CN102552323B

CN102552323B - 加速皮肤修复与再生的药物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102552323B
Application number: CN2012100136318A
Authority: CN
Inventors: 彭丽华; 高建青
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-01-17
Also published as: CN102552323A

Abstract

本发明公开了一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物，由表皮干细胞、骨髓间充质干细胞和药物载体组成，表皮干细胞和骨髓间充质干细胞均粘附在药物载体上，每立方毫米的药物载体上含有表皮干细胞的个数为(0.3～1)×10⁴个，含有骨髓间充质干细胞的个数为(0.3～1)×10⁴个。本发明药物应用在促进表皮层再生、促进真皮层再生、增强再生皮肤力学强度、促进再生皮肤胶原蛋白的含量、促进血管再生和促进毛囊再生等方面都有显著的作用，使得受伤创面能在较短的时间内修复，并能加速皮肤附属器官的再生。本发明还公开了一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的制备方法，其制备简单、可控性好、可操作性强、重现性好。

Description

加速皮肤修复与再生的药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物，特别涉及表皮干细胞、骨髓间充质干细胞及载体组成的药物。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，覆盖全身，它能使体内各种组织和器官免受物理性损伤、机械性损伤、化学性损伤和生物性损伤的侵袭。皮肤的再生主要包括：1)各种皮肤细胞的再生；2)皮肤细胞外基质，包括各种胶原蛋白等成分的再生与重塑；3)皮肤附属器官的再生与功能恢复。随着人类对皮肤再生机理的不断深入了解，促进皮肤再生已经成为皮肤修复与美容中重要导向，打破了传统的“受伤创面和手术切口愈合后必然产生疤痕”的陈旧观念，取而代之的是“陈旧性疤痕可以重新再生新的肌肤，并且没有皮肤色素差和痕迹”的事实。因此，寻找和开发能够促进皮肤再生、减少疤痕的药物及其制剂，实现对皮肤的非创伤性修复，对皮肤的再生与美容具有重要的应用价值，是医学界和美容界共同关注的话题。

在正常情况下，表皮角质层细胞不断脱落，由基底细胞增殖补充，这是生理性再生。皮肤受到损伤后修复愈合，则称为补偿性再生，其再生过程和修复时间，取决于受伤的面积和深度，当皮肤损伤面积较小时，数天即能愈合，且不留瘢痕；当皮肤缺损较大较深时，由于皮肤对损伤过度的应激反应，会导致细胞的过度增生与细胞外基质的过度分泌，从而导致疤痕的形成。与皮肤创伤以后正常的愈合方式相比，皮肤再生过程中疤痕形成的特征显著减弱，胶原蛋白等细胞外基质过度分泌的现象明显减弱。为了实现皮肤的再生，减少疤痕的形成，核心的环节之一在于直接启动皮肤的再生潜能，在愈合初期迅速实现表皮组织的再上皮化，同时抑制纤维蛋白和胶原对新的受伤创面和手术切口的合成沉积，避免疤痕的产生及其后遗症。

干细胞研究是近年来整个生命科学领域的研究热点。由于干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞，在特定条件下，还可以增殖并定向分化成不同的功能细胞。因此干细胞的研究对生命体各个组织器官的更新及损伤修复起着非常重要的作用，成为许多无法治愈的疾病，特别是细胞及组织缺失或损伤性疾病的希望。由于干细胞药物研究已在体外和动物实验中取得了部分研究结果，加之细胞移植已开始了临床治疗的应用探索。越来越多的基础研究人员和药物研究人员认为用干细胞药物来治疗由于细胞缺失或损伤而引起的疾病具有巨大的潜能和诱人的前景。尽管到目前为止，干细胞药物还只是一类概念药，还没有一个真正传统意义上的干细胞药物被研制出来并投向市场，但随着干细胞生物学及临床应用研究的深入，干细胞药物的概念也逐渐深入人心。“干细胞药物”是指可以通过调节生物体内干细胞的增殖与分化，来防治由于细胞缺失或损伤而引起疾病的一类治疗和预防药物。目前，已有多种干细胞被用于各种组织创伤的修复治疗。相信在不久的将来，干细胞药物将会像基因药物一样，成为基础研究和临床防治的重要组成。干细胞药物的研发将成为创新药物研发的新热点，并最终会作为一类治疗及预防药物，服务于患者，造福于人类。

近年来，不少研究已初步证明骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有特殊的多向分化潜能，可转化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、皮肤等多种组织细胞。具有能够修复损伤的功能组织及免疫调节等功能特点，具有广阔的治疗前景。Krause等(Krause DS et al.2001.Multi-organ，multi-lineageengraftment by a single bone marrow-derived stem cell.Cell 105：369-377)通过实验发现，BMSCs在体内还可以分化成表皮细胞，并可以长期存在。Satoh等(Satoh H.et al.2004.Transplanted mesenchymal stem cells are effective forskin regeneration in acute cutaneous wounds.Cell Transplant.13(4)：405-12)研究表明创面经骨髓间充质干细胞治疗后创面肉芽组织丰富、功能旺盛、血管密度大、分层明显。BMSCs不但有修复组织的细胞分化潜能，也具有旁分泌细胞因子诱导血管新生的潜能。多种实验证明BMSCs可以通过多种途径改善组织供血状况，如分泌促血管生成因子及具有向血管内皮细胞分化的潜能是其促血管再生的重要机制。

另一方面，皮肤损伤的修复不仅包括骨髓间充质干细胞的参与，更依赖于皮肤干细胞的增殖、分化与融合。其中，表皮干细胞数量可观，并被证明是多种皮肤细胞的祖细胞，是维持正常皮肤生理功能和调控创伤皮肤再生的重要元素。与骨髓间充质干细胞相比，表皮干细胞理论上更加具有向皮肤及其附属器官分化的趋向性。因此，表皮干细胞对创伤皮肤及其附属器官的再生无疑具有重要的研究意义，而将表皮干细胞定向输送至局部是其发挥治疗作用的关键步骤。表皮干细胞具有很强的可塑性，保留有类似胚胎细胞的多能性，是潜在的多能干细胞。可以利用表皮干细胞构建出具有完整的表皮、真皮和皮肤附属器、功能健全的人工皮肤，以满足对烧伤、创伤等大面积皮肤缺损治疗的需要噬引。近年来，随着对表皮干细胞分离纯化和培养技术的不断完善，以达到自由构建表皮层的目的。通过实现精确诱导表皮干细胞的分化，从而实现毛囊及汗腺等皮肤附属器官的构建，成为了促进皮肤创伤再生治疗领域的研究热点。

