CN102532319A - 二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体及其制备方法与应用。该二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码该抗bFGF人源双链抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明是在单链抗体的基础上，通过定点突变引入2个半胱氨酸从而引入二硫键，构建成ds-Diabody。通过实验证明，得到的ds-Diabody具有如下优点：稳定性增强；其与抗原bFGF特异性结合，亲和力更好；相对分子质量适中，具有良好的肿瘤靶向、瘤组织穿透力和较长的血液清除率，在临床诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。

Description

二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于抗体领域，涉及一种双链抗体，特别涉及一种二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体及其制备方法与应用。
背景技术
bFGF称为碱性成纤维细胞生长因子，是一种广泛的有丝***原，可通过自分泌或旁分泌的方式促进多种细胞，包括肿瘤细胞及血管内皮细胞的增殖、分化以及抗凋亡作用。bFGF具有多种生物学作用，包括促生长、***、分化功能；对成纤维细胞具有强烈的促增殖作用。近年来越来越多的研究表明，bFGF在多种肿瘤组织中高表达并与肿瘤发生发展具有密不可分的关系。因此，bFGF可以作为一些肿瘤治疗的良好靶点。用抗体中和bFGF，阻断其与受体的结合也被认为是用于肿瘤治疗的一种有效方法。
治疗性单克隆抗体在临床上已研究了三十多年，有超过400种治疗性单克隆抗体进入商业支持的临床阶段，现在单克隆抗体已经被建立成为针对多种疾病的关键治疗方式。1995年，第一个鼠源性单抗edrecolomab在德国被批准，这次批准是开创性的，但是由于鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起针对异种蛋白的免疫反应，产生抗小鼠抗体(HAMA)，批准后的研究中证明这种治疗方法不及标准的治疗方法，edrecolomab最终退出了市场。随着分子生物学技术的进展和抗体结构的阐明，DNA重组技术开始应用于抗体的改造，出现了各种各样的基因工程抗体。最初出现的基因工程抗体是为了降低鼠单抗的异源性而进行的人源化改造，包括人鼠嵌合抗体和改型抗体。前者操作简便，但人源化程度稍低；后者技术难度较大，但人源化程度较高。抗体库技术的出现为人源化提供了新的手段，但技术路线尚需进一步成熟。接着为了改进抗体的性能陆续出现了各种小分子抗体和抗体融合蛋白等。其中小分子抗体作为具有抗原结合功能的抗体分子片段，具有分子量小、穿透力强、易于构建及表达等优点。
双链抗体(Diabody)是在单链抗体的基础上构建的一种小分子抗体，具有分子量适中，双价等特点，是最好的肿瘤靶向抗体分子之一。且其亦具有瘤组织穿透力强和血液清除率适中等特点。二硫键稳定的双链抗体(ds-Diabody)是在Diabody的基础上通过引物二硫键而成为稳定的Diabody，具有提高稳定性的作用。因此具有广阔的应用前景。到目前为止尚未见到任何关于抗bFGF人源Diabody的文献和专利报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体。该二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体含有两个抗原结合位点，属于二价抗体，具有较好的亲和力；它是在单链抗体的基础上，通过定点突变引入2个半胱氨酸从而引入二硫键，构建成ds-Diabody，使两条肽链以共价键结合，大大提高了稳定性。
本发明的另一发明目的在于提供所述二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体，其氨基酸序列如下所示：QSVLTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTVVFGCGTKLTVLGGGGSQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKCLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARELTGDWGAFD IWGQGTMVTVSS；
编码所述的二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体的基因的核苷酸序列如下所示：CAGTCTGTGTTGACGCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAATCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTGTGGTATTCGGCTGTGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTGGCGGTGGCTCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCTAACTGGGGATTGGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA；
