CN102573979B - 用于向大脑递送治疗剂的导管优化配置 - Google Patents

用于向大脑递送治疗剂的导管优化配置 Download PDF

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Abstract

提供了改善药剂递送到脑部靶向区域的方法和***，使用提供最优递送管定位的位置坐标。通过优化套管定位，获得在靶向脑部区域中可重复的输液分布，从而能更有效递送治疗剂到脑部。

Description

用于向大脑递送治疗剂的导管优化配置
发明背景
增强传送递送(convection-enhanceddelivery，CED)是间隙性中枢神经***(CNS)递送技术，还可在递送药剂到中枢神经***(CNS)中避开血脑屏障。大部分治疗剂到脑部的常规局部递送依赖于根据浓度梯度的扩散。扩散率与药剂大小成反比，且通常慢于组织清除。因此，扩散导致大部分递送药剂非均匀分布且局限于所述来源的几毫米范围内。相反，CED采用在输液管顶部建立的液压梯度，整体流向胞外流动空间内的传送物质。CED使得胞外灌注的物质能经血管周隙进一步传送，血管的节律性收缩作为输液的有效动力。因此，相较单一注射，可发现更高浓度的药物在更大面积的靶向组织上更均匀分布。目前，CED在神经退行性疾病如帕金森病(PD)和神经肿瘤领域上进行临床测试。CED的实验室研究涵盖了广泛的应用领域，如递送小分子、大分子、病毒颗粒、磁性纳米颗粒和脂质体。
通过新型对比剂与治疗剂共输注辅助的CED显示已在啮齿类动物、非人灵长类(NHP)和人中进行研究。CED期间，给定药剂的分布体积(Vd)取决于传送组织的结构特性，如导水率、血管体积率和胞外流体分率。其还取决于输注过程的技术参数，如套管设计、套管定位、输注体积、和输注率，用于提高递送效率且同时努力限制治疗剂扩散到靶标外区域。
图像指导的神经导航利用立体定位原理。认为脑部是可分成三个虚拟空间相交平面的几何体积，所述平面基于笛卡儿坐标系彼此正交(水平、正面、矢状)。脑内的任何点可通过测定其沿着这3个正交平面的距离来指定。神经导航提供了精确的手术指导，这是通过参考此脑坐标系与在计算机工作站控制台上显示的患者平行坐标系的三维图像数据，使得医学图像成为对应脑内实际位置的点对点图(参见Golfinos等.，JNeurosurg1995；83：197-205)。将功能性成像模式(具体是脑磁图描记术(MEG))、机能性磁共振成像(fMRI)和正电子成象术与神经导航结合可在神经病学上取得显著进展。
本发明提供改善的套管定位方法。
发明概述
提供了方法和***，通过将递送套管定位成提供优化配置来改善治疗剂递送到脑部靶向区域。本发明的套管定位指南避免了将治疗剂递送到脑中存在的“渗漏通路”，通过采用套管定位指南，获得靶向脑区域中可重复的输液分布，从而更有效递送治疗剂到脑中。通常优选渗漏通路与递送尖端距离大于1mm。靶向的感兴趣区域包括但不限于：壳、丘脑、脑干等。在一些实施方式中，接受者是灵长类动物，例如人和非人灵长类。
提供了确定套管定位优化配置的方法。在一些实施方式中，从实验上检测配置，通过以下方法：将显像剂递送到脑的靶向区域，检测输液分布，将套管配置位点与所需分布相关联，其中优化配置产生适当包含的输液，即所述输液不扩散到所需靶区域之外。在其它实施方式中，本文提供的所述定位配置用于通过3维建模技术从一个物种外推到另一物种。
提供了将药剂递送到脑部的***，其中所述***包括递送管、配有优化套管配置的定位坐标的立体定位***。
本发明治疗剂的给药可通过能递送治疗剂的任何局部递送***进行。这类递送***的示例包括但不限于CED和脑内递送，具体是CED。
在一些实施方式中，所述递送管是分段设计的套管，通过使初始液体回流超出所述段来减少沿着输注装置的回流。在这种方法中，本发明的配置坐标使所述段和/或靶向组织内输液管尖端的最优配置位点能防止治疗剂递送到脑中的渗漏通路，如作为脑中的渗漏通路的外周白质束、血管、心室等。
一方面，本发明提供治疗特征为神经元死亡和/或功能障碍的CNS失调患者的方法。在一个实施方式中，CNS失调是慢性疾病。在另一实施方式中，CNS失调是急性疾病。通过本发明方法治疗的感兴趣CNS失调包括但不限于亭丁顿舞蹈症、阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、帕金森病、中风、颅脑损、脊髓损伤、多发性硬化症、路易体痴呆、视网膜退化、癫痫、精神病、激素平衡失调、和耳蜗退行性病变。治疗方法可包括预防性方法，例如涉及术前诊断。术前诊断可包括但不限于遗传筛选、神经成像等。神经成像可包括功能性神经成像或非功能性成像，例如PET、MRI和/或CT。
另一方面，本发明提供治疗具有CNS失调风险的病人的预防性方法。所述方法包括局部递送药物组合物给病人中的响应CNS神经元群，使用本发明的套管定位坐标，其中给予这种生长因子可防止或延迟CNS失调发生，或一旦出现CNS失调则降低其严重性。
本发明的这些和其它方面和实施方式以及制备和使用本发明的方法在图片和发明的说明、实施例、权利要求及附图中更详细描述。
附图简要说明
图1：回流的空间坐标和长度与壳中MRI示踪物分布之间的关联性。
图2：(A)壳中分段套管定位示意图。显示各种情况下绿区、蓝区和红区中的导管分段和尖端。(B)显示各区成功的分布，其定义为壳中的Vd相比总Vd(p＜0.01)。(C)代表性MR图像显示绿区、蓝区和红区的壳中钆特醇分布。图C、D和E显示各区的套管定位和初始输注。图F、G和H显示灌入各RGB区后脑中的钆特醇分布。注意到在G(蓝色)的白质束内有微小渗漏，H(红色)内有显著渗漏。绿区(F)内的输注仅形成在壳中的示踪物分布。
图3：概况了NHP的壳(A)和人壳(B)中各段的RGB区，这是基于NHP所得RBG参数并用同一标度比较。
图4：3D重构NHP(A和C)和人壳(B和C)中的绿区以及代表性“绿区”体积。从MR图像中定义绿色区为位于CC腹侧至少3mm的体积，垂直距离AC至少6mm(从导管尖端到AC的3mm加上尖端长度3mm)，侧离EC超过2.75mm，居中离IC大于3mm。
图5：代表性MR图像显示在小和大输注体积MRI示踪物时壳中钆特醇分布和白质束内的渗漏。
图6显示丘脑中Gd的Vd相比丘脑和WMT中总Vd的百分数。
图7显示丘脑中的套管定位。
图8中绘制了丘脑内所含输注示踪物百分数相对进入点的图。
图9中绘制了丘脑内所含输注示踪物百分数相对外侧缘的图。
图10.导管段到中线的距离与丘脑容量相关。
图11.CED期间脑干中的钆特醇分布。
图12.测量脑干中套管段定位的参数。
图13显示相对测量参数的脑干容量。
图14显示丘脑和脑干中的Vi与Vd。
图15.具有GdRCD的T1加权MR图像与ROI的3D构建。(a)-(e)是从开始输注到NHP丘脑至结束的各个时间点所得一系列冠状面中实时T1加权MR图像。对应输注时间点的输液体积(Vi)示于各图下方。比例尺＝0.5cm。(f)显示基于输注结束后左丘脑中Gd信号的ROI的3D重建。Gd分布体积(Vd)示于图下方。RCD：实时传送地送。ROI：感兴趣区域。
图16.用AAV2-GDNF/Gd输注的NHP中Vi和Vd间的线性关系。图显示NHP(n＝5)中Vi和Vd间的线性关系(R2＝0.904，P＜0.0001)。平均Vd/Vi比为4.68±0.33(平均值±SEM)。Vi：输液体积。Vd：Gd的分布体积。
图17.具有双侧输注AAV2-GDNF到丘脑中的灵长类#1中MRI与组织学的关联性。(a).T1加权MR图像显示丘脑中的Gd分布，以绿色概括。将对应组织切片的GDNF染色阳性区域(以橙色概括)转成MR图像以便比较。由于左和右输注在不同时间完成，各输注的最终MR图像系列裁切并合并于图a。左和右脑的输注体积示于图[Vi(L)和Vi(R)]下方。比例尺＝0.5cm。(b).a中成像的灵长类脑的冠状组织切片，显示GDNF染色模式与用Gd的MRI中所示类似。比例尺＝1cm。(c)b中加框***的高倍放大，显示丘脑内的GDNF阳性细胞。比例尺＝50mm。(d)和(e)显示一系列MR图像中左(d)和右(e)侧脑上的Gd分布和GDNF表达区域。r.相关系数。
图18.具有单侧AAV2-GDNF和AAV2-AADC共输注到丘脑中的灵长类#2中MRI与组织学的关联性。(a).T1加权MR图像显示丘脑中的Gd分布，以绿色概述。将对应组织切片的GDNF(以橙色概括)和AADC(以蓝色概括)染色阳性区域转成MR图像以便比较。比例尺＝0.5cm。(b).a中成像的灵长类脑的冠状组织切片，显示GDNF染色模式与用Gd的MRI中所示类似。比例尺＝1cm。(c)毗邻b的AADC染色组织切片，显示内源和转导的AADC表达。转导AADC以蓝色概括。(e)毗邻c的AADC和TH共标记组织切片，显示棕色的AADC和红色的酪氨酸羟化酶(TH)的共染色以区分内源AADC/TH(深红色)与转导AADC(棕色)。转导AADC的表达模式与b中的GDNF表达几乎相同。(e)c中加框***的高倍放大显示黑质中的内源AADC阳性细胞。比例尺＝200mm。(f)d中加框***的高倍放大显示黑质中的AADC/TH阳性细胞。比例尺＝200mm。(g)c中加框***的高倍放大显示壳中的AADC阳性纤维。比例尺＝200mm。(h)c中加框***的高倍放大显示壳中的AADC阳性细胞。比例尺＝200mm。(i)d中加框***的高倍放大显示丘脑中的AADC阳性细胞。比例尺＝200mm。(j)显示一系列MR图像中右侧脑上的Gd、GDNF和AADC分布区域。r1.Gd和GDNF表达区域间的相关系数。r2.Gd和AADC表达区域间的相关系数。r3.GDNF和AADC表达区域间的相关系数。
