而有效的方法。此方法基于应用亲和双水相，即特征亲水高分子化合物，优选聚乙二醇(PEG)与磷酸盐、或葡聚糖、或其它第二组份在水溶液中形成的双水相，其中的核心技术之一是特征亲水高分子化合物与凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体共价连接。凝血因子VIII优先地定位于连接了亲和小肽配位体的特征亲水高分子化合物相中，而来自细胞提取物的大部分蛋白(或称杂蛋白)倾向于移动至另一相。经过一系列洗涤操作以去除余下的杂质后，通过添加对结合至特征亲水高分子化合物的凝血因子VIII具有竞争性亲和力或可破坏PEG-凝血因子VIII亲和吸附的可溶性分子，反转蛋白质的定位，或曰反向萃取。本发明包括改变目的蛋白或多肽在一相或另一相中的存在，从而得以高效和高纯度纯化所述蛋白或多肽。本发明是关于一种提高凝血因子VIII及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的一种具有成本效益的办法。 
进一步，本发明所涉及的方法与步骤，包括使用机械或化学方法将细胞破碎、与缓冲盐溶液混合、低速低温或常温离心、去除细胞破碎沉淀物、加入特征亲水高分子化合物，优选聚乙二醇(PEG)，及双水相成相成分、借助重力或离心力实现相分离并得到双水相、反复相分离，最后通过改变盐体系、盐浓度、pH值、或添加对结合至特征亲水高分子化合物的凝血因子VIII具有竞争性亲和力或可破坏、拮抗PEG-凝血因子VIII亲和吸附的可溶性分子等措施反转蛋白质相定位的一系列步骤，具有以下特征： 
所述的凝血因子VIII主要是哺乳动物的凝血因子VIII，优选人凝血因子VIII，包括凝血因子VIII的异构体、突变体、基因修饰表达产物、融合表达产物即融合蛋白、化学修饰产物、酶切或化学切割片断(fragment)、部分基因表达成熟肽及其片断或区域(domain)，或片断、区域的连接体、组合体等。 
所述的凝血因子VIII特异性亲和作用配位小肽(包括其化学改性异构体)结构式为： 
NH2-(X-EY1C)-COOH 
其中NH2为小肽氨基端的α-氨基、X表示小肽氨基端的氨基酸亚级结构序列(包括：W、EYHSW等)或为3-吲哚乙酸(3-IAA)、E为谷氨酸、Y1为酪氨酸或与其左侧谷氨酸所形成肽键被还原成CH2的改性酪氨酸、C为半胱氨酸、COOH表示小肽羧基端羧基。按照上式，典型的凝血因子VIII特异性亲和作用配位小肽有： 
L1＝EYHSWEYC； 
L2＝WEYC； 
L3＝3-IAA-EYC，Y表示E-Y之间肽键上羰基未被还原； 
L4＝3-IAA-EY1C，Y1表示E-Y之间肽键上羰基被还原成CH2。 
进一步，用于形成双水相的特征亲水高分子化合物，优选聚乙二醇(PEG)，而其中至少一种特征亲水高分子化合物为半胱氨酸巯基反应活性基团接枝的，优选马来酸酐接枝PEG，简写为Mal-PEG、或PEG-Mal，且具有Mal-PEG、PEG-Mal、Mal-PEG-SCM、DSPE-PEG-Mal、mPEG-Mal、NHS-PEG-Mal、Mal-PEG-Mal结构中的至少一种，优选Mal-PEG结构。 
进一步，选用一种或两种特征亲水高分子化合物(其中至少一种是接枝改性的)混合物与有机盐或无机盐形成亲和双水相***。可通过调节此***的pH值、盐种类、盐浓度等参数来改变***对凝血因子VIII的分配系数。 