编码所述的二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的序列，是以编码如下所示的抗bFGF单链抗体的轻链可变区(VL)和重链可变(VH)区的基因为基础，通过重叠PCR，将抗体的VL第100位氨基酸Gly和VH第44位氨基酸Gly定点突变为Cys，引入共价键二硫键，同时用编码一个连接肽(氨基酸序列为GGGGS)的基因将突变的轻重链可变区连接一起构建成为VL-GGGGS-VH基因片段。将其与真核表达载体(p3XFLAG-Myc-CMV-25，Sigma公司)重组，接着在人胚肾细胞293T细胞中表达出的Diabody分子之间会形成共价二硫键，从而形成二硫键稳定的Diabody。
编码所述的抗bFGF单链抗体的重链可变区(VH)的基因序列如下所示：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCTAACTGGGGATTGGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA；
编码所述的抗bFGF单链抗体的轻链可变区(VL)的基因序列如下所示：
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG；
所述的二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的制备方法，包含以下步骤：
(1)以编码抗bFGF单链抗体的VL基因和VH基因片段为模板，通过重叠PCR和PCR，将抗体VL第100位氨基酸Gly和VH第44氨基酸Gly定点突变为Cys，轻重链可变区基因之间通过一个连接肽的基因片段相连，构建成编码VL-GGGGS-VH的基因片段；
(2)将步骤(1)得到的VL-GGGGS-VH的基因片段克隆到真核表达载体中表达，纯化，得到二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体。
步骤(1)中所述的的VH基因的核苷酸序列如下所示：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCTAACTGGGGATTGGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA；
步骤(1)中所述的的VL基因的核苷酸序列如下所示：
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG；
步骤(1)优选为具体如下：
①设计引物：
引物1：5′-GCGGCCGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCC-3′；
引物2：5′-TAGGACGGTCAGCTTGGTCCCACAGCCGAATACCACAGTGCTGCT-3′；
引物3：5′-CGAGCCACCGCCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC-3′；
引物4：5′-GGTGGCGGTGGCTCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT-3′；
引物5：5′-CCCACTCCAGACACTTCCCTGGAGCCTGGCGGA-3′；
引物6：5′-TCCAGGGAAGTGTCTGGAGTGGGTTTCATACAT-3′；
引物7：5′-GGATCCTCAATGATGATGATGATGGTGTGAGGAGACAGTGACCAT-3′；
②PCR定点突变VL第100位氨基酸Gly为Cys，扩增得到基因片段VL-GGGGS：
A、以编码抗bFGF单链抗体的VL基因和VH基因片段为模板，以引物1和引物2PCR扩增得到第100位氨基酸由Gly突变为Cys的VL；
B、以步骤A得到的产物为模板，接着以引物1和引物3PCR扩增得到基因片段VL-GGGGS；
③PCR定点突变VH第44位氨基酸Gly为Cys，扩增得到基因片段VH-GGGGS：
C、以编码抗bFGF单链抗体的VL基因和VH基因片段为模板，以引物4和引物5PCR扩增得到第44位氨基酸Gly突变为Cys的VH-GGGGS；
D、以编码抗bFGF单链抗体的VL基因和VH基因片段为模板，接着以引物6和引物7PCR扩增得到带有BamHI位点的部分的VH-GGGGS；
E、将步骤C和步骤D得到产物进行拼接，得到拼接产物；接着以该拼接产物为模板，以引物4和引物7为模板，PCR扩增得到完整的VH-GGGGS；
④PCR拼接、扩增基因片段VL-GGGGS-VH：将步骤②和步骤③最终得到产物进行拼接，得到拼接产物；接着以该拼接产物为模板，以引物1和引物7PCR扩增得到完整的VL-GGGGS-VH；
步骤(2)所述的真核表达载体优选为p3XFLAG-Myc-CMV-25。
上述二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)bFGF是人源蛋白，本身并不能引起人的免疫反应，且bFGF与肿瘤关系密切，所以不能直接用其开发疫苗，而本发明制备的二硫键稳定的抗bFGF双链抗体作为一种全人源性的抗体，解决了鼠源单抗无法避免的人抗鼠抗体(HAMA)反应，可以直接开发抗体药物用于人体治疗。
(2)本发明制备的二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体，是通过二硫键将两个单链抗体共价相联而形成的二聚体，含有两个抗原结合位点，是二价的，具有良好的亲和力；其次ds-Diabody中引入了二硫键，使两条肽链以共价键结合，大大增强了抗体的稳定性；而且ds-Diabody的相对分子质量适中，具有良好的肿瘤靶向、瘤组织穿透力和较长的血液清除率，在临床诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是经过定点突变PCR扩增构建的二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体基因片段的凝胶电泳结果图；