图19.具有双侧AAV2-GDNF和AAV2-AADC共输注到丘脑中的灵长类#3中MRI与组织学的关联性。(a).T1加权MR图像显示丘脑中的Gd分布，以绿色概述。将对应组织切片的GDNF(以橙色概括)和AADC(以蓝色概括)染色阳性区域转成MR图像以便比较。比例尺＝0.5cm。(b).a中成像的灵长类脑的冠状组织切片，显示GDNF染色模式与用Gd的MRI中所示类似。比例尺＝1cm。(c)毗邻b的AADC和TH共标记组织切片，显示棕色的AADC和红色的酪氨酸羟化酶(TH)的共染色。(d)和(e)显示一系列MR图像中左(d)和右(e)侧脑上的Gd、GDNF和AADC分布区域。r1.Gd和GDNF表达区域间的相关系数。r2.Gd和AADC表达区域间的相关系数。r3.GDNF和AADC表达区域间的相关系数。
图20A-D.CED的失败是由于所述“绿色区”外的套管尖端定位。A.套管尖端位置太接近渗漏通路(轴突束)，导致输注到前连合(B)而不是壳。C.套管尖端位置太接近渗漏通路(血管)，导致输注到血管周隙(D)而不是壳。
具体实施方式
将脑治疗剂如蛋白(包括生长因子)、多核苷酸、病毒载体等直接脑部递送到灵长类动物脑部的最优结果取决于整个靶区域的可重复分布。本文提供的配置坐标定义输注到非人灵长类内和人脑靶向区域的最佳位置，所述配置坐标可避开脑中的渗漏通路，例如放置成递送尖端与渗漏通路间距离至少1mm、至少1.5mm、至少2mm或更多。
描述本发明前，应理解本发明不限于所述具体实施方式，因为这些当然可以变化。也应理解本文所用术语仅用于描述具体实施方式的目的，而不是限制，因为本发明的范围仅通过所附权利要求限制。
提供一定范围的值时，应理解除非上下文另有明确说明，还特定公开了该范围上下限之间以下限单位十分之一为间隔的各值。本发明涵盖了任何设定值或设定范围的中间值与该设定范围的任何其它设定或中间值之间的各个较小范围。这些较小范围的上和下限可独立地包括于或排除于所述范围中。本发明还涵盖了其中任一、无一或2个界限都包括在较小范围内的各范围，受制于所述设定范围中排除的任何特定界限。所述设定范围包括1个或2个界限时，本发明也涵盖排除其中任一或2个所含界限的范围。
除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的涵义。尽管任何与本文所述类似或等价的方法和材料可用于实施或测试本发明，现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有发表物通过引用纳入本文以公开和描述与所引用发表物相关的方法和/或材料。应理解到了有矛盾的程度时，本文公开内容取代任何纳入发表物公开内容。
必须指出如本文和所附权利要求所用，单数形式“一个”、“一种”、“所述”包括复数参照物，除非上下文另有明确说明。因此，例如提及“个体”时包括一个或多个个体且提及“所述方法”时包括涉及本领域技术人员已知的等价步骤和方法等。
本文所讨论的发表物仅提供其在本发明提交日期前的公开内容。本文内容不应理解成许可当前发明不能凭借先前发明而提前公布。此外，提供的发表物日期可以不同于实际发表日期，其可能需要单独确认。
定义
立体定位递送：一种用于脑中精确点定位的基于计算机的模式。立体定位方法可采用脑图谱，其中许多可以数字形式获得。例如，可获得电子形式的Talairach-Tournoux(TT)图谱(综述参见Nowinski(2005)Neuroinformatics3：293-300)。所述图谱提供了脑的三维呈现用于快速和自动解读图像。
立体定位递送可采用框，其中框附于头骨以提供固定的参照点。此点结合计算机和MRI扫描提供的脑三维图形，可对靶向区域精确作图并视觉化。用多种结合所述框的装置可准确导向靶位置。或者，通过用框取代“棍”、塑料导向器或红外标记产生的参照***，无框的立体定位递送可提供精确定位。
功能性MRI(fMRI)可用于精确定位脑功能区。扫描MRI时，告知病人进行一系列活动和运动，如阅读列表或轻叩手指。与这些运动和活动相关的脑部区域在扫描中“点亮”并产生图像。此信息为手术导航计算机用于设计切口、开颅和肿瘤移除以使神经损伤最小。计算机断层扫描(CT)是结合X射线和计算机的扫描工具，用于产生详细的脑图像。
成像。确定输液体内分布可通过在带可检测标记的分子灌入脑部靶区域处成像，经MRI、正电子放射断层造影术(PET)等测定脑内扩散。选定示踪物的合适标记包括可由光谱分析、光化学、免疫化学、电、光学或化学方法检测的任何组合物。本发明的有用标记包括放射性标记(例如18F、3H、125I、35S、32P等)、酶、比色标记、荧光染料等。检测标记的方法为本领域技术人员公知。例如，可用成像技术、感光胶片或闪烁计数器检测放射性标记。在一些实施方式中，脂质体用例如钆特醇标记，通过MRI成像。
参考坐标。套管定位的X、Y和Z轴值通过成像例如磁共振成像测定，其中MR图像在所有三维空间(轴、冠状和矢状)投射。为了方便和与常规方法一致，前连合-后连合(AC-PC)连线的中点可指定为三维(3D)脑空间的零点(0，0，0)。AC-PC连线从前连合上面到后连合中央。在MRI正中矢状面上测定AC-PC连线后，可检测AC-PC连线中点。使用通过AC-PC连线中点的水平和垂直面，可展示所有3个面，获得套管位置的X、Y和Z轴值可通过测量套管到冠状MRI面上中线的距离(X值)、前面(或后面)到冠状MRI面上AC-PC连线中点的距离(Y值)、结合MRI上AC-PC连线的轴面之上(或之下)的距离(Z值)。
渗漏通路。本文所用的术语“渗漏通路”指中枢神经***，具体是脑中转运可溶性药剂的物理结构。当治疗剂递送到紧邻这些渗漏通路的组织时，所述药剂可能会不利地运至非靶向区。提供CNS中渗漏通路的解剖学结构包括但不限于轴突束、血管、血管周隙和/脑室间隙。
血脑屏障：脑膜周边的神经和细胞形成的壁。此屏障具有保护功能，同时其还降低治疗药物有效到达脑部靶向区域的能力。
壳：位于前脑(端脑)基部的圆形结构。所述壳和尾状核一起形成背侧纹状体。它也是包含基底神经节的结构之一。所述壳通过多种途径与黑质和苍白球相关联。所述壳的主要功能是调节运动和影响各类学习。它采用多巴胺行使功能。所述壳还在退行性神经疾病如帕金森病中起作用。
脑干：位于小脑前部的脑干连接小脑与脊髓并控制各种自动以及运动功能。它由延髓、脑桥、和网状结构构成。
小脑：位于脑后部的小脑控制身体活动，即平衡、行走等。
大脑：所述脑部最大的部分，可分成2部分：左和右脑半球。这些半球通过胼胝体连接，胼胝体能使“信息”在2个半球间递送。脑右侧控制身体左侧，反之亦然。各个半球还具有4个产生不同功能的叶：额叶；颞叶；顶叶和枕叶。
颅：围绕脑的骨覆盖层。所述颅和面骨包括头骨。
下丘脑：作为脑下垂体信使的脑部分；它还在体温、睡眠、食欲和性行为中起关键作用。
中脑：脑干的一部分，它是控制眼运动和眼睑开启的第三和第四颅神经来源。
脑桥：此脑干部分是4对颅神经的来源：第五(脸部表情)；第六(眼运动)；第七(味觉、面部表情、睑闭)；和第八(听觉和平衡)。
后颅窝：含有脑干和小脑的头骨部分。
丘脑：从皮层往返传送信息的脑部小区域。
灵长类动物。灵长类动物是生物目灵长目的成员，所述组包含狐猴、狐猿、懒猴、夜猴、眼镜猴、猴和猿，最后一个分类包括类人猿。灵长类分成原猴亚目和猿猴，其中猿猴包括猴和猿。猿猴分成2组：阔鼻猴或新世界猴和非洲及东南亚狭鼻猴。新世界猴包括僧帽猴、吼猴、松鼠猴，狭鼻猴包括旧世界猴如狒狒和猕猴及猿。
本发明的方法可用于所有灵长类动物。具体感兴趣的是猿猴。在一些实施方式中，所述方法用于人。在其它实施方式中，所述方法用于非人灵长类。
评价包括任何测量形式，包括检测某一元件存在与否。术语“检测”、“测量”、“评估”、“评价”和“分析”可互换使用且包括定量和定性检测。评价可以是相对或绝对的。“评价...的存在”包括检测某事物存在的量，和/或检测其是存在或是缺失。本文所用的术语“检测”、“测量”、“评估”、“评价”和“分析”可互换使用且包括定量和定性检测。
如本文所用，“治疗”或“处理”指抑制疾病或失调进展，或者延迟疾病或失调发生，无论是物理上如可分辨症状的稳定，或是生理上如物理参数的稳定，或者两者都有。本文所用的术语“治疗”、“处理”等指获得需要的药理和/或生理效果。效果可以是预防性和/或治疗性的，预防性是依据完全或部分防止疾病或病症或其症状，治疗性是依据部分或完全治愈疾病或失调和/或该疾病或失调引起的不良影响。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物如人中任何疾病或失调治疗，且包括：降低由于疾病导致的死亡风险；在倾向于发生疾病但尚未诊断出患有该病的对象中预防发生所述疾病或失调，即抑制其发展(例如降低疾病进展率)；缓解疾病，即使得疾病减轻。本发明的治疗益处包括但不限于减少帕金森病相关疾病或病症的发生风险或严重性。
递送管。如本领域已知，本发明的方法可准确配置任何递送管。例如，参见通过引用特定纳入本文的综述：Fiandaca等.(2008)Neurotherapeutics.5(1)：123-7；Hunter等.(2004)Radiographics24(1)：257-85；和Ommaya(1984)CancerDrugDeliv.1(2)：169-79。
具体感兴趣步骤的递送管设计抗回流套管，其具体应用于增强传送递送(CED)。这种套管描述于例如Krauze等.(2005)JNeurosurg.103(5)：923-9和公开的专利申请US2007-0088295；和US2006-0135945，其各通过引用特定纳入本文。
可参考本文的抗回流套管定位。基于MRI坐标，所述套管装于立体定位固定器，并引向脑部靶区域，例如通过先前放置的引导管。测量各输液管的长度以确保远端延伸超过各引导管长度，例如约1mm、约2mm、约3mm等。这在导管尖端产生分段设计以使CED过程期间流体分布最大并使沿着套管的回流最小。此从尖端到外壳的转变在本文中可称为“段”。定位数据任选获自此步骤的位置，因为其在MRI上清晰可见；或者套管尖端可用作参考点。本领域技术人员应理解任何明确标记可用于定位，这种标记可在递送管上提供，例如成像“点”可纳入套管设计。