进一步，所选特征亲水高分子化合物的分子量大小、分布范围及其相互混合比例是不受限制的，如PEG的分子量可以是300-6000道尔顿、300-2000道尔顿、或3000-6000道尔顿。 
进一步，将所选特征亲水高分子化合物与凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体连接的步骤为：让特征亲水高分子化合物上所接枝的巯基反应活性基团与凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体羧基端的半胱氨酸上的巯基发生化学反应，形成共价连接。所形成的目的产物称为凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体的巯基修饰特征亲水高分子化合物，优选Mal-PEG与L4反应产物，下称L4-Mal-PEG。 
进一步，所选的与前述亲水高分子化合物形成双水相的盐可以是有机酸盐或无机酸盐，特别是多元酸形成的无机盐，如磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐；该盐的阳离子可以是钠离子、钾离子、铵离子、镁离子、锌离子；所使用的盐浓度为3-30％，优选10-18％浓度范围。 
更具体地说，亲和双水相中分离、纯化凝血因子VIII及其类似物的通用优选 方法如下： 
本发明所述的优选的方法基于选择L4-Mal-PEG/磷酸盐和L4-Mal-PEG/葡聚糖的组合用于开发分离方法。L4-Mal-PEG/磷酸盐***能够在pH＝8.0、L4-Mal-PEG浓度为3-15％、磷酸盐浓度为5-15％的范围内形成双相，其中一相富集了L4-Mal-PEG(上相)、另一相富集了磷酸盐(下相)。优选pH＝8.0含15％L4-Mal-PEG和12.5％磷酸盐的***称为分散液P。L4-Mal-PEG/葡聚糖***能够在pH＝8.0、L4-Mal-PEG浓度为3-10％、葡聚糖浓度为5-10％的范围内形成双相，其中一相富集了L4-Mal-PEG(上相)、另一相富集了葡聚糖(下相)。优选pH＝8.0、含6％L4-Mal-PEG和6％葡聚糖的20mMTris-HCl溶液称为分散液D。上述混合液通过离心或重力产生双相。前述凝血因子VIII凝血因子VIII对L4-Mal-PEG的亲和力决定了凝血因子VIII将定位于双水相体系中的L4-Mal-PEG相(上相)中。经过一系列的洗涤，其中包括去除下相并添加相同体积的新鲜缓冲液，始终保持弃去相的组份一致，因此仍然存在相之间的分离。以发表在文献(Johansson，H.W.，Aqueous Two-Phase Systems，Methods in Enzymology，Vol.228，1994)数据为参考，前述新鲜缓冲液的组份为pH＝8.0含1％L4-Mal-PEG和16％磷酸钾，下称洗液P；组份为pH＝8.0含1％L4-Mal-PEG和16％磷酸钾，pH＝8.0、含0.5％PEG和16％葡聚糖的20mMTris-HCl溶液称为洗液D。经过重新混合与相分离后，用洗液P或洗液D取代下相，重复此过程，直到L4-Mal-PEG相凝血因子VIII的纯度相当高。 
本发明所公开的方法及步骤具有如下效果或优点： 
