CN102573906A - 抑免蛋白/亲环蛋白和emmprin免疫球蛋白受体超家族成员的双重抑制 - Google Patents

抑免蛋白/亲环蛋白和emmprin免疫球蛋白受体超家族成员的双重抑制 Download PDF

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Abstract

本公开内容提供了通过调节抑免蛋白/亲环蛋白家族成员和EMMPRIN免疫球蛋白受体超家族成员的组合，用于在对象中调节适应性免疫反应，而不显著影响先天免疫反应的方法和组合物。本发明还提供通过调节抑免蛋白/亲环蛋白家族成员和EMMPRIN免疫球蛋白受体超家族成员用于治疗各种临床症状的方法和组合物。

Description

抑免蛋白/亲环蛋白和EMMPRIN免疫球蛋白受体超家族成员的双重抑制
关于联邦赞助研究的声明
本发明是在国家科学基金会给予的授与号为MCB-0820567的政府支持下作出的。该政府在本发明中拥有某些权利。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2009年2月6日递交的美国临时专利申请号61/150,660的优先权，其内容以参考方式被合并于此，如同其被完全阐述于此。
技术领域
本发明涉及通过独立地或者组合地抑制抑免蛋白/亲环蛋白家族成员和/或EMMPRIN免疫球蛋白受体超家族成员，用于在对象中调节适应性免疫反应，而不显著影响先天免疫反应的方法和组合物。本发明还涉及通过独立地或者组合地抑制抑免蛋白/亲环蛋白家族成员和/或EMMPRIN免疫球蛋白受体超家族成员用于治疗各种临床症状的方法和组合物。
背景技术
广泛种类的临床症状和疾病由急性和慢性炎症过程介导，受免疫***调节。免疫***被设计成能保护主体不受感染性的损害，防止在暴露至各种侵入物的生命期间可能出现的肿瘤细胞，以及消除外来的潜在有毒化学物质。在广义上，免疫***用于保护主体的主要效应器途径有两个：先天免疫和适应性免疫。先天免疫和适应性免疫反应均通过普通效应分子促进对于损伤和外来侵入物的侵入的炎症性反应，特别是促炎细胞因子TNFα和IL-1β。因此，两种类型的免疫均有助于炎性疾病的病理生理。
先天免疫被设置成迅速响应，但被限制于其保护范围，并且不能发展成为长效的记忆。先天免疫反应的特征是涉及急性炎症(由受损或者受感染细胞释放的细胞因子介导)、补体***，和包括吞噬细胞(巨噬细胞、中性粒细胞、树状细胞)和天然杀伤细胞的非特异性白细胞的反应。适应性免疫发展的时间更长，其发生于首次暴露于病原体，接种疫苗，或者试验性免疫之后。然而，适应性免疫反应是特异性的(即，能够响应广泛范围的不同类型的对于主体的潜在危险性损害)，并能够发展长效的“免疫记忆”。此种能力导致记忆T细胞库，其可以被迅速调动、活化、扩大、以及被分化为成熟的外周效应细胞，以针对大部分，不一定是全部外来侵入物(即细菌、病毒和寄生虫)调节保护性的免疫反应。先天和适应性免疫两者高度交互作用，并在诱导炎症、放大免疫反应、形成免疫反应的特性、消除病原体，以及在适当的时间终结免疫效应机制和相关的炎症中扮演关键角色。适应性和先天免疫共用通常的效应分子，特别是细胞因子和趋化因子。这些介体对于细胞-细胞相互作用，效应细胞的激活和迁移，以及有效免疫反应的产生是关键性的。过度活化的先天或者适应性免疫反应(或者两者)引起症状，如炎症和自身免疫病。
由慢性炎症介导的症状的例子是自身免疫病，如类风湿性关节炎(RA)、慢性斑块银屑癣(CPPs)和牛皮癣关节炎(PsA)。这些慢性炎症疾病的特征是纤维原细胞和滑膜细胞(在RA中)和角质细胞(在CPPs/PsA中)高度增生，以及活化T细胞(特别是TH22细胞)，MΦ，及其它免疫细胞渗透入损害的皮肤和/或关节中。这些患者体内产生促炎细胞因子，其包括肿瘤坏死因子-α(TNFα)、白细胞介素-1β(IL-1β)，和白细胞介素-32γ(IL-32γ)，并引起和保持慢性炎症。包括MΦ的活化的免疫***细胞对这些因子的向上调控驱动了这些病症的发病机制。已有显示，在临床相关的动物模型中，T细胞在MΦ活化和自身免疫病的发病机制中扮演关键角色。除自身免疫病之外，慢性炎症还在许多肿瘤和心血管疾病中发挥作用。
银屑癣影响近2-3％全世界的人口，并且其仅仅在美国的治疗费用每年超过30亿美元。在此种相对普遍的免疫性疾病的病理生理学中，活化的T细胞和细胞因子是重要的。若干促炎细胞因子，特别是TNFα的皮肤和组织超量表达被认为造成皮肤损害的诱导、维持和复发。已经证明，引入TNFα抑制剂对于自身免疫和风湿性疾病的炎症是有效的治疗方式，包括类风湿性关节炎、银屑癣、牛皮癣关节炎、溃疡性结肠炎和强直性脊柱炎。然而TNFα抑制剂有许多严重的缺点。TNFα抑制剂治疗不能治愈该疾病。对于那些感受症状解除的人，该解除通常只是临时的。另外，由TNFα抑制剂所引起的副作用包括增加感染以及其它病的风险，如肺结核、革兰氏阳性感染、淋巴瘤；以及狼疮类病和脱髓鞘疾病。用TNFα抑制剂治疗的病人严重感染风险增加的原因是该抑制剂同时抑制适应性和先天免疫***，使该患者对感染不设防。
已经出现对银屑癣和牛皮癣关节炎特异性靶向的生物制品，其作为有前途的新治疗选择。这些治疗是“靶向的”，并且通过阻滞活化T细胞的信号产生而起作用。
Figure GSB00000734841600021
(alefacept(阿法赛特))是第一个被批准用于治疗银屑癣的生物制剂，其结合至T细胞上的CD2受体，破坏在免疫突触中和LFA-3的相互作用，引起病原性T细胞的凋亡。(efalizumab)结合至LFA-1，阻挡T细胞和抗原递呈细胞的ICAM-1结合，由此阻止T细胞活化和进入真皮和表皮。治疗剂(如依那西普(etanercept)、英利昔单抗(infliximab)和阿达木单抗(adalimumab))是生物制品，其被设计成结合TNFα，抑制炎症反应，细胞过滤和角质细胞增殖。然而，这些生物治疗剂不是对所有患者有效，这提示可能存在另外的T细胞致病通道和/或T细胞共激化分子。图1显示了IS的一个实施例，以及目前治疗剂的作用位点。
对于涉及慢性炎症的症状缺乏有效治疗的现状已导致对于可减少慢性炎症而不使患者失去适应性和先天免疫防御的治疗的需要。
发明内容
概述
在一个实施方式中，本公开涉及抑制促炎细胞因子产生的方法，该方法包括给予有效量的抑制CD147的活性和/或表达的组合物。在一些实施方式中，该方法可以使用同时抑制CD147和FKBP52或者CD147和亲环蛋白A(CypA)的活性和/或表达的组合物。
在一些实施方式中，该组合物可以包括两种或更多种使CD147和FKBP52表达沉默的siRNA分子。在其它实施方式中，该组合物包括抑制CD147活性的抗体或者功能抗体片段，或者，抑制CD147和FKBP52活性的两种或更多种抗体或其功能片段。在一些实施方式中，该抗体可以是双特异性抗体。在其它实施方式中，该组合物可以包括抑制CD147和FKBP52活性或者表达的两种或更多种小分子。
在另一个实施方式中，本公开涉及用于在对象中选择性抑制适应性免疫反应，而不显著影响先天免疫反应的方法，该方法包括在该对象中抑制CD147和FKBP52蛋白质的活性和/或表达。
在一些实施方式中，可以通过给予siRNA分子以沉默CD147和FKBP52表达，或者给予两种或更多种阻滞CD147和FKBP52活性的抗体或者功能抗体片段或者小分子，来抑制CD147和FKBP52的活性和/或表达。在一些实施方式中，该抗体可以是双特异性抗体。
在另一个实施方式中，本公开涉及用于治疗慢性炎症疾病的方法，该方法包括：向对象给药以治疗有效量的药物组合物，其可在所述对象中抑制FKBP52和/或CD147的活性和/或表达，该药物组合物包括CD147抑制剂和/或FKBP52抑制剂，和药学上可接受的载体。该慢性炎症疾病可以是自身免疫病，更特别地，该疾病可以是银屑癣。
在一些实施方式中，该CD147和FKBP52抑制剂包括两种或更多种siRNA分子，以抑制CD147和FKBP52的表达。在其它实施方式中，该CD147和FKBP52抑制剂可以包括两种或更多种抗体或者功能抗体片段，其可阻滞CD147和FKBP52活性。在其它实施方式中，CD147和FKBP52抑制剂可以包括双特异性抗体，其可阻滞FKBP52和CD147的活性。在另外的实施方式中，该CD147和FKBP52抑制剂包括两种或更多种小分子，其可阻滞CD147和FKBP的活性或者表达。
附图说明
图1是免疫突触的示意图，显示了已知的共刺激分子和目前可获得的相关的治疗剂。
图2为显示了当活化T细胞以培养
Figure GSB00000734841600041
时，和单独的T细胞对照培养相比，产生近两倍多的TNFα的图。
图3是这样的图，显示了TNFα和IL-1β在PHA/PMA刺激的Molt4和Jurkat细胞中几乎不被诱导，而在其余初级人类T细胞，未刺激的Hut-78、H9、Molt4或者Jurkat细胞中完全不被诱导。TNFα和IL-β在Hut-78和H9细胞中被诱导。
图4是FKBP52(图4A)、全长细胞EMMPRIN(图4B)、可溶性EMMPRIN配位体(图4C)和可溶性EMMPRIN受体(图4D)的示意图。显示了潜在抑制剂和结合位点。
图5是双特异性抗体(bsAb)如何可能作用，以识别(图5A)或者阻滞(图5B)人类CD4+T细胞表面上的FKBP52和CD147的相互作用的示意图。
图6是如何制备一组对FKBP52和CD147的哺乳动物细胞衍生的双特异性高亲合力抗体的示意图。
图7是CD147的Ig域和能够与其连接的抑免蛋白/亲环蛋白的示意图。
图8显示了重组体CD147具有活性，并可以在溶液中进行研究。A)CD14722-269刺激TNFα和IL-1β在THP-1巨噬细胞中的分泌。用PMA初级诱导THP-1细胞24小时，产生粘连巨噬细胞，其进一步用缓冲液，LPS，或者100ug/ml重组蛋白质刺激。ELISA检测试剂盒定量细胞因子。B)显示两个构建物的15N-HSQC谱，其还包括两个提议的亲环蛋白靶标位点，Pro180和Pro211。
图9显示了NMR溶液研究结果，其表明CD147Ig样域不自身连接或者彼此相互作用。用NMR溶液研究表征该两种主要CD147同种型，(a)同种型2(CD14722-205)和(b)同种型3(CD14794-205)的胞外区。用X射线晶体结构(蛋白质数据库获取码：3B5H)与相应的15N-HSQC谱和NMR松弛数据显示研究的特定区域。特别地，获取两种CD147构建物的酰胺R1(点)和R2(黑条)松驰速率，并用于计算相关倍率。得出的相关倍率被显示于邻近每一个Ig样域，Ig1和Ig2处。二级结构倾向被显示于每一图的顶端，其由我们的化学位移任务组用程序TALOS计算。(43)所有的数据在25℃和900MHz收集。
图10显示CypA和CypB通过它们的活性部位靶向CD147。自由0.5mM15N-标记的A)CypA和B)CypB的15N-TROSY-HSQC光谱。自由酶(黑)与0.5mMCD14794-214。由此，这两种酶均特异性识别CD147。在25℃和900MHz下进行滴定(左图)，只有分别显示15N或者1H位移＞0.1，0.02ppm的残余物在黑暗中被显示映射在该结构上(右面板)。
图11显示了对酶活性CypA/CD147复合物的监测。A)在没有受Pro211缓慢异构化支配的亲环蛋白配位体的情况下，CD147残基以两种构象存在。B)添加亚化学计量浓度的CypA导致新的峰值，称为“交换峰值”(黑箭头)，其指示CypA增强了催化速率。C)顺式共振强度的减弱(线变宽)比反式共振更快。D)定量上，该更快的顺式共振强度的减少提示CypA对于此构象的CD147的亲合力高于反式。E)改变该顺式：反式平衡的CypA靶向CD147Pro211的卡通描绘导致胞内发信号。
图12显示了CypA/CD147结合的表征和在溶液中CD147的CypA-介导的催化作用。A)已将包括CD147 P211的亲环蛋白-靶标位点的称为CD14710mer的短肽用于估算此复合物的亲合力。CypA残基展现的化学位移变化为KD～5mM。显示了W121HE和A101NH的结合等势线。B)用[CypA]＝0.05mM，[CD14794-214]＝0.5mM的自动和交换峰值的ZZ-交换的W121NE。
图13的图表显示，和取自健康供体的血液相比，在取自银屑癣患者的血液的T细胞中的促炎细胞因子TNFα被增量调节。
图14是H9T细胞的2D凝胶电泳。用PMA/洛诺霉素刺激H9细胞，并通过2D凝胶电泳分离。用串联质谱法和数据库检索确定为FKBP52的点13比未刺激细胞中的对应点表达至少增加3倍。
图15是串联质谱图，其显示来自图14的2D凝胶电泳结果的对于点13(FKBP52)的相对吸收。
图16是蛋白质印迹，其显示FKBP52在CD3+细胞中的增量调节。泳道1、2：H9细胞，未刺激(U)和用PMA/洛诺霉素刺激(S)。泳道3、4：CD3+T细胞，U和S。泳道5、6：Jurkat细胞，U和S。泳道7：+对照。
图17是蛋白质印迹，其通过CD3+细胞中的siRNA证明FKBP52的有效击倒。泳道1、2：未刺激(U)和洛诺霉素刺激(S)的H9细胞。泳道3、4：FKBP52siRNA转染的H9细胞，U和S。泳道5、6：CD3+T细胞，U和S。泳道7、8：FKBP siRNA转染的CD3+T细胞，U和S。
图18的图表显示FKBP52对于TNFα水平没有明显的抑制效果，以及以4-1BB为阳性对照的***图表。
图19是FACS分析，其显示CD147细胞表面表达在刺激的T细胞中被增量调节，并通过T细胞
Figure GSB00000734841600051
接触诱导。
图20的图表显示了图19的FACS分析结果。
图21显示了15N-标记的CD147在0.5mM(较暗的线)的NMR数据，其用0.5mM未标记的FKBP52滴定。与受体的膜近侧区，残基207-234对应的CD147的共振显示NMR化学位移变化，指示弱的结合。
图22的图表显示CD147和FKBP52的双siRNA击倒导致TNFα的产生明显减少。
图23的图表显示CD147(″TCISM#1)的siRNA击倒导致的细胞因子(TNFα)产生的变化不明显。
图24的图表显示在CD3+细胞中CD147(”TCISM#1″)的siRNA击倒导致细胞因子产生(IL-32γ)有中等程度减少(接近45-50％)。
图25的图表显示在CD3+细胞中FKBP52(″TCISM#2)的siRNA击倒导致的细胞因子(TNFα)产生的变化不明显。
图26的图表显示在CD3+细胞中FKBP52(″TCISM#2)的siRNA击倒导致细胞因子产生(IL-32γ)有中等程度减少。
图27的图表显示在CD3+细胞中CD147(″TCISM#1″)和FKBP52(″TCISM#2)的siRNA击倒导致细胞因子产生(TNFα)有高度明显(**P＜0.001)的减少。
图28的图表显示在CD3+细胞中CD147(″TCISM#1″)和FKBP52(″TCISM#2)的siRNA击倒导致细胞因子产生(IL-32γ)有高度明显(**P＜0.001)的减少。
图29的图表显示在Th22细胞中CD147(″TCISM#1″)和FKBP52(″TCISM#2)的siRNA击倒导致细胞因子产生(TNFα)有高度明显(**P＜0.001，显著性在*，**，和***之间匹配)的减少。
图30的图表显示在Th22细胞中CD147(″TCISM#1″)和FKBP52(″TCISM#2)的siRNA击倒导致细胞因子产生(IL-32γ)有高度明显(**P＜0.001，显著性在*，**，和***之间匹配)的减少。
图31的图表显示在Th22细胞中CD147(″TCISM#1″)和FKBP52(″TCISM#2)的mAb阻滞导致细胞因子产生(TNFα)有高度明显(**P＜0.001，显著性在*，**，和***之间匹配)的减少。
图32的图表显示在Th22细胞中CD147(″TCISM#1″)和FKBP52(″TCISM#2)的mAb阻滞导致细胞因子产生(IL-32γ)有高度明显(**0.001，显著性在*，**，和***之间匹配)的减少。
图33显示了牛皮癣皮损中的人类IL-32γ的免疫组织化学表达。用鼠抗人类IL-32γMab染色人类牛皮癣活体解剖(N＝15)(A至C)和正常皮肤(N＝13)(F)。在牛皮癣皮肤中，在基础层角质细胞中存在大量细胞质小粒染色，伴以强烈的核染色树突状细胞的随遇亚群。对照抗体没有显示阳性染色(D)。IL-32γ竟争性拮抗剂肽阻滞了IL-32γMab的染色，其证明了IL-32γ蛋白质在该牛皮癣皮肤活体解剖中表达的特异性(E)。在正常皮肤角质细胞中核以及细胞质IL-32γ染色明显弱(F)。显示的代表性数据来自总共三个分离的实验(以一式三份染色)，其中评定员不知晓每一个所观看片的身份。
图34显示IL-32及其它促炎细胞因子被表达于牛皮癣皮损活体解剖样品中。用定量的“实时”聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析在牛皮癣皮损的***-固定的及石蜡包埋的(FFPE)活体解剖样品中(N＝6)进行促炎细胞因子基因表达分析。健康的人类供体皮肤活体解剖样品(N＝6)被用作阴性对照。用人类单核细胞-衍生的
Figure GSB00000734841600071
培养物作为阳性对照组织(数据未示出)。测量用共有序列PCR探针评估的靶标细胞因子的量，一式三份。qRT-PCR结果显示IL-32γ、IL-1β、TNFα和IL-8表达与在健康的对照皮肤组织中观察到的类似细胞因子显著(*)不同(P＜0.01，根据ANOVAs)。结果表示单一实验，其中共进行三个分离的实验。每一个条表示平均+/-SD。
图35显示人类初级皮肤角质细胞的IL-32γ蛋白质产生的电化学发光(ECL)分析。人类初级角质细胞(Hka)细胞培养液(显示为黑色)和裂解液(显示为白色)的ECL分析表明IL32γ基本以细胞质细胞因子存在。IL1β(R&D***)和TNFα(R&D***)在Hka培养物中有效引致明显(*；P＜0.001，根据ANOVA)量的细胞质IL32γ蛋白质。测量样品一式两份；结果表示为单一实验，其中用不同代的初级皮肤Hka细胞培养物进行四个分离的实验。当通过ECL测量时(数据未示出)，IL32γ不引起诱导Hka组织培养液IL32γ，或者Hka裂解液IL32γ。每一个条均表示平均±SD。
图36显示促炎细胞因子在人类初级皮肤角质细胞培养物中增量调节IL-32γ基因表达。用IL1β(1ng/ml)、TNFα(10ng/ml)，或者这两种细胞因子刺激人类初级皮肤角质细胞(Hka)。在细胞因子刺激后，IL32γ基因表达显著(*；P＜0.001，根据ANOVA)增加。这些反应在体外通过IL1ra(Kineret；AmgenThousand Oaks，CA)(Cohen等人2003)或者P55-PEG(Pegsunercept；AmgenThousand Oaks，CA)(Edwards，1999)被逆转。测量用IL32共有序列IL32探针评估的靶标IL32γ的量一式三份。结果来自于单一的代表性实验(平均+/-SD)，其中进行三个分离的实验。