递送装置可包括渗透泵或输液泵。渗透泵或输液泵都从多个供应商市售获得，例如Alzet公司、汉密尔顿公司(HamiltonCorporation)、阿尔扎公司(Alza，Inc.，加利福尼亚州帕洛阿尔托)。
在一个实施方式中，所述套管与长期给药相适。在另一实施方式中，所述分段设计套管与急性给药相适。
治疗剂。本发明的方法可用于递送治疗剂到脑部靶向区域。感兴趣的药剂包括但不限于蛋白、药物、抗体、抗体片段、免疫毒素、化合物、蛋白片段和毒素。
本发明方法可采用的治疗剂示例包括GDNF家族配体、PDGF(血小板源生长因子)家族配体、FGF(成纤维细胞生长因子)家族配体、VEGF(血管内皮生长因子)和其同系物、HGF(肝细胞生长因子)、中期因子、多效生长因子、双调蛋白、血小板因子4、CTGF、白介素8、γ干扰素、TGF-β家族成员、Wnt家族配体、WISP家族配体(Wnt诱导的分泌蛋白)、血小板反应蛋白、TRAP(血小板反应蛋白相关无名蛋白)、RANTES(正常T细胞表达和分泌因子)、备解素、F-脊椎蛋白、DPP(decapentaplegic)和Hh(Hedgehog)家族成员。感兴趣的特定药剂包括GDNF、神经秩蛋白、ART(artemin)、PSP(persephin)、NG、BDNF、NT3、IGF-1和音速小子。还包括了可用于递送遗传构建体的病毒载体，例如AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体等。
治疗剂以任何有效浓度给予。治疗剂的有效浓度是引起具体药理效果减少或增加的浓度。本领域技术人员应了解如何根据本领域已知以及本文提供的方法测定有效浓度。
治疗剂和本发明促进剂的剂量取决于待治疗的疾病或病症、个体对象状态(例如物种、重量、疾病状态等)。剂量也取决于给予的药剂。这类剂量在本领域已知或可凭经验测定。此外，可根据待治疗的特定疾病或病症的典型剂量调整所述剂量。通常，单一剂量足够，然而，如果需要可重复剂量。剂量不应太大避免引起不良副作用。一般，剂量随着患者年龄、病症、性别和疾病程度变化且可由本领域技术人员根据常规方法(参见例如Remington′sPharmaceuticalSciences(《雷明顿药物科学》))测定。若发生任何并发症还可由单独医师调整剂量。
本发明的治疗剂和/或促进剂通常可包括有效量的各药剂结合药学上可接受的运载体，另外可包括其它药用剂、药物制剂、运载体、佐剂、稀释剂等。“药学上可接受”指非生物学或另外不需要的材料，即所述材料与选定药剂一起给予个体而没有引起任何不良生物效应或以可有害方式与含有其的药物组合物中任何其它组分相互作用。
临床试验：这些研究包括测试新治疗和疗法的病人且是药物批准过程的一部分。临床试验通常有3个阶段或3期，评估药物的安全性、有效性、剂量要求和副作用。病人必须符合一定标准以招募到临床试验中(其针对各单独研究确定)，参与研究是自愿的。对各试验确定了一套规则或操作方案。
术语“参考”和“对照”可互换使用，指可与观察值作比较的已知值或一组已知值。如本文所用，已知表示该值代表已理解参数，例如没有接触转染剂时细胞毒性标记基因的表达水平。
使用方法
在本发明的方法中，提供了配置坐标以改善治疗剂递送到脑部靶向区域。坐标与立体定位方法一起用于精确定位递送导管。通过采用套管定位的坐标和递送角度，可实现输液在脑部靶向区域的可重复分布，从而使治疗剂更有效递送到脑部。感兴趣的靶向区包括但不限于壳、丘脑、脑干等。本发明的方法为递送药剂到“绿色区”提供了指导，“绿色区”是离脑渗漏通路适当距离的靶向区域中的分区。
通常，药剂如下通过例如CED装置递送。将导管、套管或其它注射装置***选定对象的CNS组织。鉴于本文的教授内容，本领域技术人员易确定哪块CNS一般区域是合适的靶标。立体定位图和定位装置可获自例如密歇根州沃伦的高级科学仪器公司(ASIInstruments)。还可通过使用经对象脑部CT和/或MRI成像获得的解剖图进行定位，从而有助于引导注射装置到选定靶标。
用本发明的配置指南检测递送管的确切位置。本领域技术人员应理解优选在非人灵长类动物上经实验对靶向区域坐标作图，然后从这些坐标外推到包括人在内的其它灵长类动物的所需坐标。
从实验上确定位置后，可采用实施例中所列方法。将显像剂递送到脑部靶向区域，检测输液分布；将套管定位位置与所需分布相关联，其中最优位置的坐标是产生适合包含输液的坐标，即所述输液不扩散到所需靶向区域外。感兴趣的靶向区域包括壳；脑干；小脑；大脑；胼胝体；下丘脑；脑桥；丘脑等。
在其它实施方式中，采用本文提供的坐标通过三维建模技术从一个物种外推到另一物种。
坐标相对于参考点例如套管“分段”测量，其可以是套管尖端和外壳、套管尖端等之间的转换点。本领域技术人员易外推以根据不同长度的尖端进行调整，或其中参考点是除了分段外的目标。
套管定位和最优立体定位坐标的定义对于确保治疗有效递送到靶向脑区域具有重要意义。采用常规立体定位方法与本发明的坐标可更有效递送治疗到脑部，且应用于临床疗法。
递送治疗剂到灵长类脑部的许多方法受益于所述药剂到感兴趣区域的有效定位。例如，生长因子从靶向区渗漏掉可能具有双重缺点：减少靶向区存在的有效药剂量，同时使非靶向区接触药剂。对于本发明的方法，靶向区通常是均匀的“灰质”，由神经元细胞体、神经纤维网(树突、轴突端和胶质细胞突)、胶质细胞(星形神经胶质和少突胶质细胞)和毛细血管组成。
灰质包括神经元细胞。灰质分布在大脑表面(即大脑皮层)和小脑表面(即小脑皮层)以及大脑腹侧区(例如纹状体、尾、壳、苍白球、伏隔核；隔核、底丘脑核)；丘脑和下丘脑的区域和核；小脑深部的区域和核(例如齿状核、球状核、栓状核、顶核)及脑干的区域和核(例如黑质、红核、脑桥、橄榄核、脑神经核)；和脊柱区(例如前角、侧角、后角)，任何这些区域适合本发明方法靶向。
本发明方法不靶向且倾向于与输液不良扩散相关的区域是渗漏通路，包括白质。白质主要包含有髓的轴突束，例如胼胝体(CC)、前连合(AC)；海马连合(HC)；外囊(EC)、内囊(IC)和大脑脚(CP)。
申请人发现通过增强传送递送药剂到灰质靶向区递送的输液容量需要相对于渗漏通路的“绿色区”，如白质或脑区域边界，例如侧边界或中线，用于定位递送套管。在本发明的方法中，递送套管放置成使所述套管尖端位于绿色区内，即靶向区内含有输注物质的分区。
通过磁共振成像(MRI)回顾性分析对比剂在靶向脑区域的分布，分析增强传送递送(CED)输注。将输入体积(Vi)与靶向区域内的总分布体积(Vd)作比较。这些提供良好对比剂分布的输注用于定义最优靶体积，或“绿色”区。这些导致伴有渗漏到相邻解剖结构的部分至差分布的输注用于分别定义不太理想的“蓝色”和“红色”区。通过将递送套管置于所需坐标内，在靶向脑区域获得至少约90％输液、至少约95％输液、至少约98％输液或更多的定量控制。这些结果用于检测定义输注灵长类脑部靶向区最优位置的定位标准。
当递送套管位于绿色区时，靶区域内的良好输液容量可用小于约30μl体积的小体积、高至约100μl的大体积、和约100μl-约250μl或更大体积获得。相反，绿色区外的套管定位与输液随着输注体积增长而增加相关联。这些数据确认最优输注可基于套管定位获得。
然后，绿色区是靶向区的三维集合，其中放置了递送套管的尖端。绿色区是内部区，围绕有宽度足够包含输液的“壳”。
一般，放置递送套管尖端的“绿色区”充分位于靶向灰质区以避免渗漏通路。
例如，当靶向区位于大脑如大脑皮层、纹状体、壳、尾等时，定位坐标可相对轴突束如胼胝体(CC)、前连合(AC)；外囊(EC)、和内囊(IC)作图，其中绿色区距离为至少约2mm、至少约2.5mm，通常至少约3mm，在足够大小的靶区域，绿色区可以为至少约3.5mm、至少约4mm；各距离从轴突束例如白质开始测量，如实施例1所示。
靶向区域是丘脑或下丘脑时，“绿色区”通过靶向区域边缘定义，例如离进入点至少2.5mm、至少2.8mm、至少3.0mm；离侧边界至少1.8、至少2.0、至少2.2mm；离中线至少4.5mm、至少4.75、至少5mm，如实施例2所示。
靶向区域位于脑干如黑质、红核、脑桥、橄榄核、脑神经核等时，“绿色区”通过靶向区域边缘定义，例如离进入点至少2.8mm、至少3.0mm、至少3.5mm；离脑干侧边界至少2.5、至少2.75、至少2.92mm；离中线至少1.25mm、至少1.5、至少1.6mm，如实施例2所示。
套管尖端长度需要为至少约1mm、至少约1.5mm、至少约2mm、至少约2.5mm、至少约3mm、至少约3.5mm、至少约4mm、至少约4.5mm、至少约5mm或更多。
通过将递送套管置于上面指定的坐标，在靶向脑区域达到至少约90％输液、至少约95％输液、至少约98％或更多输液的定量控制。
在本发明的一些实施方式中，提供精确定位药物递送套管到靶向脑区域的***。这类***包括立体定位递送***中如本文所列的坐标信息。这些***还可包括一种或多种递送套管；泵；和治疗剂。