同已有的凝血因子VIII蛋白纯化***如亲和柱层析法相比，本发明具有很多 优点：本发明的方法简单、快速、经济、***通用灵活，可用于广泛的凝血因子VIII浓度。本发明避免了传统亲和柱层析法使用中经常出现的典型问题：装载费时费事、过载压力等。本发明的方法在任何情况下都比固定相载体亲和柱层析法快捷、简单。从更深的技术层面看，亲和双水相法使凝血因子VIII对凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体巯基修饰特征亲水高分子化合物的亲和吸附比共价连接亲和小肽配位体的固定相(如共价连接亲和小肽配位体的Sepharose树脂)更有效，因为本***是存在与溶液中聚合物-水相体系而非固相聚合物载体表面的亲和支撑物。本发明的方法灵活多样，可使用不同的离子力、电导率、离心力、温度、pH值、表面活性剂等来调节***参数，进一步提高凝血因子VIII的分配系数及分离效率。另外，本发明也包括其它双相***，如PEG/柠檬酸盐、PEG/硫酸盐、PEG/淀粉……。 
具体实施方式
实施例一： 
本实施例以L4-Mal-PEG为例，示范如何制备由凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体的巯基修饰的特征亲水高分子化合物。 
取聚乙二醇接枝物Mal-PEG(MW约3600Da)4.2mg，适量配制在pH＝4-8的缓冲液中的L4，室温搅拌12-48小时，后将反应液除去，稀释，置于Amicon Ultra-4超滤管中(MWCO＝1000Da)，除去低分子杂质，后以水为洗脱液，过HiTrap Desalting凝胶柱，将过柱液冷冻干燥，得产品L4-Mal-PEG，保存备用。 
实施例二： 
本实施例显示如何通过亲和双水相从非分泌表达凝血因子VIII的CHO细胞中提取纯化基因重组凝血因子VIII。离心收集一定量的已非分泌表达凝血因子VIII的CHO细胞并重悬于20ml、pH＝8.0、浓度为20mM的磷酸盐缓冲液中，在此情况下用L4-Mal-PEG/磷酸盐***进行纯化；或重悬于20ml、pH＝8.0、浓度为20mM的Tris-HCl缓冲液中(含重组凝血因子VIII约0.14mg)，在此情况下用L4-Mal-PEG/葡聚糖***进行纯化。超声波裂解细胞并离心以除去细胞碎片或残余物。向试样中添加所需的L4-Mal-PEG、磷酸钾、或/葡聚糖，用来重建缓冲液。在烧杯或其它容器中温和地搅拌溶液，(以减少会污染目的蛋白的DNA片断的产生)，直到两种化合物完全重悬。后于12000rpm、4离心5分钟。L4-Mal-PEG上相含目的蛋白凝血因子VIII，下相磷酸盐和葡聚糖溶液保留了大部分细胞杂蛋白、细胞DNA。添加亲和小肽至洗涤缓冲液，使凝血因子VIII蛋白进入下相，回收相含凝血因子VIII浓度为5.7mg/L、回收率为82％。过HiTrap Desalting凝胶柱，将过柱液冷冻干燥，得凝血因子VIII蛋白，RP-HPLC测试纯度为99.7％。采用人凝血因子VIII缺乏血浆为基质血浆及激活的部分凝血活酶(APTT)试剂等，并根据中华人民共和国药典三部附录X N人凝血因子VIII测定法(一期法)测定所纯化的人凝血因子VIII的活性单位为5090IU/mg蛋白质。使用本方法分离纯化凝血因子VIII，简单、快速、纯度高、生物活性好。 