图37显示重组人类IL32α(rhuIL32α)在初级人类皮肤角质细胞培养物中诱导促炎细胞因子。优化蛋白水平的rhuIL-32α(10pg/ml；R&D***)在人类初级皮肤角质细胞(Hka)中显著(*；P＜0.05，根据ANOVA)诱导各种促炎细胞因子。通过ECL测量Hka细胞培养液和裂解液(数据未示出)中的细胞因子蛋白质。此不含内毒素的rhuIL32α的制备物没有引起Hka细胞培养液或者裂解液IL32γ的水平增加。测量样品一式三份，所示数据来自单一的代表性实验，其中用不同的人类供体Hka培养基进行四个分离的实验。每一个条表示平均+/-SD。
图38显示重组人类IL32γ改变人类初级皮肤角质细胞的表型外观。用最佳活化水平的重组人类细胞因子处理人类初级皮肤角质细胞(Hka)，其包括IL32γ，并用苏木精染色，以及12、24和48小时后曙红(H&E)染色。显示在经处理后48小时的Hka培养物(用200倍共焦显微镜分析)。用标记的重组细胞因子处理的单个Hka细胞培养物显得散开，并包含许多具有暗染色核心的伪足。显示来自单一实验的代表性数据，其中总共进行三个分离的实验(一式三份染色)。评定员不知晓所观看的每一片的身份。
图39显示重组IL32α或者IL32γ抑制人类初级皮肤角质细胞增殖。在体外用增加量的rhuIL-32α或者rhuIL32γ处理人类初级皮肤角质细胞(Hka)，并在12、24和48小时后通过MTT测量增殖。该数据表现单个重复中的六的平均±SD。数据来自代表性的单一实验，其中用不同的人类供体Hka细胞进行三个分离的实验。和Hka未经处理的细胞相比，每一个数据点(*)都显著不同(P＜0.001，根据ANOVA)。
图40显示了间接和直接细胞-细胞接触生物分析方法。在间接的细胞-细胞接触体外分析中(显示于A中)，在被置于初级人类皮肤角质细胞(Hka)上之前，非活化的或者活化的活人类CD3+、H9或者Th22T-细胞被置于无菌的塑料转移孔插件(trans well inserts)中。通过qRT-PCR测量促炎细胞因子基因表达，并用ECL测量蛋白质的生成，随后在12、24和48小时添加于转移孔后，在收集的转移孔T-细胞或者Hka细胞培养物细胞培养液(2ml)和裂解液中测量。在该直接细胞-细胞接触分析(显示于B中)，非活化的或者活化的活人类CD3、H9或者Th22T细胞被直接置于活Hka细胞上。12、24或者48小时候，收集非粘连T-细胞和细胞培养液(2ml)，离心，由此分离T-细胞，并且在-80℃冷冻或制备T细胞总RNA，用于qRT-PCR基因表达分析。用温组织培养介质小心洗涤粘连Hka细胞3次，用橡皮刮棒刮，收集，离心，以及等量分开，然后在-80℃冷冻或者制备Hka总RNA，用于qRT-PCR基因表达分析。可以用ECL测量细胞培养液和Hka细胞裂解液(用氚X 100获得)的促炎细胞因子水平。氚X 100的添加不干扰ECL分析。
图41是柱状图，其显示了用H9T细胞直接细胞-细胞接触后Hka衍生的TNFα的产生。用非活化的或者PMA/洛诺霉素活化的人类H9T细胞进行直接细胞-细胞接触+48小时后，以剂量相关方式测定来自Hka上清液的TNFα(由ELISA测量)。(A).Hka(总共仅2.5×105个细胞)；(B).Hka(总共2.5×105个细胞)与非活化的H9T细胞(总共5×105H9)直接接触；(C).Hka(总共2.5×105Hka)与活化的H9T细胞(总共10×105H9)直接接触。测量进行一式三份。每一个条表示平均±SD(N＝3次重复)，其中仅相对于Hka*P＜0.05，并且其中仅相对于Hka*#P＜0.001。所示代表性数据来自单一实验，其中共进行四个分离的实验，它们具有类似的结果。
图42是柱状图，其显示了用H9T细胞直接细胞-细胞接触后Hka裂解液衍生的IL32γ的产生。用非活化的或者PMA/洛诺霉素活化的人类H9T细胞进行直接细胞-细胞接触+48小时后，以剂量相关方式测定来自Hka裂解液的IL-32γ(由ECL测量)。(A)).Hka(总共仅2.5×105个细胞)；(B).Hka(总共2.5×105个细胞)与非活化的H9T细胞(总共5×105H9)直接接触；(C).Hka(总共2.5×105Hka)与活化的H9T细胞(总共10×105H9)直接接触。测量进行一式三份。每一个条表示平均±SD(N＝3次重复)，其中仅相对于Hka*P＜0.05，并且其中仅相对于Hka*#P＜0.001。所示代表性数据来自单一实验，其中共进行四个分离的实验，它们具有类似的结果。
图43显示了用活化的人类记忆效应T细胞群体直接细胞-细胞接触后Hka裂解液-衍生的IL-32γ、TNFα和IL1β的产生。A)从健康的人类供体leukopacs(Belle-Bonfils血液中心，UCD医院，丹佛，科罗拉多州)获得的PMA/洛诺霉素-活化的CD3+T细胞被进一步用记忆CD4+、CD45RA+和CD45RO+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)纯化。用CD45RO-FITC、CD45RA-FITC、CD4-APC和CCR4-PE(全部从Beckman Coulter获得)在室温下染色细胞20分钟。然后在PBS中洗涤细胞，然后在2％多聚甲醛中固定。在FC 500(BeckmanCoulter，Hialeah，佛罗里达州)上进行流式细胞计数。每个样品收集5000个事件。显示的代表性的数据来自单一实验，其中用四个分离的leukopacs共进行总共四个分离实验。将1％多聚甲醛固定的T细胞添加至Hka细胞诱导的Hka裂解液衍生的IL-32γmRNA和蛋白质(数据未示出)。B).直接细胞-细胞接触+48小时后，将PMA/洛诺霉素-活化的人类Th22记忆效应T细胞群体(CD4+CD45RO+CCR4+、qD4+CD45RO+CCR4-、CD4+CD45RA+CCR4+、CD4+CD45RA+CCR4-[总共10×105T细胞，如以上所述纯化)和Hka接触。测量Hka裂解液的IL32γ(通过ECL)、TNFα、或者IL1β(通过ELISA；R&D Systems)。对每一细胞群体共进行6次单独测量。每一个条表示平均±SEM，其中(*)P＜0.05(ANOVA)，并且其中*#P＜0.001(ANOVA)。用分离的健康人类供体完成了总共三个分离的实验，结果类似。
图44的示意图显示了角质细胞和免疫细胞之间的炎症过程。
图45显示纯化的CD147构建物在没有TM域的情况下在溶液中以单一的单体种类存在。(a)此研究中分析的这些构建物的子集的尺寸-排阻色谱，以及在将100μl的1mg/ml每一个样品装载至分析Superose-12柱(柱体积24ml)时它们的滞留体积。只有包含全部TM域的构建物，如全长蛋白质CD14722-269，可以诱导大低聚物的形成，如它们在空隙容积(～8ml)的的洗脱物所示。CD14794-205和CD14722-103洗出物的估算分子量接近单体的预计分子量，而CD14722-269ΔTM和CD14722-205洗出物的估算分子量较高，这是由于它们的弹性区域和两个Ig样域之间的连结区域的弹性特性。(b)缺少和存在DTT时，含有两个域(CD14722-205)，Ig1(CD14722-103)，和Ig2(CD14794-205)的CD147构建物的变性凝胶。在每一个域内的单一二硫键的减少导致较慢的迁移性能。(c)同样构建物的天然凝胶证实所有的构建物以单一种类运动，并且Ig1和Ig2不相互作用(右边泳道)。
图46显示CypA通过其活性位点特异性结合CD147。(a)0.5 mM自由15NCypA(黑)15N-TROSY-HSQC谱和在1mM CD14722-214(红)存在下显示只有CypA活性位点残基(如Ser99和Phe60)的化学环境被该相互作用干扰。(b)在这些相同的谱内，位于靠近该活性位点的短3，10-α-螺旋的15N-CypATrp121Na1在CD14722-214存在下也展现化学位移波动。(c)显示了添加CD14722-214后展现化学位移干扰的CypA残基的两个视图，以及包含该靶向Pro211的该Ig样域的卡通延伸。如果它们各自的化学位移差大于0.06ppm，则在我们先前的测定的CypA(蛋白质数据库码：1ZKT)的X-射线晶体结构上将残基染色(红色)。在25℃和900MHz进行滴定。
图47显示了CypA和CD147之间的结合相互作用的定量。(a)显示了在添加对应CD147残基205-214的肽，CD14710聚体之后，15NCypA活化-位点酰胺和活化-位点Trp121的单一的吲哚的结合等温线。由此这些拟合中求出的Kd为4.2±0.2mM。(b)CD14722-214(1mM，红色)和CD14710聚体肽(8mM，黑色)滴定后比较15N-CypA的化学位移变化。(c)CD14710聚体肽的CypA化学位移变化被归入活性位点，因为它们具有较大的CD147结构。计算所有的化学位移变化，如图46所示。在25℃和900MHz收集实验。
图48显示CD147是CypA的底物。(a)0.5mM游离15N-CD14794-214(黑色)的15N-TROSY-HSQC谱和在100μM CypA(蓝色)和1mM CypA(红色)存在下显示在酶滴定后，CD147 Gly214酰胺顺式和反式共振会聚。因而，相对于CD147 Gly214顺式和反式构象之间的CypA-结合的化学位移差异，CypA诱导的构象交换速率是快速的。(b)数个CypA靶向的CD147残基，诸如CD147Leu213，在亚化学计量浓度酶的存在下显示强的谱线增宽而在化学计量浓度酶的存在下消失。因而，相对于CypA-结合的化学位移差异，CypA诱导的构象构象交换是在中间时标上。(c)使用0.5mM 15N-CD14794-214，在催化浓度CypA的存在下，发现残基207-214具有ZZ-交换交叉峰。此处显示的是CD147Phe212酰胺的相应光谱，其中CypA为0.05mM，混合时间为0ms(深蓝)和300ms(红色)。(d)利用150-ms的混合时间的0.5mM15N-CD14794-214和0.01mM CypA的3D-NOESY-HSQC也鉴定了CD147残基207-214的交换峰，如Phe212所显示的。在不存在CypA时，ZZ-交换或在3D-NOESY-HSQC实验内没有发现这样的交叉峰，指示在CD147顺式和反式构象之间慢得多的未催化的交换(数据未示出)。所有实验在25℃下进行。在900MHz处获得滴定，并且在720MHz处进行ZZ-交换和3DNOESY-实验。
图49定量了CypA-介导的CD147异构化的交换的催化速率。表1中的表观催化交换速率源自使用[CD14794-214]＝0.5mM和(a)[CypA]＝0.01mM或(b)[CypA]＝0.05mM的ZZ-交换实验。显示了ZZ-交换数据连同相应的适合值(fits)和来自每个CD147Trp210Nε1实验的两个样品谱。四次共振的每一次的强度同时与Eqs.(1a)、(1b)、(1c)和(1d)一致。强度被标准化为最高强度的强度，即，在没有混合时间时的反式共振的强度。
图50是CD147活性的不依赖于亲环蛋白的和亲环蛋白依赖的机制的示意图。(a)基于申请人的发现，已经显示CD147的胞外区没有自缔合，CD147嗜同性相互作用可能由潜在地包括TM蛋白(即，共同受体)在内的其它分子介导。(b)CypA介导的Pro211异构化的直接观测结果暗示这样的机理，由此CypA可以改变CD147Pro211固有顺式∶反式平衡。CD147Pro211的固有顺式∶反式比从15NHSQC谱内残基207-214的酰胺的相对峰强度计算，并且活性复合物中的顺式∶反式比基于使用模型肽底物的先前研究(55)。
图51图解说明胞外EMMPRIN是MMP/细胞因子分泌的有效刺激物。A)重组EMMPRIN胞外域靶向将在此鉴定的未知细胞蛋白质。B)基于ELISA的分析测量TNF-α和IL-1β从THP-1细胞以剂量依赖的方式的分泌。C)MMP/细胞因子阵列数据提供了鉴定/比较U937细胞由于5μg重组EMMPRIN而分泌的广泛手段。
图52是显示在由牛皮癣Th22(Psoriatic Th22)诱导的初级人角质形成细胞，由抗EMMPRIN单克隆抗体、抗FKBP52单克隆抗体或阻断FKBP52和EMMPRIN的双单克隆抗体诱导的自体反应T细胞中TNFα产生的显著逆转。分析下列组，它们对应于其图上的数字：(1)10×10+5牛皮癣Th22T细胞+抗-EMMPRIN mAb同种型IgG+抗-FKBP52mAb同种型IgG+Hka；(2)10×10+5牛皮癣Th22T细胞+抗-EMMPRIN mAb+抗-FKBP52mAb+Hka；(3)10×10+5牛皮癣Th22T细胞+抗-FKBP52mAb同种型IgG对照+Hka；(4)10×10+5牛皮癣Th22T细胞+抗-FKBP52mAb+Hka；(5)10×10+5牛皮癣Th22T细胞+抗-EMMPRIN mAb同种型IgG对照+Hka；(6)10×10+5牛皮癣Th22T细胞+抗-EMMPRIN mAb+Hka；(7)10×10+5CD3+T细胞+N.T.siTNFα+Hka；(8)10×10+5牛皮癣Th22T细胞+siTNFα+Hka；(9)10×10+5牛皮癣Th22T细胞+N.T.siIL32γ+Hka；(10)10×10+5牛皮癣Th22T细胞+siIL32γ+Hka；(11)10×10+5牛皮癣Th22T细胞+Hka；(12)7.5×10+5牛皮癣Th22T细胞+Hka；(13)5.0×10+5牛皮癣Th22T细胞+Hka；(14)2.5×10+5牛皮癣Th22T细胞+Hka；(15)1.0×10+5牛皮癣Th22T细胞+Hka；(16)Hka+rhuIL22(10ng/ml)；(17)原代人角质形成细胞(Hka)；(18)THP-1
Figure GSB00000734841600111
+LPS(100ng)；(19)THP-1以及(20)空白。
发明详述
本文提供了抑制慢性炎症反应的方法以及实施这种方法的组合物。在一个实施方式中，该方法涉及选择性抑制适应性免疫反应，而不显著影响先天免疫反应。在另一实施方式中，抑制慢性炎症反应的方法涉及抑制促炎细胞因子产生。
可以用于选择性靶向适应性免疫***的一种方法是集中于与巨噬细胞通讯的活化T细胞。当活化T细胞与
Figure GSB00000734841600122
相互作用时，一系列促炎细胞因子响应于细胞-细胞接触在免疫突触(IS)处通过一种或多种共刺激分子而释放。几种促炎细胞因子涉及慢性炎症，包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-6、LIF、IFN-γ、OSM、CNTF、TGF-β、GM-CSF、IL-11、IL-12、IL-18、IL-8、IL-32γ和TNFα。可以测量这些促炎细胞因子的一种或多种以确定免疫反应是否被活化或被抑制。
细胞因子TNFα、IL-1和IL-32γ的产生在人初级
Figure GSB00000734841600123
和THP-1
Figure GSB00000734841600124
中被强烈地诱导，所述诱导通过与用PHA/PMA、PMA/洛诺霉素(ionomycin)、αCD3/αCD28或IL-12/IL-18刺激的初级人CD3+T细胞、人T细胞淋巴瘤HUT-78细胞或人T细胞H9细胞的直接接触进行(参见，例如图2)。然而，细胞因子产生在刺激的Molt4m、Jurkat和Raji人T-细胞中几乎不被诱导并且在静止的初级人T细胞、未刺激的HUT-78、H9、Molt4、Jurkat或Raji细胞不被诱导(见，例如图3)。因此，在慢性炎症疾病如牛皮癣中，这些途径似乎经由直接的细胞-细胞接触通过免疫突触(IS)机制介导。这些途径显示通过活化期间在T细胞表面上或附近上调的T细胞共刺激分子介导。由于这些分子只在或主要仅在T细胞活化期间上调，所以这些分子代表了选择性抑制适应性免疫***同时允许先天免疫***保持完整的有希望的靶标。
活化的T-细胞表达多种膜-结合的共刺激蛋白，其有助于导致促炎细胞因子诱导的细胞-细胞接触信号级联放大。这些分子被在本文中被称为T细胞细胞因子诱导表面分子(T cell Cytokine Inducing Surface Molecules)(TCISMs)。TCISM提供了在适应性免疫反应期间T细胞活化和MΦ-驱动的细胞因子上调之间的连接。根据公开的实施方式，选择性抑制适应性免疫***的组合物可以包括TCISM抑制剂。TCISM的实例包括但不限于FKBP多基因家族的CD40配体(CD40L)成员(例如，FKBP52)、亲环蛋白(例如，亲环蛋白A)和CD147(也称为胞外基质金属蛋白酶诱导物(Extracellular matrix metalloproteinaseinducer)或EMMPRIN)。TCISM的另外的实例可以在2008年6月5日提交的国际申请号PCT/US2008/065992中见到，其以其全部并入，如同在本文中全部描述一样。
CD147，或″EMMPRIN″是EMMPRIN免疫球蛋白受体超家族的部分，是几乎在所有细胞类型中表达的I型跨膜糖蛋白，所述细胞类型包括其中其生物学作用包括调节多种蛋白家族的成纤维细胞、血小板和T细胞以及肿瘤细胞。(1-3)。例如，CD147刺激引起胞外基质的重建的多种基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌(4)，并且已经显示CD147刺激数种促炎细胞因子的分泌(2，4)。CD147在炎性病症如类风湿关节炎(RA)中过度表达，其中CD147介导的MMP分泌导致关节组织的破坏(12，13)。
尽管CD147由于其刺激MMPs分泌的能力而被熟知，其作为TCISM的作用以前是未知的(见，下面的实施例1)。此外，以前认为CD147充当其自身受体，由此，膜结合的或可溶的CD147参与与膜结合的CD147的嗜同性相互作用，以刺激细胞内信号转导(14，15)。然而，已经发生了许多CD147蛋白相互作用，暗示CD147介导的信号转导可以通过其它蛋白质配合。这种蛋白质相互作用可以包括整联蛋白、黏结蛋白聚糖-1和最近鉴定的CD147的酶配体：肽基脯氨酰异构酶的亲环蛋白类(16-18)。
