CN102574897B - 嵌合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供嵌合冠状病毒S蛋白，所述蛋白基于来自具有限制组织嗜性的冠状病毒株的S蛋白，但是其包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的至少部分S2亚基，使包含所述嵌合S蛋白的病毒具有扩展组织嗜性。本发明还提供包含这种嵌合S蛋白的病毒。

Description

嵌合蛋白
发明领域
本发明涉及嵌合冠状病毒S蛋白。特别是，当用于产生病毒时，导致病毒具有扩展组织嗜性(extended tissue tropism)的嵌合冠状病毒S蛋白。本发明还涉及编码这种嵌合蛋白的核苷酸序列；包含这种嵌合蛋白的病毒颗粒，和它们在预防和/或治疗疾病的疫苗中的用途。
发明背景
传染性支气管炎病毒(IBV)
禽传染性支气管炎病毒(IBV)是家禽的具有高度传染性(infectious)和感染性(contagious)的病原，其主要在呼吸道中复制，但也在肠、肾和输卵管的上皮细胞中复制。IBV是冠状病毒科(Coronaviridae)的成员，而且遗传学上非常相似的冠状病毒在火鸡和雉(pheasant)中引起疾病。
IB的临床症状包括打喷嚏、气管罗音、流鼻涕和气喘(wheezing)。肉禽的体重增加减缓，而蛋禽则产蛋量下降。呼吸道感染使禽类容易产生二次细菌感染，其在幼禽(chick)中可为致命的。病毒还能引起(特别是幼禽中)输卵管永久性损害，导致产蛋数量和质量下降；以及肾永久性损害，有时引起可为致命的肾病。
活疫苗和减毒疫苗两者目前都用于IB疫苗接种。至今为止，最有效的疫苗是通过经胚胎蛋盲目重复传代以经验方法产生的减毒活疫苗。
这种方法的问题是，在系列传代时，病毒的免疫原性下降。必需实现可接受的减毒程度使病毒安全和可接受的免疫原性损失使病毒疫苗仍然有效两者之间的平衡。减毒的“平衡”是试错法(trial and error approach)，使得减毒过程的结果不确定。
由于通过系列传代而减毒实际上是随机事件，因为减毒的分子基础未知，所以获得的疫苗没有清楚的遗传学定义。每批减毒病毒都不同，很难实现所得疫苗的一致性和体内预防/治疗效果的再现性。
另一个缺点是胚胎蛋很昂贵，而且不能用作持久的病毒来源。
病毒在胚胎蛋上的生长是个棘手的过程，因为每只蛋都必须灭菌、照检、接种病毒和孵育，然后从每只蛋收获少量的尿囊液，汇集然后纯化。高质量蛋的可靠供应不足导致可产生的疫苗量受到限制，特别是在紧急情况下。
除了这些物流和供应问题，胚胎蛋作为疫苗生产的宿主***还有其它局限。例如，越来越多的对于存在外来病毒的关注，特别是蛋中的逆转录病毒，其会危害减毒活病毒疫苗的产生。
因此需要可替换的IBV疫苗及其生产方法，从而不受上述缺陷所累。
冠状病毒
冠状病毒是在细胞质中复制且含有27至32kb的非节段(unsegmented)、单链、正义RNA基因组的包膜病毒。
所有冠状病毒脂质包膜都含有至少三个膜蛋白：刺突糖蛋白(S)、膜内在蛋白(M)，和小膜蛋白(E)。冠状病毒S蛋白是I类糖蛋白，其在内质网中低聚化并通过与膜蛋白之间的非共价相互作用而装配入病毒体膜。在并入冠状病毒颗粒后，S蛋白负责与靶细胞受体的结合以及病毒与细胞膜的融合。S糖蛋白由四个域组成：在合成过程中切割的信号序列；外功能区，其存在于病毒体颗粒之外；负责将S蛋白锚定于病毒体颗粒脂双层中的跨膜区；和胞质尾区。
IBV S蛋白(1162个氨基酸)被切割成两个亚基，S1(535个氨基酸；90kDa)，包含S-蛋白的N-末端部分，和S2(627个氨基酸；84kDa)，包含S蛋白的C-末端部分。
S2蛋白亚基与S1亚基非共价结合，并含有跨膜和C-末端胞质尾区域。
已经广泛报道S1亚基包含S蛋白的受体-结合活性。
例如，已显示对于血清组I冠状病毒，人冠状病毒HCoV-229E而言，在S1的N-末端结构域中有截断的三个变体中的两个不能结合受体，表明氨基酸417和547之间的区对于受体结合是重要的(Bonavia等(2003)J.Virol 77.2530-2538)。
鼠肝炎病毒(MHV)S蛋白的769个残基S1亚基的前330个氨基酸足以结合MHV受体(Kubo等(1994)J.Virol.68：5403-5410)。相似地，SARS S蛋白的193个氨基酸片段(残基318-510)结合于受体并阻断S-蛋白介导的感染(Wong等(2004)J.Biol.Chem.279：3197-3201)。
还据报道SARS-CoV S糖蛋白的氨基酸1-510代表含有受体结合位点(氨基酸270-510)的域，所述位点类似于其它冠状病毒S糖蛋白的S1亚基(Babcock等(2004)J.Virol.4552-4560)。
S蛋白是病毒的细胞嗜性的决定因素(Casias等(2003)J.Virol.77：9084-9089)。已显示S1蛋白的N-末端区中的氨基酸取代与鼠肝炎病毒(MHV)的病毒变体的扩展宿主范围相关(Thackray和Holmes(2004)Virology 324：510-524)。而且，通常认为感染的种特异性是由于病毒-受体相互作用的特异性而产生的(Compton等(1992)J.Virol.7420-7428；Gagneten等(1995)J.Virol.69：889-895)。
因此，至今为止已经普遍认为细胞嗜性是冠状病毒的S蛋白的S1域的性质。
发明简述
本发明的发明人令人惊讶地显示了冠状病毒的细胞嗜性由S2蛋白决定，并且用另一种冠状病毒的全部或部分取代S2蛋白能改变(扩展或缩小)病毒的细胞嗜性，取决于S2蛋白所来源的病毒的细胞嗜性。
这意味着不能在细胞系上生长的免疫原病毒疫苗可以通过取代其S2蛋白的全部或部分而诱导生长。
因此，在第一方面，本发明提供嵌合冠状病毒S蛋白，其基于来自具有限制组织嗜性的冠状病毒株的S蛋白，但是包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的至少部分S2亚基，使包含所述嵌合S蛋白的病毒具有扩展组织嗜性。
嵌合S蛋白可以包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的全部或部分S2亚基。
例如，嵌合传染性支气管炎病毒(IBV)S蛋白可以包含部分S2序列，其在S2蛋白的对应于作为SEQ ID No.1给出的序列的残基686和691之间的部分中包含序列XBBXBX，其中B是碱性残基而X是任何氨基酸。
序列XBBXBX可以，例如，是序列SRRKRS或SRRRRS。嵌合S蛋白可以在S2蛋白的对应于作为SEQ ID No.1给出的序列的残基686和694之间的部分中包含序列SRRKRSLIE或SRRRRSVIE。
