CN102520171B

CN102520171B - 图案编码悬浮阵列芯片的检测方法

Info

Publication number: CN102520171B
Application number: CN2011104080139A
Authority: CN
Inventors: 张继中
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2031-12-09
Also published as: CN102520171A

Abstract

本发明涉及一种图案编码悬浮阵列芯片的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：a、在检测基底上构筑能够固定图案编码微载体的微坑阵列；b、将需要检测的图案编码微载体以一个微坑固定一个图案编码微载体的方式固定在检测基底上的微坑阵列中；c、通过成像技术对在检测基底上微坑阵列中形成的图案编码微载体阵列成像以进行检测。该方法不仅解决了图案编码微载体在溶液中难以聚焦、易于互相干扰的问题，而且可以在片高通量、清晰且廉价地获取检测信息，因此为图案编码微载体悬浮阵列芯片的实际应用提供了可能。

Description

图案编码悬浮阵列芯片的检测方法

技术领域

本发明涉及图案编码悬浮阵列芯片的检测方法，尤其是在图案编码微载体与待测样品作用且检测信号可以获取的情况下，首先将图案编码微载体在微坑阵列基底上固定，然后在成像设备下解码及光学信号读取。该方法不仅可以解决常规的图案编码微载体通过流式细胞术检测时微载体不能在片检测及检测通量有限的问题，而且能够解决微载体在溶液中由于运动而难以聚焦并获取信号的问题。因此可望推进图案编码悬浮阵列芯片的发展及应用。

背景技术

悬浮阵列芯片技术也称微载体技术，它是一种通过编码微颗粒上固定的传感敏感材料与待测样品间特异性相互作用而在流体中进行多目标检测分析的工具。它不仅具有通常多目标检测分析技术所具备的信息量大、检测时间短、所需检测样品体积小以及检测成本相对传统检测方法低的特点，而且无论是制备还是使用它均较另外一种多目标检测分析技术-平面微阵列芯片技术有着许多突出的优势：更大的产量、更灵活的检测目标安排、更快速的反应以及更高质量的实验结果。因此，悬浮阵列芯片的研发正越来越受到了人们的高度关注并逐渐在药物筛选、医疗卫生、食品安全、反恐等领域得到广泛应用。

在悬浮阵列芯片中图案编码微载体由于图案易于识别且编码量大而获得人们的广泛关注。但是目前的图案编码微载体悬浮阵列芯片均通过流式细胞术进行检测，这样不仅不能在片检测（即检测前及检测后微载体均在检测基底上），而且其检测通量也受到很大程度的限制。而人们之所以采用流式细胞术进行检测的原因就在于当微载体在溶液中运动状态下难以聚焦以获取信号，并且在检测过程中由于遮挡等问题而易于相互干扰。而通过流式细胞术对图案编码微载体进行检测也受到运动中图案识别存在困难的状况,因此虽然图案编码微载体有着包括编码量大等众多优点，但是目前实际应用的悬浮阵列芯片仍然是以编码数量少的光学编码为主。这既限制了悬浮阵列芯片的应用范围同时也影响了悬浮阵列芯片的推广应用。因此开发能够对图案编码微载体进行有效识别的检测技术就成为一件很有意义的工作。为此本申请首次提出在为图案编码微载体构筑固定用微坑阵列并进行固定的基础上通过成像技术对图案编码微载体进行检测的方法。该技术不仅能够在片清晰读取图案编码微载体的编码，而且成像技术所具备的廉价、高通量也使得图案编码微载体悬浮阵列芯片在与平面微阵列芯片及其它编码悬浮阵列芯片的对比中有了更多的优势。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种适合图案编码微载体悬浮阵列芯片的检测方法，特别是在为图案编码微载体在检测基底上构筑固定用微坑阵列的情况下将需要检测的图案编码微载体在微坑阵列上固定，然后通过成像技术对需要检测的图案编码微载体阵列成像以进行检测。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种图案编码悬浮阵列芯片的检测方法，该方法包括如下步骤：