CD147的初级转录体包括两个免疫球蛋白样(Ig样)结构域，称为EMMPRIN Ig1-Ig2。如本文所讨论的，CD147可以刺激促炎细胞因子释放并且可以与抑免蛋白/亲环蛋白超家族成员FKBP52、亲环蛋白A(CypA)和亲环蛋白B(CypB)结合(缔合，associate)(图7)。EMMPRIN以几种不同形式表达，包括全长EMMPRIN——其连接于细胞膜，和两种可溶形式：微泡结合的可溶性EMMPRIN受体和修饰的可溶性EMMPRIN配体(图4)。
FK506-结合蛋白52(FKBP52)(也叫作FKBP59、p59或Hsp56)，由FKBP4基因编码，是抑免蛋白的FKBP家族的成员。FKBPs的特征在于由其催化顺式-肽基脯氨酰键的顺反异构化的能力以及其对免疫抑制药物FK-506的强亲和力。FKBP52显示了与作为蛋白质NH2末端部分属性的蛋白质的抑免蛋白特征(character)的模块组织。
亲环蛋白是抑免蛋白超家族的成员，与CD147结合并且是催化肽基脯氨酰键异构化和调节多种不同蛋白质功能的广泛表达的酶。例如，类似于甲基化和磷酸化，亲环蛋白介导的异构化被认为是几种信号转导途径的基本调节现象(19)。类似于其CD147受体，亲环蛋白在多种癌症和炎性病症诸如RA中高度表达(20-21)。在RA患者的滑液中首次鉴定作为胞外蛋白的典型亲环蛋白家族成员，亲环蛋白A (CypA)(22)。随后的研究显示CD147作为胞外CypA以及另一亲环蛋白——亲环蛋白B(CypB)的信号受体转导起作用(23，24)。胞外亲环蛋白显示出细胞因子样性质并且通过其与CD147受体的相互作用介导多种细胞内事件(18，25)(图1，机理2)。例如，CypA显示依赖于其与CD147的相互作用的有效趋化活性(24)并且CypA/CD147相互作用的抑制大大减少了患有疾病诸如急性肺损伤、哮喘和RA的小鼠模型中的免疫细胞到炎症部位的迁移(26-28)。许多病毒利用宿主细胞CypA进行感染，包括水泡性口炎病毒、牛痘病毒、人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和严重急性呼吸综合症(SARS)。然而，已经显示这些病毒的亚类(subset)依赖于宿主细胞病毒相关CypA，其从锚定在病毒膜内的先前宿主细胞被“劫持(hijacked)”，已被提议通过靶向新宿主细胞上的CD147来增加感染(29-32)。具体地，已经显示在细胞培养中阻断性CypA/CD147相互作用抑制感染支持了这种提议(32，33)。因此，理解亲环蛋白/CD147相互作用的分子机理可能对于慢性炎症疾病(包括癌症)和病毒感染的治疗具有治疗价值。
如上所述以及在以下实施例中进一步所述，亲环蛋白不仅仅是配体，其也是在亲环蛋白/CD147信号转导中起催化作用的酶。这些活性酶/受体复合物可以在催化期间被探测以直接鉴定亲环蛋白诱导的构象变化，所述构象变化被赋予到对信号转导关键的CD147受体上，与从静态结构推断它们的结果相反。因而，能够确定引起其配体独立活性的CD147结构区并且能够探测导致细胞内信号转导的亲环蛋白诱导的构象变化。
根据公开的实施方式，抑制适应性免疫反应或抑制促炎细胞因子的方法可以通过施用这样的组合物来完成，所述组合物可以包括下述靶标的一种或多种抑制剂：CD147、FKBP52或CypA。在一个实施方式中，组合物可以包括用于独立抑制CD147的一种或多种抑制剂。在另一实施方式中，组合物可以包括用于同时双重抑制CD147和FKBP52或CD147和CypA的两种或更多种抑制剂。抑制可以通过施用导致抑制靶的活性或表达降低的任何合适的抑制剂。图4示出了CD147或FKBP52的代表性抑制剂的可能靶位点。
在一个实施方式中，促炎细胞因子释放的抑制可以通过如下完成：使细胞与小的核酸分子接触的RNA干扰(RNAi)，所述RNA干扰如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、micro-RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)分子，或调节小干涉RNA(siRNA)的表达以提供降低表达水平的CD147、FKBP52和CypA的一种或多种(例如，通过降低mRNA水平和/或降低多肽水平)。
在另一实施方式中，促炎细胞因子释放的抑制可以通过使细胞与抗体或其功能片段接触来完成。抗体或其功能抗体片段是指特异结合特定抗原或或与特定抗原进行免疫学反应的免疫球蛋白分子，包括多克隆抗体和单克隆抗体。术语抗体包括遗传工程或以另外方式修饰的免疫球蛋白形式，如胞内抗体(128)、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异源偶联抗体(heteroconjugateantibodies)(例如，双特异抗体(127)、双抗体、三抗体和四抗体)。术语功能抗体片段包括抗体的抗原结合片段，包括例如Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段。术语scFv指其中传统两链抗体的重链可变区和轻链可变区已经结合形成一条链的单链Fv抗体。如图5所示，可以用于本文描述方法的双特异抗体(bsAb)可以识别(图5A)或阻断(图5B)人CD4+细胞表面上的FKBP52和CD147相互作用。图6示出了这种哺乳动物细胞来源的bsAbs的一个实例以及它们可以如何被产生。
在另一实施方式中，促炎细胞因子释放的抑制可以通过使细胞与融合蛋白接触完成。融合蛋白是由2个或更多个相关或不相关融合基因或其功能片段编码的蛋白质。其它适合的抑制剂可以包括但不限于蛋白质、肽、肽体(peptibodies)、嵌合蛋白和其它生物制剂。在一些实施方式中，小分子可以用作抑制剂。小分子的实例可以在2008年6月5日提交的国际申请号PCT/US2008/065992中见到，其以其全部并入，如同在本文中全部描述一样。
根据公开的实施方式，本文提供了治疗与慢性炎症相关的状况的方法。与慢性炎症相关的状况包括但不限于自身免疫性疾病、癌症、某些感染疾病和心血管疾病。具体而言，与慢性炎症有关或相关的状况和疾病包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化、克罗恩病、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、骨关节炎、格雷夫斯氏病、狼疮、硬皮病、血管炎、斯耶格伦综合征、多皮肌炎和皮肌炎、自身免疫性多内分泌腺综合征、遗传性蛋白尿综合征(hereditaryproteinuria syndrome)、I型糖尿病、***性红斑狼疮、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性甲状腺炎、肝炎、获得性免疫缺陷病(HIV)、移植物抗宿主病、同种异体移植物病、哮喘、慢性阻塞性肺疾患(COPD)、慢性炎性肠疾病、腹部疾病、慢性***性疾病、慢性炎性多发性神经病、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、视网膜母细胞瘤、晶状体后纤维组织形成、眼色素层炎、早产儿黄斑变性视网膜病(retinopathy of premature macular degeneration)、角膜移植片新血管形成、皮肤T细胞淋巴瘤、HTLV-I-相关的皮肤T细胞淋巴瘤、HTLV-II-相关的淋巴瘤、毛细胞白血病、黑素瘤、动脉硬化、主动脉瓣狭窄、胰腺炎、***反应和充血性心力衰竭。在一个实施方式中，治疗方法涉及由慢性炎症介导的自身免疫性疾病，诸如类风湿性关节炎(RA)、银屑病(CPPs)和牛皮癣性关节炎(PsA)。这些慢性炎症疾病的特征是成纤维细胞和滑膜细胞(在RA中)以及角质形成细胞(在CPPs/PsA中)的高度增殖和活化T细胞、MΦ和其它免疫细胞到损伤皮肤和/或关节的浸润。促炎细胞因子——包括肿瘤坏死因子-α(TNFα)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-32γ(IL-32γ)在这些患者中产生并且诱导和维持慢性炎症。由活化免疫***细胞引起的这些因子的上调包括MΦ驱动这些病症的发病机理。已经在相关活化和动物模型中显示，T细胞在自身免疫性疾病的MΦ发病机理中起关键作用。除了自身免疫性疾病，慢性炎症也在多种癌症和心血管疾病中起作用。
治疗与慢性炎症相关的状况的方法可以包括施用同时抑制FKBP52和CD147的活性和/或表达的药物组合物。药物组合物可以包括但不限于FKBP52抑制剂、CD147抑制剂以及药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物可以按照制备药用组合物的已知方法配制。而且，如本文使用的，短语“药学上可接受的载体”意指任何标准药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以包括稀释剂、佐剂和媒介物以及植入载体和惰性的无毒固体或液体填充剂、稀释剂或不与本发明的活性成分反应的封装材料。实例包括但不限于磷酸盐缓冲液、生理盐水、水和乳液，如油/水乳液。载体可以是包含例如乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇和类似物)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。描述了包含本领域技术人员熟知并且容易得到的多种来源的药学上可接受载体的制剂。例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(Martin E W[1995]Easton Pa.，MackPublishing Company，第19版)描述了可以与本发明联合使用的制剂。适合用于肠胃外施用的制剂包括，例如，水性无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得制剂与意图受体的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以以单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶提供，并且可以被储存在冷冻干燥(冻干的)条件下，在使用前，只需要无菌液体载体例如，注射用水的条件。即用注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒、片剂等制备。应该理解，除了上面特别提到的成分之外，鉴于讨论中的制剂的类型，本发明的制剂可以包括在本领域中常规其它的剂。
按照良好的临床实践，考虑个体患者的临床状况，施用的部位和方法，施用的程序表，患者年龄、性别、体重，和医疗从业者已知的其它因素，施用和给药上述的药物组合物。用于本文目的的治疗有效量因而根据这样的考虑进行确定，如本领域已知的。例如，药物组合物的有效量是提供治疗上有效的促炎细胞因子减少所必需的量。药物组合物的量对于获得改善必须是有效的，所述改善包括但不限于完全的预防或提高的生存率或更加快速的痊愈，或改善或消除与被治疗的慢性炎症状况有关的症状以及被选作本领域技术人员进行适当测量的指示剂。按照本发明，合适的单一剂量大小是在合适的期间内施用一次或多次时能够防止或减轻(减少或消除)患者的症状的剂量。基于患者的状况大小和施用途径，本领域技术人员可以容易地确定用于全身施用的合适单一剂量大小。
CD147和FKBP52协同抑制促炎细胞因子释放的双重抑制
在当前的公开中，已显示来自细胞系和健康人类志愿者的活化T细胞以及得自患有银屑病患者的T细胞以细胞-细胞接触依赖的方式诱导人巨噬细胞(MΦ)上调促炎细胞因子的产生，导致慢性炎症表型。在PMA/洛诺霉素刺激后，FKBP52在活化的T细胞中上调。此外，通过FACS测量的CD147/EMMPRIN表达也在相同的T细胞群体中增加。使用NMR在体外进行的实验显示两种蛋白质之间的生理学联系。使用证实的细胞-细胞接触生物测定，由此，人CD3+T-细胞(得自白细胞库(leukopack))和单核细胞来源的MΦ(得自白细胞库)以细胞-细胞接触的方式结合，在培养的48小时时间期间，相对大量的TNFα、IL-1β和IL-32由活化MΦ产生。
如上面所提到的，FKBP52是具有顺/反-脯氨酰异构酶活性的抑免蛋白，其作为包含脯氨酸残基的蛋白质的蛋白折叠伴侣起作用。其也结合用于治疗患有自身免疫性疾病的免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus)。通过使用针对人FKBP52制备的特异性DHARMACON siRNA smart pool探针沉默FKBP52没有导致任何明显的T细胞驱动的MΦ细胞因子抑制。同样地，当针对人CD147制备的特异性DHARMACON siRNA smart pool探针被转染到人T细胞中时，随后的T细胞介导的MΦ活化和细胞因子释放仅仅稍微减少。然而，在体外在T细胞活化之前沉默FKBP52和CD147两者在48小时期间内导致几乎90％的T细胞驱动MΦ细胞因子释放的减少。这些数据指示，这两种蛋白质的相互作用对于免疫突触形成、促炎细胞因子释放以及慢性炎症和自身免疫性建立期间的T细胞：MΦ信号转导机制是重要的。此外，使用双抑制剂如RNAi分子(例如，siRNA分子)、抗体(例如，单一特异性或双特异性抗体)、功能抗体片段、肽、融合蛋白、嵌合蛋白、肽体、胞内抗体、小分子和/或其它生物制剂抑制这两种蛋白质可以被用于控制适应性免疫而不显著影响先天免疫。
在下面的实施例1中进一步描述了上述研究。FKBP52是可能与T细胞膜蛋白CD147相互作用以随后通过MΦ上的CD147受体介导MΦ活化的T细胞的胞质蛋白质。FKBP52可以从细胞质易位到T细胞膜或其附近。使用蛋白质组学的方法，包括多反应监测、串联质谱分析和数据库搜索，被用于阐明在T细胞刺激和随后的与MΦ细胞-细胞接触之后的分泌蛋白谱。此外，从与MΦ接触后活化T细胞分泌的可溶性蛋白质充当牛皮癣和其它炎性皮肤病中的高度特异药物发现靶标并且是适应性免疫反应的靶标，同时使先天免疫反应基本上不受影响。
亲环蛋白-介导的EMMPRIN信号转导和促炎细胞因子产生的表征
EMMPRIN二级结构和与亲环蛋白A的相互作用。CD147是I型膜内在蛋白质，其包含两个称为Ig1和Ig2的胞外免疫球蛋白样(Ig)结构域、一个跨膜结构域(TM)和短的大约30个残基的胞内结构域。胞外亲环蛋白-A(CypA)和亲环蛋白-B(CypB)靶向CD147并且通过未知机制刺激包括ERK1/2在内的几种胞内蛋白质的磷酸化。如同CD147，亲环蛋白配体在癌组织中高度表达。
CD147上的亲环蛋白靶位点已经被鉴定并且已经显示受体被其亲环蛋白酶配体催化(见，实施例4)。此外，已经发现亲环蛋白介导的CD147信号转导中的催化作用。首先，CypA通过目前鉴定的至少两种蛋白质相互作用——白介素-2酪氨酸激酶和Crk，涉及数个胞内信号转导途径。这些蛋白质的下游相互作用显示由CypA诱导的构象变化调控并且因此，相似的机制可能适用于细胞外面的亲环蛋白/CD147相互作用。其次，脯氨酰-异构化通常涉及许多生物学过程。例如，在丝状噬菌体中，外被蛋白的顺式至反式脯氨酰-异构化充当允许病毒进入的“定时器”，而脯氨酰-异构化也涉及阴离子通道的打开。第三，失活的亲环蛋白突变体不能激活ERKI/2磷酸化。第四，CD147上的两个亲环蛋白靶残基，Pro180和Pro211，也可以充当底物，因为亲环蛋白催化肽基脯氨酰异构化。
胞外亲环蛋白可以到达CD147上的两个亲环蛋白靶位点，Pro180和Pro211。胞外CD147区的Pro180位于胞外Ig2结构域内，而其突变破坏亲环蛋白相互作用，这被认为是由于改变了受体的结构完整性。相反地，Pro211位于胞外Ig2结构域和TM结构域之间的界面处。两种胞外亲环蛋白，CypA和CypB，容易跨过膜，暗示这种残基的催化作用能够诱导导致胞内信号转导的构象变化。有趣的是，也通过Cyp60利用Pro211使受体穿梭至细胞表面，并且因此，CD147在胞内和胞外与亲环蛋白相互作用。然而，CD147细胞表面表达存在多种机理，因为广谱的亲环蛋白抑制剂导致细胞表面CD147的减少而不是完全消除。在亲环蛋白/CD147复合物形成和催化之后发生的构象变化可以使用本文公开的方法以原子分辨力(atomic resolution)进行鉴定。
已知靶向CD147和/或亲环蛋白对转移有作用。例如，在黑素瘤和卵巢癌中CD147的RNA干扰(RNAi)减少了体外细胞侵袭以及在小鼠模型中减小了肿瘤大小。抗CD147抗体阻断胰腺癌细胞增殖而CypA的RNAi减少了非小细胞肺癌的肿瘤生长。考虑到CD147存在于大多数肿瘤中，在这些肿瘤中，其诱导多种MMPs和促炎细胞因子的分泌，阻断CD147可能抑制肿瘤发展。因而，CD147可以用作多种癌症的治疗靶标。
EMMPRIN刺激细胞因子释放并且可以在溶液中进行研究。多种CD147构建物已经被以毫克量表达和纯化，全长蛋白质已经被发现并且是可溶的和具有活性。简而言之，仅缺少信号肽的重组CD14722-269的活性通过其增加包括TNFα和IL-1β的细胞培养物中促炎细胞因子分泌的能力来证实(图8A)。尽管全长CD147是可溶的，但是已经发现跨膜结构域诱导大聚集体的形成，如通过凝胶过滤所评价的。CD147的这种可溶形式是生物学相关的，因为肿瘤细胞在存在和不存在微泡下以整体分泌CD147。如同膜结合的CD147，已经确定可溶的CD147通过诱导MMPs和促炎细胞因子分泌而促进肿瘤生长(图8A)。此外，已经确定控制MMP和促炎细胞因子诱导的CD147残基。
全部胞外区(CD14722-214)和单独的Ig2结构域(CD14794-214)被良好地折叠，如由NMR溶液谱所示出的(图8B)。没有观察到浓度依赖的化学位移，其暗示缺少分子间相互作用并且这由下面详述的动力学研究进一步探测。这种分子间相互作用的缺少也暗示细胞培养和体内CD147嗜同性相互作用可以由其它分子调节如，例如，钙黏着蛋白二聚作用，钙黏着蛋白二聚作用被由肝素介导的钙或成纤维细胞生长因子受体相互作用所调节。对于CD147，这些小分子没有引起明显的自缔合(数据未示出)，但是这些发现是鉴定控制MMP和细胞因子诱导的CD147表面的重要步骤。因而，本文公开的方法可以用作工具以鉴定造成在肿瘤发展期间起关键作用的活性的特定残基。
单独的CD147胞外区没有自缔合。NMR溶液研究的益处是大分子的动力学和结构可以同时研究并且可以被用于探测CD147自缔合。已经暗示，CD147充当类似于其它细胞黏着受体的其自身受体并且这种相互作用可能具有弱的亲和力。NMR弛豫实验可以用作在多个时标上这种蛋白质/蛋白质相互作用的敏感标记并且因此非常适于探测具有各种亲和力的相互作用。具体而言，R1(纵向)和R2(横向)弛豫速率提供每种残基动力学的高分辨力详细资料，并且因此，如果CD147的胞外区以毫摩尔亲和力(或更紧)进行自缔合，那么这将通过NMR溶液研究观察到。
