CN102552238A

CN102552238A - 木犀草素的新用途

Info

Publication number: CN102552238A
Application number: CN2011104308732A
Authority: CN
Inventors: 韩晓; 高璐; 吴越; 孙玉洁; 朱云霞
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing University; Nanjing Medical University
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了一种木犀草素的新用途，该新用途为在制备用于治疗脂肪肝药物中的应用。通过动物实验表明，木犀草素可以降低血液中胆固醇和甘油三酯的含量，减少肝脏中甘油三酯的合成，从而阻断了肝脏中脂质堆积的来源，在制备用于治疗脂肪肝药物中将有广泛的用途；具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效应。

Description

木犀草素的新用途

技术领域

本发明涉及木犀草素，具体涉及一种木犀草素的新用途。

背景技术

脂肪肝现已成为我国发病率上升最快的慢性疾病。近年来查出脂肪肝的比例逐年上升，人群中发病率为5%，并且还有年轻化的趋势。专家指出，40%以上肥胖人都患有脂肪肝，营养过剩、酗酒、糖尿病是致病主要因素，其他疾病也可导致脂肪肝，比如结核病、严重贫血、肺心病等；另外，某些药物或毒物也可致脂肪肝。脂肪肝的危害很多，主要包括：（1）形成肝纤维化、肝硬化。肝细胞中脂滴增多，使肝细胞脂肪变性，长期的肝细胞变性会导致肝细胞再生障碍和坏死，进而形成肝纤维化、肝硬化。（2）诱发或加重高血压、冠心病、动脉粥样硬化。脂肪肝的病情进展研究表明，酒精性脂肪肝患者多合并高血压、冠心病，容易导致心肌梗死。（3）脑病脂肪肝综合征。一些发生脂肪肝的肥胖者常常表现为恶性肥胖，这类病人极易并发致命性心脑血管疾病。（4）诱发或加重糖尿病。据调查，糖尿病患者中合并脂肪肝的约50%，脂肪肝患者中合并糖尿病的为30%～40%。（5）诱发肝癌。脂肪肝与原发性肝癌的发生虽无直接关系，但是脂肪肝的病因，如饮酒、营养不良、药物作用及有毒物质损害等，可诱发肝癌。因此，脂肪肝也可增加肝癌的发病几率。

脂肪肝属于肝脏代谢障碍性疾病，故是可逆的，经合理治疗后完全可以恢复正常。现除饮食、运动疗法外，多使用药物治疗，主要的治疗药物包括：（1）保肝类药物。保肝治疗是大多数脂肪肝患者所不可缺少的治疗措施，一经确诊脂肪肝，在病因治疗及饮食疗法的同时都应辅以保肝药物，以利于肝功能的尽快恢复。常用的保肝药有：肝太乐、维生素C、肌苷等。（2）降脂类药物。脂肪肝患者因脂肪代谢障碍，体内甘油三酯及胆固醇均有不同程度升高，且常伴有高脂血症。故不可避免地需要降脂药物，如多烯康、绞股兰总甙、降脂灵、烟酸肌醇酯和蛋氨酸等。也可以服一些祛脂中草药。（3）其它辅助药物。脂肪肝患者常伴有维生素缺乏，故还应服用维生素C、维生素B12、叶酸等，维生素C可以促进胆固醇的分解、转化，能加强肝脏去除胆固醇的作用。核黄素、吡哆酸等也有去脂作用。当患者伴有消化道不适症状如恶心、食欲不振、腹胀、便秘或稀便时，可以给予对症治疗，口服酵母片等相应的对症药物。

目前，临床常用降脂类药物主要包括：（1）他汀类。三甲基戊二酰辅酶A（HMG－CoA）还原酶抑制剂，即胆固醇生物合成酶抑制剂（他汀类药物），是细胞内胆固醇合成限速酶，即HMG－CoA还原酶的抑制剂，为目前临床上应用最广泛的一类调脂药物。由于这类药物的英文名称均含有“statin”，故常简称为他汀类。近年来，他汀类药物常被被发现有严重的毒副作用。2001年曾发生轰动一时的“拜斯亭”事件。我国国家药品监督管理局与2001年8月9日发出紧急通知，禁止使用西立伐他汀钠（拜斯亭）。据悉，他汀类药上市以来，全世界仅有600万人用过它；而拜斯亭作为他汀类药之一，因毒副作用过大导致30多个美国人失去生命。最近一段时期，国外媒体纷纷报道：他汀类药在降脂的同时，也带来了肝功下降、肌肉疼痛等毒副作用。（2）贝特类。贝特类药物的主要适应症为：高甘油三酯血症或以甘油三酯升高为主的混合型高脂血症。目前临床应用的贝特类药物，主要有环丙贝特、苯扎贝特、非诺贝特及吉非贝齐。据临床实践，这些药物可有效降低甘油三酯22％～43％，而降低TC仅为6％～15％，且有不同程度升高高密度脂蛋白的作用。该药的不良反应为胃肠反应、恶心、腹泻，有报道长期使用可导致肝损害。（3）烟酸类。烟酸类药物属B族维生素，当用量超过其作为维生素作用的剂量时，可有明显的降脂作用。该类药物的适用范围较广，可用于除纯合子型家族性高胆固醇血症，及I型高脂蛋白血症以外的任何类型高脂血症。但是，该药的速释制剂不良反应大，一般不单独应用。（4）胆酸螯合剂。这类药物也称为胆酸隔置剂。有考来烯胺（Cholestyramine），常用药物有降胆宁。该药常见的不良反应为胃肠反应、恶心、便秘或腹泻，肠梗阻或头痛等。（5）胆固醇吸收抑制剂。此类药物主要通过抑制肠道内饮食和胆汁中胆固醇的吸收，来达到降低血脂的目的。目前，该类药物上市很少。