a、在检测基底上构筑能够固定图案编码微载体的微坑阵列；

b、将需要检测的图案编码微载体以一个微坑固定一个图案编码微载体的方式固定在检测基底上的微坑阵列中；

c、通过成像技术对在检测基底上微坑阵列中形成的图案编码微载体阵列成像以进行检测。

优选的，检测基底上的微坑阵列是根据微载体形状通过刻蚀技术或者模板复制技术制作的微坑阵列。

优选的，所述将需要检测的图案编码微载体以一个微坑固定一个图案编码微载体方式固定在微坑阵列中是指通过作用力将图案编码微载体固定至微坑阵列中。

优选的，所述成像技术是指采用包括光学显微镜、荧光显微镜、红外显微镜、拉曼显微镜、扫描仪、照相机在内的成像设备对图案编码微载体阵列进行成像。

优选的，所述需要检测的图案编码微载体是指固定有传感敏感材料的图案编码微载体完成包括与待测样品的作用在内的信号提取前的所有步骤进行信号提取的图案编码微载体。

有益效果：本发明首次将图案编码微载体先固定至检测基底上微坑阵列中然后通过成像技术进行图案编码微载体的检测不仅解决了图案编码微载体在溶液中难以聚焦、易于互相干扰的问题，而且可以在片高通量、清晰且廉价地获取检测信息，因此为图案编码微载体悬浮阵列芯片的实际应用提供了可能。

附图说明

图1是图案编码悬浮阵列芯片检测方法示意图；

其中 a 含微坑阵列的检测基底；b 图案编码微载体；c 荧光标记复合物；

图2是微坑阵列俯视图；

图3a是一种点编码模板；

图3b是另外一种点编码模板；

图3c是第三种点编码模板；其中

3-1第一编码；3-2第二编码；3-3第三编码；

a’方向识别区的方向识别符；b’编码区编码为1；c’编码区编码为0。

具体实施方式

下面将参照附图对本发明进行说明。

本发明的图案编码悬浮阵列芯片的检测方法采用下述步骤进行：

a、在检测基底上构筑能够固定图案编码微载体的微坑阵列；

检测基底上的微坑阵列是根据微载体形状通过刻蚀技术或者模板复制技术制作的微坑阵列。

所述将需要检测的图案编码微载体以一个微坑固定一个图案编码微载体方式固定在微坑阵列中是指通过作用力将图案编码微载体固定至微坑阵列中。

所述成像技术是指采用包括光学显微镜、荧光显微镜、红外显微镜、拉曼显微镜、扫描仪、照相机在内的成像设备对图案编码微载体阵列进行成像。

所述需要检测的图案编码微载体是指固定有传感敏感材料的图案编码微载体完成包括与待测样品的作用在内的信号提取前的所有步骤进行信号提取的图案编码微载体。

实施例一：

首先通过微电子光刻蚀工艺在硅片上分别制备尺寸为350微米间距为500微米深度为10微米的字符A、B、及C的凸型模板。然后将道康宁SYLGARD 184硅橡胶的基本组分与固化剂按10:1重量比完全混合，将其倒入含凸型字符硅片模板的容器中，抽真空至无气泡，并于100℃条件下固化1.5h，冷却、脱模即得到含凹型反写字符A、B及C阵列的PDMS模板。然后配制含2%二氧化硅、1%聚乙烯醇1750，10%丙烯酰胺和5% N,N-亚甲基双丙烯酰胺的水溶液，混合均匀后在用前加入1%过硫酸铵（APS）的溶液，备用。用点样仪取0.1微升上述溶液将其分别在有反写字符A、B及C阵列的PDMS模板上点样。然后在氮气保护及湿度大于80%RH的情况下室温聚合8小时得到含凸型字符图案A、B、C编码的不倒翁状微颗粒。将凸型字符A、B及C图案编码的不倒翁微颗粒通过戊二醛分别连接甲型肝炎抗体、乙型肝炎抗体、丙型肝炎抗体（这些抗体为传感敏感材料）即获得凸型字符图案编码的聚丙烯酰胺不倒翁微载体。分别取7-8个连接了甲肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体的凸型字符图案编码聚丙烯酰胺不倒翁微载体与人的血清样在37摄氏度混合反应2h后，用PBS缓冲液清洗，再与CY3荧光标记的甲肝抗体、乙肝抗体、丙肝抗体溶液反应1h并清洗得到待测凸型字符编码不倒翁微载体。