分子和细胞生化的一般方法可参见标准教材如MolecularCloning：ALaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)第3版(Sambrook等，冷泉港实验室出版社(HarborLaboratoryPress)2001)；ShortProtocolinMolecularBiology(《精编分子生物学实验指南》)，第4版(Ausubel等编，约翰威立出版公司(JohnWiley&Sons)1999)；ProteinMethods(《蛋白质方法》)(Bollag等，约翰威立出版公司1996)；NonviralVectorsforGeneTherapy(《基因治疗的非病毒载体》)(Wagner等编，学术出版社(AcademicPress)1999)；ViralVectors(《病毒载体》)(Kaplift和Loewy编，学术出版社1995)；ImmunologyMethodsManual(《免疫学方法手册》)(I.Lefkovits编，学术出版社1997)；和CellandTissueCulture：LaboratoryProceduresinBiotechnology(《细胞和组织培养：生物技术的实验室方法》)(Doyle和Griffiths，约翰威立出版公司1998)。本公开中所指的试剂、克隆载体和遗传操作的试剂盒可获自商业厂商如伯乐公司(BioRad)、司查塔基公司(Stratagene)、英杰公司(Invitrogen)、西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)和克隆泰克公司(ClonTech)。
给出以下实施例以提供本领域普通技术人员关于如何制备和应用本发明的完整公开和描述，且不用于限制发明者涉及其发明的范围，也不代表以下实验是进行的所有或唯一实验。努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，组成为重量分数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
本说明书引用的所有发表物和专利申请通过引用纳入本文，就好像各单独发表物或专利申请通过引用来特定和分别指明纳入。
本发明通过本发明人发现或建议的具体实施方式描述以包括实施本发明的优选模式。本领域技术人员应理解根据本公开内容，可对示例性具体实施方式作出许多修改和变化而不背离本发明的预期范围。所有这些修改旨在包括于所附权利要求范围内。
实验
实施例1
在人和非人灵长类动物中图像导向的增强传送递送治疗的最优壳区域
材料和方法
实验对象和研究设计。包括11只恒河猴(7雄4雌，年龄为8-18岁；平均年龄11.9岁，重4-9.4kg)和2只食蟹猕猴(1雄1雌，年龄都为7岁；分别重5和7kg)的13只正常成年NHP是本研究的对象。根据美国国立卫生研究院指导方针以及加州大学旧金山分校(加利福尼亚州旧金山)动物保护和利用委员会批准的实验方案和山谷生物***(ValleyBiosystems，加利福尼亚州萨克拉门托)进行实验。13只动物接受了总共25次颅内灌注GDL(2mM)或游离钆特醇(2mM，普络显思(Prohance)；新泽西州普林斯顿的博莱科诊断公司(BraccoDiagnostics))到壳中。通过前已确立的NHP的CED技术(Bankiewicz，Eberling等，2000)进行灌注。如上所述制备GDL(Fiandaca，Varenika等.2008)(Krauze，McKnight等.2005)。
灌注过程。灵长类动物在手术前接受基线MRI以呈现解剖学标志并产生各动物建议靶灌注位置的立体定位坐标。NHP接受神经外科手术以在壳上定位MRI相容性导管。各定制导管切成特定长度，通过头骨中产生的手术转孔立体定位导向其靶标，经牙用丙烯酸固定到头骨。导管集合尖端用灌注期间类似接入的导管管芯螺栓加帽。动物恢复至少2周，然后开始灌注过程。在实时MRI采集期间用异氟烷(艾思美(Aerrane)；新泽西州利伯蒂科纳的欧美达医药产品分部(OhmedaPharmaceuticalProductsDivision))麻醉动物。将各动物的头部置于MRI相容性立体定位框内，进行基线MRI。在整个过程中监控生命特征如心率和PO2。
简言之，灌注***由以下组成：连接上样线(含GDL或游离钆特醇)的熔石英抗回流套管(Fiandaca，Varenika等.2008)(Krauze，McKnight等.2005)，带油的灌注线，带台盼蓝溶液的另一灌注线。将1-ml注射器(填充有台盼蓝溶液)装到微量注射泵(蜂窝(BeeHive)，生物分析***(BioanalyticalSystem)，印第安那州西拉法叶)上，调节通过***的液流。基于MRI坐标，将套管装在立体定位固定器上并经先前放置的导管手动导向脑部靶向区域。测量各灌注管长度以确保远端延伸超出各导管3mm。这在套管尖端产生了分段设计以使CED过程期间流体分布最大并使沿着套管的回流最小。我们把此从熔石英尖端到熔石英外壳的转变称为“段”，所有定位数据获自此段的位置，因为其在MRI上清晰可见。
在固定灌注管位置后，开始CED过程，采集实时MRI数据(实时传送递送，RCD)。我们对整个研究期间灌注的各NHP使用同一灌注参数。灌注率如下：当降低套管到靶向区域时应用0.1μl/分钟并以10分钟间隔增加到0.2、0.5、0.8、1.0和2.0μl/分钟。灌注后约15分钟，从脑中取出套管。4只动物接受多次灌注。各动物在各灌注操作间有至少4周的间隔。
磁共振成像(MRI)。用***(凯他舍(Ketaset)，7mg/kg，IM)和甲苯噻嗪(隆朋(Rompun)，3mg/kg，IM)的混合物使NHP镇静。镇静作用后，将各动物置于MRI相容性立体定位框内。记录耳带和眼带测量，确立静脉导管。然后获得MRI数据，之后动物可在严密观察下恢复直到能在其家笼中自我复正。在西门子1.5TMagnetomAvanto(西门子公司(SiemensAG)，德国慕尼黑)上获取9只NHP的脑部MR图像。获得三维快速梯度回波(MPRAGE)图像，重复时间(TR)＝2110ms，回波时间(TE)＝3.6ms，翻转角为15°，激励次数(NEX)＝1(重复3次)，矩阵＝240×240，视场(FOV)＝240×240×240，切片厚度＝1mm。这些参数产生1-mm3体素体积。扫描时间约为9分钟。在1.5-TSigmaLX扫描仪(通用电气医疗***集团(GEMedicalSystems)，威斯康星州沃基肖)上获取4只NHP的MR图像，对象头部有5英寸表面线圈，与地面平行。扰相梯度回波(SPGR)图像是T1加权且用破坏性稳态梯度回聚回波序列获得，TR＝2170ms，TE＝3.8ms，翻转角为15°。NEX＝4，矩阵＝256×192，FOV＝16cm×12cm，切片厚度＝1mm。这些参数产生0.391mm3体素体积。扫描时间约为11分钟。
NHP脑部的体积和距离测量。从各实时传送递送(RCD)中获得MR图像，并用于测量从套管段到胼胝体(CC)、内囊(IC)和外囊(EC)的距离。测量在苹果MacintoshG4计算机上进行，使用医学成像软件(2.5.1版)。OsiriX软件从经局部图像存储与传输***(PACS)所得DICOM(医学数字成像和通讯)模式的MR图像中读取所有数据说明。手动确定套管段到上述各结构的距离，然后通过软件计算。所有距离以相同方式在MRI切片上测量。
绿色区中套管段位置的X、Y和Z轴值用OsiriX软件产生的2D正交MR图像测定，其中MR图像在所有三维空间(轴、冠状和矢状)投射。我们使用前连合-后连合(AC-PC)连线的中点作为三维(3D)脑空间的零点(0，0，0)。简言之，在MRI正中矢状面绘出AC-PC连线，确定AC-PC连线的中点。然后获得通过AC-PC连线中点的水平和垂直面，它们可同时显示在所有3个面上。然后，通过测量套管段到冠状MRI面上中线的距离(X值)、前面(或后面)到冠状MRI面上AC-PC连线中点的距离(Y值)、结合MRI上AC-PC连线的轴面之上(或之下)的距离(Z值)，获得套管段的X、Y和Z轴值。各种情况下，所有距离以相同方式在MRI切片上测量(以毫米计)。
MR图像还用于钆特醇分布的体积定量。还在苹果MacintoshG4计算机上定量各对象脑中钆特醇的Vd。手动确定壳和白质束中衍生的ROI，然后软件计算各MR图像的面积，并根据确定的面积乘以切片厚度(PACS体积)，确立ROI体积。各分布的边界以相同方式在MRI系列切片上确定。所分析具体分布的PACSROI体积总和(评估的MRI切片数)确定了所测结构体积。确定的ROI体积可用BrainLAB软件(博医来公司(BrainLAB)，德国海姆斯特滕)进行3D图像重构。由2个彼此毫不知情的独立观察者评估MRI和进行所有测量。在2个观察者测量NHP中距离的初步比较中，没有获得平均值间的显著差异。
统计分析。当分段位于不同区时，比较对象组中所得的套管段到胼胝体、内囊和外囊的距离，使用史蒂特氏t检验。所有测试的统计显著性标准为p＜0.05。
结果
在此研究中，13只NHP接受25次壳灌注。NHP脑的实时MR图像获自各RCD以评估钆特醇分布，并基于套管段位置测量壳中从套管段到CC、IC、EC的距离。我们观察到一些灌注导致壳内示踪物的差容量，伴有胼胝体(CC)和偶尔内(IC)及外(EC)囊的相邻白质束(WMT)的显著分布，而其它仅分散示踪物到壳内(表1)。如果壳内所含灌注示踪物的百分数相对各变量作图(图1)，显然沿着套管的回流与壳(PUT)内输液分布的显著下降相关联(图1A)。可获得95％过量的壳(PUT)内示踪物容量，逆流小于约5mm。这些实验中的尖端长度为3mm。PUT覆盖和解剖学坐标间的后续关联性还显示另一关键变量似乎是胼胝体(CC)到套管段的距离(图1B)。在壳容量超过95％的8次灌注中，套管段至-CC的范围为3.14mm-3.76mm，平均距离为3.35±0.08mm，所述分段至-IC的范围为2.13mm-5.65mm，平均距离为4.01±0.42mm，所述分段至-EC的范围为1.98mm-3.28mm，平均距离为2.75±0.17mm。