冠状病毒可以，例如是：传染性支气管炎病毒(IBV)；犬冠状病毒(CCoV)；猫冠状病毒(FeCoV)；人冠状病毒229E(HCoV-229E)；猪流行性腹泻病毒(PEDV)；传染性胃肠炎病毒(TGEV)；人冠状病毒NL63(NL或New Haven)；牛冠状病毒(BCoV)；犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)；人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)；小鼠肝炎病毒(MHV)；猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)；大鼠冠状病毒(RCV)；火鸡冠状病毒(TCoV)；HCoV-HKU1；严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)；或火鸡冠状病毒(蓝冠病病毒(Bluecomb disease virus))。
其中所述冠状病毒是IBV，具有扩展组织嗜性的IBV株可以是IBVBeaudette。
在第二方面，本发明提供能编码根据本发明第一方面的嵌合S蛋白的核苷酸序列。
本发明还提供包含根据本发明第二方面的核苷酸序列的质粒。
在第三方面，本发明提供病毒颗粒，其包含根据本发明第一方面的嵌合S蛋白，和/或根据本发明第二方面的核苷酸序列。
病毒颗粒可以是重组痘苗病毒(rVV)或冠状病毒。
病毒颗粒可为能在细胞系如Vero细胞上生长的。
根据本发明第三方面的病毒颗粒对Vero细胞的感染可通过可溶性肝素阻断。
在第四方面，本发明提供产生根据本发明第三方面的病毒颗粒的方法，所述方法通过下述步骤产生病毒颗粒：
(i)将如前面部分所述的质粒转染入宿主细胞；
(ii)用重组病毒感染宿主细胞，所述重组病毒包含具有限制组织嗜性的冠状病毒株的基因组，缺少至少部分S2亚基；
(iii)允许在质粒中的S基因序列和重组病毒基因组中的相应序列之间发生同源重组以产生嵌合S基因；和
(iv)选择包含嵌合S基因的重组病毒。
重组病毒可为痘苗病毒。
为了产生重组冠状病毒颗粒，可以使用来自步骤(iv)的病毒DNA采用反向遗传***(reverse genetics system)原位产生冠状病毒RNA。
因此上述方法任选地包括步骤：
(v)从来自步骤(iv)的重组病毒的DNA回收包含嵌合S基因的重组冠状病毒。
在第五方面，本发明提供能够产生根据本发明第四方面的病毒颗粒的细胞。所述细胞可以，例如，是能使用反向遗传***产生重组病毒的细胞，如原代鸡肾细胞，或者用根据本发明第四方面的病毒颗粒感染的细胞。
用根据本发明第四方面的病毒颗粒感染的细胞可以源自细胞系，如Vero细胞。
在第六方面，本发明提供包含本发明第四方面的病毒颗粒的疫苗。
本发明进一步的方面提供：
(i)用于治疗和/或预防受试者中的疾病的方法，其包括对受试者施用根据本发明第六方面的疫苗的步骤；
(ii)根据本发明第六方面的疫苗，用于治疗和/或预防受试者中的疾病；
(iii)根据本发明第四方面的病毒颗粒在制造用于治疗和/或预防受试者中的疾病的疫苗中的用途。
(iv)用于产生根据本发明第六方面的疫苗的方法，其包括用根据本发明第四方面的病毒颗粒感染Vero细胞的步骤；
(v)用于改变冠状病毒的细胞嗜性的方法，其包括用来自不同株的S2蛋白或其相应部分取代至少部分S2蛋白的步骤；和
(vi)细胞培养物，所述培养物包含根据本发明第五方面的细胞或细胞群体。
由于嵌合基因的存在而赋予病毒的扩展细胞嗜性意指用于疫苗产生的病毒储液可以通过在细胞系，而不是胚胎蛋或原代细胞上生长而产生。
细胞系如Vero细胞的使用具有很多优势：
(i)先前已经对于病毒的生长和诊断目的进行了确证；
(ii)细胞(并且因此病毒)能够在悬液而不是平板(flat bed)中生长；和
(iii)可能实现一致的得率(yield)。
附图简述
图1-IBV S蛋白的示意图。功能S蛋白被糖基化并作为同源三聚体存在于病毒体膜中。S1亚基的三聚形式构成受体结合结构域。
图2-显示来自Beaudette(Beau-R)和M41的S蛋白和嵌合S蛋白BeauR-M1B2(S)、BeauR-B1M2(S)、Beau-S-M41-Hep和M41-S-Beau-Hep的示意图。所有嵌合S蛋白的跨膜(TM)结构域和胞质(胞)尾域均源自Beaudette S蛋白。S2亚基中硫酸乙酰肝素-结合位点的位置用HSBS表示。
图3-含有嵌合S糖蛋白基因的质粒的产生。使用位于复制酶基因中的引物，跨越S1/S2接合点和基因3，通过PCR从两个质粒pGPT-M41S和pGPT-IBV-StuI-BamHI扩增Beau-R和M41的S1和S2亚基。使用重叠PCR合并亚基，形成嵌合S基因，然后用NsiI(位于复制酶基因中的限制位点)和BspEI(位于基因3中的限制位点)剪切所述基因。受体质粒pGPT-IBV-StuI-BamHI也用NsiI和BspEI剪切，并且通过凝胶提取而去除Beaudette S基因。将嵌合S基因连接入包含大肠杆菌鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因的残余pGPT-IBV-StuI-BamHI骨架中。
图4-pGPT-IBV-StuI-BamHI和pGPT-M41S的图。
使用质粒pGPT-IBV-StuI-BamHI和pGPT-M41S通过PCR扩增Beau-R和M41S1和S2亚基。S基因附近的复制酶基因和基因3源自Beaudette。pGPT-M41S中M41S基因的C-末端已对Beau-R S基因C-末端进行交换，因为这是与M蛋白相互作用的区域。M41和Beau-R S蛋白的C-末端彼此差别非常大，使嵌合S蛋白可与来自Beau-R的其它结构蛋白相互作用，决定保留Beau-R S基因C-末端。从pGPT-IBV-StuI-BamHI去除Beau-R S基因并将嵌合S基因***到其位置，以生成质粒pGPT-S1M41S2Beau和pGPT-S1BeauS2M41。
图5-IBV反向遗传***。
由嵌合S基因和IBV基因组中部分相邻基因构建包含gpt的质粒载体。将质粒转染入用含有IBV基因组(缺少S基因)的rVV感染的Vero细胞中。在存在和不存在gpt选择元件的情况下各进行三轮噬斑纯化，以选择含有嵌合S基因的rVV。在BHK-21细胞中制备大量病毒储液，从所述细胞纯化病毒并进行DNA提取。将VV基因组中的重组IBV cDNA和表达IBV N蛋白的质粒转染入用rFPV-T7感染的CK细胞中。过滤上清并用于在CK细胞上的传代，并回收具有嵌合S基因的rIBV。
