CN102517203A - 同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的***及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的***及方法，本发明采用Zn²⁺硫系玻璃敏感膜和Cl^-聚氯乙烯敏感膜同时沉积在结合光寻址电位传感器表面，形成Zn²⁺硫系玻璃敏感膜-Cl^-聚氯乙烯敏感膜-光寻址电位传感器，可以快速同时检测检测细胞外环境毒物中Zn²⁺浓度与细胞代谢Cl^-离子浓度，并推断出两者之间的定量化关系。构建的型腔体可以提高离子浓度的灵敏度，同时能保证检测条件的一致性，极大地降低更换配件成本，提高传感器封装单元的使用寿命；以上这些特点可以满足同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的要求，可广泛用于重金属浓度对细胞代谢机理研究的相关领域。

Description

同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的***及方法

技术领域

本发明涉及一种检测技术，尤其涉及一种同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的检测***及检测方法。

背景技术

细胞外环境毒物种类非常广泛，如细菌，病毒，有毒药物，重金属毒物等，也开发了检测这些环境毒物的传感器及检测手段。与此同时，细胞自身代谢传感器及检测方法也飞速地发展，如膜片钳法，安培计法，膜电容法等，这些技术也正在向商业化发展。然而，现有还没有可以同时检测细胞外环境毒物重金属离子的浓度与细胞代谢离子浓度的传感器及检测方法，因此，无法定量地研究胞外重金属离子浓度高低对细胞代谢的作用，并且无法给出两者之间的定量化关系，这成为阻碍细胞外环境毒物与细胞代谢机理分析快速发展的瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的检测***及方法，本发明可以实时快速并行检测和分析环境毒物中重金属离子与细胞代谢的离子浓度。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的检测***及方法，包括：微型培养腔、注射泵、培养液注射器、药物注射器、第一硅胶导管、废液缸、单片机、红外LED、传感器单元加热块、流路加热块和第二硅胶导管。其中，微型培养腔主要由腔盖、固定柱、铂丝电极、活塞、硅胶圈、小培养腔、大培养腔、固定腔、环状薄垫片、光寻址电位传感器、标准电话机接口、传感器电路板和传感器底座组成，固定腔中空，固定在传感器电路板上，标准电话机接口焊接在传感器电路板上；光寻址电位传感器在固定腔内，并通过导电胶粘结在传感器电路板上；大培养腔置于光寻址电位传感器上，大培养腔底部的第二半透膜与光寻址电位传感器接触，环状薄垫片置于大培养腔底部的第二半透膜上，小培养腔置于环状薄垫片上，固定柱、活塞和硅胶圈从上至下依次置于小培养腔底部的第一半透膜上，腔盖位于固定柱顶部，传感器底座位于传感器电路板底部，红外LED位于传感器底座的空腔内并焊接在传感器电路板底部，传感器底座置于传感器单元加热块上；腔盖、固定腔、传感器电路板和传感器底座通过固定螺杆固定。铂丝电极、第一硅胶导管、第二硅胶导管的一端均依次穿过腔盖、固定柱和活塞到达小培养腔内，铂丝电极的另一端通过电极引线与传感器电路板相连，第一硅胶导管的另一端穿过流路加热块后分别与培养液注射器和药物注射器相连，培养液注射器和药物注射器分别位于两个注射泵内；第二硅胶导管的另一端伸入废液缸内。标准电话机接口、传感器单元加热块、流路加热块和两个注射泵均与单片机相连。

进一步地，所述光寻址电位传感器上同时沉积了Zn²⁺硫系玻璃敏感膜和Cl^-聚氯乙烯敏感膜。

一种应用上述检测***同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的方法，包括以下步骤：

（1）将细胞培养至大培养腔中的第二半透膜上，依次将环状薄垫片和小培养腔盖在细胞上方，形成细胞培养微腔体，用于细胞的培养和检测；

（2）单片机初始化后，采用PID算法对传感器单元加热块和流路加热块进行37℃的恒温控制，单片机控制培养液注射器和药物注射器向细胞培养微腔体内注射入细胞培养液和药物；在铂丝电极上加载工作电压；

（3）单片机产生两个频率在1kHz-10kHz的PWM波，其中，一个PWM波驱动一个红外LED工作，该红外LED穿过传感器电路板的通孔照射光寻址电位传感器上Zn²⁺硫系玻璃敏感膜所在区域的背面；Zn²⁺硫系玻璃敏感膜所在区域产生与该PWM波的频率相同的光生电流信号；另一个PWM波驱动另一个红外LED23工作，该红外LED穿过传感器电路板的通孔照射光寻址电位传感器上Cl^-聚氯乙烯敏感膜所在区域的背面；Cl^-聚氯乙烯敏感膜所在区域产生与该PWM波的频率相同的光生电流信号，两个光生电流信号叠加，形成传感器信号；