泳道M为核酸分子量标准；泳道1为PCR扩增获得的经过定点突变的ds-Diabody基因片段。
图2是表达载体p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody经双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果图；
泳道M1和泳道M2分别核酸分子量标准；泳道1是表达载体p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody的双酶切结果。
图3是表达载体p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody的构建图谱图。
图4是二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的细胞表达上清经还原性和非还原性凝胶电泳SDS-PAGE后的Western blot结果图；
泳道1是ds-Diabody细胞表达上清经非还原性SDS-PAGE后进行的Westernblot分析结果；泳道2是ds-Diabody细胞表达上清经还原性SDS-PAGE后进行的Western blot分析结果。
图5是表达的二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体经Ni SepharoseTM 6FastFlow纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳结果图；
其中泳道M为蛋白分子量标准；泳道1是纯化抗bFGF人源性双链抗体ds-Diabody。
图6是间接ELISA检测抗bFGF人源双链抗体ds-Diabody结合抗原bFGF的活性图。
图7是抗bFGF人源性双链抗体ds-Diabody稳定性分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
编码抗bFGF单链抗体的VL基因和VH基因片段的制备：
(1)噬菌体抗体库的筛选
首先将bFGF(北京启维益成公司)用0.05mol/L、pH8.7的碳酸盐缓冲液稀释至50～100μg/ml，用1ml包被免疫管(Immunotube，NUNC公司)，4℃过夜，次日以质量体积比2.5％的脱脂奶粉加满免疫管37℃封闭2h，倒去封闭液，加入1ml噬菌体抗体库(约1013CFU)(Enprobiotech公司)，37℃孵育2h，吸去噬菌体抗体液，以含体积百分比0.05％吐温20的PBS(0.01M、pH7.2)洗2次(第二轮洗10次，以后洗涤20次以上)，蒸馏水洗涤1次。
然后用2种方法回收结合于固相的噬菌体抗体：①先加入1ml新鲜XL1-Blue菌(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，37℃孵育15min后转入10ml含20μg/mlAmp(氨苄青霉素)、10μg/ml Tet(四环素)的SB培养基(每升培养基含细菌培养用胰化蛋白陈309g，酵母提取物209g，19gMoPs，pH7.0)；②再将细菌感染回收后的免疫管用蒸馏水洗涤2次，加入1ml洗脱液(0.1ml HCl、以甘氨酸调至pH＝2.2后加入BSA至质量体积比为0.1％)，于37℃静置15min，进行洗脱回收，将洗脱液吸出后，立即加入40μl 2mol/L Tris溶液中和，再加入10mlXL1-Blue细胞(OD600＝0.8)37℃静置15min，接着加入10ml含20μg/ml Amp、10μg/ml Tet的SB培养基。从2次回收的菌液分别取出适量铺盘测定CFU，其余细菌37℃培养3h，扩大体积到50ml，加入1.7×1012PFU辅助病毒VCSM13(广州英韦创津生物科技有限公司)，30℃振荡培养过夜。次日回收上清，常规PEG沉淀，所得的次级噬菌体抗体库可进行下一轮的筛选。按相同方法进行3轮淘选，得到阳性噬菌体scFv抗体克隆。
(2)噬菌体抗体的制备及抗bFGF特异性的检测
从筛选第4轮的培养盘随机挑取集落在含有50μg/mL Amp的2YT培养液中37℃过夜培养，第二天取30μl细菌到1ml LB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入辅助病毒VCSM13，30℃培养过夜，收取上清。按以下程序进行ELISA检测：将抗原(即bFGF)稀释至10μg/ml，用50μl稀释后的抗原包被ELISA板，2h后弃去孔内液体，用质量体积比3％脱脂奶-PBS溶液(即用0.01M、pH7.2的PBS配制的脱脂奶溶液)封闭后加入噬菌体抗体液(即第三轮筛选获得的阳性噬菌体)，37℃孵育1h，用质量体积比0.05％Tween20-PBS溶液(即用0.01M pH7.2的PBS配制的脱脂奶溶液)洗涤3次，加入HRP-抗M13鼠单抗(Promega公司)进行反应，洗涤后加入TMB底物显色，读取A450值。筛选到的具有与bFGF特异性结合的噬菌体抗体克隆。测序，得到编码抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的基因。
编码重链可变区的基因序列(VH基因)如下所示：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCTAACTGGGGATTGGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA；
编码轻链可变区的基因序列(VL基因)如下所示：