图6-用多种IBV感染后48小时的感染Vero细胞。
图7-Vero细胞上的rIBV生长的共焦显微术。用rIBV感染Vero细胞，并在感染后固定24小时，并用小鼠抗-dsRNA、二抗AlexaFluor 488羊抗-小鼠(绿色，Invitrogen)免疫标记以检测IBV感染的细胞。所有细胞的细胞核用DAPI(蓝色)标记。
图8-rIBV在Vero细胞上的生长动力学。用Beau-R、M41-CK、BeauR-M41(S)、BeauR-M1B2(S)、BeauR-B 1M2(S)、Beau-S-M41-Hep和M41-S-Beau-Hep以0.1的多重性感染(multiplicity of infection)感染Vero细胞。在感染后1、12、24、48和72小时收获上清并在CK细胞上测滴度。进行三次重复并取平均值。误差线表示平均值的标准偏差。
图9-用渐增量的可溶性肝素预处理的IBV在Vero细胞上的噬斑减少试验(plaque reduction assay)。
图10-比较可溶性肝素对IBV感染的Vero细胞百分比的影响的柱状图。在感染Vero细胞之前，用PBS(-)或可溶性肝素，15mg/ml(+)在室温将IBV株Beau-R和BeauR-M1B2(S)温育30分钟。感染后将细胞固定24小时，然后用小鼠α-dsRNA、二抗羊α-小鼠IgG(绿色，Invitrogen)进行免疫标记，并用DAPI将核染成蓝色。通过40倍放大的共焦显微术每个样品分析十个视野，并计算感染细胞的百分比。
图11-Beaudette(Beau-R)、M41、具有将硫酸乙酰肝素结合位点修饰成相应M41序列的Beaudette(Beau-S-M41-Hep)和具有Beaudette硫酸乙酰肝素结合位点的M41(M41-S-Beau-Hep)。
图12-Beaudette和M41的比较。a)S蛋白序列，和b)S2区。
图13-M41和Beaudette S蛋白之间的氨基酸差异。
图14-M41和Beaudette S2区之间的氨基酸差异。
发明详述
冠状病毒
冠状病毒是属于冠状病毒科的动物病毒属。冠状病毒是具有正义单链RNA基因组和螺旋对称性的包膜病毒。冠状病毒的基因组大小从约27至32千碱基，是任何已知RNA病毒中最长的。
冠状病毒主要感染哺乳动物和鸟类的上呼吸道和胃肠道。冠状病毒的四至五种不同的目前已知的株感染人。最广为人知的人冠状病毒，可引起SARS的SARS-CoV，具有独特的发病机理，因为它可以引起上呼吸道和下呼吸道感染，还能引起肠胃炎。人们相信冠状病毒引起成年人中所有普通感冒的大部分。
冠状病毒还引起农场动物和驯养宠物中的多种疾病，其中有些可为非常严重，且为对农业生产的威胁。农场动物的经济上重要的冠状病毒包括传染性支气管炎病毒(IBV)，其主要引起鸟类中的呼吸道疾病，并严重影响全世界的家禽业；猪冠状病毒(感染性肠胃炎，TGE)和牛冠状病毒，两者均导致年幼动物中的腹泻。猫冠状病毒有两种形式，猫肠冠状病毒是临床影响较小的病原，但是这种病毒的自发突变能引起猫传染性腹膜炎(FIP)，一种与高死亡率相关的疾病。还有两类犬冠状病毒(CCoV)，一种引起轻微肠胃疾病，一种已发现引起呼吸疾病。鼠肝炎病毒(MHV)是引起具有高死亡率的流行性鼠病的冠状病毒，特别是在实验室小鼠群体中。
冠状病毒可分成三组，如下所示：
第1组
●犬冠状病毒(CCoV)
●猫冠状病毒(FeCoV)
●人冠状病毒229E(HCoV-229E)
●猪流行性腹泻病毒(PEDV)
●传染性胃肠炎病毒(TGEV)
●人冠状病毒NL63(NL或New Haven)
第2组
●牛冠状病毒(BCoV)
●犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)-常见于东南亚(SE Asia)和密克罗尼西
亚(Micronesia)
●人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)
●小鼠肝炎病毒(MHV)
●猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)
●大鼠冠状病毒(RCV)。大鼠冠状病毒在东澳大利亚非常普遍，2008年三/四月，在天然和野生啮齿动物群落中发现。
●火鸡冠状病毒(TCoV)
●(尚无通用名)(HCoV-HKUl)
●严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)
第3组
●传染性支气管炎病毒(IBV)
●火鸡冠状病毒(蓝冠病病毒)
本发明的病毒可以是第1组冠状病毒如TGEV；第2组冠状病毒如MHV；或者第3组冠状病毒如IBV。
IBV
禽类传染性支气管炎(IB)是急性并且高传染性的鸟类呼吸道疾病，其引起严重的经济损失。疾病的特征为呼吸道症状，包括气喘、咳嗽、打喷嚏、气管罗音和流鼻涕。在年幼鸟类中，可发生严重的呼吸困难。在蛋禽中，呼吸困难、肾炎、产蛋量下降，和蛋内部品质与蛋壳品质降低是常见的。
在肉禽中，咳嗽和发出咕噜声(rattling)是常见的临床症状，可在舍内所有禽只中快速传播。在未接种疫苗的群体中发病率为100％。发病率依赖于年龄、病毒株和二次感染而不同，但是在未接种疫苗的群体中可以达到60％。
鉴定的第一种IBV血清型是Massachusetts(马萨诸塞型)，但是除了最初鉴定的马萨诸塞型，几种血清型包括Arkansas(阿肯色型)和Delaware(特拉华型)，目前正在美国传播。
在禽胚中至少150次传代后得到IBV株Beaudette。对于成年鸟类，IBVBeaudette不再是病原性的，但是能迅速杀死胚胎。
图12和表1显示了IBV Beaudette和M41之间的氨基酸差异。
H120是商业化的活IBV Massachusetts血清型疫苗株，通过在胚胎禽蛋中约120次传代而减毒。H52是另一Massachusetts株，且代表在H120发展过程中更早且病原性略强的传代病毒(52代)。通常使用基于H120和H52的疫苗。
S-蛋白
冠状病毒S蛋白包含大量重度糖基化的外功能区，其在生物合成过程中由高尔基体中的弗林样酶(furin-like enzyme)切割为两个亚基(S1和S2)。并非所有冠状病毒都被切割，即使未切割，S蛋白的基本亚基结构仍是保守的。S1包含受体结合域(Li等(2005)Science 309：1864-1868)，而S2包含融合体域。IBV的S蛋白在S1/S2边界被完全切割，特别是在禽胚胎***中。
S2结构域含有五个域或功能区，如图1所示：两个域，HR1和HR2形成螺旋结构，产生蛋白的杆状结构(stalk structure)；负责将蛋白锚定至病毒体膜的跨膜域；富含半胱氨酸的胞质域，负责与其它病毒结构蛋白相互作用；和第五个域，融合肽，负责病毒-细胞融合或细胞与细胞融合。