目前，被报道能直接促进皮肤及其附属器官再生的产品还很少，因此，亟需一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物来满足市场的需求。

发明内容

本发明提供了一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物，在药物载体上复合应用表皮干细胞与骨髓间充质干细胞，应用于动物皮肤全层缺损模型，从而使制备的药物能够加速皮肤损伤快速修复与促进多种皮肤附属器官快速再生。

一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物，由表皮干细胞、骨髓间充质干细胞和药物载体组成，其中，表皮干细胞和骨髓间充质干细胞均粘附在药物载体上，每立方毫米的药物载体上含有表皮干细胞的个数为(0.3～1)×10⁴个，每立方毫米的药物载体上含有骨髓间充质干细胞的个数为(0.3～1)×10⁴个。

本发明中所用表皮干细胞与骨髓间充质干细胞均为自制细胞，其中，表皮干细胞的纯度大于80％，骨髓间充质干细胞的纯度大于90％，通过***的动物药效学试验，发现和证明了表皮干细胞与骨髓间充质干细胞的复合应用能够有效促进创伤皮肤的修复以及皮肤附属器官如毛囊、血管等的再生。

为了取得更好的发明效果，以下作为本发明的优选：

每立方毫米的药物载体上含有表皮干细胞的个数为(0.6～0.75)×10⁴个，每立方毫米的药物载体上含有骨髓间充质干细胞的个数为(0.6～0.75)×10⁴个。从实验结果来看，该优选条件下的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物在促进表皮层再生和促进真皮层再生、增强再生皮肤力学强度、促进血管再生以及促进毛囊再生都有非常好的药效。

所述的表皮干细胞由以下制备方法制备：将通过预处理后得到的分离表皮加入到含胰蛋白酶重量百分含量为0.03％～0.08％的胰酶细胞消化液中消化分离表皮3分钟～8分钟，分离后得到表皮干细胞。更进一步优选，所述的表皮干细胞由以下制备方法制备：将通过预处理后得到的分离表皮加入到含胰蛋白酶重量百分含量为0.05％的胰酶细胞消化液中消化分离表皮5分钟，分离后得到表皮干细胞。

在表皮干细胞的体外培养过程中，如何获得较纯的表皮干细胞，以及如何维持表皮干细胞表型和体外的增殖特性，是目前研究急需解决的问题。在表皮干细胞制备过程中所使用的胰蛋白酶胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)浓度和消化时间对于表皮干细胞的生物特性(如增殖能力)有着重要的影响。一方面，高浓度的Trypsin-EDTA有利于将表皮干细胞从表皮基底层提取分离，另一方面，Trypsin-EDTA浓度过高，与细胞接触时间过长将抑制细胞的生物活性，如抑制其增殖特性。在本发明优选的条件下得到的表皮干细胞，具有更好的增殖能力，并且经流式分子鉴定，细胞纯度达80％以上(分子标志物累积表达＞70％)。

所述的药物载体为明胶海绵/β-磷酸三钙(β-TCP)支架；所述的明胶海绵/β-磷酸三钙支架中明胶海绵与β-磷酸三钙的质量比为1∶1～100。制备方法参见文献(Yoshitake Takahashi et al.2005.Osteogenic differentiation ofmesenchymal stem cells in biodegradable sponges composed of gelatin andb-tricalcium phosphate.Biomaterials 26.3587-3596)。

经试验证明，所使用的明胶海绵/β-磷酸三钙比市售的两种常用细胞支架即胶原蛋白海绵支架和聚对苯二甲酸己二酯(PET)支架相比，明胶海绵/β-磷酸三钙对表皮干细胞的粘附作用，有利于表皮干细胞体外的生长繁殖。市售的胶原蛋白海绵支架往往由于硬度较差，支架的孔隙容易塌陷，影响了营养物质和氧气等的供应，且不能满足皮肤创面局部应用所需要的机械强度。而PET支架又因为硬度过大、缺乏柔韧性，在皮肤创面的应用中亦难产生较理想的治疗效果。明胶(等电点为9)是一种从猪皮的胶原质中提纯获得的胶原蛋白，可完全降解，生物安全性高，且成本低廉，已被广泛地用于医药用途。另一方面，生物可降解陶瓷材料，如beta(β)-三磷酸钙(beta(β)-TCP)也被逐渐开发为细胞支架材料，但这些陶瓷材料单独使用时具有降解程度低、柔韧性差等缺点。因此，将明胶等生物可降解材料与生物陶瓷材料联合应用，有利于优化细胞支架的硬度、柔韧性，维持细胞支架的多孔结构，保证支架载体中细胞的营养和氧气等供应，促进细胞体外的增殖和维持其生物特性。本发明中，采用明胶联合β-磷酸三钙，制备干细胞药物的细胞支架载体。并且，当β-TCP为50％(即明胶海绵/β-磷酸三钙支架中明胶与β-磷酸三钙的质量比为1∶1)时，明胶/β-磷酸三钙支架的孔径为180mm～200mm，最有利于骨髓间充质干细胞在细胞支架上的粘附，生长与繁殖。因而采用明胶/β-磷酸三钙(β-TCP)支架作为干细胞药物载体，有利于表皮干细胞和骨髓间充质干细胞在体外的粘附、生长和繁殖。

本发明还提供了一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的制备方法，其制备简单、可控性好、可操作性强、重现性好。

1)将表皮干细胞先用缓冲液清洗，再用含胰蛋白酶重量百分含量为0.03％～0.08％的胰酶细胞消化液消化6～8分钟，然后向消化后的表皮干细胞中加入含胎牛血清和青链霉素的DMEM低糖/F12培养液，离心，弃上清，再加入DMEM低糖/F12培养液，得到表皮干细胞悬浮液；

将骨髓间充质干细胞先用缓冲液清洗，再用含胰蛋白酶重量百分含量为0.03％～0.08％的胰酶细胞消化液消化2～4分钟，然后向消化后的骨髓间充质干细胞中加入含胎牛血清和青链霉素的DMEM低糖/F12培养液，离心，弃上清，再加入DMEM低糖/F12培养液，得到骨髓间充质干细胞悬浮液；

