CN102533591B - 一株耐高温、耐高糖的乳酸菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐高温、耐高糖的乳酸菌。本发明属于乳酸菌领域，特别涉及耐高温、耐高糖的菌株。本发明所提供的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4430，菌株CGMCC No.4430葡萄糖耐受浓度可以达到270g/L，与原始菌相比提高了95％。发酵结束后，乳酸含量为50g/L，与原始菌相比提高了158％。发酵罐实验跟踪的各项性能指标表明，该菌株代谢正常，产L-乳酸能力强，杂酸含量低，是一株优良的耐高温、耐高糖鼠李糖乳杆菌株。
Description
技术领域：
本发明属于乳杆菌领域，特别涉及耐高温、耐高糖的乳杆菌株。
背景技术：
近年来，由于具有一些特殊的功能，极端微生物的研究越来越引起人们重视。其中，耐高温、耐高渗乳酸菌由于其在食品、医药和化工等多种工业的广泛应用而尤为突出。目前其主要应用包括如下几个方面：(1)乳酸：乳酸是一种重要的食品和化工原料，并可制备可降解高分子材料-聚乳酸，因而近些年备受关注。(2)生物防腐剂：乳酸链球菌素是近些年广泛使用于食品和饮料的一种生物防腐剂，与化学防腐剂相比，其对人体无害，并且具有较广的抑菌谱。(3)食品：酸乳、干酪、泡菜、豆豉等都是世界上各个国家广泛喜爱的一种功能性食品，它们都是以乳酸菌为发酵菌种的。在高渗和高温的条件下，利于提高底物和产物的浓度。另外，在生产中可以减少污染杂菌，降低生产风险。
对于微生物工业来言，如何获得一株优良的菌种非常关键，因此乳酸菌的分离选育工作至关重要，但要取得优良的菌种却并非易事。尽管现在采用基因工程等技术手段可以添加外源基因到细胞内，或者删除某个基因。但就目前技术看来，获得一个具有优良性状的菌株仅靠以上的简单基因操作并不容易，并且删除某个基因或者导入外源基因可能会破坏乳酸菌胞内的代谢平衡，进而影响细胞的正常代谢生长。另外，对于食品工业而言，基因工程菌的使用可能具有高度安全隐患，在很多国家是被禁止的。因此，传统的诱变育种仍是大多数工业微生物育种最重要、最有效的技术。
目前用于微生物诱变育种的方法有物理和化学诱变，其中物理诱变包括紫外线、激光、X射线、γ射线、快中子等物理方法，化学诱变主要包括各种烷化剂(硫酸二乙酯、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯等)。
烷化剂又称烷基化剂，是能将小的烃基转移到其它分子上的高度活泼的一类化学物质。一般引入的烷基连接在氮、氧、碳等原子上。烷化剂常具突变源性，因为它能改变脱氧核糖核酸中的核苷酸。现已知道有几种不同的化学治疗药物属于烷化剂。它们具有一个或两个烷基，分别称单功能或双功能烷化剂，所含烷基能与细胞的DNA、RNA或蛋白质中亲核基团起烷化作用，常可形成交叉联结或引起脱嘌呤，使DNA链断裂，在下一次复制时，又可使碱基配对错码，造成DNA结构和功能的损害，严重时可致细胞死亡。属于细胞周期非特异性药物。常用的烷化剂有烯烃、卤烷、硫酸烷酯等。
而这些烷化剂在传统的诱变操作中，由于其具有诱变育种效果好、操作条件简单的优点，被广泛使用。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一株新的乳杆菌菌株及其在乳酸发酵方面的应用。
本发明所提供的乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保臧编号为CGMCC No.4430，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2010年12月08日。
该菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为杆状，宽度小于1μm，2到3个杆菌易于连成连接在一起；在固体培养基上，该菌菌落为乳白色，表面光滑，湿润，粘稠，边缘较整齐。与原始菌相比，该诱变菌株在形态上明显小于出发菌株。
出发菌株鼠李糖乳杆菌CGMCC No.1.2134购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明鼠李糖乳杆菌采用下述流程进行选育：
原始出发菌种→试管活化→高温驯化→硫酸二乙酯(DES)诱变→高糖平板筛选→亚硝基胍(NTG)诱变筛选→高温菌筛选→摇瓶复筛→传代稳定性试验→5L发酵罐试验
本发明所采用的原始菌株最适发酵温度为37℃，为了提高其耐高温的性质，首先采用逐步提高温度的方法进行驯化。直到其能够在45℃平板能生长为止。然后采用DES对获得高温菌进行进一步诱变，诱变后通过培养基A高糖平板(250g/L葡萄糖)进行初筛，接着对选育出来的菌株继续进行NTG诱变，通过培养基A高糖平板(250g/L葡萄糖)进行高温菌(耐受55℃)初筛，然后采用250mL三角瓶复筛，选育优良的乳杆菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性，并用液相色谱、气质联用测定发酵液中的代谢物含量，最后采用5L发酵罐进行实验效果的评价。
菌株CGMCC No.4430遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把菌株CGMCC No.4430作为选育得到的目的菌株。
将目的菌株CGMCC No.4430做5L乳酸发酵罐实验，结果表明：与出发菌株相比，CGMCC No.4430葡萄糖耐受浓度可以达到270g/L，与原始菌相比提高了95％；发酵结束后，乳酸含量为60g/L，与原始菌相比提高了158％。
有益效果：
1)本研究采用DES和NTG诱变联用技术选育鼠李糖乳杆菌，选育得到了优良菌株CGMCC No.4430。该突变菌株能够在55℃下生长良好，发酵培养基不需要灭菌。葡萄糖耐受能力为270g/L，与原始菌相比提高了95％。该菌株稳定遗传好，在连续十次传代过程中，性状没有回复，各项性能指标都正常。