M41和Beaudette S蛋白之间的氨基酸差异和S2区分别如图13和14所示。
组织嗜性
冠状病毒表现出强的物种和组织嗜性。同样地，IBV的临床分离株在体内和细胞培养物中显示不同的嗜性。
M41株已经适应了在原代幼禽肾(CK)细胞上的生长，并且仅限于感染原代禽细胞，因此需要在胚胎蛋或CK细胞上生长。
另一方面，已知Beaudette株能够感染培养物中的多种细胞，包括Vero和幼仓鼠肾(BHK)细胞。
具有限制组织嗜性的冠状病毒能感染的细胞类型比具有扩展组织嗜性的冠状病毒少。
具有限制组织嗜性的冠状病毒可以，例如仅限于感染原代细胞，而具有扩展组织嗜性的冠状病毒可(除了能够感染原代细胞之外)能够感染一种或多种细胞系。
具有扩展组织嗜性的冠状病毒可以，例如，具有感染Vero细胞的能力。
Vero细胞谱系1962年分离自从非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)提取的肾上皮细胞。Vero细胞用于很多实验和临床目的，包括用作生长病毒的宿主细胞。
Vero细胞谱系是连续的，可通过多次分化循环复制并且不会衰老。
Vero细胞已被许可用于制造疫苗，并且目前用于生产脊髓灰质炎和狂犬病疫苗。
具有限制组织嗜性的株可为免疫原性的并且能够诱导体内预防性或治疗性免疫应答。具有限制组织嗜性的株可为，例如，目前用于疫苗生产的株。对于IBV，其包括株如：H52、H120、Ma5、4/91、D41、D274和W93。具有限制组织嗜性的株可为或源自“野外”分离株如BJ1、BJ2或BJ3(Li和Yang(2001)Avian Pathol 30：535-541)。
对于IBV，具有扩展组织嗜性的株可为，例如，IBV Beaudette，使得本发明的嵌合蛋白包含全部或部分IBV Beaudette S2蛋白。
细胞嗜性可以通过用经病毒感染简单刺激给定的细胞类型而由实验建立。然后可以在一定传代次数后分析细胞病理效应(cpe)和合胞体形成程度，如实施例中所述。可以使用显微术分析感染细胞形态学上的变化。
嵌合蛋白
本发明涉及嵌合冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)，其基于来自具有限制组织嗜性的冠状病毒株的S蛋白，但是其包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的至少部分S2亚基。
术语“基于”表示至少S1域源自或可源自具有限制组织嗜性的株。嵌合蛋白还可以包含来自具有限制组织嗜性的株的部分S2域。例如，跨膜和/或胞质域可为源自或可源自具有限制组织嗜性的株。
嵌合蛋白可包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的全部或部分S2亚基。
嵌合蛋白可包含位于，例如，IBV Beaudette的S2亚基中的硫酸乙酰肝素结合位点。
嵌合传染性支气管炎病毒(IBV)S蛋白可，例如，在S2蛋白的对应于如SEQ ID No.1给出的序列的残基686和691之间的部分中包含序列XBBXBX(图12ABEAU-CK序列)，其中B是碱性碱基，而X是任何氨基酸。
例如，蛋白可在S2蛋白的对应于如SEQ ID No.1给出的序列的残基686和691之间的部分中包含序列SRRKRS或SRRRRS。
例如，蛋白可在S2蛋白的对应于如SEQ ID No.1给出的序列的残基686和694之间的部分中包含序列SRRKRSLIE或SRRRRSVIE。
嵌合蛋白可包含基本上全部S2序列部分，其是来自具有扩展组织嗜性的株的N-末端至HR1域。嵌合蛋白可包含部分S2序列，其是来自具有扩展组织嗜性的株的N-末端至HR1域，以及HR1域。嵌合蛋白可包含部分S2序列，其是来自具有扩展组织嗜性的株的N-末端至HR1域，HR1域和HR1与HR2域之间的序列的部分。嵌合蛋白可包含部分S2序列，其是来自具有扩展组织嗜性的株的N-末端至HR1域，HR1域，HR1与HR2域之间的序列的部分和HR2域。
嵌合蛋白可包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的基本上全部S2亚基。
嵌合蛋白可包含表1和图14中所示的S2区十九种氨基酸变化中的一种或多种。具体地，嵌合蛋白可在位置687包含精氨酸残基，在位置689包含赖氨酸残基。嵌合蛋白还可在位置692包含亮氨酸残基。
术语“基本上全部”表示嵌合蛋白包含野生型序列的相应部分的至少95％。缺失的氨基酸可以位于序列中任何位置，并且可为成组在一起(从而缺失序列的小部分)或单独的。
当部分嵌合蛋白可源自给定株的S蛋白时，所述部分可具有与野生型序列的相应部分相同的氨基酸序列，或者与野生型序列相比，它可具有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，只要保留序列该部分的初始功能即可。
术语“野生型”用于意指具有与天然蛋白(即病毒蛋白)相同的一级氨基酸序列的多肽。
突变体序列可以天然产生，或者人工生成(例如通过定点突变)。突变体可与野生型序列的相应部分具有至少70、80、90或95％的序列同一性。突变体在野生型序列的相应部分可具有少于20、10或5个突变。
同一性比较可通过目测进行，或者更通常地，在容易可用的序列比较程序的帮助下进行。这些商业上可得到的计算机程序可计算两个或多个序列之间的％同一性。进行这种比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Unviersity of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12：387)。能进行序列比较的其它软件的实例包括，但不限于，BLAST软件包(参见Ausubel等，1999ibid-第18章)、FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和比较工具的GENEWORKS套装。BLAST和FASTA可用于离线和在线检索(参见Ausubel等，1999ibid，7-58至7-60页)。然而，对于有些应用，优选使用GCGBestfit程序。一个新工具，称作BLAST 2 Sequences也可用于比较蛋白和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999177(1)：187-8和tatianancbi.nlm.nih.gov)。