所述的DMEM低糖/F12培养液由重量比为1.25～3.5∶1的DMEM低糖培养液和F12培养液组成；

所述的含胎牛血清和青链霉素的DMEM低糖/F12培养液由以下重量百分含量的组分组成：

DMEM低糖培养液 50％～70％；

F12培养液 20％～40％；

胎牛血清 3％～9％；

青链霉素 0.5％～1.5％；

DMEM低糖培养液和F12培养液均可采用美国Gibico Brl公司的产品，DMEM低糖培养液的鉴定可采用美国生物医药行业的统一标准。

2)将药物载体、步骤1)中的表皮干细胞悬浮液和骨髓间充质干细胞悬浮液混合，孵育得到加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物。

本发明提供了一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的应用，所述的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物可作为促进表皮层再生和促进真皮层再生的药物。皮肤从里到外主要分为三层，分别为皮下组织、真皮层、表皮层。表皮层是皮肤的最外层，由两类细胞组成：一类是角朊细胞，占表皮细胞的绝大多数，它们在分化中能合成大量角蛋白，使细胞角化并脱落；另一类细胞为非角蛋白形成细胞，数量少，分散存在于角蛋白形成细胞之间，包括黑(色)素细胞、郎格汉斯细胞和梅克尔细胞，它们各有特别的功能，但与表皮角化无直接关系。表皮下层，占有大部分结构的是真皮层，厚度为2毫米左右，又可分为三层，即***层、***下层及网状层。正常真皮层中含有成纤维细胞，肥大细胞，组织细胞，淋巴细胞及少量真树皮突状细胞，少量噬黑素细胞，少量朗格汉斯细胞等。成纤维细胞能分泌产生胶原纤维，弹力纤维，网状纤维和基质；同时在皮肤组织深层损伤后是主要的组织修复细胞。因此，成纤维细胞的增殖与迁移试验成为体外模拟真皮层修复与再生以及衡量药物加速真皮修复与再生的重要技术手段。创面愈合过程中，角朊细胞迁移、增殖和分化形成新的表皮层是覆盖创面的必须过程之一，与此同时，真皮层成纤维细胞的增殖，迁移形成新生的真皮层，并分泌胶原蛋白等细胞外基质，与表皮层共同形成完整的皮肤组织是创伤皮肤修复的主要过程。通过实验，与支架对照组相比，使用本发明加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物后，创面的愈合速度约为支架对照组的1.4倍，证明了本发明加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物在促进表皮层再生和促进真皮层再生方面具有显著功效，加速创伤部位皮肤的再生。

本发明提供了一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的应用，所述的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物可作为增强再生皮肤力学强度的药物。皮肤作为机体抵抗外界不良环境的屏障，具有多种功能，其生物力学性能保证了其抵抗外界拉力、压力等物理因素影响的能力。皮肤具有一定的弹性和韧性，其张力大小主要取决于真皮胶原纤维的机械特性和交织模式。创伤组织生物力学的恢复是创伤愈合的重要的衡量指标。通过实验，证明了本发明加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物显示出增强创伤部位再生皮肤抗张强度的趋势，使皮肤的生物力学性能趋于正常组织。

本发明提供了一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的应用，所述的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物可作为促进再生皮肤胶原蛋白含量的药物，加速再生皮肤中胶原蛋白的生成。胶原蛋白是脊椎动物***极重要的结构蛋白和细胞外基质成分，广泛存在于动物的皮肤、骨骼、肌腱、韧带等组织中，约占哺乳动物总蛋白的1/3。胶原蛋白作为细胞生长的依附与支架，能诱导上皮细胞等的增殖分化和移植，起支撑器官和保护肌体的重要机能。胶原蛋白与其他成分以特定的形式排列结合，形成细胞外间质的网状结构。这种结构对细胞起到锚定和立持作用，并为细胞的增殖生长提供适当的微环境。从实验的马森染色结果可以看出，本发明加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物显著促进了创伤部位再生皮肤胶原蛋白的含量，与正常组织中胶原蛋白的形态和排列方式类似，改善了创伤部位再生皮肤的质量。

本发明提供了一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的应用，所述的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物可作为促进血管再生的药物。血管再生是创伤修复过程中的关键环节之一，直接影响创面愈合的效果和疾病的转归。创面血管再生是指皮肤组织损伤后，在各种因素刺激下，如出血、缺血缺氧和炎性反应等，在原有微血管床基础上血管再生的过程。人体血管为创伤部位提供氧、营养和生物活性物质。在正常生理状态下，人体血管内皮细胞的倍增时间约为1年。人体只有在较特殊的环境下才会出现血管生成，例如创伤愈合，胚胎发生等。组织修复的关键环节之一为血管再生，血管再生的好坏直接影响组织修复的速度，促进血管生成剂几乎可以改善所有类型伤口的愈合。与此同时，再生血管是加速再生皮肤恢复正常功能的重要元素。因此血管再生调控一直是组织修复研究领域关注的焦点之一。而开发能促进创伤局部血管再生一直是创伤药物治疗中最具挑战性研究领域之一。通过实验，证明了本发明加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物能够促进血管再生。

本发明提供了一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的应用，所述的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物可作为促进毛囊再生的药物。毛囊是皮肤附属器官，毛发周围存在毛囊干细胞，参与毛囊的周期性生长；毛囊是一个周期性器官，除了维持毛发的周期性生长，还可参与皮肤软组织创伤的修复。有大量的观察证据表明毛囊参与创面修复可提高创面愈合质量，减少瘢痕形成。毛囊结构也是毛发中的一个具有重要意义的亚器官，它的缺失将使皮肤失去重要的生理功能，会给病人带来极大的痛苦。毛囊作为皮肤的重要附属器官，具有独特的结构和周期性再生的能力，因此具有重要的生理病理、免疫、美容等功能，一直以来是组织胚胎学、细胞生物学、皮肤病学和皮肤美容学研究的热点。而促进再生皮肤中毛囊的再生是皮肤再生治疗领域主要的治疗目标之一。通过实验，证明了本发明加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物能够促进毛囊再生。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明根据皮肤再生的机理，***地设计了皮肤创面愈合与附属器官再生评价试验，将表皮干细胞、骨髓间充质干细胞和药物载体复合应用制备加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物进行了全面、科学的评价，包括证明了本发明加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物在促进表皮层再生、促进真皮层再生、增强再生皮肤力学强度、促进再生皮肤胶原蛋白的含量、促进血管再生和促进毛囊再生等新作用。本发明在设计上科学严谨、方法上合理实用，得到的实验结果***全面，其结果将为制定新型皮肤再生局部治疗方案提供重要的科学依据和技术支持。

