CN102507948B - 液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法 - Google Patents

液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102507948B
CN102507948B CN2011103605498A CN201110360549A CN102507948B CN 102507948 B CN102507948 B CN 102507948B CN 2011103605498 A CN2011103605498 A CN 2011103605498A CN 201110360549 A CN201110360549 A CN 201110360549A CN 102507948 B CN102507948 B CN 102507948B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pbs
tbn
phase chip
microballoon
listeria monocytogenes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2011103605498A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102507948A (zh
Inventor
王振国
刘金华
蔡阳
罗雁非
王亚丽
宋战昀
孟日增
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER JILIN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Original Assignee
INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER JILIN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER JILIN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU filed Critical INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER JILIN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority to CN2011103605498A priority Critical patent/CN102507948B/zh
Publication of CN102507948A publication Critical patent/CN102507948A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102507948B publication Critical patent/CN102507948B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种应用液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术，提供一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，以便实现对单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测。本发明制备了液相芯片，然后应用液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌。本发明应用液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌与其它几种检测方法相比，优势在于检测样品数量和检测项目的双向高通量（可同时对大量样品进行多达96个项目的检测）且具有灵活性好、灵敏度高、信噪比好、操作简便、标准曲线范围宽和应用范围广等特点，液相芯片技术作为生物信息学先进的操作平台，在临床诊断、兽医传染病诊断、食品微生物检测等领域具有广阔的应用前景。

Description

液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
技术领域
本发明属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。
背景技术
食源性病原菌单核细胞增生李斯特氏菌的检测已经有多种检测方法，如传统的培养检测方法、免疫学检测方法、PCR技术及核酸探针等。这些方法虽然可提供相对敏感特异的定性或定量方法，但一次仅能检测一种病原菌，当用于多种病原菌检测时变得繁琐费时且价格较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术，提供一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，以便实现对单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测。
本发明由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，其中微球为羧基化的42号微球；所述捕获抗体是单核细胞增生李斯特氏菌的单克隆抗体，所述检测抗体是单核细胞增生李斯特氏菌的多克隆抗体，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与单核细胞增生李斯特氏菌结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合单核细胞增生李斯特氏菌的数量；
液相芯片的制备：捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布，用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200μl 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10μl，再加入80μl的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500μl稀释至250μg/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500μl的PBS进行洗涤，洗涤后加入500μl 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；
液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的单核细胞增生李斯特氏菌10μl，用PBS-TBN补足体积到100μl，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200μl PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10μl，用PBS-TBN补足体积到100μl，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10μl，用PBS-TBN补足体积到100μl， 置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到100μl，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于100μl PBS-TBN中，上机进行检测。
本发明应用液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌与其它几种检测方法相比，优势在于检测样品数量和检测项目的双向高通量（可同时对大量样品进行多达96个项目的检测）且具有灵活性好、灵敏度高、信噪比好、操作简便、标准曲线范围宽和应用范围广等特点，液相芯片技术作为生物信息学先进的操作平台，在临床诊断、兽医传染病诊断、食品微生物检测等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明捕获抗体最佳工作浓度；
图2是本发明灵敏度检测结果；
图3是本发明特异性的检测结果；
图4是本发明重复性检测结果。
具体实施方式
本发明所采用的技术方案是：通过单核细胞增生李斯特氏菌的特异抗体，与微球进行偶联后，制备出可以对单核细胞增生李斯特氏菌进行检测的液相芯片，在应用时，加入样品增菌液，使增菌液中的单核细胞增生李斯特氏菌被微球上的捕获抗体所捕获，检测抗体也与单核细胞增生李斯特氏菌结合后，再与生物素标记的抗抗体共同孵育，然后通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白反应，应用Luminex100检测***实现对单核细胞增生李斯特氏菌的特异检测。
本发明涉及的检测单核细胞增生李斯特氏菌液相芯片主要由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）组成。其特征是，所述微球为羧基化的42号微球；所述捕获抗体是单核细胞增生李斯特氏菌的单克隆抗体（Li.m mAb），所述检测抗体是单核细胞增生李斯特氏菌的多克隆抗体（Li.m pAb），生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG(biotin-羊抗兔IgG)；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与单核细胞增生李斯特氏菌结合。以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合单核细胞增生李斯特氏菌的数量。
上述的检测抗体是用于识别单核细胞增生李斯特氏菌的另一类抗体，其作用是将与液相芯片上捕获抗体结合的单核细胞增生李斯特氏菌与抗抗体结合，而抗抗体能与检测荧光偶联，间接将结合的单核细胞增生李斯特氏菌浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对单核细胞增生李斯特氏菌的浓度进行定量测定。生物素标记的抗抗体通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白结合，最后通过Luminex100检测***对单核细胞增生李斯特氏菌进行定性定量检测。
本发明检测方法步骤是：
（1）捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布。用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS。然后取200μl 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min。取出后弃上清，加入NHS和EDC各10μl，再加入80μl的活化缓冲液。混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清。加入500μl稀释至250μg/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h。取出后离心弃上清，用500μl的PBS进行洗涤，洗涤后加入500μl 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭。封闭后4℃保存。
（2）应用液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min。取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的单核细胞增生李斯特氏菌10μl，用PBS-TBN补足体积到100μl。置于37℃摇床120rpm，1h。取出后离心弃上清，用200μl PBS-TBN洗两次。加入已稀释的检测抗体10μl，用PBS-TBN补足体积到100μl。 置于37℃摇床120rpm，1h。取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次。然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10μl，用PBS-TBN补足体积到100μl。 置于37℃摇床反应1h。取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次。再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到100μl，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次。重悬于100μl PBS-TBN中，上机进行检测。
1.捕获抗体最佳工作浓度的确定
当单抗浓度为250μg/ml时，其MFI值达到最大，故单抗最佳的工作浓度为225μg/ml（见图1）。
2．偶联是否成功的检测
Figure 634350DEST_PATH_IMAGE001
由上述结果可知单抗与微球偶联效果很好，且封闭效果也良好。
3. 正交实验结果—确定反应较优条件
Figure 551490DEST_PATH_IMAGE003
根据上述结果可知实验条件A3B1C3D2为较优实验条件，即多抗工作浓度为1:10000，生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:500，SA-PE的工作浓度为4μg/ml,生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为40min。
4. 灵敏度检测结果
由图2可以看出，在菌的浓度达到103CFU/ml时仍可被检出。因此本方法的灵敏度较高，可达到103CFU/ml。
5.特异性的检测结果
用已建立的方法从图3中可看出此方法特异性良好，与其它的菌无交叉反应。
6. 重复性试验
在1d，5，d，7d用此方法分别检测阳性菌和阴性菌，由图4可见阳性菌，阴性菌MFI值上下浮动都不大，可证明本方法重复性较好。
7. 实际样品添加的检测结果
样品 细菌 MFI
绿豆 单增菌 784
绿豆 沙门氏菌 125
绿豆 空白 121
绿豆 空白 15（背景值）
兔肉 单增菌 737
兔肉 沙门 150
兔肉 空白 136
兔肉 空白 18（背景值）
分别在绿豆和兔肉中添加单增菌，沙门氏菌，并做空白对照，由上表可见在添加了实际样品后应用本方法仍可将单增菌检出。