Claims (8)

1.一种提高凝血因子VIII及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的简单、快捷方法。此方法基于应用亲和双水相技术，即将特征亲水高分子化合物，优选聚乙二醇(PEG)，与磷酸盐、或葡聚糖、或其它第二组份在水溶液中形成稳定亲和双水相，其核心技术之一是：实现PEG与凝血因子VIII特异性亲和小肽配位体共价连接。凝血因子VIII优先地定位于连接了亲和小肽配位体的特征亲水高分子化合物相中，而来自细胞提取物的大部分蛋白(或称杂蛋白)倾向于移动至另一相。经过一系列洗涤操作以去除余下的杂质后，通过添加对结合至特征亲水高分子化合物的凝血因子VIII具有竞争性亲和力或可破坏PEG-凝血因子VIII亲和吸附的可溶性分子，反转蛋白质的定位，或曰反向萃取。本发明包括改变目的蛋白或多肽在一相或另一相中的存在，从而得以高效和高纯度纯化所述蛋白或多肽。本发明是关于一种提高凝血因子VIII及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的一种具有成本效益的办法。
本发明所涉及的方法与步骤，包括使用机械或化学方法将细胞破碎、与缓冲盐溶液混合、低速低温或常温离心、去除细胞破碎沉淀物、加入特征亲水高分子化合物，优选聚乙二醇(PEG)，及双水相成相成分、借助重力或离心力实现相分离并得到双水相、反复相分离，最后通过改变盐体系、盐浓度、pH值、或添加对结合至特征亲水高分子化合物的凝血因子VIII具有竞争性亲和力或可破坏、拮抗PEG-凝血因子VIII亲和吸附的可溶性分子等措施反转蛋白质相定位的一系列步骤。
2.根据权利要求1所述凝血因子VIII，其特征在于，所述凝血因子VIII主要是哺乳动物的凝血因子VIII，优选人凝血因子VIII，包括凝血因子VIII的异构体、突变体、基因修饰表达产物、融合表达产物即融合蛋白、化学修饰产物、酶切或化学切割片断(fragment)、部分基因表达成熟肽及其片断或区域(domain)，或片断、区域的连接体、组合体等。
3.根据权利要求1所述的凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体，其特征在于，所述凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体(包括其化学改性异构体)结构式为：
NH2-(X-EY1C)-COOH
式中：NH2为小肽氨基端的α-氨基、X表示小肽氨基端的氨基酸亚级结构序列(包括：W、EYHSW等)或为3-吲哚乙酸(3-IAA)、E为谷氨酸、Y1为酪氨酸或与其左侧谷氨酸所形成肽键被还原成CH2的改性酪氨酸、C为半胱氨酸、COOH表示小肽羧基端羧基。按照上式，典型的凝血因子VIII特异性亲和作用配位小肽有：
L1＝EYHSWEYC；
L2＝WEYC；
L3＝3-IAA-EYC，Y表示E-Y之间肽键上羰基未被还原；
L4＝3-IAA-EY1C，Y1表示E-Y之间肽键上羰基被还原成CH2。
4.根据权利要求1所述用于形成双水相的特征亲水高分子化合物，其特征在于，所述特征亲水高分子化合物是一种亲水性聚合物、且具有在水溶液中形成双水相的能力，所述特征亲水高分子化合物优选聚乙二醇(PEG)，而其中至少一种特征亲水高分子化合物为半胱氨酸巯基反应活性基团接枝的，优选马来酸酐接枝PEG，简写为Mal-PEG、或PEG-Mal，且具有Mal-PEG、PEG-Mal、Mal-PEG-SCM、DSPE-PEG-Mal、mPEG-Mal、NHS-PEG-Mal、Mal-PEG-Mal结构中的至少一种，优选Mal-PEG结构。
5.根据权利要求1所述亲和双水相***，其特征在于，建立双水相时选用一种或两种特征亲水高分子化合物(其中至少一种是接枝改性的)混合物与有机盐或无机盐形成亲和双水相***。可通过调节此***的pH值、盐种类、盐浓度等参数来改变***对凝血因子VIII的分配系数。
6.根据权利要求4所选特征亲水高分子化合物，其特征在于，特征亲水高分子化合物的分子量大小、分布范围及其相互混合比例是不受限制的，如PEG的分子量可以是300-6000道尔顿、300-2000道尔顿、或3000-6000道尔顿，但优选2000-5000道尔顿。
7.根据权利要求1所述特征亲水高分子化合物与凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体共价连接步骤或方法，其特征在于，将权利要求4所述的特征亲水高分子化合物与权利要求2所述的凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体连接的步骤为：让特征亲水高分子化合物上所接枝的巯基反应活性基团与凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体羧基端的半胱氨酸上的巯基发生化学反应，形成共价连接。根据权利要求4所述的优选特征亲水高分子化合物与权利要求2所述的优选凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体与所形成的目的产物称为优选凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体的巯基修饰特征亲水高分子化合物，如Mal-PEG与L4化学反应产物，下称L4-Mal-PEG。
8.根据权利要求1所述的形成双水相的盐，其特征是，所述的形成双水相的盐可以是有机酸盐或无机酸盐，特别是多元酸形成的无机盐，如磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐；该盐的阳离子可以是钠离子、钾离子、铵离子、镁离子、锌离子；所述的盐浓度为3-30％，优选10-18％浓度范围。
CN2012100311961A 2012-02-13 2012-02-13 一种利用亲和双水相***提高凝血因子ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法 Pending CN102584933A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012100311961A CN102584933A (zh) 2012-02-13 2012-02-13 一种利用亲和双水相***提高凝血因子ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012100311961A CN102584933A (zh) 2012-02-13 2012-02-13 一种利用亲和双水相***提高凝血因子ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102584933A true CN102584933A (zh) 2012-07-18