本发明加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物，使得受伤创面能在较短的时间内修复，并能加速皮肤附属器官的再生，能最大限度的满足患者希望伤口快速愈合并且恢复皮肤正常功能的愿景，具有很好的应用前景和广阔的市场需求。

本发明加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的制备方法，其制备简单、可控性好、可操作性强、重现性好。

附图说明

图1为实施例1中优选条件下制备的表皮干细胞的显微形态观察、细胞免疫组化鉴定结果和流式鉴定结果图；

图2为实施例4中不同试验组皮肤创面愈合的测定结果图；

图3为实施例5中不同试验组对皮肤创面再生皮肤再生力学的测定结果图；

图4为实施例6中不同试验组对皮肤胶原蛋白含量、血管再生和毛囊再生的测定结果图；

图5为实施例7中不同试验组皮肤中再生血管免疫组化鉴定的测定结果图。

具体实施方式

实施例1：表皮干细胞的制备方法、制备条件的优化以及鉴定

一、表皮干细胞的制备方法

目前，表皮干细胞的制备方法主要包括两大环节：1)先是通过中性蛋白酶水解表皮真皮间连接的功能分离得到单一的皮肤表皮层，避免了真皮细胞的污染；并且，由于胰蛋白酶对细胞损伤较大且需要时间过长，因此，首先采用中性蛋白酶消化法，利用其水解表皮真皮间连接的功能分离得到单一的皮肤表皮层，再将皮肤表皮层用胰蛋白酶进行消化获得单个细胞，有利于对所消化的细胞的活性的保护，保证获得足够数量的且有活性的目的细胞；2)然后通过IV型胶原与表皮干细胞的特异性结合将表皮干细胞分离出来，或采用流式细胞分选术将表皮干细胞从其它提取的表皮层细胞中分离出来。IV型胶原是由三条多肽链组成大分子蛋白，多肽链之间以二硫键相连接，这些多肽链较其他胶原的多肽链，每条多肽链上有3个螺旋区，甘氨酸、赖氨酸、脯氨酸的比例也较其他类型的胶原高。IV型胶原对表皮干细胞和短暂扩增细胞的粘附性不同，表皮干细胞的黏附在20min内可完成，而短暂扩增细胞则需60min以上。分选出的表皮干细胞和短暂扩增细胞借助于IV型胶原的黏附来分离，收＜20min内黏附于IV型胶原的细胞即可获得表皮干细胞。通过表皮干细胞对IV型胶原快速黏附的特性从表皮细胞中分离表皮干细胞得方法较其它细胞分离纯化方法，如流式细胞分选术操作更简单，不需要特殊仪器和设备，成本更低，有利于其走向工业化和临床应用。因此，本发明选择了快速酶解联合IV型胶原快速黏附，对表皮干细胞进行了分离制备。

二、制备条件的优化

尽管表皮干细胞技术的发展为皮肤再生等领域带来了新的动力.但是，表皮干细胞位于表皮基底层，数量很少，仅占基底细胞中的1％～10％，且其生长周期缓慢，体外难以在较短的时间内大量获得，大大限制了其临床应用。如何提高表皮干细胞体外分离和培养的效率是表皮干细胞走向临床亟待解决的问题。在表皮干细胞制备过程中，IV型胶原蛋白的浓度、细胞密度和Typsin-EDTA的浓度是影响表皮干细胞得率和增殖活性的三个主要因素。因此，本发明中，将IV型胶原蛋白的浓度，细胞快速粘附时的细胞密度和Typsin-EDTA的浓度设为三个考察因素，并设定三个考察水平，采用正交设计法设定实验安排，以表皮干细胞的提取率为考察指标，对不同的表皮干细胞制备条件对表皮干细胞提取率的影响进行了比较(考察因素及水平见表1，实验安排见表2)。

表1

表2

三、表皮干细胞的制备，以试验组1#为例

1)取下大鼠背部，头部皮肤，去除脂肪，血丝，剪成长1.5cm，宽2mm的大鼠皮条；

2)用普通D-Hanks(无钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液，北京弘博康医药科技有限公司)，清洗3次，20mL/次，每次清洗3分钟；

3)再用高抗D-Hanks(高抗D-Hanks由普通D-Hanks溶液与双抗溶液混合得到，其中，混合时，普通D-Hanks溶液与双抗溶液的体积比为100∶4，双抗为青霉素和链霉素这两种抗生素，双抗溶液购自于Gibico，Brl，USA)浸泡150分钟；

4)放入含dispaseII中性蛋白酶(购自于Gibico，Brl，USA)重量百分含量为0.25％的中性蛋白酶水溶液，其中，中性蛋白酶水溶液的体积为浸没大鼠皮条为适量，在4℃过夜放置15小时；

5)过夜放置后，用镊子轻轻将表皮剥离下来；

6)用含胎牛血清的DMEM低糖/F12培养液(含胎牛血清的DMEM低糖/F12培养液由重量百分含量为60％的DMEM低糖培养液、重量百分含量为30％的F12培养液和重量百分含量为10％的胎牛血清混合得到，其中，DMEM低糖培养液、F12培养液和胎牛血清均购自于Gibico，Brl，USA)将含胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)重量百分含量为0.25％的胰酶细胞消化液(胰酶细胞消化液由胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶解于pH＝7.4的磷酸缓冲液得到)稀释至0.02％，得到含Trypsin-EDTA重量百分含量为0.02％的胰酶细胞消化液；

向含Trypsin-EDTA重量百分含量为0.02％的胰酶细胞消化液中加入步骤5)中剥离下来的表皮，含Trypsin-EDTA重量百分含量为0.02％的胰酶细胞消化液以浸没剥离下来的表皮为适量，在37℃消化分离表皮5分钟；

7)用15ml离心管轻轻震荡5分钟，反复吹打；

8)用PBS溶液反复冲洗4次，并依次过200目和300目筛选，在1000rpm离心3分钟；

9)用细胞计数器(北京卓川电子科技有限公司)计数细胞密度；

10)用DMEM低糖/F12培养液(DMEM低糖/F12培养液由重量比为2∶1的DMEM低糖培养液和F12培养液组成，DMEM低糖培养液和F12培养液均购自于Gibico，Brl，USA)将细胞重悬，调整细胞密度至5×10⁵个/mL，并注入培养瓶(培养瓶采用含IV型胶原蛋白和醋酸的水溶液预包被，含IV型胶原蛋白和醋酸的水溶液中IV型胶原蛋白的重量百分含量为0.01％，含IV型胶原蛋白和醋酸的水溶液中醋酸的重量百分含量为0.1％)；静置10分钟后，弃去上清液，换新鲜DMEM低糖/F12培养液，在细胞培养箱中培养，三天换一次液，第8天，细胞达到80％的融合，消化细胞，用于制备加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物。