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG。
将测序正确的阳性克隆，通过下述引物扩增之后，连接到原核表达载体pET32a(Promega公司)中。
PCR的反应条件为：
反应体系为50μl：
扩增ScFv的上游引物5’-GGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGA-3’；
下游引物：5’-AAGCTTGCTGACCGTCCTAGGG-3’；
10×PCR Buffer(Mg2+)5μl，dNTP Mixture(2mM)5μl，上下游引物各1μl(10μmol/L)，Blendtaq-plus(Promega公司)0.5μl，阳性噬菌体抗体克隆1μl，灭菌去离子水补充至50μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性4min，94℃变性45s，54℃退火40s，72℃延伸60s，28个循环后，72℃延伸10min。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到PCR扩增的ScFv片段。
酶切反应：通过BamHI(Takara公司)和HindIII(Takara公司)双酶切pET32a载体，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段；通过BamHI(Takara公司)和HindIII(Takara公司)双酶切PCR扩增的ScFv片段，通过酶切产物回收试剂盒回收ScFv片段。
连接反应体系(10μl)：pET32a酶切产物(50ng/μl)1μl，ScFv酶切产物5uL(50ng)，连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶(Promega公司)1uL。加去离子水至终体积为20μl。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌HB2151(Promega公司)，挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定，将阳性克隆送上海生物工程公司测序，得到构建的pET32a-ScFv重组载体。
实施例2
本发明中二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体，是以实施例1制备的编码抗bFGF单链抗体的VL基因和VH基因片段为基础，通过Overlap PCR和PCR，将抗体VL第100位氨基酸Gly和VH第44位氨基酸Gly定点突变为Cys，引入共价键二硫键，同时用编码一个连接肽(氨基酸序列为GGGGS)的基因片段，构建得到VL-GGGGS-VH基因片段(长度为705bp)，表达的两个VL-GGGGS-VH(分子量为49.78KD)分子间通过二硫键共价连接，形成二硫键稳定的双链抗体。
本发明中二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的制备方法，步骤如下：
(一)制备VL-GGGGS-VH
(1)PCR定点突变VL第100位氨基酸Gly为Cys，扩增得到基因片段VL-GGGGS：
反应1)：设计引物：
引物1：5′GCGGCCGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCC-3′(Not I)；
引物2：5′-TAGGACGGTCAGCTTGGTCCCACAGCCGAATACCACAGTGCTGCT-3′(Cys)；
反应体系①为：
10×PCR Buffer(Mg2+)5μl，dNTP混合物(浓度2mM)5μl，引物1(10μmol/L)1μl，引物2(10μmol/L)1μl，Blendtaq-plus(2.5U/μl，Promega公司)0.5μl，pET32a-ScFv重组载体1μl(50μmol/L)，灭菌去离子水36.5μl；总体积为50μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性2min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到第100位氨基酸Gly突变为Cys的VL。
反应2)：设计引物
引物1：5′-GCGGCCGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCC-3′(Not I)；
引物3：5′-CGAGCCACCGCCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC-3′(Linker)；
反应体系②为：
10×PCR Buffer(Mg2+)5μl，dNTP Mixture(2mM)，5μl，引物1(10μmol/L)1μl，引物3(10μmol/L)1μl，Blendtaq-plus(2.5U/μl)0.5μl，反应1)得到的胶回收产物为模板1μl，灭菌去离子水36.5μl；总体积为50μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性2min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到基因片段VL-GGGGS。
(2)PCR定点突变VH第44位氨基酸Gly为Cys，扩增得到部分的基因片段VH-GGGGS：
反应3)：设计引物
引物4：5′-GGTGGCGGTGGCTCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT-3′(Linker)；