另外通过微电子工艺在硅片表面刻蚀出尺寸为400微米，深度为200微米间距为500微米的微坑阵列的。将上述待检测的微载体溶液滴加在硅片的微坑阵列上并借助微载体自身的重力作用使得大部分上述待测不倒翁微载体沉积至微坑中，然后用海绵轻轻拭去多余的溶液及微坑外的不倒翁微载体。然后在金相荧光显微镜下观察，根据不同字符编码不倒翁微载体上荧光的有无即可判断所测血清样品中是否含有甲肝病毒、乙肝病毒或者丙肝病毒。

实施例二：

先通过爱普生R230喷墨打印机将浓度为20wt%的尺寸范围介于100纳米至250纳米的含5%超顺磁性的尺寸为10纳米的四氧化三铁的交联聚甲基丙烯酸甲酯微球含40%的乙二醇的水溶液分别在投影片基（溶液的接触角为80度）上打印出间距为500微米尺寸为400微米的圆形、方形及三角形阵列。室温干燥后在150摄氏度下处理1小时，然后通过去离子水将交联聚甲基丙烯酸甲酯构建的圆形、方形及三角形片状微颗粒从投影片基上冲洗下来并清洗干燥。将所获得的圆形、方形及三角形片状交联聚甲基丙烯酸甲酯微颗粒先通过氨等离子处理1分钟后，将其置于1%的戊二醛PB缓冲液室温反应4小时，随后用PBS缓冲液10分钟清洗三次。然后分别用0.2mg/ml的甲肝抗体的PBS缓冲溶液4摄氏度处理圆形微颗粒12小时，用0.2mg/ml的乙肝抗体的PBS缓冲溶液4摄氏度处理方形微颗粒12小时，用0.2mg/ml的丙肝抗体的PBS缓冲溶液4摄氏度处理三角形微颗粒12小时。未反应的戊二醛用1%的BSA的PBS缓冲溶液反应2小时进行阻塞。PBS缓冲液清洗后，以3-4个/10微升的浓度储存于4摄氏度的PBS缓冲液中，得到能够检测甲肝的圆形图案编码片状微载体，检测乙肝的方形图案编码片状微载体及检测丙肝的三角形图案编码片状微载体。检测前各取20微升的圆形编码微载体储存液、方形编码微载体的储存液及三角形编码微载体的储存液混合并在37摄氏度与待测血清样品在振荡器中以180rpm速度孵育2小时，然后用PBST溶液清洗三次。加入4微克/毫升的CY3标记甲肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体PBS缓冲溶液，在37摄氏度以60RPM的速度孵育1小时，随后用PBS清洗三次得到待测的不同图案编码微载体。

另外通过微电子工艺在硅片表面刻蚀出尺寸为450微米，深度为150微米间距为500微米的圆形微坑阵列的。将上述待检测的微载体溶液滴加在硅片的微坑阵列上并借助微载体自身的重力作用及微坑阵列背面的磁铁的磁力作用使得大部分上述待测圆形、方形及三角形片状微载体沉积至微坑中，然后用海绵轻轻拭去多余的溶液及微坑外的微载体。然后在倒置荧光显微镜下观察，根据不同形状编码微载体上荧光的有无即可判断所测血清样品中是否含有甲肝病毒、乙肝病毒或者丙肝病毒。