试验组2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#分别按上述步骤进行表皮干细胞，制备条件采用表2中的具体条件，其余条件同上。

通过各实验组制备的表皮干细胞的形态、数目以及形成克隆情况如表3所示，从表3可见，试验组7#制备的表皮干细胞的数目最多，形成克隆的能力较强(说明细胞活力较强)，形成克隆的时间由7～10天缩短至3～5天，被确定为本发明制备表皮干细胞的最优选条件。

表3

四、表皮干细胞的鉴定

I、细胞免疫组化：

1)将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，将试验组7#制备的表皮干细胞按2×10⁴个/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定；

2)用PBS(pH＝7.4的磷酸缓冲液)清洗细胞3次，2min/次；

3)将清洗后的细胞浸没在含多聚甲醛的重量百分含量为4％的多聚甲醛水溶液中固定15分钟，固定过程在4摄氏度冰箱中进行；

4)将固定后的细胞在空气干燥5min；

5)对盖玻片上的细胞用PBS清洗3次，2min/次；

6)将聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)溶解于PBS中，得到含TritonX-100重量百分含量为0.5％的溶液，在该溶液中孵育20min；

7)经含Triton X-100重量百分含量为0.5％的溶液孵育后再用PBS清洗3次，2min/次；

8)将H₂O₂溶解于PBS中，得到含H₂O₂重量百分含量为3％的溶液，在该溶液中孵育15min；

9)经含H₂O₂重量百分含量为3％的溶液孵育后再用PBS清洗3次，2min/次；

10)将盖玻片上的细胞在封闭血清孵育20min；

11)经过封闭血清孵育后，在一抗(p63)溶液(一抗溶液中由一抗p63和PBS配制而成，其中，一抗p63和PBS的体积比为1∶25)中37℃孵育60min；

阴性对照在PBS中37℃孵育60min；

12)将孵育后的细胞再用PBS清洗3次，5min/次；

13)在二抗工作液孵育pv6001(湿盒)中37℃孵育30min；

14)将孵育后的细胞再用PBS清洗5次，2min/次；

15)将盖玻片上的细胞用DAB显色(避光，镜下观察至棕色)约10～15min；

16)用蒸馏水清洗5min；

17)用苏木素复染10min；

18)用蒸馏水清洗5min；

19)树胶封片。

II、流式检测：

1)向100ul接有荧光染料的Percp-CD34(Santa Cruze，USA)抗体中加入100ul试验组7#制备的表皮干细胞(ESCs)中，并在冰水浴中孵育30分钟；

2)再加入PBS溶液，1.5ml/次，离心5分钟(2000rpm)，弃上清，洗两次，去除多余的抗体；

3)用500ul含多聚甲醛的重量百分含量为1％的多聚甲醛水溶液重悬细胞，并在冰浴中固定30分钟，离心5分钟(2000rpm)，弃上清；

4)再用PBS溶液洗两遍，1.5ml/次，离心5分钟(2000rpm)，弃上清；

5)加入含胎牛血清的PBS溶液(含胎牛血清的PBS溶液由胎牛血清与PBS混合得到，其中，含胎牛血清的PBS溶液中胎牛血清的重量百分含量为5％)，并放于冰浴中孵育10分钟；

6)再加入1ml含多聚甲醛的重量百分含量为4％的多聚甲醛水溶液，室温25℃固定30分钟；

7)将步骤1)中的抗体溶液换成PBS溶液，重复步骤1)至6)，同样的步骤处理样品，作为阴性对照。

8)用流式检测仪(BD，USA)测定样品中CD34和CD71两种细胞分子表面抗原的阳性表达率。

图1为实验组7#条件下制备的表皮干细胞的分子标志物流式鉴定结果。其中，图a、b为表皮干细胞显微形态，图a为实验组7#条件下制备的表皮干细胞的在第3天时的细胞形态显微形态图，如图a所示，所分离的细胞分散均匀，较圆整，但大小不一；图b为实验组7#条件下制备的表皮干细胞的在第11天时的细胞形态显微形态图，如图b所示，细胞连接成片，成铺路石状，个别区域会有复层生长。图c为实验组7#条件下表皮干细胞细胞免疫组化鉴定p63阳性染色图；图g为流式测定实验组7#条件下表皮干细胞阳性标志物p63阳性率为49.2％，图d为实验组7#条件下表皮干细胞阴性对照p63阳性率为1.2％；图h为流式测定实验组7#条件下表皮干细胞阳性标志物CD3阳性率31.1％，图e为实验组7#条件***性对照CD34阳性率为1.1％；图i为流式测定实验组7#条件下表皮干细胞阴性标志物CD71阳性率为2.7％，图f为实验组7#条件***性对照CD71阳性率为1.5％。表皮干细胞来源于表皮基底层和毛囊隆突部，其中，p63为来源于表皮基底层的表皮干细胞高表达的特异性细胞表面抗原，CD34为来源于毛囊隆突部的表皮干细胞的特异性细胞表面抗原。图1证明了实验组7#条件下制备的表皮干细胞纯度较理想(p63与CD34两种细胞表面抗原表达率之和高达80.3％)，且细胞增殖能力强，可用作创伤组织再生的治疗药物。

实施例2：骨髓间充质干细胞的制备

骨髓间充质干细胞的制备可参考文献(Cai-Xia He，Ni Li，Yu-Lan Hu，Xiu-Mei Zhu，Hai-Jie Li，Min Han，Pei-Hong Miao，Zhong-Jie Hu，Gang Wang，Wen-Quan Liang，Yasuhiko Tabata，Jian-Qing Gao*，Effective gene delivery tomesenchymal stem cells based on the novel reverse transfection andthree-dimensional cell culture system，Pharm Res，2011，28(7)：1577-1590)