（4）单片机通过标准电话机接口接收传感器信号，然后通过快速傅里叶变换计算出传感器两个检测区域产生的两个光生电流信号的幅值，通过光寻址电位传感器的电流电压曲线换算出离子产生的表面电势，最终计算出对应环境毒物的离子浓度和细胞代谢的离子浓度，实现同时检测环境毒物和细胞代谢的离子浓度。

本发明的有益效果，本发明采用Zn²⁺硫系玻璃敏感膜和Cl^-聚氯乙烯敏感膜同时沉积在结合光寻址电位传感器表面，形成Zn²⁺硫系玻璃敏感膜-Cl^-聚氯乙烯敏感膜-光寻址电位传感器，可以快速同时检测检测细胞外环境毒物中Zn²⁺浓度与细胞代谢Cl^-离子浓度的传感器，可有效用于同时检测环境毒物重金属Zn²⁺离子浓度与细胞代谢Cl^-离子浓度、并推断出重金属Zn²⁺离子浓度与细胞代谢之间的定量化关系。采用具有良好生物相容性半透膜培养细胞更利于细胞贴附和生长保持原有的生理状态，构建的微型腔体可以提高离子浓度的灵敏度，传感器整体单元的固定，使微腔体和流路腔具有良好的密封性，同时又能保证检测条件的一致性，整个传感器单元的所有配件均采用可分离独立式设计，便于传感器单元各部分的配件快速更换，极大的降低更换配件成本，提高传感器封装单元的使用寿命。以上这些优点和功能可以满足同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的检测要求，可广泛用于重金属浓度对细胞代谢机理研究的相关领域。

附图说明

图1是本发明同时检测环境毒物与细胞代谢的检测***的整体结构图；

图2是本发明传感器单元细胞培养检测腔体的结构图；

图3是本发明Zn²⁺硫系玻璃敏感膜-Cl^-聚氯乙烯敏感膜-光寻址电位传感器的结构图；

图4是本发明细胞培养检测腔体和独立分离式的传感器的组装结构图；

图5是本发明单片机工作流程图。

图6是本发明的传感器单元检测环境毒物中Zn²⁺浓度的结果图；

图7是本发明的传感器单元检测细胞代谢产生的Cl^-浓度的结果图；

图中，注射泵1、培养液注射器2、药物注射器3、固定螺杆4、腔盖5、固定柱6、铂丝电极7、活塞8、小培养腔9、大培养腔10、固定腔11、第一硅胶导管12、硅胶圈13、第一半透膜14、环状薄垫片15、第二半透膜16、光寻址电位传感器17、标准电话机接口18、传感器电路板19、传感器底座20、废液缸21、单片机22、红外LED23、传感器单元加热块24、流路加热块25、电极引线26、第二硅胶导管27、Zn²⁺硫系玻璃敏感膜28、Cl^-聚氯乙烯敏感膜29、第一掩膜30、第二掩膜31。

具体实施方式

下面详细介绍所使用光寻址电位传感器的基本原理和Zn²⁺硫系玻璃敏感膜、Cl^-聚氯乙烯敏感膜检测离子的基本原理。

光寻址电位传感器核心是电解液/绝缘层/半导体结构，光寻址电位传感器利用了半导体的内光电效应，即当半导体受到一定波长的光照射时，半导体吸收光子，发生禁带到导带的跃迁也就产生了电子空穴对。在传感器两侧外加偏置电压时，半导体中产生耗尽层，这些光生载流子对中的一部分总能在未重新复合前到达耗尽层，于是电子和空穴被耗尽层的强电场分离，此过程中电子空穴对的移动即形成光电流。光寻址电位传感器采用强度调制的光照射在器件的表面，则外电路中就可以检测到交替变化的光电流。光电流的大小与传感器两端电势差的大小相关，其频率等于照射光强变化的频率。

Zn²⁺硫系玻璃和Cl^-聚氯乙烯敏感膜的表面膜上的活性物质一般含有带正电荷或负电荷的有机离子或络合离子，它们与相应的金属离子会形成离子交换盐类。敏感膜的选择性敏感机制，定量表现为被测离子在膜表面发生的物理、化学反应，从而产生电势差。该电势差的大小与溶液中离子分子等的种类和浓度有关。通过对此电势差的测量，可以达到对溶液中待测离子浓度的检测。