Family

ID=46474250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012100311961A Pending CN102584933A (zh) 2012-02-13 2012-02-13 一种利用亲和双水相***提高凝血因子ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102584933A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102875690A (zh) * 2012-10-15 2013-01-16 南京美福天然药物科技有限公司 一种抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物、制备方法及用途
CN105274158A (zh) * 2015-11-23 2016-01-27 上海应用技术学院 一种采用双水相技术从发酵液中提取聚谷氨酸的方法
CN106046148A (zh) * 2016-06-27 2016-10-26 新乡医学院 一种利用肽配基亲和纯化凝血因子viii的方法
CN106693048A (zh) * 2017-02-23 2017-05-24 苏州睿研纳米医学科技有限公司 一种双组分可注射型原位功能水凝胶生物材料及其制备方法
CN110850081A (zh) * 2014-03-07 2020-02-28 加利福尼亚大学董事会 用于整合分析物提取、浓缩和检测的装置
WO2020133993A1 (zh) * 2018-12-26 2020-07-02 深圳翰宇药业股份有限公司 多肽的纯化方法
CN111876451A (zh) * 2020-08-10 2020-11-03 武汉轻工大学 一种从鸡粪中提取氨基酸的方法
US11885803B2 (en) 2015-09-04 2024-01-30 The Regents Of The University Of California Methods and devices for analyte collection, extraction, concentration, and detection for clinical applications

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010023633A1 (en) * 2000-03-22 2001-09-27 Shuichi Matsumoto Musical score data display apparatus
CN1256426C (zh) * 2004-07-29 2006-05-17 南昌市万华生化制品有限公司 一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法
CN102112156A (zh) * 2008-08-01 2011-06-29 巴克斯特国际公司 凝血因子viii聚合物偶联物
CN102146360A (zh) * 2010-12-31 2011-08-10 杭州师范大学 一种分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法
CN102220300A (zh) * 2011-06-10 2011-10-19 黑龙江大学 双水相萃取分离纯化α-淀粉酶的方法
WO2011131510A2 (en) * 2010-04-21 2011-10-27 Novo Nordisk A/S Selective modification of proteins