序列可以具有一个或多个氨基酸残基的缺失、***或取代，产生沉默变化并得到功能上等同的分子。只要能够保留活性，可基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行故意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有具有相似亲水性值的不带电的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以，例如根据下表，进行保守取代。第二列中相同单元格内的氨基酸，并且优选第三列中相同行的氨基酸，可以互相取代。
本发明还提供用于改变冠状病毒的细胞嗜性的方法，其包括用来自不同株的S2蛋白或其相应部分取代至少部分S2蛋白的步骤。
可通过本领域已知的方法，如通过剪切和连接，来交换序列的部分。
“相应部分”，意指当具有限制组织嗜性的株的S蛋白的序列与具有扩展组织嗜性的S蛋白的序列进行比对时(如，例如图12A和12B中所示)，与另一个序列比对的一个序列的部分。
不同株的S蛋白之间的比对是直接的，因为冠状病毒共享通用的域结构并且，在不同株之间，应具有相对高水平的序列同一性。可以使用比对软件，如上述的BLASTTM软件包。
核苷酸序列
本发明还提供能编码嵌合蛋白的核苷酸序列。
核苷酸序列可为天然、合成或重组的。它可为双链或单链，它可为DNA或RNA或其组合。它可为，例如，cDNA、PCR产物、基因组序列或mRNA。
核苷酸序列可为密码子优化的用于在所选宿主/宿主细胞中生产。
核苷酸序列可为分离的，或者作为质粒、病毒或宿主细胞的一部分。
质粒
质粒是与染色体DNA相分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。它们通常是环状和双链的。
质粒，或(有时称作)载体，可用来在宿主细胞中表达蛋白。例如可用能够编码特定蛋白的质粒转染细菌宿主细胞，以表达该蛋白。此术语还包括酵母人工染色体和细菌人工染色体，它们能容纳较长的DNA部分。
本发明的质粒包含能编码嵌合S基因的核苷酸序列。它还可包含一个或多个其它冠状病毒核苷酸序列，或者能够编码一个或多个其它冠状病毒蛋白的核苷酸序列，如复制酶基因和/或基因3。
质粒还可以包含抗性标记，如来自大肠杆菌的黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)，其在黄嘌呤和次黄嘌呤存在下赋予对霉酚酸(MPA)的抗性，并由痘苗病毒P7.5早期/晚期启动子控制。
病毒颗粒
本发明还涉及具有嵌合S基因的病毒颗粒。所述病毒颗粒可为重组痘苗病毒(rVV)或冠状病毒。
病毒颗粒可为重组的。
病毒颗粒可使用反向遗传***产生，如基于反向遗传***的痘苗病毒。
在这个方面，本发明还提供通过下述步骤产生病毒颗粒的方法：
(i)将如前所述的质粒转染入宿主细胞；
(ii)用包含具有限制组织嗜性的冠状病毒株基因组的重组病毒感染宿主细胞，所述基因组缺少至少部分S2亚基；
(iii)允许在质粒中的S基因序列和重组病毒基因组中的相应序列之间发生同源重组，以产生嵌合S基因；
(iv)选择包含所述嵌合S基因的重组病毒。
具有限制组织嗜性的冠状病毒株的基因组可缺少S2蛋白的对应于由质粒提供的部分的部分，从而形成嵌合蛋白。
重组病毒适于允许其基因组和质粒之间的同源重组。痘苗病毒是特别合适的，因为同源重组常规用于***和缺失痘苗病毒基因组的序列。
上述方法任选地包括如下步骤：
(v)从来自步骤(iv)的重组病毒的DNA回收包含所述嵌合S基因的重组冠状病毒。
用于回收重组冠状病毒如重组IBV的方法是本领域中已知的(参见Britton等(2005)24页)。
例如，可将来自步骤(iv)的重组病毒的DNA***质粒中，并用于转染表达胞质T7 RNA聚合酶的细胞。(所述细胞可，例如用表达T7 RNA聚合酶的鸡痘病毒预感染)。然后可分离重组冠状病毒，例如，从生长培养基中分离。
在将质粒***痘苗病毒基因组中时会形成不稳定的中间体。可以，例如，使用质粒上的抗性标记选择包含质粒的重组体。
然后可以通过，例如，PCR和测序，验证阳性重组体包含嵌合S基因。
可以生长大量包括嵌合S基因的重组病毒(例如重组痘苗病毒，rVV)，并提取DNA，以进行步骤(v)。
合适的反向遗传***是本领域中已知的(Casais等(2001)J.Virol 75：12359-12369；Casais等(2003)J.Virol.77：9084-9089；Britton等(2005)J.Virological Methods 123：203-211；Armesto等(2008)Methods in MolecularBiology 454：255-273)。
细胞
病毒颗粒可用于感染细胞。
因为包含嵌合S基因的病毒颗粒具有扩展的组织嗜性，所以细胞可为可源自细胞系或者部分细胞系。
细胞可，例如为幼仓鼠肾细胞(例如BHK-21)或Vero细胞。
细胞可以用于产生病毒颗粒。
因此本发明还提供用于产生病毒颗粒的方法，所述方法包括下述步骤：
(i)用根据本发明第六方面的病毒颗粒感染细胞；
(ii)使病毒在细胞中复制；和
(iv)收获后代病毒。
细胞可来自细胞系或者是细胞系的部分，如Vero细胞。可，例如，通过本领域已知的方法从上清液收获病毒颗粒，并且任选地进行纯化。
本发明还提供能使用反向遗传***产生根据本发明第四方面的重组病毒颗粒的细胞。例如，细胞可包含重组病毒基因组，所述基因组包含能够编码嵌合S基因的核苷酸序列。
细胞能够产生包含嵌合S基因的重组病毒(例如痘苗病毒)。细胞可为Vero细胞。
可替换地，细胞能够通过反向遗传***产生重组冠状病毒。细胞可以表达或者经诱导表达T7聚合酶以拯救(rescue)重组病毒颗粒。细胞可为CK细胞。
疫苗
病毒颗粒可以用于产生疫苗。
疫苗可为病毒颗粒的活的减毒形式。
本发明还涉及用于产生这种疫苗的方法，所述方法包括用病毒颗粒感染细胞，例如Vero细胞的步骤，所述病毒颗粒包含根据本发明第一方面的嵌合蛋白。
疫苗接种方法
本发明的病毒颗粒可用于治疗和/或预防疾病。
“治疗”指对患现有疾病的受试者施用疫苗以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。
“预防”指对尚未患病和/或未显示疾病的任何症状的受试者施用疫苗，以防止或减弱病因(例如感染)或减少或防止与疾病相关的至少一种症状的发展。
疾病可为由冠状病毒引起的任何疾病，如人的呼吸道疾病和/或肠胃炎和其它动物中的肝炎、肠胃炎、脑炎，或呼吸道疾病。
疾病可为传染性支气管炎(IB)；猪流行性腹泻；传染性肠胃炎；小鼠肝炎病毒；猪血凝性脑脊髓炎；严重急性呼吸道综合征(SARS)；或蓝冠病。