我们推断，所述分段至-CC的距离应超出壳内输液优化容量约3mm。从套管段到IC和EC的距离(图1C、D)与壳容量相关性差。我们定义与基本上定量的示踪物壳容量相关的空间区域为“绿色区”。对应“蓝色区”与79％-94％的示踪物壳容量相关，平均为87％±3％，指示有少量渗漏到CC内，这也在4个实例中确定。因此，所述分段至-CC的范围为2.74mm-2.88mm，平均距离为2.81±0.04mm；所述分段至-IC的范围为3.26mm-4.86mm，平均距离为4.18±0.37mm，所述分段至-EC为1.92mm-3.43mm，平均距离为2.68±0.36mm。
类似地，在13个实例中确定了“红色区”，其中示踪物不太限于PUT，有31％-67％在PUT，平均为49％±0.05％，表明大量渗漏到CC、EC和IC中。在这些灌注中，所述分段至-CC的范围为0.12mm-1.99mm，平均距离为1.26±0.16mm；所述分段至-IC的范围为0.65mm-4.08mm，平均距离为2.63±0.27mm，所述分段至-EC为0.85mm-4.25mm，平均距离为1.88±0.25mm。
脑内钆特醇分布的体积。当所述分段在8个实例中置于“绿色区”时，在壳中获得52.9-174.1mm3的良好钆特醇Vd，平均体积为116.4±0.04mm3(图2A和2B)。发现2个实例在灌注结束时具有较少的钆特醇渗漏到CC中，其白质束(WMT)中的Vd分别为2.7和6.1mm3。代表性MRI示于图2C和图2F。
在所述分段置于蓝色区的4个实例中，壳中钆特醇的Vd为40.7-261.9mm3，平均体积为139.6±0.05mm3(图2A和2B)。发现所有4个实例中有渗漏到CC中。首次观察到渗漏时，灌注体积为4.7-10.5μl，平均体积为6.9±0.9μl。WMT中的终Vd为6.3-40.7mm3，平均体积为19.4±0.01mm3。代表性MRI示于图2D和2G。
“红色区”内所述分段的定位在13个实例中产生17.7-97.5mm3的钆特醇Vd，平均体积为62.1±0.01mm3(图2A和2B)。发现所有13个实例中有显著的渗漏到CC内，IC和EC中的渗漏可变。首次观察到渗漏时，灌注体积为1.6-21.8μl，平均体积为7.9±1.7μl。WMT中的终Vd为26.7-152.2mm3，平均体积为66.8±0.01mm3。在CED期间有相对较大渗漏的17个实例中，在所有17个实例中发现渗漏到CC内(100％)，3个实例有IC内渗漏(17.6％)，1个实例有EC内渗漏(5.9％)。代表性MRI示于图2E和2H。
NHP的3D脑空间的壳内绿色区的坐标。AC-PC连线中点定义为3D脑空间的零点(0，0，0)。基于通过MRI的套管段坐标计算，壳内绿色区的靶标范围为侧面9.57-14.95mm，平均距离为11.85±0.56mm(X坐标)、前面到AC-PC中点为5.88-8.93mm，平均距离为7.36±0.49mm(Y坐标)、上面到AC-PC轴面为1.64-4.47mm，平均距离为3.62±0.40mm(Z坐标)。
用于NHP壳内套管段的RGB区。基于这些分析，我们确定了壳灌注的坐标，其鉴定优选套管特征和离脑中主要结构的最优距离(RBG区)。“绿色区”定义为位于CC腹侧至少3mm的体积，垂直距离AC至少6mm(从套管尖端到AC的3mm加上尖端长度3mm)，侧离EC超过2.75mm，居中离IC大于3mm。如果包括苍白球，则离IC的最优距离大于4.01mm。“蓝色区”定义为围绕“绿色区”的厚壳，“蓝色区”的外轮廓离绿色区的外缘约0.5mm。最后，“红色区”定义为从蓝色区外轮廓到壳边缘的区域。基于这些参数，在MRI上确定NHP壳中用于套管定位的RBG区(图3A)。其次，我们还概括了单独“绿色区”，然后计算的绿色区体积为10.3mm3，前-后长度为8.5mm(图4A)。
NHP壳中的容量与分布。在上述研究中，灌注极少量(＜30μl)示踪物足以记录相对分到PUT、CC、IC和/或EC中的输液。然而，我们希望能显示绿色区内的较大体积灌注会准确地分布到PUT中而没有不适宜的非壳分布。回顾检测NHP中的其它壳灌注，我们发现套管定位在绿色区的动物中，在小(＜30μl)和大(＞100μl)体积时观察到PUT内良好的输液容量(图5)。相反，蓝色区中的套管定位与WMT内输液分布随着输液体积增长而增加相关联。这些代表性数据证明，通过确定的RBG区***，我们可仅基于最优套管定位来鉴定最优灌注。
人脑中壳的RBG区。我们采用获自NHP的RBG区的参数以预测人脑中壳的RBG区(图3B，图4)，其在局部治疗如基因转移或蛋白给予转化成临床治疗时用作人PUT中RBG区的导引。我们还划出了MR系列图像上的绿色区，然后从各MR图像计算面积以预测绿色区体积为239.5mm3，前-后距离为19.7mm。用于NHP和人中PUT的套管段的RBG区也如图3所示以同一尺度作比较。
本研究中，我们将NHP的PUT中输液管的准确立体定位与MRI示踪物分布到PUT内的效率相关联。显然，一些灌注与良好的示踪物容量相关，另一些效率较低且显示某些回流迹象。然而，许多灌注在PUT内包含较差，且与示踪物渗漏主要在胼胝体WMT内相关。分析这些数据(图1)表明壳容量的最具决定性变量是套管尖端长度和套管段到胼胝体的距离。所述段到内及外囊的距离与容量的相关性较弱。套管立体定位坐标和所得示踪物PUT:WMT分离间的关联性使我们能定义壳“绿色区”，其是套管定位最优且输液到壳的传送最优的3D空间。类似地，“蓝色区”定义为次优但仍能在一些情况下接受，“红色区”与不能接受的结果相关。另外，我们显示“绿色区”预测有效的PUT内Vd，其中可避免输液不适宜地渗漏到WMT中。
回流到套管导致压力梯度受到破坏，其削弱PUT中输液的分布，引起Vd减少。输液渗漏到CC中最普遍，其取决于所述段毗邻CC，如我们在此报道中所示。如果所述段靠近CC，加上套管轴贯穿其，回流通常在套管轴方向发生。
我们使用NHP“绿色区”预测人PUT中的对应区。我们的计算分析显示人相较NHP具有成比例更大的绿色区，绿色区体积的23倍差异是由于NHP和人PUT间的大小差异，如前所示(Yin等.2009JNeurosciMethods176(2)：200-5)。除了明显的大小差异，绿色区的整体形态非常类似。此知识对于在病人壳中获得良好治疗Vd而没有显著渗漏到周围解剖学结构来说关键。
如前所述已在治疗人神经疾病中更广泛使用CED(Eberling等2008Neurology70(21)：1980-3)，脑结构内治疗剂的受控分布对于采用基因或分子治疗的任何方法关键。这对于优化涵盖整个靶向治疗体积的效力而同时避免相邻脑区域或CSF途径是重要的。非常难以预测CED递送的治疗剂分布，这是由于缺乏对这些情况下最优套管定位的理解。这适用于将化疗剂递送到脑肿瘤，在PD病人中注入生长因子、酶和病毒载体。
出现用于功能性神经外科手术治疗干预的实时影像的MRI技术，如PD中MRI导向的DBS刺激电极定位(Larson等.2008StereotactFunctNeurosurg86(2)：92-100；Martin等.2009TopMagnResonImaging19(4)：213-21)，是脑中图像导向治疗应用的另一示例。准确靶向CED的“绿色区”可通过使用装有瞄准装置和iMRI单元的头骨来完成。除了呈现灌注管精确定位，所需治疗剂分布可通过呈现CED和随后的控制灌注过程来获得。
总之，本发明提供通过MRI的第一定量分析套管定位和钆特醇分布，引入NHP壳中的RBG区定义。此外，通过MRI实时呈现套管定位和随后的准确控制钆特醇分布程度，涉及重要的安全问题，特别是当需要薄壁组织灌注大体积且渗漏或过量分布可能不利时。从我们转化的非人灵长类研究开发的RBG区套管定位对于临床试验具有重要意义，所述试验对于PD以壳内各种治疗剂的CED为特征。类似的RBG区也可对其它脑区域定义，如丘脑和脑干，从而确立可靠的坐标用于临床中治疗剂的外科手术灌注。
表1：测量段到CC、IC和EC的距离、逆流长度和壳中MRI示踪物分布的百分数。空间坐标与逆流长度和壳内示踪物容量的百分数相关联。通过将壳中MRI示踪物分布体积除以白质束中示踪物渗漏体积，获得PUT中Vd与渗漏Vd的比例，CC为胼胝体；IC为内囊；EC为外囊；PUT为壳；Vd为分布体积。
实施例2
通过磁共振成像在非人灵长类中实时观察和表征钆特醇向丘脑和脑干内的递送
在本研究中，6只NHP接受22次丘脑和脑干内的灌注。从各RCD获得NHP脑的实时MR图像以评估Gd分布并基于套管段位置分别测量从丘脑或脑干中的套管段到中线、侧边缘和套管进入点到靶向结构的距离。
实验对象和研究设计
包括4只食蟹猕猴(2雄2雌，年龄为7-8岁；平均年龄8.2岁，重5-12.8kg)和2只恒河猴(1雄，年龄10岁；重12.2kg；1雌，年龄8岁，重6kg)的6只正常成年NHP参与本研究。根据美国国立卫生研究院指导方针用加州大学旧金山分校(加利福尼亚州旧金山)动物保护和利用委员会批准的实验方案和山谷生物***(ValleyBiosystems，加利福尼亚州萨克拉门托)进行实验。这些动物接受了总共22次颅内灌注钆特醇(Gd，2mM)到丘脑和脑干中。通过前已确立的NHP的CED技术进行灌注。
灌注过程。灵长类动物在手术前接受基线MRI以呈现解剖学标志并产生建议灌注靶位置的立体定位坐标。NHP接受丘脑和脑干中CED的MRI相容性塑料导管阵列(12mm直径×14mm高，含有27个检查孔)立体定位。各导管阵列经塑料螺栓和牙用丙烯酸固定到头骨。导管阵列定位后，动物恢复至少2周，然后开始灌注过程。在灌注当日，用异氟烷(艾思美；新泽西州利伯蒂科纳的欧美达医药产品分部)麻醉动物。然后，将各动物的头部置于MRI相容性立体定位框内，进行基线MRI。在整个过程中监控生命特征如心率和PO2。简言之，灌注***由以下组成：连接上样线(含Gd)的熔石英抗回流套管，带油的灌注线，带台盼蓝溶液的另一灌注线。将1-ml注射器(填充有台盼蓝溶液)装到哈佛MRI相容性注射泵(哈佛生命科学公司(HarvardBioscienceCompany)，马萨诸塞州霍利斯顿)上，调节通过递送套管的液流。基于MRI坐标，将套管经先前放置的导管阵列***脑部靶向区域。