引物5：5′-CCCACTCCAGACACTTCCCTGGAGCCTGGCGGA-3′(Cys)；
反应体系③为：
10×PCR Buffer(Mg2+)5μl，dNTP Mixture(2mM)5μl，引物4(10μmol/L)1μl，引物5(10μmol/L)1μl，Blendtaq-plus(2.5U/μl)0.5μl，抗bFGF ScFv的质粒1μl，灭菌去离子水36.5μl；总体积为50μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性2min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环后，72℃延伸5min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到部分的VH-GGGGS。
反应4)：设计引物：
引物6：5′-TCCAGGGA AGTGTCTGGAGTGGGTTTCATACAT-3′(Cys)；
引物7：5′-GGATCCTCAATGATGATGATGATGGTGTGAGGAGACAGTGACCAT-3′(BamHI)：
10×PCR Buffer(Mg2+)5μl，dNTP Mixture(2mM)5μl，引物6(10μmol/L)1μl，引物7(10μmol/L)1μl，Blendtaq-plus(2.5U/μl)0.5μl，pET32a-ScFv重组载体质粒1μl，灭菌去离子水36.5μl；总体积为50μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸5min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到带有BamHI位点的部分的VH-GGGGS。
反应5)：PCR拼接、扩增基因片段VH-GGGGS。
Overlap PCR拼接反应体系(25μl体系)
10×PCR Buffer(Mg2+)2.5μl，dNTP Mixture(2mM)2μl，反应3)得到的产物5μl，反应4)得到的产物5μl，Blendtaq-plus(2.5U/μl)0.5μl，灭菌去离子水10μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，7个循环后，72℃延伸10min。
PCR扩增基因片段VH-GGGGS，向上述拼接产物中加入等体积的扩增反应溶液(25LLl)：
10×PCR Buffer(Mg2+)2.5μl，dNTP Mixture(2mM)4μl，引物41μl，引物7 1μl，Blendtaq-plus(2.5U/μl)0.5μl，灭菌去离子水16μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到完整的VH-GGGGS。
(3)PCR拼接、扩增基因片段VL-GGGGS-VH
Overlap PCR拼接反应体系(25μl体系)
10×PCR Buffer(Mg2+)2.5μl，dNTP Mixture(2mM)2μl，反应2)得到的产物5μl，反应5)得到的产物5μl，Blendtaq-plus(2.5U/μl)0.5μl，灭菌去离子水10μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，7个循环后，72℃延伸10min。扩增得到的产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，根据片段长度推断已经得到VL-GGGGS-VH片段。
(二)构建克隆载体PMD18-T-ds-Diabody及重组表达质粒p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody。
(1)构建克隆载体PMD18-T-ds-Diabody
将扩增得到的基因片段VL-GGGGS-VH连接到pMD18-T载体(宝生物工程有限公司)上，连接反应体系(10μl)：
pMD18-T(50ng/μl)1μl，VL-GGGGS-VH片段100ng，Solution I 10μl，加去离子水至终体积为20μl；
16℃连接8h，连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(宝生物工程有限公司)，接种于Amp+的LB琼脂糖培养板上过夜，挑取单菌落扩增，提质粒，经Not I和BamH I酶切鉴定正确后，送上海生工测序，测序结果显示通过突变获得的DsDiabody基因正确，克隆载体构建成功。
(2)构建表达载体p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody。
①用Not I和BamH I分别双酶切克隆载体PMD18-T-ds-Diabody和表达载体p3XFLAG-Myc-CMV-25。
酶切体系(50μl)：
PMD18-T-ds-Diabody/p3XFLAG-Myc-CMV-251μg，10×Buffer K 2.5μl，BSA5μl，Not I(4～12U/μl)2μl，BamH I(8～20U/μl)2μl，加去离子水至终体积为50μl；
37℃酶切8h，酶切反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，分别得到表达载体p3XFLAG-Myc-CMV-25，以及带有Not I和BamH I酶切位点的VL-GGGGS-VH。
②将从①酶切得到的基因片段VL-GGGGS-VH与酶切后表达载体p3XFLAG-Myc-CMV-25进行连接。