疾病可为传染性支气管炎。
可以对刚刚孵化的幼禽或禽类施用疫苗，例如通过滴眼液或鼻内施用。尽管精确，但是这些方法较为昂贵，例如对于较大的肉禽群体。替代方法包括向饮用水中喷雾接种施用，但是使用这些方法难以确保均一的疫苗施用。
可以适于其施用的形式提供疫苗，如用于眼内使用的滴眼剂。
可通过蛋内接种而施用疫苗，例如通过注射胚胎蛋。蛋内接种具有提供对疾病的早期抗性的优势。不同于喷雾接种和通过饮用水的施用，这种方法还促进每个受试者施用均一的剂量。
疫苗可对蛋的任何合适的区室施用，包括尿囊液(allantoic fluid)、卵黄囊(yolk sac)、羊膜(amnion)、气室(air cell)或胚胎。可以在壳(气室)膜和绒毛膜***下施用。
通常在胚胎发育晚期过程中将疫苗注射入胚胎蛋，通常是在孵育期的最后四分之一过程中，如孵化前3-4天。在禽类中，可以在21天孵育期的15-19天之间，例如在17天或18天，施用疫苗。
所述过程可以使用机器人注射过程自动进行，如WO 2004/078203所述。
疫苗可与一种或多种其它疫苗，例如，其它疾病的疫苗，如Newcastle病病毒(NDV)一起施用。本发明还提供包含根据本发明的疫苗连同一种或多种其它疫苗的疫苗组合物。本发明还提供试剂盒，所述试剂盒包含根据本发明的疫苗和用于单独、顺序或同时施用的一种或多种其它疫苗。
本发明的疫苗或疫苗组合物可以用于治疗人类、动物或禽类受试者。例如，所述受试者可以是幼禽/小鸡、禽类/鸡或小鼠(如实验小鼠，例如转基因小鼠)。
通常地，医生或兽医能确定最适合于个体受试者或受试者组的实际剂量，并且剂量随特定受试者的年龄、体重和响应而变化。
组合物可任选地包含药物可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药物载体、赋形剂或稀释剂可以根据意欲施用途径和标准药学实践而进行选择。药物组合物可以本身(或除此之外)包含载体、赋形剂或稀释剂，任何合适的结合剂(binder)、润滑剂、悬浮剂、涂层剂、溶解剂和其它可以帮助或增加病毒的递送或免疫原性的载体试剂。
现在通过实施例进一步描述本发明，所述实施例用于帮助本领域普通技术人员实施本发明，而不意欲以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-包含(i)来自M41的IBV S1亚基和来自Beaudette的S2亚基 (M1B2)；和(ii)来自Beaudette的S1亚基和来自M41的S2亚基(B1M2)的或 由它们组成的嵌合S基因的生产
使用重叠聚合酶链式反应(PCR)策略产生两个嵌合S基因，一个具有来自M41的S1亚基和来自Beaudette的S2亚基(M1B2)，而另一个具有来自Beaudette的S1亚基和来自M41的S2亚基(B1M2；参见图2和3)。Beau-R(Beaudette的一个分子克隆)和M41的S基因分别包含于质粒pGPT-IBV-StuI-BamHI和pGPT-M41S中(见图4)。将复制酶基因和基因3中的引物设计为接近于IBV基因组中已经包含的限制位点，使得更容易从质粒pGPT-S1M41S2Beau(M1B2)和pGPT-S1BeauS2M41(B1M2)回收嵌合S基因。Beau-R和M41之间在S1/S2切割位点的S基因序列是相同的，因此还设计了跨越该位点的引物。S基因两侧各保留约500个核苷酸以便于操作。
将嵌合S基因克隆入含有来自大肠杆菌的鸟嘌呤黄嘌呤磷酸转移酶基因(gpt)的质粒中，所述gpt在黄嘌呤和次黄嘌呤存在下赋予对霉酚酸(MPA)的抗性，并且受痘苗病毒P7.5早期/晚期启动子的控制。
实施例2-拯救表达嵌合S蛋白B1M2或M1B2的rIBV并确定它们是否 能在Vero细胞上生长
利用基于痘苗病毒的反向遗传***产生具有嵌合S基因的重组IBV(rIBV)(见图5)。将质粒pGPT-S1M41S2Beau(M1B2)和pGPT-S1BeauS2M41(B1M2)转染入用含有全长IBV cDNA基因组但缺少S基因的重组痘苗病毒(rVV)感染的Vero细胞中。将质粒***痘苗病毒基因组，产生不稳定的中间体。在霉酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤存在下的三轮噬斑纯化选择gpt-阳性重组体。然后通过在不存在gpt选择培养基的情况下的三次噬斑纯化来选择GPT-阴性重组体。
通过PCR筛选BeauR-M1B2(S)和BeauR-B1M2(S)重组体，并测序以确定已将嵌合S基因序列成功***rVV基因组。在幼仓鼠肾(BHK-21)细胞中生长大量包含IBV基因组(具有嵌合S基因)的rVV，直至观察到细胞病理效应(cpe)。纯化痘苗病毒并提取DNA。
回收具有Beau-R基因组背景和来自M41的S1或S2亚基的两个分离株rIBV BeauR-M1B2(S)和BeauR-B1M2(S)。将用表达T7RNA聚合酶的重组鸡痘病毒(rFPV-T7)感染的CK细胞用rVV DNA转染，并在37℃温育。一旦观察到约60％的cpe，则去除培养基并过滤以去除任何rFPV-T7。将包含rIBV的培养基在CK细胞上传代三次。分离总细胞RNA并通过RT-PCR分析IBVRNA的存在。测定S基因的序列。
在CK细胞上三次传代后，将rIBV BeauR-M1B2(S)和BeauR-B1M2(S)在Vero细胞上传代三次。通过具有免疫荧光的共焦显微术(图7)和亮视野显微术(图6)拍摄rIBV BeauR-M1B2(S)和BeauR-B1M2(S)感染的Vero细胞的照片。在CK细胞上测定重组病毒的滴度，并研究在Vero细胞上的生长动力学(图8)。
BeauR-B1M2(S)在Vero细胞上不形成cpe，并且通过具有间接免疫荧光的共焦显微术观察到的感染Vero细胞非常少。生长曲线表明BeauR-B1M2(S)不能在Vero细胞上复制。传代一次后，BeauR-M1B2(S)在Vero细胞上引起大量cpe，并且进一步在Vero细胞上传代至第7代，从第5代开始形成合胞体。生长曲线表明BeauR-M1B2(S)能够在Vero细胞上复制。
如图6-8所示，Vero细胞不支持M41、BeauR-M41(S)、源自Beaudette但表达M41S蛋白的rIBV，或BeauR-B1M2(S)的生长，用这些IBV株感染的细胞的形态与模拟感染的细胞相似。然而，用BeauR-M1B2(S)感染的Vero细胞显示与用Beaudette(Beau-R)感染的细胞相同的形态。这些结果表明S2亚基与Vero细胞的感染力有关。
实施例3-可溶性肝素能够阻断使用rIBV Beau-R和BeauR-M1B2(S)对 Vero细胞的感染