下面结合附图和实施例进一步说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。

如图1-4所示，本发明同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的检测***，包括：微型培养腔、注射泵1、培养液注射器2、药物注射器3、第一硅胶导管12、废液缸21、单片机22、两个红外LED23、传感器单元加热块24、流路加热块25和第二硅胶导管27。其中，微型培养腔主要由腔盖5、固定柱6、铂丝电极7、活塞8、硅胶圈13、小培养腔9、大培养腔10、固定腔11、环状薄垫片15、光寻址电位传感器17、标准电话机接口18、传感器电路板19和传感器底座20组成，固定腔11中空，固定在传感器电路板19上，标准电话机接口18焊接在传感器电路板19上；光寻址电位传感器17在固定腔11内，并通过导电胶粘结在传感器电路板19上；大培养腔10置于光寻址电位传感器17上，大培养腔10底部的第二半透膜16与光寻址电位传感器17接触，环状薄垫片15置于大培养腔10底部的第二半透膜16上，小培养腔9置于环状薄垫片15上，固定柱6、活塞8和硅胶圈13从上至下依次置于小培养腔9底部的第一半透膜14上，腔盖5位于固定柱6顶部，传感器底座20位于传感器电路板19底部，两个红外LED23位于传感器底座20的空腔内并焊接在传感器电路板19底部，传感器电路板19相应两个红外LED23的位置上具有2个通孔，传感器底座20置于传感器单元加热块24上；腔盖5、固定腔11、传感器电路板19和传感器底座20通过固定螺杆4固定。铂丝电极7、第一硅胶导管12、第二硅胶导管27的一端均依次穿过腔盖5、固定柱6和活塞8到达小培养腔9内，铂丝电极7的另一端通过电极引线26与传感器电路板19相连，第一硅胶导管12的另一端穿过流路加热块25后分别与培养液注射器2和药物注射器3相连，培养液注射器2和药物注射器3分别位于两个注射泵1内；第二硅胶导管27的另一端伸入废液缸21内。标准电话机接口18、传感器单元加热块24、流路加热块25和两个注射泵1均与单片机22相连。

本发明的工作过程如下；将细胞培养至大培养腔10中的第二半透膜16上，依次将环状薄垫片15和小培养腔9的第一半透膜14盖在细胞上方，形成细胞培养微腔体，用于细胞的培养和检测。然后将硅胶圈13和活塞8，依次放置在第一半透膜14的上方，形成流路培养腔，通过注射泵1、培养液注射器2、药物注射器3、第一硅胶导管12对细胞培养液进行更新，细胞废液通过第二硅胶导管27流入废液缸21中。

如图3所示，光寻址电位传感器17上同时沉积了Zn²⁺硫系玻璃敏感膜28、Cl^-聚氯乙烯敏感膜29。采用导电胶将光寻址电位传感器17粘在传感器电路板19上，将两个红外LED23、电极引线26和标准电话机接口18焊接在传感器电路板19上。利用中间带1cm×1cm方孔第一掩膜30，选用现有的芯片点样仪在芯片表面悬涂溶解在四氢呋喃中的Cl^-聚氯乙烯敏感膜29，在4°C条件下密封避光保存10小时以上，待四氢呋喃挥发即可在光寻址电位传感器17上形成面积为1cm×1cm厚度为400nm Cl-聚氯乙烯敏感膜29。利用中间带1cm×1cm方孔第二掩膜31，选用现有的脉冲激光沉积技术进行成膜，脉冲激光沉积技术利用短脉冲高能激光束，在基底温度为373K、压力为20Pa N₂的真空腔中，采用能量密度为0.2J·cm^-2、波长248nm、脉冲宽度为30ns、重复频率为1.3Hz的脉冲激光，沉积时间为30min，将Zn²⁺硫系玻璃敏感膜28从靶材上蒸发材料到光寻址电位传感器17上形成面积为1cm×1cm厚度为300nm Zn²⁺硫系玻璃敏感膜28。

细胞代谢过程中产生Cl^-，引起细胞培养微型腔内对应离子浓度的变化，Cl^-的特异性Cl^-聚氯乙烯敏感膜29会特异性结合Cl^-，从而引起表面电势的变化，使光寻址电位传感器17输出光生电流信号，环境毒物中的毒性离子Zn²⁺，引起微型腔内Zn²⁺浓度的变化，Zn²⁺的特异性Zn²⁺硫系玻璃敏感膜29会特异性结合Zn²⁺，从而引起表面电势的变化，引起光寻址电位传感器17输出光生电流信号幅值的变化。