NMR弛豫测量指示两个CD147胞外结构域，Ig1和Ig2，既没有彼此相互作用也没有以任何显著的量自缔合。使用定义每种酰胺的关联时间的R2/R1比，发现CD147残基22-101和残基105-205是展示几乎有3ns不同的关联时间的独立旋转结构域，这与它们的大小差异相一致(图9A)。这在平均R2率中是直接显而易见的，对于残基22-101(Ig1)其为大约22Hz，对于残基104-205(Ig2)，其为35Hz。尽管这些动力学研究与在近来的X-射线晶体结构内发现的两个独立折叠结构域一致，但是事实是这些结构域的不同关联时间混乱(tumble)也提供了溶液内没有保持晶体接触的直接证据。与这些动力学发现相一致，在用CD14722-103滴定15N-CD14794-205后，没有观察到显著的化学位移变化，由此证明这两个结构域没有作为单独的实体(部分，entities)相互作用(数据未示出)。而且，对于CD14722-205，没有观察到浓度依赖的化学位移变化——如果恰好存在弱的相互作用(即，Kd＞1mM)，预期这将发生。最后，每个结构域R2/R1来源的关联时间和观察到的线宽度与单体蛋白完全一致。因此，如果CD147的这些结构域在体内自缔合，那么这可能在共同受体或小分子的存在下发生。
动力学研究也提供了对残基94-101的重要了解，所述残基包括两种主要的CD147同种型，占～98％的CD147的同种型-2(包含Ig1和Ig2的残基1-269)和同种型-3(残基94-269，仅包含Ig2)。即，在Ig1的情况下，仅残基94-101形成β-链，而这些残基在自然发生的同种型-3的较短胞外区内是杂乱的(图9B)。因此，CD147的生物物理研究已允许探测已经被发现在癌进程中起作用的两种主要同种型的胞外区。
亲环蛋白通过其活性位点结合CD147。为了确定亲环蛋白如何与其受体相互作用，使用NMR溶液研究，已经鉴定了亲环蛋白相互作用表面(图10)。最后，使用标准NMR方法，已经确定了全部的CypB主链共振指认(backboneresonance assignments)。滴定实验已显示，CypA(图10A)和CypB(图10B)通过它们的活性位点唯一地靶向CD147，从而支持在亲环蛋白/CD147细胞信号转导中的催化作用。而且，在这些滴定期间单个平均组的亲环蛋白共振的观察结果指示亲环蛋白/CD147亲和力在高的微摩尔范围之内。许多配体/受体相互作用比此处表征的亲环蛋白/CD147结合弱得多(例如，醇以毫摩尔亲和力结合其受体)。
CD147 Pro211存在于缓慢互变的平衡内并且被亲环蛋白A催化。CD147残基206-214存在于由Pro211控制的顺式∶反式平衡内并且这种平衡在CypA催化后改变。尽管几个以前的报道已假定CD147 Pro180和Pro211都可以被亲环蛋白靶向，但是这些结合位点仅在小肽的情况下被探测到并且在折叠蛋白内部不被探测到。本公开提供了显示亲环蛋白唯一靶向CD147 Pro211而不是Pro180，并且CypA只催化这种Pro211靶位点肽基-脯氨酰异构化的第一个直接证据。
CD147残基206-214位于跨膜结构域的近侧并且显示两组共振，所述共振指示该区正在在两种构象之间以秒时标进行互变。显示了W210的两种共振中一种这样观察到的组的实例，其直接先于催化的Pro211(图11A)。中心脯氨酸突变为丙氨酸(即，P211A)导致只有一组共振，即，反式共振，证实Pro211的顺式∶反式平衡是这种观察到的构象异质性(heterogeneity)的根本原因。脯氨酸残基是可以采用顺式和反式构象的唯一氨基酸，而这种现象只在两种构象之间缓慢互变的蛋白质的亚组(subset)中观察到。因此，CD147是独特的受体，独特性在于其显示了临近跨膜区的两种主要构象。而且，相对的共振强度指示所取样的相对密度(relative population)并且因此，基于这种强度，在没有其亲环蛋白酶配体的情况下，CD147残基206-214显示33％∶67％(顺式～33％、反式67％，Keq，free＝33/67＝0.5)的顺式∶反式比。
CypA增强Pro211的顺反互变，如通过只在酶的存在下观察到的“互换峰”的出现所证明的(图11B，黑色箭头)。只有在NMR实验的时标内具有足够的时间来取样顺式和反式构象异构体时，这些互换峰才会出现。换言之，在没有酶存在下时这种顺/反互变非常缓慢而不能观察到互换峰，但是CypA介导的催化增加其互变，首次直接证明亲环蛋白催化其CD147受体。因此，CD147再一次显示独特性质，所述独特性质在于其配体也是催化它们的靶位点的脯氨酸异构化的酶。
这些结果暗示CD147顺反比被其亲环蛋白配体改变，并且这可以连接胞外亲环蛋白和CD147胞内信号转导。对于此的证据在加入CypA后CD147的顺式共振强度相对于反式共振强度损失增加中见到(图11C和D)。这称为“线增宽”，其由于结合和催化引起。实际上，CD147类似于“容量控制(volumecontrol)”，其调控胞内信号转导。在本模型中，CD147总是通过增加顺式构象，即，“构象转变”，打开(即，低水平信号转导)亲环蛋白“开大容量”(turnup the volume)(增加信号转导)。
表征CypA/CD147结合和催化。本公开超出了结构研究以表征CypA/CD147复合物内的结合和催化。已经显示亲环蛋白在其对于模型底物的催化活性方面存在不同，并且如果生物物理表征显示对其CD147受体底物催化的不同，那么预期在细胞培养中的比较研究反映这种不同。换言之，如果不同的亲环蛋白显示它们的CD147P211靶位点的不同平衡常数，那么，在其胞内信号转导的活化中将存在不同。当然，这也依赖于它们的相对亲和力。
为了定量CypA与CD147 P211的结合，产生了模拟这种靶位点的肽。产生这种CD147肽的原因是在CD147构建物的情况下不可能测定CypA对该位点的亲和力，这是由于毫摩尔亲和力需要这种高浓度的受体。这证明了表征亲环蛋白相互作用的一般性问题，由于瞬时特征和对于其底物的低亲和力通常使得更加难以鉴定多个亲环蛋白靶标。这在其中多种病毒依赖于感染的宿主细胞亲环蛋白的病毒世界中得到说明，而鉴定靶向宿主细胞亲环蛋白的特定病毒蛋白已经证明是迷惑人的(即，对于毫摩尔亲和力“蛋白质相互作用”实验(“pull-down”experiment)是困难的)。这种肽在CypA的活性位点内结合，正如其在较大的CD147构建物的情况下以结合KD～5mM所进行的(图12A)。因而，CypA微弱但特异地结合(engage)CD147。
亲环蛋白介导的CD147的催化通过使用称为“ZZ-交换”的记述进行定量(图12B)。简言之，以催化量的CypA观察到的CD147的交换峰可以被用于定量催化，因为这分别提供了清楚的顺式-反式和反式-顺式互变速率常数，kct和ktc。不同的混合时间(即，32个驰豫期)被排列并且包括顺式、反式、顺式→反式以及反式→顺式峰在内的所有峰强度的调节同时适合于推导出表观催化速率。尽管可以使用上述CD147肽，但是更精确代表受体的CD147构建物，CD14794-214被用于本文描述的实验。ZZ-交换不需要上面所需要的较高浓度来获得完全的结合等温线(isotherm)，并且仅存在几次与观察到的由CypA介导的催化产生的交换峰交迭的共振。使用1∶10的CypA∶CD147比，两种催化速率被确定为kct＝40s-1和ktc＝20s-1，注意到NMR提供了具有高精度的这两种速率，而经典UV-分析不能提供。这些测量结果的小于5s-1的不确定性通过独立地拟合四个峰中的每一个获得并且图解说明了该数据的高质量。尽管具有依赖于相对酶浓度的表观催化速率，但是ZZ-交换测量结果在多个CypA∶CD147处收集以推断在饱和浓度下的真正催化速率常数。这种数据已经提供CypA对CD147的催化功效的有价值地研究，如下所述。
从ZZ-交换数据，可以看出CypA介导的CD147的催化对于模型肽底物是非常有效的。当描述可逆的过程如亲环蛋白介导的异构化时，总的互变速率是比较催化功效的有用参数并且被定义为kex(＝kct+ktc)。使用从肽结合(图12A)确定的计算的KD～5mM和在上面用于ZZ-交换的亚化学计量的CypA浓度下的kex～60s-1(图12B)，可以粗略地外推出化学计量条件下的kex。在这些条件下只有1％的CD14794-214与CypA结合，并且因此对于1∶1复合物来说，kex为～6000s-1(＝100*60s-1)。这种异构化速率稍微高于以前测量的模型肽底物的速率并且对应于大约四个数量级的未催化交换速率的CypA介导的速率增加。利用多个CypA∶CD14794-214比和CypB介导的催化的比较分析，更精确地外推出显示速率增加。可以看出，CD147被其主要的亲环蛋白酶配体，CypA，有效地催化。
可能的是，亲环蛋白介导的肽基-脯氨酰“构象转换”是普遍的现象。例如。目前研究的唯一其它人亲环蛋白底物是胞内白介素-2酪氨酸激酶(Itk)，并且其也显示类似于CD147的相似内在顺式∶反式平衡。因此，亲环蛋白介导的催化可以通过共同的机制调节细胞内和细胞外的信号转导事件。而且，亲环蛋白、其胞内Itk靶标或其胞外CD147靶标的下调都导致癌症发展。因此，本发明的一些方面显示这种途径的原子分辨力的详细资料以弄清这些蛋白如何相互作用以及提供用于合理治疗干预的基础。
CD147和FKBP52的双重抑制抑制了促炎细胞因子从角质形成细胞释放
牛皮癣是增生性角质形成细胞、树枝状细胞、嗜中性细胞、记忆T细胞和
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之间的复杂相互作用的结果(图44)。IL-32(最初称为自然杀细胞转录体4(NK4))是被公认与人类炎症相关的促炎细胞因子并且已经显示与疾病诸如克罗恩病、溃疡性结肠炎、RA、COPD和牛皮癣的疾病严重性相关。IL-32活化核因子κB(NF-κB)和p38促***原活化蛋白激酶的典型细胞因子信号转导通路，以诱导IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和TNFα。IL-32和NOD1/NOD2(核苷酸寡聚结构域)配体激活胱天蛋白酶1途径用于诱导IL-1β和IL.6。另外，IL-32与蛋白酶3诱导MIP2和IL-8。
测量来自人全血的刺激和未刺激T细胞亚群在与初级人角质形成细胞(Hka)间接和直接的细胞-细胞接触后刺激细胞因子产生的能力。在用rhuTNFα或rhuIL-1β刺激后，在Hka裂解物而不是上清中，检测到IL-32γ及其同种型IL-32γ的诱导，而qRT-PCR结果显示，与健康人皮肤相比，在牛皮癣皮肤中，IL-32γ以及TNFα和IL-1β显著增加(P＜0.05)。进一步，人H9和CLA+抗原阳性的CD4+CD45RO+CCR4+Th22T细胞通过直接的细胞-细胞接触机制刺激Hka，从而以与未刺激的H9T细胞或CD4+CD45RO+CCR4-、CD4+CD45RA+CCR4+和CD4+CD45RA+CCR4-记忆T细胞相比显著增加的水平(P＜0.05)上调IL-32γ、TNFα和IL-1β。这些发现(在下面的实施例2中进一步讨论)首次显示，在T细胞：Hka细胞-细胞接触后，在HKa中，促炎细胞因子IL-32γ上调并且可能涉及牛皮癣发病机理的早期阶段。
进一步，当单克隆抗体被用于阻断牛皮癣Th22细胞中的FKBP52和/CD147时，初级人角质形成细胞的细胞因子产生被明显抑制，如图52所示。这显示单一抑制和双重抑制都可以对牛皮癣、风湿病和其他炎性疾病具有重要的治疗应用。
参考实施方式和说明性实施例描述了本发明，本领域技术人员可以理解对如所描述和说明的发明的改变，其不背离在说明书中公开的本发明精神和范围。描述实施例以帮助理解本发明而不是意图以任何方式限制本发明的范围，以及不应该被解释为以任何方式限制其范围。例如，本文描述的许多个实施例涉及慢性斑块的病理生理学和治疗，但是本领域技术人员将会意识到，实施例也适用于与慢性炎症相关的其他状况例如上面讨论的那些状况。实施例不包括常规方法的详细描述。这些方法对于本领域技术人员来说是熟知的并且在大量的出版物中进行了描述。进一步，上面引用的所有参考文献和下面的实施例都通过引用并入本文，如同在本文中全部描述。
具体实施方式
实施例1：同时沉默FKBP52和EMMPRIN显著减少细胞因子产生
用PMA/洛诺霉素刺激人T-细胞淋巴瘤H9细胞。溶解细胞并且使用商业可得的膜蛋白提取试剂盒对蛋白质进行分级，然后通过2D凝胶电泳进行分离。切除显示在刺激样品和未刺激样品之间大于2倍变化的蛋白质点，用胰蛋白酶消化并通过纳米LC/MS/MS分析。应用蛋白质印迹、siRNA击倒(敲除，knockdown)和细胞-细胞接触生物分析来验证蛋白质鉴定、定量和功能。
材料和方法
患者，材料和方法。声明：研究得到相关机构审查委员会和伦理委员会批准以及所有人类参与者提供书面的知情同意。
细胞系的培养。人细胞系培养在标准培养基中，所述标准培养基由补充有10％(v/v)FCS血清、2mM L-谷胺酰胺、100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素的RPMI 1640(Biochrom，Berlin，德国)组成。Hut78、H9、Molt4、Jurkat、Raji和THP-1细胞系得自ATCC。
外周血单核细胞(PBMCs)的细胞分离。通过Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs。获得的PBMCs的生存力总是＞95％，如通过台盼蓝染色所测定的。活的细胞在Neubauer室(Zeiss，Oberkochen，德国)中定量并且储存在液氮中。
CD3+T细胞。再次在1,500rpm下离心解冻的PBMC 5分钟，然后弃去上清。然后将小球(细胞团，pellet)重悬于MACS缓冲液中并且将细胞打乱成单一的细胞悬浮液。每108细胞悬浮在0.8ml缓冲液中。每108细胞加入0.2ml半抗原-抗体混合物。细胞和抗体混合物充分混合并且在冰上温育20分钟。然后通过加入20×标记体积(volume)洗涤细胞，离心并且除去上清。细胞球重悬于0.8ml缓冲液中(每108细胞)。每108细胞加入0.2ml MACS抗-半抗原微珠(MicroBead)以通过磁力标记细胞，然后充分混合混合物并且在冰上温育15分钟。用20×体积洗涤混合物(如果使用来自白细胞电泳包(Leukophoresispack)的冷冻细胞，则使细胞通过45um的网孔滤器以除去群集的死细胞)，离心，然后全部除去上清。然后将细胞重悬于1ml MACS缓冲液(每108细胞)。将LS+柱置于适当的MACS分离器的磁场中并且通过用3ml缓冲液洗涤来预备柱。细胞悬浮液被施加至柱上，使得未标记的细胞通过。收集流出物作为阴性部分，代表富集的T细胞部分。用4×3ml的缓冲液冲洗柱，收集流出物。然后离心柱并且除去上清，将细胞球重悬于50ml组织培养基中。计数细胞并且制备106细胞/ml的悬浮液。这些悬浮液是具有大于95％纯度的纯化T细胞。细胞纯度可以通过CD3-FITC标记和FACS分析来测定。对于单核细胞，方法与上面讨论的对于CD3+T细胞分离的方法相同。
细胞的免疫分型。收获的细胞在FACS介质[含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)]中洗涤并且通过与异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)直接结合的抗体在4℃下染色20分钟。此后，用PBS洗涤细胞三次并且使用CellQuest软件(Becton Dickinson)通过FACScan(Becton Dickinson，Heidelberg，德国)进行分析。抗体是下述：PE-标记的抗小鼠IgG、抗人CD40L和CD147。
细胞-细胞接触分析。用冷PBS洗涤初级T细胞或H9细胞并且以5×106细胞/ml将细胞球重悬于新鲜制备的1％多聚甲醛中。在冰上保持细胞固定2小时，然后用20×体积的冷PBS洗涤三次。在第三次洗涤之后，将在4℃细胞保持在PBS中过夜以使任何痕量的多聚甲醛漏出细胞。次日早晨再次离心细胞并且再一次洗涤。以1×107细胞/ml将固定的T细胞重悬于培养基中。将1×106/ml THP-1细胞分配到96孔U形底板中，每孔100μl。加入8×、4×和2×106细胞/ml初级T细胞或H9细胞，每孔100μl。将板置于湿润的37℃，5％CO2温箱中48小时。以1,500 rpm离心板5分钟并且小心地将120μl的上清转移到新的板中。将上清保持在-20℃冰箱中直至使用。
固定的T细胞以大约5×105细胞/100μl的密度铺平板，然后以5×104细胞/100μl加入THP
Figure GSB00000734841600241
然后在37℃下将细胞温育24小时和48小时(图53)。然后分析上清的TNFα、IL-1β和IL-32γ。
siRNA。通过转染siRNA(Nucleofection，amaxa)以特异地敲掉T细胞中候选基因的表达来进行RNA干扰。通过FACS分析来测量候选基因表达。
RNA样品制备和杂交。使用RNeasy MinElute试剂盒(Qiagen)，Qiagen MiniRNeasy试剂盒，根据制造商的方案提取总RNA并且纯化。使用每种样品的100ng总RNA，如表达分析技术手册中所述的进行cDNA合成(Affymetrix，two-cycle protocol)。使用BioArray High-Yield Transcript Labeling试剂盒(Enzo)，进行cRNA反应。15微克的标记cRNA被片段化并且按照厂商的用法说明顺序地与GAPS Slides(Corning)杂交。
微阵列数据分析。所有阵列都被标准化并且使用PerfectMatch程序(Zhang等人，2003)进行分析。对野生型和异位无眼触角、腿和翅原基(wing discs)进行双因素方差检验。为了调节多个检验，计算假发现率并且确定具有在0.001处的截止组(cutoff set)的总计956个基因和在一个样品中至少两倍诱导。为了进一步减少假阳性，不在最高40百分点中表达的基因被认为是没有的并且被排除用于进一步分析。而且，只有以高于野生型腿、翅或触角原基中表达水平在野生型眼原基中表达的基因被包括在内，用以进一步分析。
双向凝胶电泳和分析。使用可得自Pierce的哺乳动物细胞的膜蛋白2D样品制备试剂盒从对照和刺激的H9细胞提取膜蛋白。在提取和沉淀之后，在离液序列高的溶解缓冲液(7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS、50mM DTT、0.2％载体两性蛋白质(pH 4-7)、1％蛋白酶抑制剂混合物)中溶解蛋白质，并且使用改良的Bradford assay(BioRad)进行定量。通过用包含1000mg蛋白质的450mL离液序列高的溶解缓冲液再水化24cm长的pH 4-7 Immobiline DryStrips(GE Healthcare)，进行第一向的等电聚焦。在12小时的活性再水化之后(50V，20℃)，使用