连接反应体系(20μl)：
VL-GGGGS-VH 200ng，p3XFLAG-Myc-CMV-25450ng，10×Buffer 2μl，T4DNA连接酶(350U/μl)1μl，加去离子水至终体积20μl；
16℃连接12h，连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种于Amp+的LB琼脂糖培养板上过夜，挑取单菌落扩增，提质粒，经Not I和BamH I酶切鉴定，结果显示表达载体p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody构建成功(如图2所示)，其结构示意图如图3所示。
(三)二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的表达与western blot鉴定。
(1)二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的表达
接种3×106个人胚肾(HEK 293T)细胞(中科院上海细胞所)到100mm×20mm的细胞培养皿中，以含体积百分比10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基于37℃、5％CO2培养15小时，转染前将细胞培养基换为含有100μmol/L氯喹的DMEM基本培养基。将p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody10μg加入到500μL opti-MEM I低血清培养基中，混匀后加入40μL的转染试剂Fugene HD，涡旋混匀后低速(800rpm)离心，室温静置15分钟，然后逐滴加入到细胞培养皿中，混匀后37℃培养6小时，0.015mol/L PBS(pH7.4)洗涤细胞两次后，加入含有体积百分比10％FBS、4mmol/L丙戊酸的DMEM培养基，33℃、5％CO2培养，每64h换液一次，共换液二次。将换掉的细胞培养上清收集起来用于纯化抗体。
(2)二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体表达上清的western blot鉴定。
取细胞表达上清15μL，按分子克隆进行操作，经还原性和非还原性SDS-PAGE后，进行Western blot鉴定，结果(图4)显示经还原性SDS-PAGE后，在分子量30kD处有一条蛋白带；经非还原性SDS-PAGE后，在分子量50kD处有一蛋白带，说明ds-Diabody构建成功。
(四)二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的纯化与SDS-PAGE鉴定。
将收集的细胞表达上清用50％的饱和硫酸铵沉淀，4℃放置过夜后，8500r/min离心20min，弃上清，于沉淀中加入8ml PB(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.4)使之溶解，经PB透析后，用0.45μm滤膜过滤，然后用Ni SepharoseTM6Fast Flow进行纯化：先用水冲洗，再用平衡缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH7.4)冲洗平衡，然后以250μl/min的流速上样，上样后用平衡缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH7.4)冲洗，然后用含有200mmol/L咪唑的PB洗脱杂蛋白，用含有300mmol/L咪唑的PB洗脱目的蛋白。最后将所收集的目的蛋白30KD超滤管超滤并用PBS(0.015mol/L、pH值7.4)置换。纯化后的产物用12％SDS-PAGE电泳鉴定(如图5所示)，结果显示在分子量30kD处有一条蛋白带，并且纯化后抗体的纯度达到了95％。
实施例3
以下是根据上述方法制备出的二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的相关生物学活性的测试，测试方法及结果如下：
(一)间接ELISA检测二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体同抗原bFGF结合活性。
将重组人bFGF(北京启维益成公司)用0.05mol/L、pH值9.6的碳酸盐缓冲液稀释至0.5μg/ml，以100μL/孔包被ELISA板，37℃孵育3h后弃去孔内液体，PBST(含体积百分比0.05％Tween20的0.015mol/L、pH值7.4的PBS)洗涤3次。用质量百分比5％脱脂奶-PBST封闭后，以100μL/孔加入一定浓度实施例1制备的ds-Diabody和抗bFGF ScFv，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次后，100μL/孔加入1∶20000(体积比)稀释的抗His-tag鼠单抗(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，100μL/孔加入1∶8000(体积比)稀释的HRP标记的羊抗鼠多抗(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，37℃孵育0.5h，PBS-T洗涤5次之后加入TMB显色，测A450值，实验以PBS为阴性对照。
结果如图6所示，显示相对于ScFv，ds-Diabody能更好的与抗原bFGF进行特异性结合，具有良好的亲和力。
(二)二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体体外血清的稳定性检测