测量各灌注管长度以确保远端延伸超出套管段3mm。这在套管尖端附近产生了分段设计，使CED过程期间流体传送最大而使沿着套管的回流最小。我们把此从熔石英尖端到熔石英外壳的转变称为“段”，所有定位数据获自此段的位置，因为其在MRI上清晰可见。我们在灌注管***脑部期间保持其中为正压以使管***期间尖端闭塞的可能性最小。在固定灌注管位置后，开始CED过程，采集实时MRI数据(实时传送递送，RCD)。我们对整个研究期间灌注的各NHP使用同一灌注参数。灌注率如下：当降低套管到靶向区域时应用0.1μl/分钟(用以防止组织进入尖端)，达到靶标后以10分钟间隔增加到0.2、0.5、0.8、1.0和2.0μl/分钟。灌注后约15分钟，从脑中取出套管。4只动物接受多次灌注。各动物在各灌注操作间有至少4周的间隔。
磁共振成像(MRI)。用***(凯他舍，7mg/kg，IM)和甲苯噻嗪(隆朋，3mg/kg，IM)的混合物使NHP镇静。镇静作用后，将各动物置于MRI相容性立体定位框内。记录耳带和眼带测量确立静脉导管。然后获得MRI数据，之后动物可在严密观察下恢复直到能在其家笼中自我复正。在西门子1.5TMagnetomAvanto(西门子公司，德国慕尼黑)上获取4只NHP中14次CED的脑部MR图像。获得三维快速梯度回波(MP-RAGE)图像，重复时间(TR)＝2110ms，回波时间(TE)＝3.6ms，翻转角为15°，激励次数(NEX)＝1(重复3次)，矩阵＝240×240，视场(FOV)＝240×240×240，切片厚度＝1mm。这些参数产生1-mm3体素体积。扫描时间约为9分钟。
在1.5-TSigmaLX扫描仪(通用电气医疗***集团，威斯康星州沃基肖)上获取2只NHP中8次CED的MR图像，对象头部有5英寸表面线圈，与地面平行。扰相梯度回波(SPGR)图像是T1加权且用破坏性稳态梯度回聚回波序列获得，TR＝2170ms，TE＝3.8ms，翻转角为15°。NEX＝4，矩阵＝256×192，FOV＝16cm×12cm，切片厚度＝1mm。这些参数产生0.391mm3体素体积。扫描时间约为11分钟。
NHP脑部的体积和距离测量。从各RCD中获得MR图像，并用于测量从套管段到中线(段-中线)、套管进入点(段-进入)到靶区域(丘脑或脑干)、靶区域侧边缘(段-侧面)的距离。测量在苹果MacintoshG4计算机上进行，使用医学成像软件(2.5.1版)。OsiriX软件从经局部图像存储与传输***(PACS)所得DICOM(医学数字成像和通讯)模式的MR图像中读取所有数据说明。手动确定套管段到上述各点的距离，然后在选择各点后通过软件计算。所有距离以相同方式在所有MRI切片上测量。
绿色区中套管段位置的X、Y和Z坐标值用OsiriX软件产生的2D正交MR图像测定，其中MR图像在所有三维空间(轴、冠状和矢状)投射。我们使用前连合-后连合(AC-PC)连线的中点即连合中点(MCP)作为三维(3D)脑空间的零点(0，0，0)。简言之，在MRI正中矢状面上绘出AC-PC连线，确定MCP。然后测定通过MCP的正交水平(轴)和垂直(冠状)面，轴面含有AC-PC连线以及正中矢状面。然后，通过测量套管段到冠状MRI面上中线的距离(X值)、前面(或后面)到轴MRI面上MCP的距离(Y值)、矢状MRI上AC-PC连线之上(或之下)的距离(Z值)，获得套管段的X、Y和Z值。各种情况下，所有距离以相同方式在MRI切片上测量(以毫米计)。
MR图像还用于Gd分布的体积定量(Vd)。还在苹果MacintoshG4计算机上定量各对象脑中Gd的Vd。通过概括丘脑或脑干以及周围结构中提高的灌注面积，手动确定感兴趣区域(ROI)。然后OsiriX软件计算各MR图像的面积，并根据确定的面积乘以切片厚度(PACS体积)，确立ROI体积。各分布的边界以相同方式在MRI系列切片上确定。所分析具体分布的PACSROI体积总和(评估的MRI切片数)确定了所测体积。确定的ROI体积可用BrainLAB软件(博医来公司，德国海姆斯特滕)进行3D图像重构。
统计分析。比较对象组中的Gd分布和距离变量(套管段到中线；套管段到区域进入点；套管段到各区侧边缘)，使用史蒂特氏t检验。所有测试的统计显著性标准为p＜0.05。
结果
CED期间丘脑中钆特醇的分布。在丘脑进行的14次灌注中，8个实例(57.1％)获得了优良的Gd分布，其Vd的范围为159.1-660.3mm3，平均体积为405.6±66.6mm3。图6显示丘脑中Gd的Vd相比丘脑和WMT中总Vd的百分数，其在所有8个实例中为100％，表明没有Gd渗漏到WMT。
在6个实例(42.9％)中，获得了丘脑中的良好Gd分布，5个实例中有渗漏进WMT且4个实例中渗漏进豆核束(Lenf)。丘脑中Gd的Vd范围为58.5-267.6mm3，平均体积为191.3±38.1mm3。丘脑中Vd百分数的范围为86.0％-93.1％，平均为89.0％±1.3％(图6)，表明有某些渗漏到周围结构中。渗漏的Vd范围为8.3-43.7mm3，平均体积为24.3±7.0mm3。丘脑中的Gd分布在优良Vd与伴有渗漏的良好Vd间有显著差异。代表性MRI显示丘脑中套管段定位(图6B和6F)和Gd分布(图6C到6E和6G到6I)。
丘脑中套管段定位的参数测量。我们观察到一些灌注引起丘脑内良好的示踪物容量，有一些分布到相邻WMT和Lenf中，而其它仅使示踪物分布到丘脑中。CED期间，给定药剂的Vd取决于许多因素。在我们的实验中，成功CED的重要组成可能是套管定位。因此，采用MR图像测量从套管段到丘脑的中线(段-中)、侧边缘(段-侧)和套管进入点(段-进入)的距离。丘脑中的套管定位示于图7。
在丘脑中有优良Gd容量的7个实例中，分段至-中线的范围为4.99mm-7.73mm，平均距离为6.24±0.36mm，分段至-进入点的范围为2.82mm-4.59mm，平均距离为3.96±0.29mm，分段至-侧边缘的范围为2.16mm-6.95mm，平均距离为3.58±0.63mm。套管和水平线间的角度范围为58.85-66.67°，平均为63.90±1.02°。
在丘脑中有良好Gd容量且一些渗漏到周围结构的5个实例中，分段至-中线的范围为5.92mm-7.69mm，平均距离为7.18±0.27mm，4个实例中分段至-进入点的范围为1.26mm-2.18mm，平均距离为1.79±0.19mm且伴有渗漏到WMT中，3个实例中分段至-侧边缘的范围为1.33mm-1.88mm，平均距离1.67±0.19mm且伴有渗漏到Len中。分段至-进入点和分段至-侧边缘在优良Vd组与带渗漏的良好Vd组间有显著差异。套管和水平线间的角度范围为61.08-69.89°，平均为64.65±1.46°。
如果丘脑内所含灌注示踪物的百分数相对各变量作图，显然从套管段到其进入点或丘脑侧边缘的距离与丘脑内输液分布显著下降相关联(图8和9)。在渗漏到MWT的4次灌注中，套管段置于丘脑的套管进入点附近，平均距离为1.79mm(图8A)。在渗漏到Lenf的3次灌注中，套管段置于丘脑的侧边缘附近，平均距离为1.67mm(图9A)。我们推断对于丘脑内最优输液容量，分段至-进入点和分段至-侧边缘距离应分别超出约2.8和2.2mm。套管段到中线的距离与壳容量弱相关(图10)。
CED期间脑干中钆特醇的分布。在脑干进行的所有8次灌注(100％)中，获得了优良的Gd分布，Vd的范围为224.3-886.3mm3，平均体积为585.2±75.4mm3。仅发现一个实例有很少量的Gd在灌注结束时渗漏到丘脑中，其丘脑中的Vd为30.5mm3。脑干中Gd的Vd相比脑干和丘脑中总Vd的百分数，在7个实例中为100％且在1个实例中为95.6％(图11A)。较好控制了脑干中的灌注，本研究所用的灌注体积小于212μl。脑干灌注朝向中脑头侧分布且尾侧朝向延髓。未观察到分布到小脑中。代表性MRI显示脑干中的套管段定位(图11B)和Gd分布(图11C到11E)。
脑干中套管段定位的参数测量。图12显示8个实例中脑干的套管定位具有优良的Gd分布。分段至-中线的范围为1.56mm-3.88mm，平均距离为2.58±0.30mm，分段至-进入点的范围为3.55mm-12.63mm，平均距离为7.29±0.97mm，分段至-侧边缘的范围为2.87mm-5.09mm，平均距离为4.14±0.25mm。套管和水平线间的角度范围为60.89-67.26°，平均为64.27±0.83°。如果脑干内所含灌注示踪物的百分数相对各变量作图，显然套管合适放置从而获得脑干内的最优输液容量(图13)。
丘脑和脑干中Gd分布体积的三维重构。用BRainLab软件概括MRI上观察到的Gd信号，在丘脑(绿色)和脑干(红色)中获得Vd的3D重构。显示Gd分布的结构相关体积，在丘脑和脑干中有强分布。丘脑和脑干中的分布体积相对灌注体积(Vi)作图。线性趋势线显示在优良Vd(R2＝0.997)和有渗漏的良好Vd((R2＝0.996)情况下的丘脑以及脑干(R2＝0.992)中Vi与Vd间有强关联性。根据这些发现，预期Vd是Vi的3-4倍大，Vi在丘脑中高至158μl且在脑干中高至212μl。我们研究中灌注的结构内脂质体的所有Vd/Vi比总体上在丘脑中为3.2且在脑干中为3.9。丘脑中的最大分布对于158μl产生约660.3mm3，分布比为417.9％，脑干中对于212μl为约695.6mm3，分布比为328.1％。
用于NHP的丘脑和脑干中套管段的绿色区。基于这些分析，我们确定了丘脑和脑干灌注的坐标，其鉴定优选套管特征和离脑中主要结构的最优距离。
当套管放置于合适角度时，丘脑中的“绿色区”定义为离进入点至少2.8mm，离丘脑侧边缘超过2.2mm，离中线大于5mm。类似地，当套管放置于合适角度时，脑干中的“绿色区”定义为离进入点至少3.5mm，离脑干侧边缘超过2.9mm，离中线大于1.6mm。