Figure GSB00000734841600251
IEF cell(Bio-Rad)，用每带50mA的最高电流分离蛋白质并且以70,000伏特-小时(Vh)在10kV下结束伏特梯度。在第一向分离之后，将带置于-80℃至少2小时。
在第二向分离(SDS-PAGE)之前，解冻的带首先用平衡缓冲液((20％甘油、20％SDS、1.5M Tris pH 8.8和6M尿素)中的10mg/mL DTT温育15分钟，然后用在相同缓冲液中的25mg/mL碘代乙酰胺温育。使用Ettan DALT-12***用12.5％预制聚丙烯酰胺凝胶(26×20cm)和DALT缓冲液试剂盒(GEHealthcare)进行第二向分离。使用60W 30分钟和180W大约5小时并且保持在15℃下通过分子量分离蛋白质。按照厂商说明书用考马斯亮蓝(Bio-SafeTM，Bio-Rad Laboratories，CA，USA)染色蛋白质过夜。在LabScan(GE Healthcare)上以每英寸(dpi)300点成像，之后用水脱色。蛋白质丰度的统计学显著变化通过IMAGE-Master platinum II software 5.0版(GE Healthcare)确定。每个蛋白质点的强度(3维的量)被标准化为凝胶上检测的所有点的总强度。在比较24块凝胶(6个组，每组n＝4)之前，单独地调节产生每个凝胶平均1500个蛋白质点的检测阈值。聚集24块胶中的至少23块中出现的点。使用软件的相对量(％Vol)选项确定蛋白表达的差异。所有统计学显著的点(与对照相比，学生T检验p＜0.05)被人工地研究以确保两个点没有融合或所述点被错误地分组。与对照相比平均密度大于±40％平均点量的变化是用于切除随后通过质谱分析法进行鉴定的点的标准。
使用改良的Havlis和Jimenez的方法，消化凝胶点中的蛋白质。简言之，组合来自至少两个重复样本的点并且用1/1乙腈和100mM碳酸氢铵脱色两至三次，然后用100％乙腈浓缩并且真空干燥。用25ng/ml胰蛋白酶再水化点并且在37℃下温育过夜。收集上清并且使用1％蚁酸(含水的)和30％乙腈另外提取2次汇集。所汇集的提取物真空浓缩为大约10μL并储存在-80℃直至使用。通过反相纳米喷射(nanospray)LC-MS/MS(Agilent 1100 HPLC，75 mm ID×15cm柱，Zorbax C18)分析约30％的凝胶内消化的样品。缓冲液A 0.1％蚁酸。利用增加的缓冲液B(90％ACN，0.1％蚁酸)的梯度以300nl/min的流速从分离柱洗脱肽至质谱仪中。在350-1800D的m/z范围内收集光谱(Agilent LC/MSDTrap XCT Ultra)。收集了六种最丰富m/z值的三个MS/MS光谱，然后从分析中排除这些质量1分钟，接下来选择下面的六种最丰富m/z值，用以破碎。
利用Mascot(Matrix Science)和Spectrum Mill(Agilent)程序，通过搜索NCBInr、IPI human和SwissProt数据库，鉴定蛋白质。对于Mascot，使用10,000的密度阈值和以5次扫描分组的0.2％相对丰度的最小值生成所得到的光谱的化合物列表。以.mgf文件输出化合物列表并且利用人类的分类学筛选再次搜索数据库(每周更新)。数据库搜索中使用的参数如下：单一同位素质量、2.4Da的肽质量公差(peptide mass tolerance)、0.7Da的片段离子质量公差(fragmention mass tolerance)、仅允许2个遗漏***的胰蛋白酶肽、由于固定修饰的Cys脲基甲基化(carbamidomethylation)和由于可变修饰的脱酰胺(N，Q)和乙酰化作用(K)。类似的参数被用于SpectrumMill搜索。SpectrumMill蛋白质分值高于13，其中肽分值超过10并且记分的百分比强度(SPI)超过70％是初级击打(hit)确认的截止值(cutoff)。
FKBP52在刺激的CD3+T细胞中上调
与在获自健康捐赠者的血液的T细胞中相比，促炎细胞因子TNFα在取自牛皮癣患者的血液的T细胞中上调(图13)。已经显示促炎细胞因子通过活化的巨噬细胞(MΦ)的上调驱动慢性银屑病的发病机理，最可能通过皮肤中的免疫突触(IS)机理经由直接的细胞-细胞接触进行。在一些实施方式中，提供了T细胞和
Figure GSB00000734841600261
蛋白质，其在该***中介导适应性免疫。
刺激的和未刺激的人T细胞的差示双向凝胶电泳被用于选择上调的蛋白质候选物用于随后通过串联质谱进行鉴定。
基于双向凝胶的蛋白质组学是用于鉴定响应于一些触发物改变其表达或修饰状态的蛋白质的广泛接受的方法。研究了这种方法用于刺激的人T细胞系H9细胞的差异表达分析。蛋白质分离的pH范围通过电荷和丙烯酰胺百分比进行优化，用于使用全细胞裂解提取物通过大小分离蛋白质。这些条件(11 cmIPG带，pH 104-6，10.5-14％梯度SDS-PAGE凝胶)被应用到刺激的和未刺激的H9细胞的制备。刺激样品的蛋白质分离示于图14中。切除标记的点——代表至少1.5倍的表达变化，使用胰蛋白酶消化并且然后在安捷伦超高容量离子阱(Agilent Ultra high capacity ion trap)上通过nanoLC/MS/MS进行分析。用Spectrum Mill的数据库搜索被用于鉴定蛋白质。获得所有点的高的分值、验证的蛋白质鉴定。使用串联质谱，号码为13的点被鉴定为FKBP52(图15)。
蛋白质印迹分析确认FKBP52的表达在刺激的H9细胞中稍微增加(数据未示出)，而在刺激的CD3+T细胞中显著增加(图16)。
总结在表1中的微阵列分析显示在H9细胞中FKBP52和FKBP12的增加的上调(与未刺激的对照相比)，而在牛皮癣损伤皮肤中具有显著的上调，这支持了蛋白质组学的结果。
通过蛋白质印迹、qRT-PCR和FACs分析验证蛋白质表达。使用siRNA抑制感兴趣蛋白质的表达，测量细胞因子水平的细胞-细胞接触分析被用于建立蛋白质功能性(下面讨论)。来自蛋白质组学研究的结果暗示，FKBP52的表达在通过PMA/洛诺霉素处理活化T细胞后显著增加。
使用H9或CD3+T细胞，FKBP52的击倒没有可见地影响细胞因子水平
为了确定FKBP52是否是导致细胞因子上调的T cell:MΦ信号转导中的重要分子，siRNA被用于抑制FKBP52的表达。siRNA实验的结果在下面讨论。蛋白质印迹显示在CD3+T细胞中的有效击倒(图17)。siRNA没有有效抑制H9细胞中的FKBP52表达。
细胞-细胞接触分析显示FKBP52的击倒对TNFα(4-1BB，活化淋巴细胞的标记物，在***物中被显示为阳性对照)的水平没有显著的抑制作用，表明FKBP52在该信号转导途径中是不重要的或其与另一蛋白质联合起作用(图18)。
在与巨噬细胞接触并且与FKBP52相互作用后CD147在人CD3+T细胞中 上调
FKBP52是具有顺反脯氨酰异构酶活性的抑免蛋白。这种超家族的其他成员包括亲环蛋白，例如，亲环蛋白A和B。这些蛋白质与CD147(EMPRINN)结合或以另外的方式缔合(图7)并且是炎性疾病的介质。
如图21所示，NMR被用于显示CD147和FKBP52之间的相互作用。0.5mM的15N-标记的CD147用0.5mM未标记的FKBP52滴定。对应于受体膜近端区(残基207-234)的CD147的共振显示NMR化学位移变化，指示弱的但是生理学上的缔合。这种弱的相互作用与已知的亲环蛋白A/CD147结合一致。
FACS分析显示，CD147细胞表面表达在刺激的T细胞中上调并且由T细胞：
Figure GSB00000734841600281
接触引起(图19-20)。
在T细胞：接触之后TNFα水平的测量结果显示，TNFα在活化的T细胞与
Figure GSB00000734841600283
接触时显著上调。但是，TNFα水平没有明显地被CD147的siRNA击倒——被用作对照的模拟siRNA(CTL)或FKBP52的siRNA击倒所抑制。当CD147和FKBP52都被击倒时，TNFα的浓度显著减少，暗示这两种蛋白一起作用以介导T细胞活化期间的T细胞：
Figure GSB00000734841600284
信号转导(图22)。
通过siRNA或单克隆抗体双重抑制FKBP52和CD147协同抑制T-细胞介 导的分泌促炎细胞因子的MΦ活化
为了确定CD147或FKBP52单独的或一起抑制是否导致来自健康人捐赠者的THP-1
Figure GSB00000734841600285
CD3+细胞的促炎细胞因子释放的减少，来自银屑病(Psoriasisvulgaris)患者的Th22细胞(记忆T细胞类型)被能够击倒FKBP52或CD147的siRNA或单克隆抗体靶向并且在将它们置于细胞-细胞接触分析中相对于THP-1
Figure GSB00000734841600286
的各种浓度中之前进行刺激。在温育48小时之后，吸出上清并且分析IL32γ、TNFα和IL-1β的水平。T细胞被分离并且可以用于通过FACs、qRT-PCR、蛋白质印迹或免疫组织化学(IHC)测量FKBP52和CH147。溶解
Figure GSB00000734841600287
并通过qRT-PCR或任何其他合适的方法检测胞内IL-32γ和其他
Figure GSB00000734841600288
细胞因子。在图22-32中，TCISM#1是CD147，而TCISM#2是FKBP52。
CD3+细胞中的抑制研究。人CD3+T细胞介导的
Figure GSB00000734841600289
TNFα产生显示与T细胞数成比例。单独的CD147或FKBP52siRNA击倒不抑制T细胞介导的
Figure GSB000007348416002810
TNFα产生(图22、25)。单独的CD147或FKBP52siRNA击倒适度地抑制T细胞介导的
Figure GSB000007348416002811
IL-32γ产生50％(CD147，图23-24)和20％(FKBP52，图26)。然而，CD147和FKBP52的同时siRNA敲除抑制T细胞介导的
Figure GSB000007348416002812
TNFα(图27)和IL32γ(图28)产生大约90％。
Th22细胞中的双重抑制研究。在Th22细胞中，CD147和FKBP52的同时siRNA击倒抑制T细胞介导的
Figure GSB000007348416002813
TNFα(图29)和IL32γ(图30)产生大约95％。同样地，通过特异性单克隆抗体同时阻断CD147和FKBP52抑制T细胞介导的
Figure GSB000007348416002814
TNFα(图31)和IL32γ(图32)产生大约95％。
该数据显示，尽管CD147和FKBP52可能对
Figure GSB000007348416002815
细胞因子释放具有可接受的独立作用，但是两种蛋白协同作用达到更有效的抑制。
实施例2：在T细胞刺激后，IL-32由角质形成细胞产生
为了进一步研究其在牛皮癣中的作用和发病机理，通过免疫组织化学(IHC)和细胞因子的电化学发光(electrochemilucent(ECL))测量以及使用Hka的原代细胞培养实验以及分离的人记忆效应T细胞的亚群研究了IL-32在人牛皮癣皮肤组织中的表达和特征。结果显示，IL-32是新型的促炎细胞因子，其可能涉及包括银屑病的皮肤炎性疾病的早期阶段并且独特的CD4+CD45RO+CCR4+效应器Th22T细胞群可能涉及这种疾病的引发。
材料和方法
牛皮癣对象。在两个不同的University of Colorado Denver，Anshutz医学院机构审查委员会许可的程序(COMIRB#05-0275[Dr.Carl Edwards，主要研究者]，和COMIRB#06-0303[Dr.Carl Edwards，主要研究者])中，患有牛皮癣(影响5-10％的体表面积)的15个成人(年龄在18-65岁之间)提供了对于LS和NL 3-6mm钻取皮肤活组织检查的书面同意书。根据根据赫尔辛基宣言准则进行研究。牛皮癣患者需要具有至少一个其医师可见的有效牛皮癣损伤。在这之前，患者没有进行全身或局部治疗分别4周和2周。另外，获得来自N＝21健康志愿者的活组织检查样品用于IHC和qRT-PCR研究。每个活组织检查样品的一半被冷冻在OCT中(Sakura Fine technical，Tokyo，日本)并且储存在-80℃用于IHC，剩余的切片保存在液氮中直到分析。
重组IL-32α和IL-32γ蛋白的纯化。在大肠杆菌中将重组IL-32α和IL-32γ蛋白表达为his6标签N-末端融合蛋白，随后如以前所述(90，123)在TALON亲和柱(Invitrogen)上进行亲和纯化。在30℃，用烟草蚀刻病毒蛋白酶(Invitrogen)消化TALON亲和纯化的重组IL-32α和IL-32γ蛋白2小时，以除去N-末端his6标签。制备物被透析并且使用1-ml HiTrapTM QFF柱，利用0至500-mM NaCl梯度，在AKTA FPLC(Amersham Pharmacia Biosciences)上进行离子交换。洗脱的蛋白质峰部分针对50mM Tris-碱缓冲液(pH 8)进行透析并且然后进行大小排阻层析(Superdex75，AKTA FPLC)。得到的部分通过SDS/PAGE用银染色进行鉴定。
最终的三步纯化的重组IL-32α和IL-32γ蛋白被用于单核细胞分化和细胞因子分析。在10g/ml多粘菌素B(Sigma-Aldrich)——其不影响TNFα或IL-1β的产生——的存在下，重组IL-32α和IL-32γ被加至人PBMCs的培养物中。
细胞分离。外周血单核细胞(PBMCs)。直接从健康人类志愿者的全血中分离PBMCs，或者从仅包含来自健康人类志愿者的白细胞的白细胞库(leukopacs)(Denver Bonfils Blood Center，University of Colorado DenverUniversity Hospital，Aurora，CO)中分离。在知情同意之后，从肘前静脉抽取静脉血到肝素管中并且如在许可的COMIRB方案中所描述的处理PBMCs。研究得到了科罗拉多州多机构审查委员会的许可。如以前所述的进行PBMC的Ficoll密度梯度离心(124)。获得的PBMCs的生存力总是＞95％，如通过台盼蓝染色所测定的。活细胞在Neubauer chamber(Zeiss，Oberkochen，德国)中定量并且储存在液氮中。捐赠者没有处方和非处方用药。
体外细胞研究。正常的人初级角质形成细胞(Hka)被培养在无血清的EpiLife培养基中，所述培养基具有人KC生长添加剂(0.2％牛垂体提取物(v/v)、5μg/ml牛胰岛素、5μg/ml牛运铁蛋白、0.2ng/ml人EGF和0.18μg/ml氢化可的松)，全部购自Cascade Biologics (OR，USA)。H9T细胞淋巴瘤细胞系(ATCC，Manassas，VA，USA)、正常的人初级CD3+T细胞(Belle Bonfils BloodDonor Center，University of Colorado University Hospital，Aurora，CO，USA)和获自牛皮癣患者血液的Th22T细胞被培养在RPMI 1640中，所述RPMI 1640具有10％胎牛血清(FCS)、100mM Hepes、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，全部购自Invitrogen Life Technologies。PMA和洛诺霉素购自Calbiochem(SanDiego，CA)。
细胞刺激。在37℃，用PMA(1ng/ml)和洛诺霉素(500ng/ml)刺激初级T-细胞、H9细胞和Th22细胞(1×106细胞/ml)18hrs。用TNFα(1ng/ml)、TNF α(10ng/ml)+PEG sTNF-RI(10g/ml)、IL-1β(10ng/ml)、IL-1βng/ml+IL-1ra10g/ml、IL-1βng/ml+TNFα10ng/ml和IL-32α或IL-32β刺激HKa 24hrs。在37℃，用活化的H9和初级T细胞刺激Hka 24hrs。PEGsTNF-RI和IL-1ra得自Amgen(Thousand Oaks，CA)。
细胞因子刺激。新鲜分离的人PBMCs用对照RPMI培养基或用30ng/mlIL-32在96孔平板中温育。在37℃温育24h，收集上清并且使用BioVeris装置通过电化学发光测量促炎细胞因子(TNF、IL-1β、IL-32和IL-6)浓度。用于生物素化和钌化(ruthenylation)以及标准的抗体获自R&D Systems。在一些实验中，检查了MAPK抑制剂(2μM SB203580；Calbiochem)和泛胱天蛋白酶(pan-caspase)抑制剂(10M z-VAD-fmk；Calbiochem)。
细胞因子检测ELISA。根据厂商的用法说明，通过酶联免疫吸附测定(R&DSystems)定量细胞培养上清中的细胞因子产生。使用藻红蛋白结合的抗-IFNγ(BD PharMingen)、Alexa Fluor 647结合的抗人IL-17(eBioscience，SanDiego，CA)和Alexa Fluor 488结合的抗人forkhead盒P3(FoxP3；BioLegend，San Diego，CA)，通过胞内染色测定细胞因子产生细胞。简而言之，用豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯和洛诺霉素刺激细胞4小时并且在2小时后加入Golgiplug(BDBiosciences，San Jose，CA)。在4％多聚甲醛中固定细胞，用0.1％皂角苷使之具有渗透性，用荧光抗体染色，并且在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。Cell Quest软件(BD Biosciences)被用于获取数据，而Flow Jo软件(Tree Star，Ashland，OR)被用于分析。