1)原代大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的制备与体外培养：3周龄SD大鼠拉颈处死，分离胫骨与股骨，用5ml一次性注射器(常州市海峡医疗设备厂)吸取含血清培养液反复冲洗胫骨与股骨，将得到的骨髓过200目细胞筛(上海锐谷生物科技有限公司)，1000rpm离心5分钟，弃上清液。离心后加入含胎牛血清和双抗的DMEM低糖/F12培养液(含胎牛血清和双抗的DMEM低糖培养液由重量百分含量62％的DMEM低糖培养液、重量百分含量32％的F12培养液、重量百分含量为5％的胎牛血清和重量百分含量为1％的双抗溶液组成，其中，胎牛血清、双抗溶液、DMEM低糖培养液和F12培养液均购自于Gibico，Brl，USA，双抗是指青霉素和链霉素)。第7天用含胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)重量百分含量为0.25％的胰酶细胞消化液(胰酶细胞消化液由胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶解于pH＝7.4的磷酸缓冲液得到)消化原代细胞，1∶3～1∶4传代培养，第一代及之后的细胞传代后换新鲜培养液一次，待细胞生长至培养皿80％满时消化传代(约传代后第五天)，第二代至第五代细胞用作实验。

2)换液：用移液枪弃净培养皿中的培养液，然后加入新鲜的含胎牛血清和双抗的DMEM低糖/F12培养液10mL，横8字形摇匀。新制取的BMSCs第一次换液时，在加入新鲜的含胎牛血清和双抗的DMEM低糖/F12培养液前可先用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗一遍；

3)传代：用移液枪弃净培养皿中的培养液后，用PBS洗两遍，加入2.5mL的含胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)重量百分含量为0.25％的胰酶细胞消化液消化，光镜下观察，待细胞蜷缩成圆形时，立马加入5mL含10％胎牛血清的低糖DMEM/F12培养液(含10％胎牛血清的DMEM低糖/F12培养液由重量百分含量为5％的胎牛血清、重量百分含量为63.33％的DMEM低糖培养液和重量百分含量为31.67％的F12培养液混合得到，胎牛血清、DMEM低糖培养液和F12培养液均购自于Gibico，Brl，USA)终止消化。用移液枪反复吹打成细胞悬液，置离心管中，在1200rpm离心5分钟后，弃去上清液，加入含15％胎牛血清的DMEM低糖/F12培养液(含15％胎牛血清的DMEM低糖/F12培养液由重量百分含量为15％的胎牛血清、重量百分含量为56.67％的DMEM低糖培养液和重量百分含量为28.33％的F12培养液混合得到，胎牛血清、DMEM低糖培养液和F12培养液均购自于Gibico，Brl，USA)，吹打混匀，按1∶3～1∶4传代培养。

实施例3：加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的制备

1)将实施例1中实验组7#制备的表皮干细胞(ESCs)先用PBS洗两遍，再用含胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)重量百分含量为0.05％的胰酶细胞消化液(胰酶细胞消化液由胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶解于pH＝7.4的磷酸缓冲液得到)消化7分钟，然后向经胰酶细胞消化液消化后的表皮干细胞中加入含胎牛血清和青链霉素的DMEM低糖/F12培养液(含胎牛血清和青链霉素的DMEM低糖/F12培养液由重量百分含量为10％的胎牛血清、重量百分含量为1％的青链霉素、重量百分含量为59.33％的DMEM低糖培养液和重量百分含量为29.67％的F12培养液混合得到，胎牛血清、青链霉素、DMEM低糖培养液和F12培养液均购自于Gibico，Brl，USA)，在1200rpm离心3分钟，弃上清，加入适当体积的DMEM低糖/F12培养液(DMEM低糖/F12培养液由重量比为2∶1的DMEM低糖培养液和F12培养液组成，DMEM低糖培养液和F12培养液均购自于Gibico，Brl，USA)，得到表皮干细胞悬浮液，表皮干细胞悬浮液中表皮干细胞的浓度为1.3334×10⁷个/ml；

将实施例2制备的骨髓间充质干细胞(BMSCs)先用PBS洗两遍，再用含胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)重量百分含量为0.05％的胰酶细胞消化液(胰酶细胞消化液由胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶解于pH＝7.4的磷酸缓冲液得到)消化3分钟，然后向经胰酶细胞消化液消化后的骨髓间充质干细胞中加入含胎牛血清和青链霉素的DMEM低糖/F12培养液(含胎牛血清和青链霉素的DMEM低糖/F12培养液由重量百分含量为10％的胎牛血清、重量百分含量为1％的青链霉素、重量百分含量为59.33％的DMEM低糖培养液和重量百分含量为29.67％的F12培养液混合得到，胎牛血清、青链霉素、DMEM低糖培养液和F12培养液均购自于Gibico，Brl，USA)，在1200rpm离心3分钟，弃上清，加入适当体积的DMEM低糖/F12培养液(DMEM低糖/F12培养液由重量比为2∶1的DMEM低糖培养液和F12培养液组成，DMEM低糖培养液和F12培养液均购自于Gibico，Brl，USA)，得到骨髓间充质干细胞悬浮液，骨髓间充质干细胞悬浮液中骨髓间充质干细胞的浓度为1.3334×10⁷个/ml；

2)将表皮干细胞悬浮液与骨髓间充质干细胞悬浮液等体积混匀得到混合液，混合液中表皮干细胞和骨髓间充质干细胞的浓度均为6.6667×10⁶个/ml；

3)将药物载体明胶海绵/β-磷酸三钙(β-TCP)支架(体积为1cm×1cm×3mm，明胶海绵/β-磷酸三钙支架中明胶海绵与β-磷酸三钙的质量比为1∶1)加入24孔板中，向每孔加入300μl的步骤2)中的混合液，共孵育半小时，即可得到加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物，可作为药物使用，混合液中的表皮干细胞悬浮液与骨髓间充质干细胞几乎全部粘附在药物载体上，1cm×1cm×3mm的药物载体上含有表皮干细胞的个数为(1.8～2)×10⁶个，1cm×1cm×3mm的药物载体上含有骨髓间充质干细胞的个数为(1.8～2)×10⁶个。即每立方毫米的药物载体上含有表皮干细胞的个数为(0.6～0.67)×10⁴个，每立方毫米的药物载体上含有骨髓间充质干细胞的个数为(0.6～0.67)×10⁴个。

实施例4：动物创面皮肤再生试验

1)清洁级6周龄SD雌性大鼠25只，体重140g左右，分成5组，每组5只。5个组分别是：空白对照组、支架对照组、BMSCs(骨髓间充质干细胞)给药组、ESCs(表皮干细胞)给药组、BMSCs+ESCs复合药物组；

2)将动物用异戊巴比妥钠麻醉(6毫克/100克)，剪去背部毛发，用电动游标卡尺量出1cm×1cm的面积，用记号笔标记好该面积，用剪刀剪出1cm×1cm的面积，用碘酒进行消毒；