将一定浓度纯化的ds-Diabody和ScFv置37℃含质量体积比0.2％人血清白蛋白(HAS)的PBS中，37℃孵育0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h；于各时间点取孵育后的抗体，100μL/孔加入到以50ng/孔包被有bFGF的ELISA板中，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次后，100μL/孔加入1∶2万稀释的抗His-tag鼠单抗，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，100μL/孔加入1∶8000稀释的HR标记的羊抗鼠多抗，37℃孵育0.5h，PBS-T洗涤5次之后加入TMB显色，测A450值。
结果如图7所示，显示ScFv在37℃含0.2％HSA的PBS中孵育1h后活性就开始下降，2h后活性仅剩约1/2，24h后活性完全丧失。而ds-Diabody在37℃含0.2％HSA的PBS中孵育72h后结合活性并无明显的改变，具有很好的稳定性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000125971090000011
Figure IDA0000125971090000021
Figure IDA0000125971090000041
Figure IDA0000125971090000051
Figure IDA0000125971090000061

Claims (6)

1.一种二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体，其特征在于：编码所述的二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.权利要求1所述的二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)以编码抗bFGF单链抗体的VL基因和VH基因片段为模板，通过重叠PCR和PCR，将抗体VL第100位氨基酸Gly和VH第44氨基酸Gly定点突变为Cys，轻重链可变区基因之间通过一个连接肽的基因片段相连，构建成编码VL-GGGGS-VH的基因片段；VH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；VL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(2)将步骤(1)得到的VL-GGGGS-VH的基因片段克隆到真核表达载体中表达，纯化，得到二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体。
4.根据权利要求3所述的二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体包含以下步骤：
①设计引物：
引物1：5′-GCGGCCGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCC-3′；
引物2：5′-TAGGACGGTCAGCTTGGTCCCACAGCCGAATACCACAGTGCTGCT-3′；
引物3：5′-CGAGCCACCGCCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC-3′；
引物4：5′-GGTGGCGGTGGCTCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT-3′；
引物5：5′-CCCACTCCAGACACTTCCCTGGAGCCTGGCGGA-3′；
引物6：5′-TCCAGGGAAGTGTCTGGAGTGGGTTTCATACAT-3′；
引物7：5′-GGATCCTCAATGATGATGATGATGGTGTGAGGAGACAGTGACCAT-3′；
②PCR定点突变VL第100位氨基酸Gly为Cys，扩增得到基因片段VL-GGGGS：
A、以编码抗bFGF单链抗体的VL基因和VH基因片段为模板，以引物1和引物2PCR扩增得到第100位氨基酸由Gly突变为Cys的VL；
B、以步骤A得到的产物为模板，接着以引物1和引物3PCR扩增得到基因片段VL-GGGGS；
③PCR定点突变VH第44位氨基酸Gly为Cys，扩增得到基因片段VH-GGGGS：
C、以编码抗bFGF单链抗体的VL基因和VH基因片段为模板，以引物4和引物5PCR扩增得到第44位氨基酸Gly突变为Cys的VH-GGGGS；
D、以编码抗bFGF单链抗体的VL基因和VH基因片段为模板，接着以引物6和引物7PCR扩增得到带有BamHI位点的部分的VH-GGGGS；
E、将步骤C和步骤D得到产物进行拼接，得到拼接产物；接着以该拼接产物为模板，以引物4和引物7为模板，PCR扩增得到完整的VH-GGGGS；
④PCR拼接、扩增基因片段VL-GGGGS-VH：将步骤②和步骤③最终得到产物进行拼接，得到拼接产物；接着以该拼接产物为模板，以引物1和引物7PCR扩增得到完整的VL-GGGGS-VH。
5.根据权利要求3所述的二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的真核表达载体为p3XFLAG-Myc-CMV-25。
6.权利要求1或2所述的二硫键稳定的抗bFGF人源性双链抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
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