在体外活化后初级人T细胞和效应器记忆T细胞纯化。使用Pan T cell分离试剂盒II和AutoMACCs仪器(Miltenyi，CA，USA)，按照厂商提供的程序，通过负向选择分离人CD3+T细胞。得到的纯化T细胞具有＞98％的纯度，如通过CD3-FITC标记和FACS分析所测定的。使用25ng ml-1豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯和2mg ml-1天然CD4+T细胞活化CD3+T细胞，使用人天然或记忆CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)，在PMA+洛诺霉素刺激后进一步纯化效应器记忆CD4+CD45RA+或CD4+CD45RO+T细胞。CD45RA+和CD45RO+T细胞的纯度为＞90％。
CD3+T细胞群纯化、流式细胞术、细胞-细胞接触分析。使用记忆CD4+、CD45RA+和CD45RO+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，获自白细胞库(Belle-Bonfils Blood Center，UCD Hospital，Denver，CO)的PMA+洛诺霉素活化的记忆CD3+T细胞被进一步纯化。在室温下，用CD45RO-FITC、CD45RA-FITC、CD4-APC和CCR4-PE (全部获自Beckman Coulter)染色细胞20分钟。然后再PBS中洗涤细胞，随后在2％多聚甲醛中进行固定。在FC500(Beckman Coulter，Hialeah，FL)上进行流式细胞术。每个样品收集5000个事件(events)。显示的数据代表来自其中总共进行四个单独实验的单一实验。1％多聚甲醛固定的T细胞加至Hka细胞诱导Hka细胞IL-32γmRNA或蛋白质(数据未示出)。在直接的细胞-细胞接触48小时后，PMA+洛诺霉素活化的人记忆效应器T  细胞群(CD4+CD45RO+CCR4+、CD4+CD45RO+CCR4-、CD4+CD45RA+CCR4+、CD4+CD45RA+CCR4-[10×105总的T细胞，如上面描述的纯化])与初级Hka接触。通过如上所述的ECL测量Hka细胞上清和裂解物的IL-32γ、TNFα或IL-1。对于每个细胞群，评价了总共6次独立的测量。每一条(bar)代表平均数±SEM，其中(*)P＜0.05(ANOVA)，*#P＜0.001(ANOVA)。完成了使用单独的健康人捐赠者的总共两个分开的实验，具有相似的结果。
ECL。兔中产生的抗重组IL-32γ的多克隆抗体被用于ECL。用Econo-Pac制备IgG，并且随后通过IL-32-固定化的Affi-gel 15琼脂糖珠柱进行亲和纯化。根据厂商的用法说明(Bio Veris，Gaithersburg，MD)，用生物素标记亲和纯化的抗IL-32γ抗体的一个等分试样，用钌标记另一等分试样。使用重组IL-32γ，生物素、钌和标记抗体被用于构建标准曲线，用于ECL分析。液相ECL方法被用于测量人初级角质形成细胞细胞培养基和0.5％Triton-X中的细胞裂解液中的TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-32γ。ECL的量通过使用Origen Analyzer(Bio Veris)测定。
MTT分析。使用MTT细胞增殖试剂盒I(Roche Applied Science)，评价Hka的增殖。以2000细胞/孔将Hka接种在96-孔板中具有完全人KC生长添加剂的EpiLife培养基中。在让细胞生长过夜后，将培养基变为补充有系列浓度(0、1、5、10、20、40、60、80、100pg/ml)的人重组IL-32γ和IL-32γ的EpiLife。在37℃和5％CO2下，将细胞培养物温育24小时。在温育时期之后，根据厂商的方案(Roche Applied Science)检测增殖。
细胞-细胞接触生物分析。以2.5×105细胞/孔将Hka接种在控制***物(Control Inserts)6-孔板Micron)(Cat.No.354567，BD)中具有完全人KC生长补充剂的EpiLife培养基中。16hrs之后，除去培养基。将具有10％胎牛血清(FCS)、100mM Hepes、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640中的未刺激和刺激H9细胞(5×105、7.5×105和1×106)以及初级T细胞(1×106)加在具有或没有控制***物(control Inserts)的Hka的顶部24小时。除去H9细胞和初级T细胞，用1×PBS洗涤Hka三次。对于IL-32浓度，用0.5％Triton-X裂解Hka，对于IL-32基因表达，根据RNeasy Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)的方案，用裂解缓冲液裂解Hka。
免疫组织化学和组织学。在10％***中固定皮肤组织样品并且用石蜡包埋。来自石蜡块的三个切片被用于IL-32的IHC，使用ABC检测***(DakoCytomation，Carpinteria，CA)；抗人IL-32γ的小鼠单克隆抗体(Mab)被使用(90)。如以前所述的，在室温进行IHC步骤(125)。在脱蜡后，将切片置于压力炊具的10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中，满功率运行4分钟，随后用3％过氧化氢处理10分钟。初级抗体(5mg/ml)被稀释(1∶16,000)，与组织切片温育20分钟并暴露于EnVision试剂(DAKO)30分钟。然后用显色剂顺序温育玻片10分钟，用Meyer’s苏木精复染，并封片。通过使用小鼠IgG1同种型进行阴性对照染色(90)。使用相等浓度的亚类匹配的IgG1(BD Pharmingen，San Diego，CA)，在所有切片上进行阴性对照。IL-32肽(0.4mg/ml；Dr.Charles A.Dinarello)被用于抗体阻断研究：1μlIL-32肽被加至400μl稀释的IL-32γMab，混合并在40℃温育过夜。在以15k/rpm离心15分钟后，上清被用于温育皮肤组织。苏木精和曙红(HE)染色被用于Hka组织学研究。
免疫组织化学染色的评价。通过光学显微镜观察玻片。进行整个组织切片的观察以评价抗原分布的异质性和遍及每张组织切片的IL-32γ阳性细胞的比例。以如以前描述的相同方式对IL-32γ表达的细胞分布模式进行分类(126)。
定量实时定量聚合酶链式反应(TaqMan)分析(qRT-PCR)。在10％***中固定来自牛皮癣患者和正常健康捐赠者的皮肤样品并且石蜡包埋。用RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)从4个新鲜切的10μM切片提取总RNA。IL-1β、IL-6、IL-8、IL-32和TNFα基因表达试剂盒(ABI)被用于qRT-PCR。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)，提取Hka的总RNA。根据厂商的使用说明，使用随机六聚体作为引物，利用TaqMan ReverseTranscription试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)合成互补DNA。反应在ABI Prism 7700序列检测***上以四个重复试验(在96孔板中24个基因转录体)进行。每一孔也包含特异的引物和探针以测量作为内部对照的18SrRNA。加至每一反应的cDNA的量被保持在相对窄的范围内，其通过测量18SRNA确定。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)被用作内源性对照。实时PCR的结果以与IL-32基线相比的相对表达来表示。
统计学分析。使用SigmaStat 3.1软件(StataCorp，College Station，TX)进行统计学分析。实验进行至少三次，数据被表示为平均数±SEM。组间的比较通过使用一对非对数Wilcoxon检验和/或两因素方差(ANOVA)分析，其中P＜0.05被认为是差异显著。双尾配对的学生t检验被用于比较正常对牛皮癣未损害和损害细胞数，用于IL-32α和IL-32γT-细胞群。双尾P-值被指定为P＜0.05(*)、P＜0.01(**)和P＜0.001(***)。
结果
IL-32γ在牛皮癣皮肤损害中的表达。通过IHC将IL-32γ在牛皮癣皮肤中的存在和表达模式与正常人皮肤进行了比较。来自15个患有活跃疾病的牛皮癣对象的整个皮肤的***固定石蜡包埋(FFPE)活组织切片显示独特的IL-32表达模式，包括基层角质形成细胞中的胞质颗粒染色和在表皮中的增加的树突细胞(DC)染色(图33A-C)。观察到在各种DC中增加的核染色以及皮肤中小血管中的上皮细胞染色(图33B)。作为另外的对照，获自健康成人捐赠者(N＝6)的皮肤被染色，并且发现存在阳性IL-32γ染色，尽管与所有领域中的不一致或者不如获自患有活跃疾病的牛皮癣患者的皮肤的明显(图33F)。另外，使用不与IL-32γ交叉反应的特异的抗IL-32γMab(90)或竞争性拮抗肽(来自Dr.Charles Dinarello的馈赠)，通过抗体阻断分析，证实牛皮癣皮肤中的IL-32γ的特异性(图33E)。假定现已知IL-32γ是与导致额外的细胞因子产生的NOD配体联合作用的促炎细胞因子(91)，那么在牛皮癣皮肤中强烈存在而在健康成人皮肤中不存在暗示其在牛皮癣中具有重要作用。
为了进一步研究IL-32在牛皮癣皮肤中的表达，从上面标明的FFPE人组织提取总RNA，并且使用高度验证的分析体系(92)通过qRT-PCR评价IL-32mRNA的存在。qRT-PCR分析显示，牛皮癣皮肤组织合成升高的IL-32γmRNA水平(图34)。正常和牛皮癣损伤的皮肤都表达IL-32γ的mRNA，尽管获自牛皮癣皮肤的IL-32γmRNA水平比健康人皮肤中表达的IL-32γmRNA水平几乎高10倍(图34)。这些牛皮癣损伤皮肤活组织检查样品中的IL-32γ表达显著高于健康人对照中的表达(P＜0.01)。此外，在这些牛皮癣皮肤活组织检查样品中发现了IL-1β、IL-8和TNF的存在。如同IL-32γ表达，与健康捐赠者活组织检查样品相比，这些细胞因子表达水平在牛皮癣损伤皮肤中显著增加(P＜0.01)(图34)。尽管以前在成人皮肤中没有描述IL-32γ转录体，但是已经在几种其他人组织中显示IL-32γ转录本(86、93)。以前已经显示，与在非免疫组织中相比，IL-32γ表达在免疫细胞中更明显地一致(94)。上述结构显示，IL-32在人皮肤中表达，特别是在获自健康人捐赠者的Hka中表达。
IL-32γ在Hka中的表达及其生物学活性。接下来，在蛋白质和RNA水平确定了Hka产生IL-32γ。最近已经显示，rhuIL-32上调IL-32，与用于ECL定量的MAb没有明显的交叉反应性(90)。在经受作为炎症刺激物的TNF、IL-1β或重组人IL-32(rhuIL-32)处理之后，在+48小时培养后，使用ECL分析，分析来自Hka的细胞裂解物和上清的新产生的促炎细胞因子。在Hka细胞裂解物中主要检测到基础水平的IL-32γ，显示在这种皮肤细胞类型中IL-32是胞内细胞因子(图35)。另外，用rhuTNFα或rhuIL-1β刺激Hka诱导非常显著(P＜0.001)的胞质IL-32γ水平(图35)。而且，qRT-PCR结果显示，TNFα和IL-1β相互地诱导IL-32mRNA表达(图36)。这些反应被与TNFα(即，PEGs TNF-RI，来自Amgen的赠品)(95)具有高结合亲和力的重组人p55TNF可溶性受体和重组人IL-1ra(i.e.，Anakinra，Amgen)(96)所逆转。如图37所示，rhuIL-32γ诱导显著量的IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα，而IL-32γ蛋白水平没有增加，如以前已经显示的(90)。
最后，用最佳活化水平的rhuIL-32和其他细胞因子处理Hka。IL-32对Hka增殖的作用。我们接下来评价IL-32α或IL-32γ在单层培养物中是否能诱导Hka增殖。出乎意料的是，我们发现初级Hka增殖显著地被用任一IL-32同种型的刺激所抑制(图39)。在rhuIL-32刺激后+12、+24和+48hrs的MTT分析结果显示，对Hka增殖的剂量依赖抑制反应，而无论其活化的表型如何，如图38所示。这些数据也证明，在两种IL-32同种型抑制Hka增殖之间的差异是可以忽略的。
Hka和从T-细胞的细胞-细胞接触生物分析。接下来，确定了由Hka产生的IL-32γ是否可以被天然的或活化人T细胞诱导和/或上调。为了这些实验，我们使用经过验证的细胞-细胞接触生物分析***(97、98)(图40)。如图41所示，使用穿孔***物(transwell insert)，发现PMA+洛诺霉素活化的人H9T细胞而不是天然的H9T细胞，显著(P＜0.05)间接上调Hka裂解物来源的IL-32水平。直到48小时，存在H9细胞依赖的IL-32增加；与未活化的H9细胞相比，Hka IL-32水平非常显著(P＜0.01)(图41)。我们也发现，IL-32mRNA水平与增加的IL-32ECL蛋白水平相关(图42)。
然后确定以直接的细胞-细胞接触方式与Hka接触的H9细胞是否诱导IL-32。发现在与活化H9T细胞细胞-细胞接触后，在48小时的Hka培养物中，具有显著的(P＜0.05)细胞依赖的IL-32的增加。最后，测量了Hka裂解物来源的IL-32是否能够在与初级人CD3+T细胞的细胞-细胞接触之后产生。观察到活化的T-细胞依赖的Hka来源的IL-32蛋白的显著增加(P＜0.001)。这些结果显示，初级人T细胞和人T细胞系都具有可溶的和T细胞膜结合的介质存在，其诱导Hka产生IL-32。
人记忆效应T细胞亚群和Hka的细胞-细胞接触相互作用引起IL-32γ产生。已经显示发病的效应记忆T细胞通过引发牛皮癣损伤形成中细胞和分子网的链反应而在牛皮癣中发挥关键作用(99、100)。为了更好地确定哪一效应记忆CD4+T细胞群在上调Hka来源的IL-32中是重要的，我们从健康的人类志愿者获得CD3+T细胞，并且在体外用PMA+洛诺霉素活化后，使用磁珠进一步纯化这些T细胞并且使用流式细胞术进行分选。分离程序被用于纯化CD4+CD45RO+和CD4+CD45RA+T细胞，因为在牛皮癣组织中已经发现这两个群(101、102)。尽管未显示在对照、未活化CD4+RO+和CD4+RA+群的前向散射(forward scatter)中存在明显差异，但是的确显示了更多的CD4+CD45RA+T细胞存在。在T细胞活化后，显示，与活化的CD4+CD45RA+T细胞相比，具有至少两个不同的CD4+CD45RO+T细胞群(图43A)。由于以前已经显示趋化因子CCR4在表皮内T细胞迁移至牛皮癣皮肤中是极其重要的(103、104)，因此，使用磁珠以进一步将这些群分为CD4+CD45RO+CCR4+、CD4+CD45RO+CCR4-、CD4+CD45RA+CCR4+和CD4+CD45RA+CCR4-T细胞群。与CD4+CD45RA+CCR4+T细胞相比，似乎具有更丰富和亮度更高的CD4+CD45RO+CCR4+细胞存在。使用分离的T细胞亚群CD4+CD45RO+CCR4+、CD4+CD45RO+CCR4-、CD4+CD45RA+CCR4+、和CD4+CD45RA+CCR4-，比较了每个单独的群在直接的细胞-细胞接触直至+48小时后刺激Hka产生促炎细胞因子的能力。当与测试的其他T细胞亚群相比时，测量了获自CD4+CD45RO+CCR4+T细胞/Hka共培养物的上清和裂解物的IL-32、TNFα和IL-1β，显示了每种Hka来源的细胞因子的产生都具有统计学意义上的显著增加(P＜0.05)(见，图43)。显示CD4+CD45RO+CCR4+和CD4+CD45RA+CCR4+T细胞对于该过程是重要的，因为CCR4-T细胞在上调Hka-来源的细胞因子不是那么有效(图43B)。这些是显示不同人效应记忆T细胞群能够以细胞-细胞接触的方式诱导Hka来源的IL-32γ的第一数据。
实施例3：通过抑制FKBP52和CD147(EMMPRIN)显著减少人角质形成细胞产生TNFα
使用实施例2中描述的方法，利用对FKBP52和CD147特异的单克隆抗体，进行Hka和人Th22T细胞的细胞-细胞接触生物分析。当单独加入抗FKBP52时，TNFα产生的减少显著地降低了大约60％(图52，组4)。当单独加入抗EMMPRIN时，TNFα产生的减少显著地降低了大约70％(图52，组6)。使用抗EMMPRIN和抗FKBP52的双重抑制导致TNFα产生的几乎全部抑制，所述降低达到几乎95％。这些数据显示FKBP52和CD147的抑制，单独地或组合地，能够显著减少体内角质形成细胞群中的炎症并且显示对有效治疗牛皮癣(或其它炎症状况)患者的潜力。
实施例4：溶液中EMMPRIN胞外区的表征以及所述胞外区与其酶配体亲环蛋白A(CypA)的相互作用。
材料和方法
蛋白质表达、再折叠和纯化。一般而言，在LB肉汤中产生未标记的蛋白质，而在补充有需要的15N氯化铵、13C-葡萄糖和99％NMR研究用D2O的M9基本培养基中产生标记的蛋白质。所有蛋白质在37℃下生长的BL21(DE3)细胞中表达，使用0.1mM β，D-异丙基-β-D硫代半乳糖苷在大约0.6(600nm)的光学密度下诱导蛋白质的表达。如以前所述(49，63)纯化CypA，而如下所述纯化CD147和黏结蛋白聚糖-1的胞外区。除非另外指出，在AKTA FPLC上使用的所有柱和树脂都购自GE Healthcare。
对于CD147，从以前描述的载体24PCR扩增所有的构建物并且使用NdeI和BamHI位点连接入pET15b载体(EMD Biosciences，Inc.，San Diego，CA)。所有引物包含适当的限制性位点，其中6个碱基对突出，用于连接前裂解。在4℃下使所有的CD147蛋白如下再折叠。对应典型的2-L生长，在35ml100mMTris，pH 7.5，0.5MNaCl和1mM乙二胺四乙酸中经由超声裂解细胞，在Sorvall SS-34转子(Sorvall，Asheville，NC)中以12,000g离心，收集不溶性组分。在35ml变性缓冲液(5M胍，100mM Tris，pH 7.5，100mMNaCl和2-巯基乙醇)中对不溶性部分进行超声处理至均一性，再次离心并且透析到再折叠缓冲液中(1M精氨酸，100mM Tris，pH 7.5和100mM NaCl)持续48小时。随后将样品透析到100mM Tris，pH 7.5和300mM NaCl持续至少12小时，并且离心以除去任何沉淀。可溶性再折叠的蛋白质然后被进一步透析至50mM NaPO4，pH 7.5，0.5M NaCl和10mM咪唑中用于纯化——所述纯化经由在相同缓冲液中平衡的Ni琼脂糖进行，并且在补充有0.4M咪唑的相同缓冲液中洗脱。洗脱的蛋白质用凝血酶切割过夜，经由用50mM NaPO4，pH 6.5，150mM NaCl和50mM咪唑平衡的预装S-100大小排阻柱纯化；然后施加至在相同缓冲液中的1-ml苄脒柱以除去残留的凝血酶。