如图5所示，单片机的工作流程如下：单片机22产生两个频率在1kHz-10kHz的PWM波，其中，一个PWM波驱动一个红外LED23工作，该红外LED23穿过传感器电路板19的通孔照射光寻址电位传感器17上Zn²⁺硫系玻璃敏感膜28所在区域的背面；Zn²⁺硫系玻璃敏感膜28所在区域产生与该PWM波的频率相同的光生电流信号；另一个PWM波驱动另一个红外LED23工作，该红外LED23穿过传感器电路板19的通孔照射光寻址电位传感器17上Cl^-聚氯乙烯敏感膜29所在区域的背面；Cl^-聚氯乙烯敏感膜29所在区域产生与该PWM波的频率相同的光生电流信号，两个光生电流信号叠加，形成传感器信号。单片机22通过标准电话机接口18接收传感器信号，然后通过快速傅里叶变换计算出传感器两个检测区域产生的两个光生电流信号的幅值，在铂丝电极上加载从-1V到+1V的工作电压，记录对应工作电压的光生电流信号幅值，构成I-V曲线，通过求导算法计算曲线斜率绝对值最大值对应的工作电压。

本发明应用上述同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的传感器的检测方法，包括以下步骤：

1、将细胞培养至大培养腔10中的第二半透膜16上，依次将环状薄垫片15和小培养腔9盖在细胞上方，形成细胞培养微腔体，用于细胞的培养和检测；

2、单片机22初始化后，采用PID算法对传感器单元加热块24和流路加热块25进行37℃的恒温控制，在铂丝电极7上加载工作电压，单片机22控制培养液注射器2和药物注射器3向细胞培养微腔体内注射入细胞培养液和药物；细胞培养液可以采用RPMI1640培养基，药物可以采用Zn(NO₃)₂溶液，其浓度为10^-6mol/L-10^-1mol/L。

3、单片机22产生两个频率在1kHz-10kHz的PWM波，其中，一个PWM波驱动一个红外LED23工作，该红外LED23穿过传感器电路板19的通孔照射光寻址电位传感器17上Zn²⁺硫系玻璃敏感膜28所在区域的背面；Zn²⁺硫系玻璃敏感膜28所在区域产生与该PWM波的频率相同的光生电流信号；另一个PWM波驱动另一个红外LED23工作，该红外LED23穿过传感器电路板19的通孔照射光寻址电位传感器17上Cl^-聚氯乙烯敏感膜29所在区域的背面；Cl^-聚氯乙烯敏感膜29所在区域产生与该PWM波的频率相同的光生电流信号，两个光生电流信号叠加，形成传感器信号。

4、单片机22通过标准电话机接口18接收传感器信号，然后通过快速傅里叶变换计算出传感器两个检测区域产生的两个光生电流信号的幅值，通过光寻址电位传感器17的I-V曲线换算出Zn²⁺和Cl^-离子产生的表面电势，通过Zn²⁺的浓度标定曲线及其表面电势计算出对应环境中Zn²⁺浓度，通过Cl^-的浓度标定公式及其表面电势计算出细胞代谢的Cl^-浓度，最终实现同时检测环境毒物和细胞代谢的离子浓度。

光寻址电位传感器17的I-V曲线的建立过程如下：在铂丝电极上加载从-1V到+1V的工作电压，记录对应工作电压的光生电流信号幅值，构成I-V曲线。

Cl^-的浓度标定公式的建立过程如下：通过检测10^-1mol/L、10^-2mol/L、10^-3mol/L、10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L浓度的Zn²⁺表面电势得到Zn²⁺的浓度与表面电势关系式，检测10^-1mol/L、10^-2mol/L、10^-3mol/L、10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L的Cl^-表面电势得到Cl^-的浓度与表面电势关系式。

下面给出本发明的应用案例。

同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的检测***及方法主要应用于微环境中的毒性离子与细胞代谢离子的检测。实验中，采用传感器单元中的光寻址电位传感器检测微环境中的Zn²⁺与细胞代谢Cl^-的变化，采用人的乳腺癌MCF-7细胞，微环境中的毒性离子Zn²⁺实验结果如图6所示。由图中可以看出，微环境中毒性离子的浓度与传感器的响应成正比关系，随着浓度的增加，传感器响应信号也逐步增加，并成较好的线性关系；细胞生理代谢产生的离子Cl^-实验结果如图7所示，由图中可以看出，细胞代谢离子的浓度与传感器的响应成正比关系，随着离子浓度的增加，传感器响应信号也逐步增加，并成较好的线性关系。实验结果表明本发明的传感器及检测方法具备同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢功能，能同时检测毒物环境中的Zn²⁺浓度和细胞代谢产生Cl^-浓度。