木犀草素（luteolin）是一种天然黄酮类化合物，存在于多种植物中。具有多种药理活性，如消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等，临床主要用于止咳、祛痰、消炎、治疗心血管疾病、治疗“肌萎缩性脊髓侧索硬化症”，SARS，肝炎等。但在治疗脂肪肝疾病中，没有任何研究和报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种木犀草素的新用途，以实现使其在制备治疗脂肪肝药物中有广泛的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种木犀草素的新用途，为在制备用于治疗脂肪肝药物中的应用。

一种用于治疗脂肪肝的药物，有效成分为木犀草素。

木犀草素，化学名：3',4',5,7-四羟黄酮，别名：黄色黄素、黄示灵，CasNo:491-70-3，化学式：C₁₅H₁₀O₆，分子量：286.23。物理性状：黄色针状结晶，熔点328-330℃。微溶于水，具弱酸性，可溶于碱性溶液中，正常条件下稳定。木犀草素多以糖苷的形式存在于多种植物中，这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高，具有镇咳和祛痰作用。研究表明，木犀草素抑制巨噬细胞磷酸化，抑制转录因子NF-kB的活性，能够抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞产生细胞因子IL-6、TNF-a。木犀草素还能提高IFN-γ，降低特异性Ig-E，减少嗜酸性粒细胞的浸润。另外，木犀草素除了抗炎、抗过敏作用以外，还具有抑制PDE、抗SARS、HIV病毒特性。

本发明，通过动物实验表明，木犀草素可以降低血液中胆固醇和甘油三酯的增加，减少肝脏中甘油三酯的合成，从而阻断了肝脏中脂质堆积的来源，在制备用于治疗脂肪肝药物中将有广泛的用途。

有益效果：与现有的用于治疗脂肪肝药物相比，本发明的木犀草素类治疗脂肪肝药物具有的突出优点包括：通过动物实验表明，木犀草素可以降低血液中胆固醇和甘油三酯的含量，减少肝脏中甘油三酯的合成，从而阻断了肝脏中脂质堆积的来源，在制备用于治疗脂肪肝药物中将有广泛的用途；具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1是小鼠给药干预8周后的血脂含量图；

图2是小鼠给药干预8周后的肝脏中的甘油三酯含量图；

图3是各组小鼠的随机血糖含量图；

图4是各组小鼠禁食12h后的糖耐量结果图；

图5是给药干预8周后各组小鼠肝脏的特征图；

图6是给药干预8周后各组小鼠肝脏的超声影像图（A）、肝脏中的脂质图（B）、肝脏中糖原图（C）和脂肪组织图（D）；

图7是通过western blot方法检测脂肪酸合成的限速酶的表达结果图；

图8是木犀草素对人肝癌细胞系HepG2和小鼠原代肝细胞的脂质合成中的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

（1）木犀草素购自中国药品生物制品检定所，非酒精性脂肪性肝自发性动物模型db/db小鼠购自南京大学模式动物所。

（2）实验组db/db小鼠：雄性，6周龄，体重28~33g/只；分组：共18只，随机分成3组，每组6只。同窝阴性小鼠（C57BL/KsJ）：雄性，6周龄，体重18~22g/只；分组：共6只，作为对照组。

（3）给药处理：腹腔注射给药，20mg/kg/只或100mg/kg/只，每两天给药一次，持续给药6~8周。

（4）血样的采集：眼眦取血，置于肝素钠抗凝的干燥0.5ml EP管中，3000r/min，离心5min，每只小鼠每次取血清20ul，用于小鼠血脂的检测。结果血脂含量如图1所示，甘油三酯含量如图2所示。db/db小鼠作为一个自发肥胖的动物模型，血液中的胆固醇和甘油三酯是显著性增加的。在db/db小鼠连续给药干预后，进行的血脂的常规检测中，发现木犀草素可以减少血液中胆固醇和甘油三酯的增加，同时也阻断了肝脏中脂质堆积的来源。