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010023633A1 (en) * 2000-03-22 2001-09-27 Shuichi Matsumoto Musical score data display apparatus
CN1256426C (zh) * 2004-07-29 2006-05-17 南昌市万华生化制品有限公司 一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法
CN102112156A (zh) * 2008-08-01 2011-06-29 巴克斯特国际公司 凝血因子viii聚合物偶联物
WO2011131510A2 (en) * 2010-04-21 2011-10-27 Novo Nordisk A/S Selective modification of proteins
CN102146360A (zh) * 2010-12-31 2011-08-10 杭州师范大学 一种分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法
CN102220300A (zh) * 2011-06-10 2011-10-19 黑龙江大学 双水相萃取分离纯化α-淀粉酶的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
皮川真: "凝血因子Ⅷ的纯化", 《万方数据库》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102875690A (zh) * 2012-10-15 2013-01-16 南京美福天然药物科技有限公司 一种抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物、制备方法及用途
CN110850081A (zh) * 2014-03-07 2020-02-28 加利福尼亚大学董事会 用于整合分析物提取、浓缩和检测的装置
CN110850081B (zh) * 2014-03-07 2024-02-06 加利福尼亚大学董事会 用于整合分析物提取、浓缩和检测的装置
US11885803B2 (en) 2015-09-04 2024-01-30 The Regents Of The University Of California Methods and devices for analyte collection, extraction, concentration, and detection for clinical applications
CN105274158A (zh) * 2015-11-23 2016-01-27 上海应用技术学院 一种采用双水相技术从发酵液中提取聚谷氨酸的方法
CN105274158B (zh) * 2015-11-23 2020-01-31 上海应用技术学院 一种采用双水相技术从发酵液中提取聚谷氨酸的方法
CN106046148A (zh) * 2016-06-27 2016-10-26 新乡医学院 一种利用肽配基亲和纯化凝血因子viii的方法
CN106693048A (zh) * 2017-02-23 2017-05-24 苏州睿研纳米医学科技有限公司 一种双组分可注射型原位功能水凝胶生物材料及其制备方法
WO2020133993A1 (zh) * 2018-12-26 2020-07-02 深圳翰宇药业股份有限公司 多肽的纯化方法
CN111876451A (zh) * 2020-08-10 2020-11-03 武汉轻工大学 一种从鸡粪中提取氨基酸的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102584933A (zh) 一种利用亲和双水相***提高凝血因子ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法
Rother et al. The complement system
Murthy et al. RETRACTED: Crystal Structure of a Complement Control Protein that Regulates Both Pathways of Complement Activation and Binds Heparan Sulfate Proteoglycans
US5474911A (en) Promotion of high specificity molecular assembly
JP6590695B2 (ja) アルブミン結合ポリペプチド
KR20140007394A (ko) 면역 글로불린 결합성 신규 폴리펩티드
EA012507B1 (ru) Высокоаффинные мелан-а т-клеточные рецепторы
TW200944218A (en) Mutants of streptokinase and their covalently modified forms
CN102007140A (zh) 生物活性肽
CN101910194A (zh) 供纯化用的双亲和性多肽
CN108289851A (zh) 长效凝固因子及其产生方法
CN102191250A (zh) 特异性结合epo的dna适配体、其制备方法及其用途
JPS5928492A (ja) 細胞培養系よりの血しよう蛋白質の分離
Yeo et al. Novel silica-forming peptides derived from Ectocarpus siliculosus
PL164894B1 (pl) Sposób izolowania c zynnika krzepniecia VIII PL PL PL PL PL PL PL PL
CN109689088A (zh) 稳定的液体纤维蛋白原
JP2000510454A (ja) カルシウム依存性結合タンパク質の改変されたリガンド
Takita et al. Cyclic peptides for efficient detection of collagen
CN101258242B (zh) 膜转位肽
Xia et al. PM1-loaded recombinant human H-ferritin nanocages: A novel pH-responsive sensing platform for the identification of cancer cells
Demolliens et al. Tyrosinase-catalyzed synthesis of a universal coil-chitosan bioconjugate for protein immobilization
CN102033057A (zh) 基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法
CN105017410A (zh) 一种b区部分缺失型重组人凝血因子ⅷ
Bonde et al. Random mutagenesis of amelogenin for engineering protein nanoparticles
CN101899118B (zh) 一种融合蛋白HABP-mKate及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: 213161, Room 102, unit 57, Hutang four seasons new town, Wujin District, Jiangsu, Changzhou

Applicant after: Wang Zhiyou

Address before: 100093 Beijing city Haidian District minzhuang Road Beijing Fragrant Garden No. 80

Applicant before: Wang Zhiyou

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM:

SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 158, biological building, No. 217, Renmin East Road, Wujin District, Changzhou, Hutang, 213161, Jiangsu

Applicant after: Wang Zhiyou

Address before: 213161, Room 102, unit 57, Hutang four seasons new town, Wujin District, Jiangsu, Changzhou

Applicant before: Wang Zhiyou

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120718