3)在创伤的半个小时后，对创伤表面分别局部贴敷药物，即支架对照组(不含干细胞，药物载体为明胶海绵/β-磷酸三钙支架，体积为1cm×1cm×3mm，明胶海绵/β-磷酸三钙支架中明胶海绵与β-磷酸三钙的质量比为1∶1)、BMSCs给药组(体积为1cm×1cm×3mm的明胶海绵/β-磷酸三钙支架上含BMSCs为4×10⁶个，明胶海绵/β-磷酸三钙支架中明胶海绵与β-磷酸三钙的质量比为1∶1)、ESCs给药组(体积为1cm×1cm×3mm的明胶海绵/β-磷酸三钙支架上含ESCs为4×10⁶个，明胶海绵/β-磷酸三钙支架中明胶海绵与β-磷酸三钙的质量比为1∶1)、BMSCs+ESCs给药组(采用实施例3制备的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物)，创伤表面贴敷药物后，用透明生物敷料敷上固定和保护伤口，空白对照组不做任何处理；

4)此后除空白对照组以外，其余各组每三天换药一次。每天观察各组动物创伤的愈合情况和疤痕的形成情况，并拍照，实验周期为10天。处死大鼠，将实验开始时圈定部位的皮肤剪下(1cm×1cm的面积)，以备之后的考察。

图2为10天的各试验组皮肤创面愈合率。如图2所示，与空白对照组相比，支架对照组仅在第8天时显示出对创面愈合的促进作用。BMSCs给药组在第7，8天表现出显著的促进愈合作用；ESCs给药组在第5～9天均显示出显著的促进作用。BMSCs+ESCs复合药物组在4～10天均显示出显著或极显著的加速愈合的作用(*p＜0.05，**p＜0.01)，一方面证明了BMSCs和ESCs两种干细胞均有加速皮肤创面愈合(创面皮肤新生)的功效，另一方面也证明了两种干细胞复合运用在加速皮肤创面愈合(创面皮肤新生)方面的协同作用。

实施例5：创面皮肤生物力学强度试验

采用张力测定仪，测定实施例4中第10天各组创面再生皮肤的生物力学强度，张力测定仪上测试再生皮肤的张力，取健康的皮肤作为阳性对照，作为正常皮肤组，牵拉皮肤组织的速度为25mm/分钟，具体力学数据详见图3。

图3为各实验组第10天创伤部位再生皮肤生物力学强度，如图3所示，与空白对照组相比，只有BMSCs+ESCs复合药物组可以使皮肤组的生物力学强度显著性增高(*p＜0.05，**p＜0.01)，证明了表皮干细胞与骨髓间充质干细胞这两种干细胞复合应用在增强新生皮肤生物力学强度方面的功效，使再生皮肤的抗张强度趋近于正常皮肤。

实施例6：动物创面新生皮肤组织染色试验

于第10天，取实施例4中各试验组别中创面再生皮肤及正常皮肤进行组织切片染色，具体实施内容包括：

1)取材：全皮摘除，面积1cm×1cm，去除皮下脂肪，得到各试验组中创面新生皮肤组织；

2)固定：将步骤(1)中皮肤组织于含多聚甲醛重量百分含量为4％的多聚甲醛水溶液中固定24h，固定液的体积是皮肤体积的15倍，固定过程在4摄氏度冰箱中进行；

3)水洗：将固定后的空白对照组、支架对照组、BMSCs给药组、ESCs给药组、BMSCs+ESCs复合药物组的皮肤组织投入PBS缓冲液(pH＝7.4)中，每10分钟更新洗涤液一次，累计1小时；

4)脱水：(质量百分数为0～95％乙醇水溶液脱水1～10小时)具体脱水条件如下：

70％乙醇，5小时，

85％乙醇，2小时，

95％乙醇，2小时，

100％乙醇，2小时，

100％乙醇，2小时；

5)透明化：把乙醇脱水后的空白对照组、支架对照组、BMSCs给药组、ESCs给药组、BMSCs+ESCs复合药物组的皮肤组织用吸水纸吸干表面水分后投入到由无水乙醇和二甲苯1∶5(体积比)混合组成的混合液中透明5分钟，然后放置到二甲苯中浸泡两次，每次0.5小时；

6)浸腊、包埋：液体石蜡(45℃)中浸渍5个小时，再放入液体石蜡(60℃)中浸渍5个小时，包埋；

7)切片：切片厚度为8μm，得到石蜡切片；

8)染色(步骤如下)：

a.石蜡切片置于二甲苯中浸泡两次，每次5分钟。再置于无水乙醇中浸泡2次，每次3分钟。再置于95％、85％、75％乙醇各3分钟；自来水洗，蒸馏水洗，然后转移到质量百分数为0.5％的甲苯胺蓝溶液(阿拉丁公司)；

b.在苏木精-三氯化铁混合液(苏木精3g，溶于100ml 95％乙醇水溶液，记为储备液A；19％三氯化铁溶液4ml，双蒸水95ml，盐酸3ml，记为储备液B；A和B等体积混合)(苏木精购自Sigma公司，三氯化铁溶液购自国药集团)中染色10分钟；

c.双蒸水冲洗5分钟；

d.质量百分数为1％的比布列西猩红-质量百分数为1％的酸性品红混合液(体积比9∶1)(上海杰星生物科技有限公司)中染色5分钟；

e.蒸馏水洗；

f.在磷钼酸磷钨酸混合液(质量百分数为5％的磷钼酸和质量百分数为的5％磷钨酸以体积比为1∶1混合)(磷钨酸和磷钼酸购自阿拉丁公司)中区分15分钟或者直至胶原不再显红色；

g.直接转移到质量百分数为2.5％的苯胺蓝溶液中，染色5分钟，在水中简单水洗，在质量百分数为1％冰醋酸溶液中区分3分钟；

h.水洗，吸干水分；

i.依次脱水(95％乙醇，100％乙醇，二甲苯各两次脱水，每次1分钟)，中性树脂封片；

1.拍照，结果如图4所示，10倍目镜下第十天各试验组的创伤部位以及正常皮肤部位的皮肤马森三色染色切片，其中，空白对照组如图4中A所示，支架对照组如图4中B所示，正常皮肤组如图4中C所示，BMSCs给药组如图4中D所示，ESCs给药组如图4中E所示，BMSCs+ESCs复合给药组如图4中F所示。