实施例三：

首先在避光条件下配制含5wt%超顺磁的尺寸约为10纳米的氧化铁胶体的2M丙烯酰胺及2mM甲叉双丙烯酰胺及1.5%v/v的2-羟基-2-甲基苯丙酮水溶液。将该溶液置于一厚度约为50微米边长为500微米的方形透紫外光的流动池中保持不动。然后取出如图3-1具有长方形边长尺寸约为300微米*150微米的点编码阵列的掩模板。其中a’为点编码方位识别标志以提供微载体图案编码识别的起始位置及方向。b’为编码区不透光时其编码为1，而c’则为编码区透光时其编码为0。这样每个点可以有两个编码，则这种点编码微载体的编码数量就为2⁵=32个。将该掩模板放置在流动池的上方并在其上面将100W的高压汞灯照射50秒，随即关闭汞灯并将流动池中的液体冲入烧杯中。用磁铁将由点编码的掩模板所制备的微孔编码方形片状微载体从溶液中分离并用去离子水清洗三次，重复制备数十个微载体。然后再采用相似方法制备如图3-2及图3-3不同微孔编码的微载体。取三种微孔编码的微载体分别连接传感敏感材料a：5’-丙烯酰氧基-TTT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3’； b：5’-丙烯酰氧基-TAT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3’；C：5’-丙烯酰氧基-TCT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3’； d：5’-丙烯酰氧基-TGT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3’并用去离子水清洗，获得能够检测核酸序列a、b、c及d的微载体。从四种微载体中各取三个微载体与0.2M的氯化钠及含0.05%的Tween-20的Tris-EDTA缓冲液中的生物素连接待测样品杂交后用PBS缓冲液清洗。随后将微载体进一步与连接有藻红蛋白的抗生蛋白链菌素的PBST缓冲液在37摄氏度混合孵育30分钟。随后用PBS清洗并保存得到待测微孔编码微载体。

另外通过微电子工艺在硅片表面刻蚀出尺寸为350微米，深度为60微米间距为400微米的圆形微坑阵列。然后将道康宁SYLGARD 184硅橡胶的基本组分与固化剂按10:1重量比完全混合，将其倒入放置了含圆形微坑阵列的硅片的容器中，抽真空至无气泡，并于100℃条件下固化1.5h，冷却、脱模即得到含微突起的PDMS模板。再在PDMS模板上铺展20%的聚苯乙烯N,N’-二甲基甲酰胺溶液，干燥后在200摄氏度处理2小时，冷却后将含有圆形微坑阵列的聚苯乙烯片材与PDMS分离。

将上述待检测的微载体溶液滴加在聚苯乙烯片材的微坑阵列上并借助微载体自身的重力作用及微坑阵列背面的磁铁的磁力作用使得大部分上述待测不同微孔编码片状微载体以一个微坑一个微载体的形式沉积至微坑中，然后用海绵轻轻拭去多余的溶液及微坑外的微载体。然后在倒置荧光显微镜下观察，根据不同微孔图案编码微载体上荧光的有无即可判断所测血清样品中是否含有甲肝病毒、乙肝病毒或者丙肝病毒。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。

Claims

1.一种图案编码悬浮阵列芯片的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

a、在检测基底上构筑能够固定图案编码微载体的微坑阵列；

2.根据权利要求1所述图案编码悬浮阵列芯片的检测方法，其特征在于，检测基底上的微坑阵列是根据微载体形状通过刻蚀技术或者模板复制技术制作的微坑阵列。

3.根据权利要求1所述图案编码悬浮阵列芯片的检测方法，其特征在于，所述将需要检测的图案编码微载体以一个微坑固定一个图案编码微载体方式固定在微坑阵列中是指通过作用力将图案编码微载体固定至微坑阵列中。

4.根据权利要求1所述图案编码悬浮阵列芯片的检测方法，其特征在于，所述成像技术是指采用包括光学显微镜、荧光显微镜、红外显微镜、拉曼显微镜、扫描仪、照相机在内的成像设备对图案编码微载体阵列进行成像。

5.根据权利要求1所述图案编码悬浮阵列芯片的检测方法，其特征在于，所述需要检测的图案编码微载体，是指固定有传感敏感材料的图案编码微载体，该微载体完成包括与待测样品的作用在内的信号提取前的所有步骤进行信号提取。