Claims (3)

1.一种同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的***，包括：微型培养腔、注射泵（1）、培养液注射器（2）、药物注射器（3）、第一硅胶导管（12）、废液缸（21）、单片机（22）、红外LED（23）、传感器单元加热块（24）、流路加热块（25）和第二硅胶导管（27）等；其中，微型培养腔主要由腔盖（5）、固定柱（6）、铂丝电极（7）、活塞（8）、硅胶圈（13）、小培养腔（9）、大培养腔（10）、固定腔（11）、环状薄垫片（15）、光寻址电位传感器（17）、标准电话机接口（18）、传感器电路板（19）和传感器底座（20）等组成，固定腔（11）中空，固定在传感器电路板（19）上，标准电话机接口（18）焊接在传感器电路板（19）上；光寻址电位传感器（17）在固定腔（11）内，并通过导电胶粘结在传感器电路板（19）上；大培养腔（10）置于光寻址电位传感器（17）上，大培养腔（10）底部的第二半透膜（16）与光寻址电位传感器（17）接触，环状薄垫片（15）置于大培养腔（10）底部的第二半透膜（16）上，小培养腔（9）置于环状薄垫片（15）上，固定柱（6）、活塞（8）和硅胶圈（13）从上至下依次置于小培养腔（9）底部的第一半透膜（14）上，腔盖（5）位于固定柱（6）顶部，传感器底座（20）位于传感器电路板（19）底部，两个红外LED（23）位于传感器底座（20）的空腔内并焊接在传感器电路板（19）底部，传感器电路板（19）相应两个红外LED（23）的位置上具有两个通孔，传感器底座（20）置于传感器单元加热块（24）上；腔盖（5）、固定腔（11）、传感器电路板（19）和传感器底座（20）通过固定螺杆（4）固定；铂丝电极（7）、第一硅胶导管（12）、第二硅胶导管（27）的一端均依次穿过腔盖（5）、固定柱（6）和活塞（8）到达小培养腔（9）内，铂丝电极（7）的另一端通过电极引线（26）与传感器电路板（19）相连，第一硅胶导管（12）的另一端穿过流路加热块（25）后分别与培养液注射器（2）和药物注射器（3）相连，培养液注射器（2）和药物注射器（3）分别位于两个注射泵（1）内；第二硅胶导管（27）的另一端伸入废液缸（21）内；标准电话机接口（18）、传感器单元加热块（24）、流路加热块（25）和两个注射泵（1）均与单片机（22）相连。

2.根据权利要求1所述同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的***，其特征在于，所述光寻址电位传感器（17）上同时沉积了Zn²⁺硫系玻璃敏感膜（28）和Cl^-聚氯乙烯敏感膜（29）。

3.一种应用权利要求1所述***同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）将细胞培养至大培养腔（10）中的第二半透膜（16）上，依次将环状薄垫片（15）和小培养腔（9）盖在细胞上方，形成细胞培养微腔体，用于细胞的培养和检测；

（2）单片机（22）初始化后，采用PID算法对传感器单元加热块（24）和流路加热块（25）进行37℃的恒温控制，单片机（22）控制培养液注射器（2）和药物注射器（3）向细胞培养微腔体内注射入细胞培养液和药物；在铂丝电极（7）上加载工作电压；

（3）单片机（22）产生两个频率在1kHz-10kHz的PWM波，其中，一个PWM波驱动一个红外LED（23）工作，该红外LED（23）穿过传感器电路板（19）的通孔照射光寻址电位传感器（17）上Zn²⁺硫系玻璃敏感膜（28）所在区域的背面；Zn²⁺硫系玻璃敏感膜（28）所在区域产生与该PWM波的频率相同的光生电流信号；另一个PWM波驱动另一个红外LED（23）工作，该红外LED（23）穿过传感器电路板（19）的通孔照射光寻址电位传感器（17）上Cl^-聚氯乙烯敏感膜（29）所在区域的背面；Cl^-聚氯乙烯敏感膜（29）所在区域产生与该PWM波的频率相同的光生电流信号，两个光生电流信号叠加，形成传感器信号；

（4）单片机（22）通过标准电话机接口（18）接收传感器信号，然后通过快速傅里叶变换计算出传感器两个检测区域产生的两个光生电流信号的幅值，通过光寻址电位传感器（17）的电流电压曲线换算出离子产生的表面电势，最终计算出对应环境毒物的离子浓度和细胞代谢的离子浓度，实现同时检测环境毒物和细胞代谢的离子浓度。

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