如图4所示，与空白对照组A相比，支架对照组B能促进部分胶原蛋白的合成；相比于空白对照组A和支架对照组B，BMSCs给药组能显著促进血管的新生(实线箭头为血管)，ESCs给药组则显著促进了毛囊的再生(虚线箭头为毛囊)，在BMSCs+ESCs复合给药组中，皮肤组织中既有血管的再生又有毛囊的再生，更趋近于正常皮肤组织的结构。一方面证明了BMSCs和ESCs分别具有加速皮肤层血管和毛囊再生的功能，另一方面，实验结果也再次证明了BMSCs和ESCs这两种干细胞合用在加速皮肤附属器官再生方面的协同作用，和其发展成为临床加速皮肤及其附属器官再生治疗新方案的巨大潜力。

实施例7：动物创面再生血管分子免疫组化鉴定试验

免疫组织化学染色，具体步骤如下：

1)在第10天，取下实施例4中的空白对照组、支架对照组、BMSCs给药组、ESCs给药组、BMSCs+ESCs复合药物组中的创伤部位皮肤切片以及正常皮肤切片，将皮肤切片常规脱蜡至水；

2)用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，每次5分钟；

3)用含甲醇质量百分数为3％甲醇水溶液，过氧化氢适量，室温25℃下孵育20分钟；

4)蒸馏水清洗清洗3次，每次5分钟；

5)在1mol/L枸橼酸缓冲液(pH＝6.0)温箱内修复，在98℃维持20分钟后，冷却至室温；

6)在含胎牛血清的PBS溶液(含胎牛血清的PBS溶液由胎牛血清和PBS混合得到，其中，含胎牛血清的PBS溶液中胎牛血清的重量百分含量为10％)中，在37℃温箱湿盒内孵育30分钟：

7)滤纸吸去多余血清，加入CD31一抗溶液(CD31一抗溶液中由一抗CD31和PBS配制而成，其中，一抗和PBS的体积比为1∶20)，在4℃过夜15h；

8)用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗3次，每次5分钟；

9)滴加生物素化二抗(山羊抗鼠的二抗)工作液适量，在37℃温箱湿盒内孵育30分钟；

10)再用PBS清洗3次，每次5分钟；

11)滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液适量，在37℃温箱湿盒内孵育30分钟：

12)用PBS清洗3次，每次5分钟；

13)DAB显色剂适量，显色10分钟；

14)自来水充分冲洗，终止显色；

15)苏木精复染60分钟；

16)梯度酒精脱水：分别用含乙醇质量百分数为70％、80％、90％的乙醇水溶液各洗脱5分钟，含乙醇质量百分数为95％的乙醇水溶液洗脱10分钟，100％乙醇洗脱两次，每次60分钟，；

17)用二甲苯洗脱三次，每次60分钟，至透明；

18)中性树胶封固。

19)阴性对照用PBS替代步骤7)中的一抗，其余步骤同上。

图5为10倍目镜下第十天创伤部位皮肤CD31免疫组化鉴定结果，其中，空白对照组如图5中A所示，支架对照组如图5中B所示，正常皮肤组如图4中C所示，BMSCs给药组如图5中D所示，ESCs给药组如图5中E所示，BMSCs+ESCs复合给药组如图5中F所示。

如图5所示，在空白对照组和支架对照组中，均未鉴定出明显的血管内皮细胞分子标志物CD31；在BMSCS给药组和BMSCs+ESCs复合给药组中均鉴定出相当数量的CD31，趋近于正常皮肤鉴定结果，一方面进一步验证了BMSCs在加速皮肤层血管再生的功能，另一方面，也证明了BMSCs和ESCs这两种干细胞合用同样具有加速皮肤创面血管新生的功效。

Claims

1.一种加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的制备方法，包括以下步骤：

1）将表皮干细胞先用缓冲液清洗，再用含胰蛋白酶重量百分含量为0.03%～0.08%的胰酶细胞消化液消化6～8分钟，然后向消化后的表皮干细胞中加入含胎牛血清和青链霉素的DMEM低糖／F12培养液，离心，弃上清，再加入DMEM低糖／F12培养液，得到表皮干细胞悬浮液；

将骨髓间充质干细胞先用缓冲液清洗，再用含胰蛋白酶重量百分含量为0.03%～0.08%的胰酶细胞消化液消化2～4分钟，然后向消化后的骨髓间充质干细胞中加入含胎牛血清和青链霉素的DMEM低糖／F12培养液，离心，弃上清，再加入DMEM低糖／F12培养液，得到骨髓间充质干细胞悬浮液；

所述的DMEM低糖／F12培养液由重量比为1.25～3.5:1的DMEM低糖培养液和F12培养液组成；

所述的含胎牛血清和青链霉素的DMEM低糖／F12培养液由以下重量百分含量的组分组成：

2）将药物载体、步骤1）中的表皮干细胞悬浮液和骨髓间充质干细胞悬浮液混合，孵育得到加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物；

所述的药物载体为明胶海绵/β-磷酸三钙支架；

所述的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物由表皮干细胞、骨髓间充质干细胞和药物载体组成，其中，表皮干细胞和骨髓间充质干细胞均粘附在药物载体上，每立方毫米的药物载体上含有表皮干细胞的个数为（0.3～1）×10⁴个，每立方毫米的药物载体上含有骨髓间充质干细胞的个数为（0.3～1）×10⁴个。

2.根据权利要求1所述的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的制备方法，其特征在于，每立方毫米的药物载体上含有表皮干细胞的个数为（0.6～0.75）×10⁴个，每立方毫米的药物载体上含有骨髓间充质干细胞的个数为（0.6～0.75）×10⁴个。

3.根据权利要求1或2所述的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的制备方法，其特征在于，所述的表皮干细胞由以下制备方法制备：将通过预处理后得到的分离表皮加入到含胰蛋白酶重量百分含量为0.03%～0.08%的胰酶细胞消化液中消化分离表皮3分钟～8分钟，分离后得到表皮干细胞。

4.根据权利要求3所述的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的制备方法，其特征在于，所述的表皮干细胞由以下制备方法制备：将通过预处理后得到的分离表皮加入到含胰蛋白酶重量百分含量为0.05%的胰酶细胞消化液中消化分离表皮5分钟，分离后得到表皮干细胞。

5.根据权利要求1或2所述的加速皮肤层修复与皮肤附属器官再生的药物的制备方法，其特征在于，所述的明胶海绵/β-磷酸三钙支架中明胶海绵与β-磷酸三钙的质量比为1：1～100。