对于黏结蛋白聚糖-1，从商业可得的质粒(Open Biosystems，Huntsville，AL)PCR扩增对应于残基23-251的胞外区并且使用NdeI和BamHI位点连接到pET15b载体(EMD Biosciences，Inc.)。引物包含适当的限制性位点用于在连接之前的切割。尽管从这种构建的载体中没有可测量的这种pET15b-黏结蛋白聚糖-1的表达，随后***链球菌G蛋白(GB1)导致高的蛋白质表达。这通过PCR扩增具有在5′和3′端具有NdeI限制性位点的56个残基的GB1编码区(下面描述的载体)并且随后***单一NdeI消化的pET15b-黏结蛋白聚糖-1质粒来完成。在证实GB1序列被正确***之后，所有进一步的黏结蛋白聚糖-1纯化利用这种pET15b-GB1-黏结蛋白聚糖-1融合，所述融合在释放黏结蛋白聚糖-1残基23-251(具有N-末端Gly-Ser)的凝血酶切割之前和之后全部在可溶性表达的部分中发现。对于典型的2-L培养物，细胞球用35ml 50mMNaPO4，pH7.5，0.5M NaCl和10mM咪唑裂解并且直接施加到在相同缓冲液中的Ni琼脂糖柱。所有随后的纯化步骤与上述CD147蛋白的相同。
肽表达和纯化。用于重组肽产生新的程序被用于产生与CD147残基205-214对应的肽，CD14710mer。除非另外指明，所有柱和树脂都用在购自GE Healthcare的AKTA FPLC上。使用标准PCR扩增，我们构建了具有6×His、凝血酶位点的PCR产物，然后是CD147 205-214序列(HLAALWPFLG)。也包括5′BamHI位点和3′EcoRI位点，用合适的酶消化PCR产物。将这种PCR产物连接入编码GB1(来自Gerhard Wagner，Harvard University的赠品)的pET30b载体产生这样的载体，其编码GB1，接着编码申请人感兴趣的肽。这种GB1-肽融合蛋白在补充有卡那霉素的LB肉汤中在BL21(DE3)细胞中表达。在50mMNaPO4，pH7.5，0.5MNaCl和10mM咪唑中裂解细胞，然后通过用相同缓冲液平衡的Ni琼脂糖柱纯化。用凝血酶在室温下从这种纯化的融合蛋白裂解肽，持续12小时，留下N-末端Gly-Ser接着是CD147残基205-214，然后再次施加至重力流柱(gravity flow column)中的Ni琼脂糖树脂。用三氟乙酸(TFA)将洗脱样品的pH降低至2，然后利用在0.2％TFA/水和0.18％TFA/乙腈溶剂***中平衡的HPLC(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)，将洗脱样品施加至使用反相柱(Agilent，Zorbax SB300，9.6mm×25cm)。最后，包含肽的部分通过分析HPLC(Agilent，Zorbax SB300，4.6mm×15cm)和质谱验证，汇集并且冻干，用于以后使用。
分析型大小排阻层析、凝胶电泳和蛋白质印迹分析。大约1mg标明的CD147纯化蛋白被施加至分析型Superose-12柱(柱体积，～24ml)，所述Superose-12柱在用于大多数NMR实验的相同缓冲液(50mM NaPO4，pH 6.5，150mM NaCl和50mM咪唑)中平衡。用于SDS-PAGE的蛋白质样品包含10μl的0.02mM蛋白质，具有或没有DTT，相同浓度的蛋白质被用于自然的PAGE分析。对于蛋白质印迹分析，在存在和不存在1mM DTT并且随后煮沸5分钟的情况下进行10μl 0.02mM重组CD14722-205的SDS-PAGE凝胶电泳。凝胶被转移至Immobilon PVDF膜并且用1∶1000单克隆人EMMPRIN抗体(R&DSystems，Minneapolis，MN)随后用1∶3000抗鼠辣根过氧化物酶(Cell SignalingTechnology，Danvers，MA)进行印迹。使用ECL化学发光试剂盒(Perkin Elmer，Waltham，MA)以三个不同的曝光时间(10、30和60s)进行蛋白质带检测。
NMR样品制备、波谱学和数据分析。在25℃下，在Varian 600-、720-、800-或900-MHz光谱仪上，在补充有7％D2O的50mM NaPO4，pH 6.5，150mMNaCl和50mM咪唑中收集所有的NMR谱。在咪唑存在时，只有适度的共振位置变化(数据未示出)，而咪唑确实些微微增加每一样品的有效期，因此，咪唑被保持在所有的样品中。用于分配目的的样品包含0.5-1mM蛋白质，而所有用于滴定目的的样品包含0.5mM蛋白质和标明终浓度的滴定剂。使用NMRPipe软件65处理所有的谱并且使用CCPNmr软件66进行分析。除非另外指出，所有脉冲序列从标准Varian Biopack实验室获得。只在指明时使用横向弛缓最佳化光谱(transverse relaxation optimized spectroscopy)(即，基于TROSY的)HSQC实验。
确定了包括CD14722-205和CD14794-205的几种CD147构建物以及包含CD147Pro211、CD14722-214和CD14794-214的CypA靶的构建物的主链指认(backbone assignments)。对于每一构建物，使用包括HNCACB和CBCA(CO)NH的标准多维NMR实验，而-15N-NOESY和3D-15N-TOCSY(全相关谱)在确认每一旋转***中是有用的。使用程序TALOS.43，储存在CCPNmr数据库内的共振指认(resonance assignments)被用于计算二级结构倾向。
对于弛豫实验，标准R1和R2弛豫实验被应用在900MHz处的2.5s的再循环延迟。R1实验的弛豫延迟为0.01、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1s，而R2实验的弛豫延迟为10、30、50、70和90ms。尽管在再循环延迟之前补充脉冲被用于R2测量以具有(account for)潜在的样品加热，但是所有的弛豫使用被排列在单一的实验中以同样具有任何电场的均一性。如Larsson等描述的，使用R2/R1比计算每一酰胺的关联时间和使用在平均数的一个标准偏差内的R2/R1比计算每一结构域的关联时间。使用FAST-Modelfree使用的Modelfree版4.45，计算每一结构域的关联时间。由于使用Modelfree的计算近来已经显示受到局部极小化的限制，68，11至18ns的初始关联时间范围被使用，具有1-ns的增量。尽管大多数计算被会聚于报告的值，但是由于大的x平方值容易排除局部极小化。内部手稿中，使用峰高度，组合的NMRPipe和Gnuplot软件被使用于拟合所有的弛豫速率。
对于ZZ-交换实验，Farrow等人的脉冲方案被使用，其中选择性绝热的CHIRP脉冲用于水峰抑制(water suppression)混合中心。(69)在25℃下，在720MHz处，在具有0.01或0.05mM CypA和都含有0.5mM15N-CD14794-214的两个样品上收集两个数据组，并且如以前所述地进行分析以计算表观顺反交换率(kex)。(36、70、71)。简而言之，获得在0至840ms范围内的这两个数据组的每一个的14个混合时间(τm)，和R1弛豫率被用于拟合这些数据，即，在这些样品上直接收集顺式的R1(R1c)和反式的R1(R1t)。下面的等式(1a)、(1b)、(1c)和(1d)被分别用于同时拟合自动的(auto)反式峰(Itt)、自动的顺式峰(Icc)、反式→顺式交换峰(Itc)和顺式→反式交换峰(Ict)，作为τm的函数。Itt(0)和Icc(0)分别是反式和顺式自动峰的最初强度，a11＝R1t+ktc、a22＝R1c+kct、a21＝-ktc和a12＝-kct。最后，在这些条件下，ktc和kct可以重新作为其游离Keq(Pcis/Ptrans＝0.33/0.67)的函数，并且因此，ktc＝0.33kex和kct＝0.67kex。
Itt(τm)＝Itt(0)(-(λ2-a11)exp(-λ1τm)+(λ1-a11)exp(-λ2τm))/(λ1-λ2)(1a)
Icc(τm)＝Icc(0)(-(λ2-a22)exp(-λ1τm)+(λ1-a22)exp(-λ2τm))/(λ1-λ2)(1b)
Itc(τm)＝Itt(0)(a21exp(-λ1τm)+a21exp(-λ2τm))/(λ1-λ2)(1c)
Ict(τm)＝Icc(0)(a12exp(-λ1τm)+a12exp(-λ2τm))/(λ1-λ2)(1c)
GraphPad Prism版本4.0(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)被用于同时拟合CD147残基207-214内的所有可解析的峰。Ala207和Gly214都不能被使用，这是因为它们各自的反式和顺式共振显示在氮维中很少至没有离差(dispersion)。
重组CD147活性。重组CD14722-205以50、100和200μg/ml的终浓度被加至分化的THP-1细胞8小时，通过夹心ELISA(ElisaTech，Aurora，CO)测量从细胞释放的细胞因子的量。THP-1细胞被培养在RPMI(补充有10％胎牛血清)中并在所有的时间都保存在37℃和5％CO2下。如下实现THP-1细胞的分化：加入100nM佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯至1百万细胞/ml在24孔细胞培养皿中的1ml悬浮细胞持续24小时，通过吸出除去未分化的细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤并且然后更换培养基。然后将细胞与CD147一起温育，通过ELISA测量分泌到培养基中的细胞因子。根据厂商(ElisaTech)的程序进行ELISA。
评价重组CD147的正确再折叠和探测CD147寡聚化
在细菌中胞内表达的CD147构建物最初由于不正确的硫化物形成而是未折叠的，但是其可以在体外进行再折叠以产生毫克量的高度可溶并且具有生物学活性的蛋白质。主要CD147同种型(同种型2，其为CD14722-269)的胞外区包含两个Ig样结构域，本文称为Ig1(残基22-103)和Ig2(残基105-205)，每个包含两个半胱氨酸残基，其在每一结构域内形成单个二硫键。较少发现的CD147同种型的胞外区仅包括Ig2结构域(同种型3，其为CD14794-269)。这些二硫键的存在最近通过纯化自细菌外周胞质表达***的CD147胞外区的X-射线晶体结构所证实，所述细菌外周胞质表达***依赖于这种氧化环境内的自发折叠。(34)然而，在此申请人发现，在胞内细菌表达产生可溶性蛋白(具有和没有残基1-21的信号肽序列，尽管这些残基导致可溶性寡聚物)之后，这些同种型都可以以其全部容易地再折叠。尽管申请人可以通过体外再折叠方法产生许多代表受体的不同区的可溶性CD147构建物，但是，包含残基215-229——其对应于疏水跨膜(TM)区——的CD147构建物形成大的集合体，如通过大小排阻层析所评定的(图45A，CD14722-269)。除去包含膜近端和TM区的残基205-229则完全消除了集合(图45A，CD14722-269ΔTM)。发现包含胞外Ig样结构域的再折叠CD147构建物全部在大小排阻层析上作为单一的单体种类洗脱，因此下面通过SDS-PAGE变性凝胶和天然凝胶分析进行进一步的分析。
代表单独的Ig样结构域、CD14722-103(Ig1)和CD14794-205(Ig2)以及两个结构域CD14722-205(Ig1和Ig2)的三种CD147构建物被用于探测CD147的正确二硫化物形成和寡聚物特征。通过申请人的再折叠程序，每一胞外CD147结构域内的单个二硫键都正确形成，如通过SDS-PAGE变性凝胶所证实的，在所述SDS-PAGE变性凝胶中，二硫苏糖醇(DTT)的存在还原每个二硫键并且导致所有构建物更慢的迁移种类(图45B)。而且，所有胞外CD147构建物作为单一的种类在自然凝胶上迁移(图45C)，并且与前述的大小排阻数据合起来，暗示正确的二硫化物形成，每个Ig样结构域既不自缔合也不与其它的Ig样结构域相互作用。
以重组CD147A生物学活性显示正确折叠的最终确认。具体而言，再折叠的重组CD14722-205在细胞培养中刺激两种充分表征的促炎细胞因子，TNFo和IL1β的释放(图51)，提供了CD147的糖基化对于细胞因子刺激不是必需的第一个证据，如最近MMP刺激所显示的。
考虑到几个最近的报道，其利用申请人在此已经表征的完全相同的构建物之一，即，CD14722-205，已经鉴定了痕量的CD147二聚作用，阐释为什么申请人没有观察到这种现象是重要的。14、34这些观察到的差异的最可能的解释是分子间二硫键形成。具体地，以前的重组CD14722-205纯化方案依赖于在大肠杆菌外周胞质的氧化环境中的自发再折叠，这可能导致小群的不正确折叠蛋白质，其易于形成分子间二硫化物。相反地，申请人的体外再折叠程序可能是简单的更有效，因为申请人没有在SDS-PAGE上或自然凝胶分析中观察到这种二聚体。但是，这种交联的二聚体仍然可以在使用蛋白质印迹分析的蛋白质制备内观察到，显示即使申请人的纯化程序也引起痕量的这种交联二聚体，虽然目前相对于单体种类浓度较低。虽然申请人怀疑这些二聚体仅仅是纯化的副产品而不是生物学相关的蛋白质，但是完全排除CD147嗜同性相互作用的二硫键改组(二硫键重排，disulfide shuffling)的潜在作用会是幼稚的
Figure GSB00000734841600401
然而，依赖于二硫键改组的受体相互作用需要其它的蛋白质相互作用如蛋白质二硫键异构酶(41)，对于CD147，没有确定这种相互作用。无论这种假定的相互作用如何，申请人的数据显示，完整的完全折叠的CD147的单体胞外结构域的胞外区在不存在另外的介体时没有自缔合。
CD147Ig样结构域的NMR溶液研究
尽管CD147的胞外结构域在用于自然凝胶的浓度(即，低的微摩尔级浓度)下既不自缔合也不彼此相互作用，但是涉及细胞附着的受体如CD147，有时显示弱的亲和力。由于几个报道已经显示，CD147充当类似于其它细胞黏着受体的自身受体，(42)这样的亲和力可能潜在地在上面进行的自然凝胶分析的检测极限之下。相反地，NMR溶液实验可以被用作多个时标上这种蛋白质/蛋白质相互作用特别灵敏的标记物，并且因此适于探测多种亲和力的相互作用。例如，NMR滴定实验提供监测显示按使用的浓度级别(微摩尔级到毫摩尔级浓度)的亲和力的相互作用的明显手段。此外，NMR弛豫实验提供每种残基的动力学详细资料，并且因此，如果CD147的单个Ig样结构域自缔合，那么这可以以原子分辨力(atomic resolution)检测。为此，申请人已经完成了两种最常见CD147同种型CD14722-205(同种型2，包括Ig1和Ig2)和CD14794-205(同种型3，包括Ig2)的胞外区的主链共振指认，从而以原子分辨力表征CD147溶液特性和其他潜在的相互作用(补充材料，表S1和S2以及BMRB登陆号16322和7433)。
CD14722-205的上述X-射线晶体结构与NMR溶液研究的对比显示，在晶体结构和溶液结构之间既有相似性也有差异。就溶液中的单体结构而言，使用程序TALOS，从共振指认计算CD14722-205的二级结构倾向(43)，其在很大程度上与在晶体中发现的相一致。换言之，溶液中的单体结构高度类似于晶体中的结构。唯一的主要差异是对应于残基151-159的共振，其包括晶体中的短的α-螺旋和β-折叠“D”的部分，在溶液中没有观察到。(34)这显示在中间NMR时标上，至少部分的残基151-159经历化学交换(即，在两种不同的化学环境之间的构象互变)，和因此，具有交换速率的样品多个构象，其类似于取样状态之间的化学位移差异(即，中间交换)。
NMR谱、NMR弛豫实验和NMR滴定实验全部显示，在晶体中观察到的分子间接触没有保持在溶液中。在2D15N编辑的异核单量子相干(HSQC)谱的情况下，CD147同种型的胞外区产生高质量的谱并被示于此(图9)。尽管高的离差(dispersion)指示特征性适当折叠的蛋白质，在溶液中观察到的相对窄的线宽已经提供晶体中四个建议的亚纳摩尔级相互作用没有在溶液中持续(图9A和9B，顶部右侧)的证据。此处测量的R1(纵向)和R2(横向)弛豫速率定义了每种酰胺的关联时间并且显示CD147残基22-101(即，Ig1)和残基105-205(即，Ig2)是CD14722-205(图9A和9B，底部)内独立旋转的结构域。使用由Larsson等人描述的等式，从一个标准偏差内具有R2/R1比的所有残基计算每个结构域的关联时间(44)，并且差异在原始数据中是非常明显的。例如，对于残基22-101，平均R2速率为大约22Hz，而对于残基105-205，平均R2速率为35Hz，表明这些结构域显示在溶液中具有显著不同的下跌时间(tumbling times)。尽管这些不同的R2/R1比与在X-射线晶体结构内发现的两个独立折叠的Ig样结构域一致，(34)但是这些结构域与不同的关联时间一起下跌的事实提供这样的证据，其中在晶体中观察到的结构域内相互作用没有在溶液中保持。换言之，如果CD147Ig1和Ig2结构域在溶液中自缔合，预期它们显示相同的关联时间。为了排除各向异性旋转的可能性，也使用各向异性模型和各向异性模型，利用用于每一结构域的FAST Modelfree(Facile Analysisand Statistical Testing for Modelfree)分析，计算各个结构域的每一个的关联时间。对于各向异性模型，使用了X-射线晶体结构内各个结构域中的每一个。对于Ig1和Ig2，使用等方性模型计算的关联时间分别是11.8和14.1ns，而对于各向异性模型，发现Ig1的关联时间稍微增加至12.6ns，而Ig2的关联时间与等方性模型的相同。因而，无论旋转的各向异性如何，这些弛豫实验的主要发现是两个CD147样结构域在溶液中的下跌时间具有至少1.5ns的不同。与这些发现一致，在用化学计量量的CD14722-103滴定15N CD14794-205后，没有观察到化学位移变化，由此证明这两个结构域没有作为单独的实体相互作用，即使是微弱的(即，Kd～1.0mM)。而且，对于CD14722-205，没有观察到浓度依赖的化学位移变化，如果具有更弱的自缔合(即，KdN1 mM)，预期化学位移变化将会发生。最后，每个结构域的R2/R1来源的关联时间和观察到的线宽完全与单体蛋白质一致。因而，NMR溶液数据与前述也显示不存在另一介体时CD147嗜同性相互作用不通过胞外区发生的自然凝胶一致。