进行噬斑减少试验，其中在Vero细胞上进行噬斑试验之前，在0-20mg/ml各种浓度的可溶性肝素钠盐存在下培育Beau-R和两个BeauR-M41(S1)分离株。分析产生的噬斑数以确定肝素的存在对于病毒在Vero细胞上生长的能力是否具有任何影响(图9)。
在感染Vero细胞之前，在存在15mg/ml肝素钠盐和不存在肝素钠盐的情况下培育Beau-R和两个BeauR-M1B2(S)分离株。使用共焦显微术和间接免疫荧光观察肝素对于存在的感染细胞数的影响(图10)。通过40倍放大倍数的共焦显微镜，每个样本分析十个视野，并计算感染细胞的百分比。
图9显示用渐增量的可溶性肝素预处理的IBV在Vero细胞上的噬斑减少试验。绿线代表Beaudette，而蓝线和红线代表表达嵌合M1B2 S蛋白的两个rIBV。图10显示比较可溶性肝素对于IBV-感染的Vero细胞百分比的影响的柱状图，通过具有间接免疫荧光的共焦显微术测量。这些结果表明可溶性肝素在rIBV上具有与在Beaudette上相同的阻断感染的作用。
实施例4-将硫酸乙酰肝素结合位点导入BeauR-M41(S)中M41 S基因的S2 亚基和将Beau-R的S蛋白中的硫酸乙酰肝素结合位点用来自M41 S蛋白的相 应区替代
设计了两个质粒，一个具有Beau-R S基因部分，所述部分具有位于S2亚基的硫酸乙酰肝素结合位点，用于与M41的相应序列交换(Beau-S-M41-Hep)，而另一个具有M41S基因部分，所述部分具有来自Beau-R的硫酸乙酰肝素结合位点(M41-S-Beau-Hep)。两个质粒都包含用于选择的gpt基因。
使用如实施例2和图5中所述的反向遗传***产生两个嵌合rIBV，Beau-S-M41-Hep和M41-S-Beau-Hep(图2和11)。各两个合适的重组体在CK细胞上传代三次，然后通过亮视野显微术分析它们在Vero细胞上的生长特性以评价rIBV是否引起cpe(图6)、感染细胞的共焦显微术(图7)和生长动力学(图8)。
如图6-8所示，Vero细胞不支持M41、BeauR-M41(S)、BeauR-B1M2(S)或Beau-S-M41-Hep的生长。用这些IBV株感染的细胞的形态与模拟感染的细胞相似，通过具有间接免疫荧光共焦显微术观察到的感染细胞非常少。然而，用M41-S-Beau-Hep感染的Vero细胞显示与用Beaudette(Beau-R)和BeauR-M1B2(S)感染的细胞相同的形态。Vero细胞上的生长曲线显示从Beau-R去除硫酸乙酰肝素结合位点会消除其在Vero细胞上生长的能力，而将硫酸乙酰肝素结合位点引入BeauR-M41(S)S蛋白允许在Vero细胞上生长。这些结果表明Beaudette的S2亚基中的硫酸乙酰肝素结合位点与Vero细胞的感染力有关。
在本文中，除非上下文需要，词语“包含”或变型如“含有”或“包括”应理解为表示包括所述要素或整体(integer)，或要素或整体的组，但不排除任何其它要素或整体，或要素或整体的组。
通过提述将上文所述所有出版物并入本文。在不背离本发明范围和精神的情况下，本发明所述方法和***的各种修饰和变型对于本领域技术人员显而易见。尽管已连同特定的优选实施方案描述了本发明，但是应理解的是，要求保护的本发明不应不适当局限于这些特定的实施方案。实际上，对于分子生物学、病毒学或相关领域的技术人员显而易见的实施本发明所述模式的各种修饰意欲在所附权利要求的范围内。

Claims (11)

1.嵌合的传染性支气管炎病毒(IBV)S蛋白，其基于来自具有限于感染原代细胞的限制组织嗜性的IBV株的S蛋白，但是其包含位于IBV Beaudette S2亚基内的硫酸乙酰肝素结合结构域，使包含所述嵌合S蛋白的病毒能够在Vero细胞上生长。
2.根据权利要求1的嵌合S蛋白，所述S蛋白包含来自IBV Beaudette的全部S2亚基。
3.根据权利要求1或2的嵌合S蛋白，其在S2蛋白的对应于作为SEQ ID No.1给出的序列的残基686和691之间的部分中包含来自IBV Beaudette序列SRRKRS。
4.根据权利要求3的嵌合S蛋白，其在S2蛋白的对应于作为SEQ ID No.1给出的序列的残基686和694之间的部分中包含来自IBV Beaudette序列SRRKRSLIE。
5.核苷酸序列，其能够编码根据任何前述权利要求的嵌合S蛋白。
6.质粒，其包含根据权利要求5的核苷酸序列。
7.IBV病毒颗粒，其包含根据权利要求1-4中任一项的嵌合S蛋白，和/或根据权利要求5的核苷酸序列。
8.根据权利要求7的病毒颗粒，其能够在Vero细胞上生长。
9.根据权利要求8的病毒颗粒，其对Vero细胞的感染可通过可溶性肝素阻断。
10.细胞，其能够产生根据权利要求7-9中任一项的病毒颗粒。
11.根据权利要求10的细胞，其中所述细胞是Vero细胞。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060325B (zh) * 2013-01-14 2015-01-07 韩健宝 抗猪流行性腹泻病毒pedv的反义核酸及肽核酸pna
CN104072592B (zh) * 2013-03-26 2016-12-28 复旦大学 对新型冠状病毒HCoV-EMC 2012感染具有抑制作用的多肽及其应用
GB201308057D0 (en) 2013-05-03 2013-06-12 Pirbright Inst The Protein
GB201310031D0 (en) * 2013-06-05 2013-07-17 Pirbright Inst The Cell
CN103394097A (zh) * 2013-06-09 2013-11-20 东北农业大学 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻两联疫苗的引物及制备方法
GB201413020D0 (en) * 2014-07-23 2014-09-03 Pribright The Inst Coronavirus
CN104262488B (zh) * 2014-09-24 2017-07-28 普莱柯生物工程股份有限公司 一种融合蛋白及其疫苗组合物的制备与应用
GB201601498D0 (en) 2016-01-27 2016-03-09 Pirbright Inst The Coronavirus
KR20210084596A (ko) * 2018-10-31 2021-07-07 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 이종 스파이크 단백질을 갖는 h52 ibv 백신