2)发酵罐实验跟踪的各项性能指标表明，该菌株代谢正常，产L-乳酸能力强，杂酸含量低，是一株优良的耐高温、耐高糖鼠李糖乳杆菌株。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
举例1：
具体过程如下：
1.高温驯化
1)在超净台上取试管斜面上的鼠李糖乳杆菌CGMCC No.1.2134一环，接入装有50mL培养基A(无琼脂)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
培养基A：(酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，一水硫酸锰0.05g，碳酸钙20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH6.8)。
2)取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
3)用生理盐水稀释成107个/mL菌悬液。
4)稀释涂布于含培养基A的平皿中。在39℃培养2～3天后挑取菌落最大的菌株，标号为H1菌。
5)重复上面方法，将筛选到得菌稀释涂布于含培养基A的平皿中。在41℃培养2～3天后挑取菌落最大的菌株，标号为H2菌。
6)重复以上操作，培养温度每次提高2℃，直至筛选出能够在45℃生长的菌株，标号为H菌。
2.DES诱变选育
1)在超净台上取试管斜面上的鼠李糖乳杆菌H一环，接入装有50mL培养基A(无琼脂)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，45℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
2)取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
4)取32mL pH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mL DES在预先放入转子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1％(v/v)。
5)在30℃摇床中150rpm反应30min，取1mL混合液，加入0.5mL 25％Na2S2O3溶液中止反应。
6)稀释涂布于含250g/L葡萄糖的培养基A筛选培养基平皿中。在45℃培养2～3天后挑取菌落最大的菌株，标号为HG菌。
3.亚硝基胍诱变
1)在超净台上取试管斜面上的鼠李糖乳杆菌HG一环，接入装有50mL培养基A(无琼脂)培养基(葡萄糖浓度为250g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，45℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
2)取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
4)取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
5)在30℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。
6)适当稀释涂，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于含250g/L葡萄糖的培养基A筛选培养基平皿中。在55℃培养2～3天后挑取菌落较大的100支。
4.摇瓶复筛
1)在超净台上分别取各试管斜面上的鼠李糖乳杆菌一环，接入装有50mL培养基A(无琼脂)培养基(葡萄糖浓度为250g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养15h左右，使菌体处于对数生长中期。
2)取5mL菌液，接入装有50mL高糖培养基A(无琼脂)(葡萄糖浓度为250g/L)中的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养3-4天，每天检测葡萄糖浓度和L-乳酸浓度变化。发酵结束后，比较100株菌种的葡萄糖消耗速率和L-乳酸产生速率、葡萄糖对L-乳酸的转化率以及杂酸含量。
3)选择葡萄糖消耗速率快、最终残糖浓度低和L-乳酸浓度高、葡萄糖对L-乳酸的转化率高以及杂酸含量少的菌种为最终菌种，命名为HGN菌。
5.遗传稳定性试验
将HGN菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
6.5L发酵罐试验
1)取斜面上的鼠李糖乳杆菌一环，接入装有50mL培养基A(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。
2)将对数期的菌种接入装有3L发酵液的5L发酵罐中。接种量为10％，30℃下100rpm，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养3-4天。
3)发酵结束后，残糖90g/L、L-乳酸含量为50g/L，与原始菌相比提高了158％。
Claims (2)
1.一株耐高温、耐高糖的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，保藏编号为CGMCCNo.4430。
2.如权利要求1所述耐高温、耐高糖的鼠李糖乳杆菌CGMCC No.4430，其特征在于，该菌株在55℃下生长良好，耐受250g/L葡萄糖。
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