NMR研究也提供了对包含CD147同种型3(即，CD14794-269)的胞外区的N-末端部分的残基94-101的重要理解。即，基于共振的二级结构倾向和弛豫速率显示残基94-101只在Ig1的情况下形成β折叠，但在这种仅包含Ig2的较短CD147同种型3的情况下是无序的(图9B)。使用申请人的这种CD147构建物的共振指认，通过TALOS没有预测到二级结构倾向，并且对应的低R2速率和高R1速率与无序的残基一致(图9B，底部)。
CD147的CypA靴位点的鉴定和和初步表征
CD147内的区存在于由中心脯氨酸残基控制的内在顺式/反式平衡中，CypA增加这种互换的速率，并且在复合物形成后可能改变顺式∶反式比。而且，这种预先存在的平衡可能是亲环蛋白生物学底物的普遍现象，因为对于其他的CypA蛋白底物，也观察到异乎寻常高的顺式含量。(19、36、37)几个以前的研究暗示CypA能靶向CD147Pro180(24)和Pro211，(46)而亲环蛋白与CD147结合仅在肽的情况下被研究。(46、47)因此，申请人现在提供了第一个直接证据显示，在完全折叠的蛋白质的情况下，CypA唯一地靶向CD147Pro211，而不是Pro180。而且，CypA只催化这个单一的Pro211位点的肽基-脯氨酰异构化。申请人CD147共振指认的测定允许在溶液中表征具有其酶配体CypA的这种受体，所述酶配体自身先前已经在溶液中在游离的(48)和在数种底物的情况下(36、49)被指认。
使用具有未标记CD147的15N-CypA，首先进行NMR滴定实验，对于包括CD147残基206-214的膜近端区的胞外重组CD147构建物，仅观察到化学位移变化。使用CD14794-205或CD14722-205，没有检测到CypA和CD147的Ig样结构域之间的相互作用(数据未示出)，而对于包含残基206-214、CD14794-214和CD14722-214的两个构建物，观察到相同的化学位移变化(图46A)。预测这些CD147残基位于胞外TM区的表面，而这些残基中的一些可能甚至位于膜本身内部。然而，已知两种CD147的胞外亲环蛋白配体，CypA和CypB，容易地横穿膜。(20)在将这些包括残基206-214的后面的CD147滴定至15NCypA后，发现CypA酰胺残基(图46A)和Trp121单一CypA吲哚(图46B)都显示化学位移变化，其全部位于CypA活性位点(图46C，左侧)。因此，CypA通过其活性位点特异性地结合CD147的残基206-214，并且在该区内只有一个潜在的靶残基，Pro211(图46C，右侧)。而且，在这种滴定期间，仅观察到一组CypA共振，指示在游离和结合状态之间的互变在NMR化学位移时标上是快速的并且这两种蛋白质的亲和力相对地弱。同样，支持CypA/CD147复合物的这种弱的亲和力，测量的化学位移变化在使用的滴定范围内是线性的，指示申请人不能全部地使所有CypA结合位点饱和(超过1-2mM，CD147构建物不稳定)。因此，申请人的数据意味着CypA/CD147的结合亲和力弱于所使用的最高CD147浓度(即，KdN1mM，由于1mM是最后的滴定点)并且与亲环蛋白对于其大多数底物所具有的相对弱的亲和力一致。50这种弱的亲和力也说明以前的蛋白质相互作用实验(pull-down experiments)的失败。24因此，CypA特异地靶向CD147的残基207-214但是具有相对弱的亲和力。
尽管CypA对CD147残基206-214的弱亲和力不允许精确测定其结合亲和力必需的饱和浓度，但是申请人使用代表该感兴趣区的肽作为替代方法。具体而言，申请人使用本文称为CD14710mer(205-HLAALWPFLG-214的序列)(SEQID NO：1)的肽——其对应于CD147上的CypA靶位点，估计了CypA对CD147残基206-214的亲和力。基于R1和R2测量，保证代表性肽对于该CD147靶位点的使用，这是由于这种膜近端区在快速时标上是高度柔性的。按照已暗示CypA/CD147相互作用具有相对弱的亲和力的先前研究，由15N-CypA和CD14710mer之间的结合等温线计算Kd为4.2±0.2mM(图47A)。使用这种肽更多的残基显示化学位移变化，这归因于申请人滴定至饱和条件的能力(图47B)，并且如所预期的，这些干扰(perturbations)仍然被限制于活性位点，证实了CypA对于这种肽的专一性(图47C)。
在撤销标记方案以监测CypA诱导的15N-CD14722-214的变化之后，发现了对应于Pro211的内在顺式/反射构象互变的残基207-214的两组共振(图48A-B，黑色谱)。对于目前研究的两种CypA底物，HIV-1衣壳(HIV-1CA)36，37和Itk.(19)，已经观察到类似的预先存在的构象平衡。在CD147中，在CD14722-214和CD14794-214的情况下探测的这种脯氨酸到丙氨酸的突变，即，CD147P211A导致仅有一组共振，证实脯氨酸异构化是这种内在构象异质性的根本原因。CD147P211A内的许多共振也与对应于在野生型受体中观察到的主要构象的那些共振重叠，同时证实反式构象子在野生型受体中占优势并且使得申请人指认顺式共振。由野生型CD147的相对峰强度，计算33％∶67％的顺式∶反式比(即，在顺式构象中具有33％的CD147Pro211分子)，其为HIV-1CA36的顺式含量的大约两倍，并且与Itk非常相似。(51)因而，现在于分子水平研究的所有三种CypA蛋白底物，即，HIV-1CA、Itk和CD147显示具有异乎寻常高的顺式含量的靶脯氨酸的这种内在构象平衡。而且，可能的是，酶介导的催化改变了这些平衡(在复合物形成后)，如下所述。
CypA介导的CD147催化的证据最初由游离15N-CD14794-214与用化学计量浓度的未标记CypA滴定的15N-CD14794-214的谱比较提供(图48A-B)。观察到游离15N-CD147残基207-214具有两种不同组的共振的事实意味着肽基-脯氨酰异构化的内在速率在NMR时标上是缓慢的(b0.1s-1)。相反地，在加入化学计量浓度的CypA后，15N-CD147残基207-214内的酰胺共振会聚或是非常严重的线变宽以至于它们消失了(分别是图47A和B)。这暗示，在CypA的存在下，CD147在快速和中间NMR时标上经历构象互变。换言之，在CypA的存在下，CD147Pro211内在互换较高，并且因此，Pro211的肽基-脯氨酰互换的构象互变被CypA介导的催化增强。会聚的那些残基经历“快速互变”而消失的那些残基经历“中间互变”。然而，这种互变不是简单地与结合的化学位移差异有关，这是因为由于复合物的弱亲和力，其也包括与游离状态的互变。最后，上面也观察到，随着未标记CD147构建物的加入，活性位点15N-CypA酰胺共振的线加宽，而这些并不完全消失，这是由于其是可能与CD147底物直接接触的CypA侧链。
在观察到的CD147共振在CypA的存在下线变宽之外，两个额外的NMR实验提供了CypA介导的CD147肽基-脯氨酰异构化的速率增加的直接实验证据。对于“ZZ-交换”实验(图48C)和标准3D-核欧佛豪瑟效应频谱(NOESY)实验，在催化量的酶的存在下，观察到对应的15N-CD147顺式和反射共振之间的交换峰的出现(图48D)。如果催化的表观速率允许磁化在两个样品状态(即，顺式和反式)之间转移——在实验的时间框内(即，混合时间)发生，则出现这样的交换峰，并且该交换峰仅在CypA的存在下观察到。因此，这些实验内交换峰的出现指示CypA增加Pro211的内在缓慢的交换并且再次提供CD147是其CypA酶配体的底物的证据。
CypA介导的CD147的催化的表征
ZZ-交换被用于确定CD147Pro211的CypA介导的肽基-脯氨酰异构化的表观催化交换速率，提供活性CypA/CD147复合物的定量分析(图49)。具体而言，除了0.01mM(图49A)和0.05mM(图49B)的CypA两种亚化学计量浓度(即，催化浓度)的酶之外，使用相同浓度的0.5mM 15N-CD14794-214，收集(collect)两个ZZ-交换实验。在每一条件下，测定表观交换速率((kex)，其为表观顺式→反式(即，kct)和反式→顺式(即，ktc)催化速率的和，以定量CypA介导的催化的速率增加(表1)。
Table 1.从ZZ-交换测定的CD147残基207-214的CypA介导的互换的表观催化互变速率
  [CypA]   kex(s-1)   使用的拟合(fit)
  0.01mM   9.6±3.5   24
  0.05mM   44.3±8.1   20
显示了邻近催化的CD147 Pro211的CD147 Trp210Nε1的所有四个峰(即，两个自动峰和两个交换峰)的原始数据和拟合。通过最大交叉峰强度分开大约5倍出现和对应于酶浓度中的5倍差异的事实，来确认样品制备物(示于中心的图49A和49B光谱)。例如，申请人观察到，对于0.01mM CypA样品和0.05mM CypA样品，分别在～240ms和～48ms处CD147交换峰的最大交叉峰强度。这些数据以及CD147残基207-214的CypA靶位点内的所有非重叠酰胺被用于计算在每一CypA浓度处的表观催化速率常数，如表1所示。使用源自上述申请人的模型肽底物的CypA/CD147复合物的Kd定量估计，对于0.01和0.05mM CypA，将存在相对于游离15NCD14794-214的0.2％和1.1％复合物(见，补充材料，部分2)。因此，将这些表观交换速率(表1)外推至完全结合的复合物，产生在25℃下大约4000-4800s-1的CD147的CypA介导的互换。尽管这仅仅是CypA介导的互变速率的大致近似值，清楚的是，相对于小于0.1s-1的肽基-脯氨酰异构化的未催化顺式/反式互变速率，CypA提供显著的速率增加。(52)然而，这种速率增加小于在相同温度下测量的申请人以前的模型肽底物的研究中的增加。49这种较低的催化速率的可能解释是CD147具有在催化的CD147Pro211(即，CD147Trp210-Pro211)之前的大的Trp残基，其可能使相对于模型肽底物的互换速率减慢。实际上，近二十年前进行的在催化的Pro之前用各种氨基酸取代的研究中，研究者发现Trp-Pro序列显示人CypA.53具有最慢的kct速率。结论是，CypA催化的作用是增加未催化的互换速率至少几个数量级。
CD147胞外区未自缔合
申请人使用多种溶液技术直接表征两种主要的CD147同种型，同种型2(CD14722-269)和同种型3(CD14794-269)的胞外区，并且已经显示不存在介体时都没有自缔合。对于与这些胞外区对应的所有CD147构建体，只检测到单一的单体种类，如由凝胶过滤分析、自然凝胶分析和多NMR溶液研究所确认的。关于单体种类，基于申请人的NMR共振指认的二级结构预测很大程度上与同种型2，CD14722-205的胞外区的X-射线晶体结构一致，由此证实单体的溶液结构类似于晶体内的结构。唯一值得注意的不同是对应于CD147残基151-159的共振在溶液中没有观察到，因而，该区可能经历中间时标内的构象互变(相对于取样构象之间的化学位移差异)。有趣的是，这种相同的区包含三个潜在N-连接的糖基化位点之一(Asn152)并且暗示固有的柔性对于功能可能是重要的。然而，有可能在Ig样结构域之间没有接触并且相对于彼此没有优选的定向，如在最近解析的CD14722-205X-射线晶体结构内观察到的。(34)从本文进行的几个实验得出这样的结论，其指示Ig样结构域自身不相互作用。具体而言，自然凝胶分析显示在结合组合时，CD147 Ig1和Ig2结构域都展示相同的迁移模式，如同它们单独时一样。而且，在较大的CD147同种型2的情况下，NMR弛豫实验显示这些结构域在溶液中展示非常不同的关联时间并且因此最可能独立地下跌。在标记一个结构域和滴定其它结构域之后，在15N-HSQC实验内没有观察到化学位移，证实Ig样结构域不作为单独的实体相互作用。因而，申请人的数据提供了围绕这两种Ig样结构域(即，分别包括序列Gly-Pro-Pro的CD147残基103-105)之间的短连接区自由旋转的直接证据。最后，申请人首次表征了第二种最丰富的CD147同种型，同种型3(即，CD14794-269)的胞外区的溶液特性。在此，申请人发现，与较大CD147同种型2内在Ig1结构域的情况下β-折叠的形成相比，同种型3的N-末端残基94-104是无序的(disordered)。
尽管几个最近报道的结论已经暗示重组CD147的部分在溶液中自缔合，(14，34)但是没有这种相互作用在体内没有被另一分子(即，共同受体或小分子)介导的情况下发生的直接证据。CD147寡聚化可能是复杂的过程，其包括通过其它分子如共同受体介导来引起信号转导(图50A)。
由CypA-介导的催化的胞内信号转导
尽管胞外亲环蛋白通过其CD147受体刺激数个胞内信号转导事件，但是内在机理仍然不清楚。已经显示亲环蛋白和CD147之间的直接相互作用通过酵母双杂交分析(24)和通过使用阻断这些亲环蛋白/CD147相互作用的特异抗体发生。(23)此处，申请人已经开始允许直接监测催化期间水性缓冲液中CypA/CD147相互作用的研究。由于亲环蛋白介导的反应的可逆性质(reversiblenature)使得这样的研究成为可能，并且充当理解细胞外面上肽基脯氨酰异构化和胞内信号转导之间的连接的重要的第一步。尽管已经显示CypA和CypB作为CD147的胞外配体起作用，但是CypA是更丰富的蛋白并且因此已经是此处研究的焦点。而且，尽管NMR是能够揭示分子相互作用的原子分辨力详细资料的有力技术，其在探测具有中等至弱的亲和力的亲环蛋白相互作用中特别有用。(50)许多弱的但是生物学上重要的相互作用在自然中发生，其包括展示微摩尔级亲和力的黏着蛋白(59)和展示毫摩尔级亲和力的醇。(60)因此，NMR检测弱相互作用的高度灵敏度是使用NMR方法以原子分辨力在溶液中研究CypA/CD147相互作用的最初推动力。
使用NMR溶液研究，显示CypA结合并催化CD147Pro211，预测位于细胞外面并临近受体的TM区的位点。CD147残基207-214的这种膜近侧区已经以由33％的非寻常高顺式含量表征的顺式∶反式平衡以其游离形式存在(图50B，左侧)。然而，这种未催化的顺/反异构化非常低，如由对于CD147的该区内所有残基的取样的顺式和反式共振的观察结果所证明的。在加入化学计量浓度的CypA后，在活性CypA/CD147复合物上收集的15N-HSQC谱显示出几个顺式和反式共振的消失(collapse)并且对于其它具有严重的线增宽，暗示构象互变事件发生在活性CypA/CD147复合物内(即，催化)。催化的进一步证据来自在亚化学计量条件下收集的几个NMR实验，其明确地证实CypA催化CD147Pro211。即，在ZZ-交换和3D-NOESY实验中交换峰的出现证明CypA-诱导的CD147残基207-214的固有缓慢顺/反平衡的速率增加，因此，提供了CypA-介导的其CD147受体的催化的直接证据。ZZ-交换数据的定量分析显示催化可以仅比以前研究的非天然底物稍慢，发现反映了大的CD147Trp210残基先于靶向的Pro211。
此处显示的CD147是其CypA酶配体的底物的确认和几个以前的报道暗示CypA-介导的通过CD147受体的根本机理(图50B，右侧)。具体而言，这种相互作用可能包括负责调节下游信号转导的“构象转换”，由此游离CD147Pro211的相对顺式∶反式比通过其CypA相互作用增加。结晶学和NMR研究都支持这样的模型。
参考文献：
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Claims (21)

1.抑制促炎细胞因子产生的方法，所述方法包括施用有效量的抑制CD147的活性和/或表达的组合物。
2.权利要求1所述的方法，进一步包括同时抑制CD147和FKBP52的活性和/或表达的组合物。
3.权利要求1所述的方法，进一步包括同时抑制CD147和CypA的活性和/或表达的组合物。
4.权利要求2所述的方法，其中所述组合物包括使CD147和FKBP52表达沉默的两种或更多种siRNA分子。
5.权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括抑制CD147活性的抗体。
6.权利要求2所述的方法，其中所述组合物包括抑制CD147和FKBP52活性的两种或更多种抗体或其功能片段。
7.权利要求2所述的方法，其中所述组合物包括抑制CD147和FKBP52活性的双特异性抗体。
8.权利要求2所述的方法，其中所述组合物包括抑制CD147和FKBP52活性或表达的两种或更多种小分子。
9.选择性抑制对象中的适应性免疫反应而不明显影响先天免疫反应的方法，所述方法包括抑制所述对象中CD147和FKBP52蛋白的活性和/或表达。
10.权利要求9所述的方法，其中抑制适应性免疫反应包括施用包含使CD147和FKBP52表达沉默的组合物。
11.权利要求9所述的方法，其中抑制适应性免疫反应包括施用包含阻断CD147和FKBP52活性的两种或更多种抗体或其片段的组合物。
12.权利要求9所述的方法，其中抑制适应性免疫反应包括施用包含阻断CD147和FKBP52活性的双特异性抗体的组合物。
13.权利要求2所述的方法，其中抑制适应性免疫反应包括施用包含抑制CD147和FKBP52的活性和/或表达的两种或更多种小分子的组合物。
14.治疗慢性炎性疾病的方法，所述方法包括将治疗上有效量的药物组合物施用给对象，所述药物组合物抑制所述对象中FKBP52和CD147的活性和/或表达，所述药物组合物包括：
i.CD147抑制剂；
ii.FKBP52抑制剂；和
iii.药学上可接受的载体。
15.权利要求11所述的方法，其中所述慢性炎性疾病是牛皮癣或自身免疫病。
16.权利要求12所述的方法，其中所述疾病是牛皮癣。
17.权利要求11所述的方法，其中所述CD147和FKBP52抑制剂包括两种或更多种siRNA分子以使CD147和FKBP52表达沉默。
18.权利要求11所述的方法，其中所述CD147和FKBP52抑制剂包括阻断EMMPRIN和FKBP52活性的两种或更多种抗体或其功能片段。
19.权利要求11所述的方法，其中所述CD147和FKBP52抑制剂包括阻断FKBP52和CD147活性的双特异性抗体。
20.权利要求11所述的方法，其中所述CD147和FKBP52抑制剂包括阻断CD147和FKBP52活性或表达的两种或更多种小分子。
21.抑制促炎细胞因子产生的方法，所述方法包括施用有效量的抑制FKBP52的活性和/或表达的组合物。
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