实施例3
MRI预测增强传送递送AAV2-GDNF后NHP脑中GDNF的分布
采用增强传送递送(CED)的基因治疗需要实时紧密监控药物灌注和准确预测药物分布。对比(钆特醇，Gd)MRI用于监控CED灌注以及预测治疗剂2型腺相关病毒(AAV2)载体的表达模式，所述载体编码胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)。非人灵长类(NHP)丘脑用于建模灌注以允许递送临床相关的大体积。将胞内分子-编码芳族L氨基酸脱羧酶(AADC)的AAV2与AAV2-GDNF/Gd共灌注以区分AAV2转导与胞外GDNF扩散。Gd的分布体积(Vd)与Vi线性相关且平均Vd/Vi比为4.68±0.33。Gd分布与AAV2-GDNF或AAV2-AADC表达之间有很好的相关性，GDNF或AADC的表达面积与Gd的比例都接近1。我们的数据支持使用对比(Gd)MRI通过CED监控AAV2并预测AAV2转导的分布。
本研究目标是开发一种方法，用于在基于AAV2的基因治疗载体递送到靶区域中提高安全性和可预测性。本发明特别集中于预测人纹状体中AAV2介导的GDNF表达体积和模式的方法，使用MRI示踪物钆特醇(Gd，普络显思)的共灌注。Gd和AAV2-GDNF的共灌注可近似实时监控灌注，使用重复的MRIT1序列。开发MRI导向的监控***对于将我们的临床前AAV2-GDNF基因治疗程序转化成临床现实是关键的。
通过增强传送递送(CED)将AAV2-GDNF壳递送到年老和患帕金森症的非人灵长类(NHP)的临床前研究证实壳是此基因治疗策略的理想递送区域。然而，由于PD患者的壳比患帕金森病的NHP壳约大5倍，灌注体积需要按比例增加以对临床试验中人壳所需覆盖面积建模。然而，由于输液会溢出进入其周围的白质束，NHP壳仅可用不超过30-40μL的体积灌注。为了更好接近使人壳覆盖最大化所涉及的灌注临床参数，我们靶向NHP丘脑，其是NHP壳大小的约1.4倍但在毗邻周围结构方面与壳相当。因此，在本研究中，我们以临床相关体积(～150μL)灌注AAV2-GDNF载体到NHP丘脑以使Gd分布模式与随后组织学切片上的GDNF表达分布相关联。
先前的研究显示大脑内的AAV2-GDNF灌注不仅引起胞内神经元胞体和纤维染色，还产生胞外免疫反应性，提示转导的GDNF蛋白释放到胞外空间。这提出了一种可能性，胞外GDNF蛋白可能通过浓度梯度介导的扩散来展开。因此，GDNF分布不仅可受AAV2载体传送和转导影响，还可能受胞外GDNF蛋白扩散影响。为了更好区分病毒转导与GDNF蛋白扩散，我们将表达非分泌性胞内分子芳族L氨基酸脱羧酶(AADC)的第二AAV2载体与AAV2-GDNF/Gd共灌注。由于内源AADC在NHP丘脑中正常不存在，丘脑中转导AADC的表达可提供对AAV2载体转导和分布边界的可靠预测。
材料和方法
实验对象和研究设计。3只正常成年NHP是本研究的对象。根据美国国立卫生研究院指导方针和加州大学旧金山分校(加利福尼亚州旧金山)动物保护和利用委员会批准的实验方案进行实验。3只NHP接受颅内灌注AAV2载体和游离钆特醇(1mMGd，普络显思；新泽西州普林斯顿的博莱科诊断公司)到丘脑中。通过前已确立的NHP的CED技术进行灌注。
灌注配方。钆特醇(Gd，C17H29N4O7Gd，普络显思)购自博莱科诊断公司(新泽西州普林斯顿)。AAV2载体含有在巨细胞病毒启动子控制下的人GDNF(AAV2-GDNF)或人AADC(AAV2-AADC)的cDNA序列，所述载体由费城儿童医院(Children’sHospitalofPhiladelphia)的AAV临床载体核心(AAVClinicalVectorCore)包装，使用三重转染技术且随后通过CsCl梯度离心纯化。AAV2-GDNF/AAV2-AADC原液浓缩到2×1012载体基因组/ml(vg/ml)，由定量PCR测定，然后临用前在磷酸盐缓冲液盐水(PBS)-0.001％(v/v)普朗尼克(Pluronic)F-68中稀释到1～1.2×1012载体基因组(vg/ml)。
灌注过程。NHP接受神经外科手术以将MRI相容性引导阵列置于丘脑上。各定制导管切成特定长度，通过头骨中产生的手术转孔立体定位导向其靶标，经牙用丙烯酸固定到头骨。所述阵列的较大直径干分别具有0.53和0.45mm的外和内径。尖端区段的外和内径分别为0.436和0.324mm。引导阵列集合尖端用灌注期间类似接入的导管管芯螺栓加帽。动物恢复至少2周，然后开始灌注过程。
用***(凯他舍，7mg/kg，IM)和甲苯噻嗪(隆朋，3mg/kg，IM)的混合物使NHP镇静，用异氟烷(艾思美；新泽西州利伯蒂科纳的欧美达医药产品分部)麻醉。将各动物的头部置于MRI相容性立体定位框内，在灌注前进行基线MRI，从而呈现现解剖学标志并产生各动物建议靶灌注位置的立体定位坐标。在整个过程中监控生命特征如心率和PO2。简言之，灌注***由以下组成：连接上样线(含载体和Gd)的带3mm段的熔石英抗回流套管，带油的灌注线，带台盼蓝溶液的另一灌注线。将1-ml注射器(填充有台盼蓝溶液)装到微量注射泵(蜂窝；生物分析***，印第安那州西拉法叶)上，调节通过***的液流。基于MRI坐标，套管经先前放置的引导阵列手动导向脑部靶向区域。设计套管尖端3mm段以使CED过程期间流体分布最大并使沿着套管的回流最小。在固定灌注管位置后，开始CED过程，采集实时MRI数据(实时传送递送，RCD)。我们对整个研究期间灌注的各NHP使用同一灌注参数。灌注率如下：当降低套管到靶向区域时应用0.1μl/分钟并以20～30分钟间隔增加到1.5和2.0μl/分钟。灌注后，从脑中取出套管，动物可在严密观察下恢复直到能在其家笼中自我复正。
磁共振成像(MRI)。在西门子1.5TMagnetomAvanto(西门子公司，德国慕尼黑)上获取脑部MR图像。获得三维快速梯度回波(MP-RAGE)图像，重复时间(TR)＝17ms，回波时间(TE)＝4.5ms，翻转角为15°，激励次数(NEX)＝1(重复3次)，矩阵＝256×256，视场(FOV)＝240×240×240，切片厚度＝1mm。这些参数产生1-mm3体素体积。扫描时间约为每序列5分钟，在整个灌注过程中连续扫描。
MR图像中Gd分布的体积和面积定量。各灌注脑区域内的Gd分布体积用OsiriX医学图像软件(3.6版)定量。所述软件从MR图像中读取所有数据说明。确定Gd信号的象素极限值后，所述软件计算确定阈值上的信号，确立各MRI系列的感兴趣区域(ROI)面积并估算NHP脑的ROI的分布体积Vd。这使得Vd可在任何给定时间点确定并能在三维图像中重构。
组织学操作。动物用戊巴比妥钠(25mg/kgi.v.)深度麻醉，在给予载体后约5周实施安乐死。收获脑部，用脑模具冠状切割。脑块用4％多聚甲醛(PFA)后固定，然后在低温恒温箱内切成40-μm冠状切片。加工切片用于免疫组化(IHC)染色。染色连续切片用于胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和芳族人L氨基酸脱羧酶(hAADC)。每20个切片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗并在1％H2O2中孵育20分钟以封闭内源性过氧化物酶活性。在PBS中清洗后，所述切片在封闭液封闭液(保科医疗公司(BiocareMedical)，加利福尼亚州康科德)中室温孵育30分钟，然后用溶于Da稀释剂(保科医疗公司)的一抗(GDNF，1∶500，明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物(R&DSystems)；AADC，1∶1000，马萨诸塞州比尔里卡的开米康公司(Chemicon)；TH，1∶10000，开米康公司)室温过夜孵育。各自在PBS中室温冲洗3次5分钟后，切片在Mach2或山羊HRP聚合物(保科医疗公司)中室温孵育1小时，然后清洗数次并显色(DAB；加利福尼亚州伯林盖姆的载体实验室公司(VectorLaboratories)；瓦拉肯坚牢玫红(VulcanFastRed)；保科医疗公司)。免疫染色切片装在载玻片上并用(理查德-艾伦科技公司(Richard-AllanScientific)，密歇根州卡拉马祖)密封。
GDNF和AADC表达的面积定量。用蔡斯(Zeiss)光学显微镜进行GDNF和AADC表达的分析。在低倍下鉴定GDNF-和AADC-阳性区域，在高倍下确认阳性染色细胞。低倍GDNF染色图像用ImageJ软件分析，用阈函数鉴定阳性染色面积。基于高倍显微镜成像，手动概括AADC-IR面积。将GDNF或AADC染色阳性的区域转至对应灵长类MRI，通过在对应基线MRI图像上手动描述阳性区域，使用OsiriX软件而不参考显示Gd分布的MR图像。
统计分析。GDNF和AADC表达的Gd分布面积通过史蒂特氏t检验和皮尔逊积差相关作比较。所有测试的统计显著性标准为p＜0.05。
表2.实验设计
结果
丘脑中的Gd分布。在此研究中，3只恒河猴灵长类动物灌注～150μL(Vi)AAV2-GDNF/Gd(1～1.2×1012vg/ml，n＝5)到丘脑，这些灌注中的3次包括AAV2-AADC(1×1012vg/ml，n＝3)(表1)。磁共振成像(MRI)在灌注之前和期间进行，每隔1cm获得冠状脑图像以评估Gd分布(Vd)。
T1-加权的MRI以5分钟间隔进行，图像显示有Gd灌注的解剖学区域与周围非灌注组织清晰可分(图15a-15e)。在灌注开始时，Gd分布的圆柱形环在套管尖端周围形成(图15a)。灌注迅速扩大以随着Vi增加而呈现更具球型模式(图15a-15e)。灌注结束时用OsiriX软件3D重构Gd分布，显示泪滴型信号(图15f)。