EA202191145A1 (ru) * 2018-10-31 2021-08-23 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх Вакцина виб 4/91 с гетерологичным шиповидным белком
CN109943536B (zh) * 2019-03-26 2021-09-14 昆明理工大学 一种戊型肝炎病毒的培养方法及其灭活疫苗的制备方法
JP2022531731A (ja) * 2019-05-10 2022-07-08 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー コロナウイルススパイクタンパク質の改変されたｓ１サブユニット
MX2021013702A (es) * 2019-05-10 2021-12-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Subunidad s2 modificada de la proteina de espicula de coronavirus.
WO2020229257A1 (en) * 2019-05-10 2020-11-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Attenuated ibv with extended cell culture and tissue tropism
CN110894217B (zh) * 2019-12-16 2021-07-13 中国农业大学 一种牛冠状病毒嵌合抗原以及检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡
US10975126B1 (en) 2020-04-23 2021-04-13 King Faisal University MERS-CoV inhibitor peptides
CN111607003B (zh) * 2020-05-21 2022-08-23 上海百英生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2 N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用
WO2022005214A1 (ko) * 2020-06-30 2022-01-06 포항공과대학교 산학협력단 코로나-19 바이러스의 스파이크 단백질의 에스터가수분해효소 활성을 이용한 코로나 바이러스 감염증 치료제 스크리닝 키트 및 상기 키트를 이용하여 스크리닝된 물질의 코로나 바이러스 감염증의 예방, 개선 또는 치료 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1721430A (zh) * 2004-07-05 2006-01-18 华中农业大学 含有与鸡传染性支气管炎病毒特异性结合短肽的噬菌体及应用
CN1763085A (zh) * 2005-11-02 2006-04-26 浙江大学 鸡传染性支气管炎病毒s1重组蛋白抗原、制备方法及用途
CN101240289A (zh) * 2008-03-11 2008-08-13 四川大学 一种禽传染性支气管炎病毒S1基因与禽IL-2基因共表达DNA疫苗pIRES-S1/IL2

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE445412T1 (de) 2003-03-03 2009-10-15 Intervet Int Bv Ein virus der infektiösen bronchitis mit veränderten spike-gen

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1721430A (zh) * 2004-07-05 2006-01-18 华中农业大学 含有与鸡传染性支气管炎病毒特异性结合短肽的噬菌体及应用
CN1763085A (zh) * 2005-11-02 2006-04-26 浙江大学 鸡传染性支气管炎病毒s1重组蛋白抗原、制备方法及用途
CN101240289A (zh) * 2008-03-11 2008-08-13 四川大学 一种禽传染性支气管炎病毒S1基因与禽IL-2基因共表达DNA疫苗pIRES-S1/IL2

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cooperative Involvement of the S1 and S2 Subunits of the Murine Coronavirus Spike Protein in Receptor Binding and Extended Host Range;de Haan C.A.M.等;《Journal of Virology》;20060906;第80卷(第22期);第10909-10918页 *
Heparan Sulfate Is a Selective Attachment Factor for the Avian Coronavirus Infectious Bronchitis Virus Beaudette;Madu I.G.等;《Avian Diseases》;20070331;第51卷(第1期);第45-51页 *
Manipulation of the infectious bronchitis coronavirus genome for vaccine development and analysis of the accessory proteins;Cavanagh D.等;《Vaccine》;20070726;第30卷(第26期);第5558-5562页 *
Recombinant Avian Infectious Bronchitis Virus Expressing a Heterologous Spike Gene Demonstrates that the Spike Protein Is a Determinant of Cell Tropism;Casais R.等;《Journal of Virology》;20030831;第77卷(第16期);第9084-9089页 *

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