（5）血糖的测定：通过尾静脉微创采血，采用雅培安妥血糖仪进行小鼠血糖的检测。测量随机血糖结果如图3所示。由于db/db小鼠是自发高血糖模型，过度摄取含糖量较高的食物也会导致肥胖。通过检测木犀草素对db/db小鼠血糖的作用实验，结果表明木犀草素可以增加葡萄糖的摄取，而这部分摄入体内的葡萄糖以糖原的形式贮存在肝脏内，并没有大量的转化为脂肪，而对照组小鼠结果相反。

（6）腹腔葡萄糖耐量实验：采用经腹腔注射2g/kg葡萄糖的方法，分别监测注射后0、15、30、60和120min时的小鼠血糖的变化情况。糖耐量结果如图4所示。

在持续给药过程中，通过小动物B超仪也多次观测活体内脂肪肝的发展情况，同时在给药8周时，取出小鼠的肝脏和脂肪进行了切片检测和肝脏蛋白western检测。

（7）小鼠肝脏的B型超声成像：选用VEVO2100小动物超声仪进行活体脂肪肝的实时诊断与监测；

（8）肝脏的油红O和苏木素的复合染色：先用D-hanks将样本细胞或者组织切片冲洗充分，然后加入油红稀释染色10~15 分钟，接下来用75%的乙醇溶液将样本分化至间质清晰，然后蒸馏水冲，最后再用苏木素对细胞核部分进行复染，并于100 倍镜下观察拍照。以每组样本随机选取5~10 视野进行拍照观察以考察脂质积累的效果。

（9）肝脏的糖原颜色：肝脏标本切片，以过碘酸-Schiff氏法（PAS）行肝糖原染色，镜下观察切片，以每组样本随机选取5~10 视野进行拍照观察以考察肝脏中糖原的含量。

（10）脂肪组织的苏木素-伊红（HE）染色：将脂肪组织切片至于60℃烘箱45s，95%酒精固定，苏木素染色15min后，进行盐酸酒精分化，室温返蓝10min，伊红染色5min，脱水，封片。

（11）Western bolt：将取出的新鲜肝脏标本，放人液氮中，转至-80℃保存。用组织裂解法提取蛋白后-20℃保存，用考马斯亮蓝法测量蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳采用39 g/L浓缩胶、100 g/L分离胶，上样量50 μg，蛋白Marker 5μL，电压60 V待蛋白跑出浓缩胶后调至120 V，电泳结束后取出凝胶，用Quantity One软件分析光密度值。

在持续给药过程中，通过小动物B超仪多次观测活体内脂肪肝的发展情况，同时在给药8周时，取出小鼠的肝脏和脂肪进行了切片检测和肝脏蛋白western检测。给药干预8周后各组小鼠肝脏的特征图如图5所示，给药干预8周后各组小鼠肝脏各项检测指标如图6所示，其中A图为超声影像，B图为肝脏中的脂质，C图为肝脏中糖原，D图为脂肪组织；通过western blot方法检测小鼠肝脏中脂肪合成相关蛋白的表达情况，结果如图7所示；各实验结果表明木犀草素可以减少db/db小鼠肝脏中的脂肪酸合成相关基因的表达和脂肪堆积，显著性的改善自发性的脂肪肝。

实施例2

原代肝细胞的分离与培养：将C57BL/KsJ小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠进行麻醉处理，从小鼠的门静脉插管并且间断下腔静脉后，以2ml/min流速灌入Kreb溶液，待肝脏内的血液冲洗干净后，继续以2ml/min流速灌入胶原酶IV 30ml。待肝脏充分消化后，将组织块剪碎，加入DMEM完全培养液50ml终止消化并且充分混匀，以200目筛子过滤。以50G/min离心5min，浓缩肝细胞。

为了在细胞水平观察到较为明显的脂肪积累，预先采用了肝脏X受体激动剂T0901317对HepG2细胞和小鼠原代肝细胞进行处理，在处理48h后，进行了苏木素–油红染色。实验结果如图8所示，结果表明，激动剂T1317可以激活肝脏X受体的活性，上调下游的脂肪酸合成相关基因，从而使细胞内的脂肪酸和甘油三酯的含量增加。但在观察过程中，经过木犀草素和激动剂T1317共同处理的细胞内的脂质含量明显少于T1317处理组。说明了木犀草素可以减少肝脏细胞中的脂质合成。

与现有的预防与治疗脂肪肝的药物相比，天然化合物木犀草素具有明显的优势，药效明显、毒副作用小。

Claims

1.木犀草素在制备用于治疗脂肪肝药物中的应用。

2.一种用于治疗脂肪肝的药物，其特征在于：有效成分为木犀草素。