用OsiriX软件在各个时间点定量Gd分布体积(Vd)。与灌注期间总MR成像表现保持一致(图15a-15e)，Gd的Vd随着Vi线性增加(R2＝0.904，P＜0.0001)(图16)，终体积范围为700-900mm3，涵盖约70-90％的NHP丘脑总体积。各灌注位置的Vd/Vi比保持一致且平均值为4.68±0.33。
Gd与GDNF组织学的关联性。5周后对动物实施安乐死，含有丘脑的脑块进行后固定并按冠状切片。相隔0.8mm的连续切片组用抗GDNF的抗体染色。免疫组化分析证明灌注位点的GDNF蛋白表达模式与Gd分布类似(图17a和17b)。定量分析显示GDNF表达面积与Gd分布面积高度相关(图17d和17e)。GDNF染色面积相比Gd分布面积的平均比例为1.08±0.17。高倍显微镜图像显示在神经元细胞胞质以及胞外空间观察到GDNF染色，胞外空间的染色模式提示GDNF结合胞外基质(图17c)。
在丘脑AAV2-GDNF灌注后的所有动物中，在远离针道的不同皮质区观察到强GDNF染色(图17b、18b和19b)。我们还发现用AAV2-AADC共灌注的NHP皮质中有AADC染色(图18c和19c)。皮质中存在GDNF或AADC蛋白是由于来自丘脑的轴转运。因此，在当前研究中，我们排除了在丘脑皮层纤维和来自基因表达区的皮质中的染色，以更好比较Gd分布与GDNF或AADC表达，所述表达主要源自丘脑内的直接传送递送。
GDNF和AADC组织学的关联性。丘脑递送AAV2-GDNF产生强烈的胞内和胞外GDNF免疫反应性。考虑到MRI示踪物Gd的广泛分布，本研究中显著的GDNF分布可归因于灌注载体的散布体积(～150μL)。然而，GDNF胞外扩散水平还可影响分布。因此，为了评价胞外扩散对绿色表达总面积的影响，在共灌注AAV2-AADC的动物中，将GDNF表达面积与胞内分子AADC表达面积作比较。这样，可区分细胞转导与基因产物的分泌和扩散。
2只灵长类动物(#2和#3)共灌注AAV2-GDNF和AAV2-AADC到丘脑；1只接受单侧灌注且另1只接受两侧。含有丘脑灌注的相邻脑切片分别对GDNF和AADC染色。另外，由于AADC免疫染色可检测NHP中的转导和内源AADC(图18c和18e)，我们开发了双重染色显色法以区分转导AADC与内源AADC，后者与TH阳性分布共定位。对切片进行双标记，AADC为浅棕色且内源性酪氨酸羟化酶(TH)为亮红色(图18d)。几乎所有含内源AADC的神经元对TH阳性。因此，含内源AADC以及TH的细胞进行双标记并以深红色染色(图18f)，仅具有外源AADC的转导神经元以单一色原染色并显示浅棕色(图18i)。通过重叠相邻AADC染色切片与AADC/TH双染色切片，我们能描述出转导AADC表达的边界(图18c，蓝线)。
单侧共灌注AAV2-GDNF和AAV2-AADC到1只灵长类动物(#2)丘脑中，可容易区分内源和转导AADC，因为转导AADC仅在脑部灌注面观察到。相反，与TH共定位的内源AADC存在于尾、壳和黑质的双侧(图18d)。对于此具体灵长类动物，由于丘脑灌注延伸到壳的内面，发现AADC阳性细胞在内壳边缘(图18h)，与仅含有内源AADC阳性纤维的左壳相反(图18g)。右壳中的这些AADC阳性细胞可包含用于以蓝色概括的面积测量(图18h)。右壳和尾中的总AADC染色强度看来强于左侧(图18c、18g和18h)。我们还观察GDNF染色切片中的类似模式(图18b)。右壳和尾上的AADC或GDNF免疫活性提高最可能是由于从背部黑质顺行转运已表达基因产物，其中灌注在此灵长类动物中扩展。因此，这些区域不包括作为直接载体转导区。
通过比较相邻GDNF和AADC/TH染色切片，我们发现丘脑中的GDNF和外源AADC的表达模式几乎相同。另外，GDNF和AADC表达用MRIGd分布基本重叠(图18a)。MRI冠状面系列中的Gd、GDNF和AADC分布面积彼此高度相关(图18j)。AADC染色面积相比分布面积的平均比例为1.07±0.06，等于GDNF相比Gd(1.08±0.17)。所有这些数据有力表明AADC和GDNF分布间的优良匹配。
双侧共灌注AAV2-GDFN和AAV2-AADC到另一灵长类动物(#3)的丘脑，进一步证实了我们的发现(图19)。大部分的转导GDNF和AADC蛋白限于丘脑两侧(图19b和19c)，其中表达模式与Gd分布高度相关(图19a、19d和19e)。
本研究中，我们采用MRI对比剂近似实时呈现灌注以预测治疗剂AAV2-GDNF的分布。NHP丘脑用于建模人壳中的灌注以递送临床相关体积。我们能以～150μL的Vi通过CED给予载体到丘脑中，而无回流或渗漏。Gd的Vd与Vi线性相关且Vd/Vi的平均比为4.68±0.33。Gd分布与AAV2-GDNF和AAV2-AADC表达的相关性都很好，GDNF或AADC的表达面积相比Gd的比例都接近1，有力表明我们能预测AAV2转导分布和随后用对比(Gd)MRI的基因表达。另外，由于GDNF和AADC的表达模式几乎相同，AAV2-GDNF转导后没有可检测的GDNF蛋白扩散。因此，在未来的临床试验中接受AAV2-GDNF的病人的预期GDNF表达预计是共灌注Gd的Vi的约4-5倍，而没有GDNF从转导区域扩散引起的任何额外覆盖。此信息对于准确选择临床研究中AAV2-GDNF载体剂量关键。
使用CED在大脑内直接灌注强效治疗到疾病影响区域提供了治疗神经疾病的有效策略。在当前研究中，使用CED共灌注MRI对比增强剂Gd与AAV2-GDNF治疗已证明可用于监控灌注和估计治疗分布。用Gd的实时MR成像显示易与周围组织区分的灌注区(图15A-15E)。此明确定义的灌注区可近似实时调整灌注参数并进行准确体积分析。
CED灌注期间，Gd和AAV载体间的分布差异相对较小，这可能是由于压力梯度介导液体流动的主要推动力，而不是浓度梯度介导的扩散。因此，MRIGd信号能可靠地模拟灌注期间的AAV2载体分布。对于灌注结束后的更长时间，脑中AAV2载体以及转导细胞释放的胞外GDNF的分布可仅仅取决于浓度梯度和组织中的输液扩散率。我们发现基于灌注期间近似实时MRI的Gd分布与灌注5周后的GDNF表达高度相关，Gd相比GDNF的比例接近1。此外，GDNF分布与胞外分子AADC几乎相同。这些发现与先前的研究一致，有力说明灌注停止后AAV2载体或GDNF的扩散有限。因此，Gd的CED灌注分布可有效预测AAV2-GDNF在急性和更长时间段的分布。
Gd(Vd)分布随着输液体积(Vi)线性增加，Vd与Vi的比例为4.68±0.33，这在先前研究(约4～5)的相对较窄范围内。MRI导向CED递送平台中此Vd与Vi的恒定线性关系可作为规划AAV2-GDNF载体临床剂量以及预测此和其它治疗剂在PD患者中分布的基础。
总之，我们能通过CED准确灌注AAV2-GDNF载体到靶向脑区域，使用近似实时MRI成像。对比MRI额外提供了引导AAV2载体灌注和可靠预测AAV2-GDNF表达的有价值工具，从而能提高PD患者中用此载体的安全性、准确性和壳的临床相关覆盖。

Claims (13)

1.一种递送治疗剂到灵长类脑部的***，其中所述***包括：
作为递送管的抗回流分段插管；
成像设备，该成像设备能够产生一组确定区域内的坐标，所述区域的确定用于在灵长类动物脑部靶向区域提供输液定量容量；
用于脑中精确点定位的基于计算机的模式，所述基于计算机的模式包括立体定位方法和数字形式的脑图谱；
立体定位固定器，装在该立体定位固定器上的抗回流分段插管，所述抗回流分段插管由所述坐标与所述立体定位方法一起引导到所述脑部靶向区域，从而使得抗回流分段插管的尖端和/或段位于所述确定区域内，所述确定区域距离渗漏通路至少3mm，所述渗漏通路包含选自以下的轴突束：胼胝体(CC)、前连合(AC)；外囊(EC)、和内囊(IC)。
2.如权利要求1所述的***，其特征在于，所述治疗剂通过增强传送递送来递送。
3.如权利要求2所述的***，其特征在于，所述渗漏通路还包含以下所述之一或多项：血管、血管周隙和脑室间隙。
4.如权利要求1所述的***，其特征在于，脑部靶向区域在大脑内。
5.如权利要求4所述的***，其特征在于，脑部靶向区域选自：纹状体、尾、壳、苍白球、伏隔核、隔核和底丘脑核。
6.如权利要求5所述的***，其特征在于，所述脑部靶向区域是壳。
7.如权利要求1所述的***，其特征在于，所述脑部靶向区域是丘脑或下丘脑。
8.如权利要求7所述的***，其特征在于，所述递送管尖端定位选择为离进入点至少2.5mm；离侧边界至少1.8mm；离中线至少4.5mm。
9.如权利要求7所述的***，其特征在于，所述递送管尖端定位选择为离进入点至少3mm；离侧边界至少2.2mm；离中线至少5mm。
10.如权利要求1所述的***，其特征在于，所述脑部靶向区域在脑干内。
11.如权利要求10所述的***，其特征在于，所述递送管尖端定位选择为离进入点至少2.8mm；离侧边界至少2.5mm；离中线至少1.25mm。
12.如权利要求10所述的***，其特征在于，所述递送管尖端定位选择为离进入点至少3.5mm；离侧边界至少2.92mm；离中线至少1.6mm。
13.如权利要求12所述的***，其特征在于，所述脑部靶向区域选自黑质、红核、脑桥、橄榄核、和脑神经核。
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Detection of infusate leakage in the brain using real-time imaging of convection-enhanced delivery;Vanja varenika etal;《J Neurosurg.》;20081130;摘要，正文874-880，图1-2 *

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