Claims (1)

1.一种应用液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于：液相芯片由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，其中微球为羧基化的42号微球；所述捕获抗体是单核细胞增生李斯特氏菌的单克隆抗体，所述检测抗体是单核细胞增生李斯特氏菌的多克隆抗体，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与单核细胞增生李斯特氏菌结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合单核细胞增生李斯特氏菌的数量；
液相芯片的制备：捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布，用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200μl 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10μl，再加入80μl的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500μl稀释至250μg/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500μl的PBS进行洗涤，洗涤后加入500μl 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；
液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取5000个微球，加入108 CFU/ml 的单核细胞增生李斯特氏菌10μl，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200μl PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10μl，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10μl，用PBS-TBN补足到100μl， 置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入链霉亲和素-藻红蛋白，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于100μl PBS-TBN中，上机进行检测。
CN2011103605498A 2011-11-15 2011-11-15 液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法 Expired - Fee Related CN102507948B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011103605498A CN102507948B (zh) 2011-11-15 2011-11-15 液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011103605498A CN102507948B (zh) 2011-11-15 2011-11-15 液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102507948A CN102507948A (zh) 2012-06-20
CN102507948B true CN102507948B (zh) 2013-12-04

Family

ID=46220054

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011103605498A Expired - Fee Related CN102507948B (zh) 2011-11-15 2011-11-15 液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102507948B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103901210A (zh) * 2014-03-07 2014-07-02 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种基于光纤倏逝波生物传感器检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
CN113945504A (zh) * 2021-09-16 2022-01-18 贵州安康医学检验中心有限公司 一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测***

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101158635A (zh) * 2007-11-19 2008-04-09 上海师范大学 一种用量子点检测细菌的方法
CN101464464A (zh) * 2008-02-29 2009-06-24 无锡中德伯尔生物技术有限公司 检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法
CN101493468A (zh) * 2009-03-04 2009-07-29 中国检验检疫科学研究院 一种可定量检测鼠疫耶尔森菌的蛋白质悬浮芯片方法
CN101493469A (zh) * 2009-03-04 2009-07-29 中国检验检疫科学研究院 一种可定量检测鼠疫耶尔森菌的蛋白悬浮芯片及其制备方法
CN101561436A (zh) * 2009-06-05 2009-10-21 中国检验检疫科学研究院 一种单增李斯特菌胶体金试纸条及其制备方法和应用
CN102128934A (zh) * 2010-01-13 2011-07-20 贵州省临床检验中心 流式微球检测人心肌钙蛋白t的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001294648A1 (en) * 2000-09-22 2002-04-02 Luminex Corporation Multiple reporter read-out for bioassays
EP1556507A2 (en) * 2002-10-09 2005-07-27 Hôpitaux Universitaires de Genève Analytical chip for the detection of 16s-rrna from clinically relevant bacteria and analytical method based thereon

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101158635A (zh) * 2007-11-19 2008-04-09 上海师范大学 一种用量子点检测细菌的方法
CN101464464A (zh) * 2008-02-29 2009-06-24 无锡中德伯尔生物技术有限公司 检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法
CN101493468A (zh) * 2009-03-04 2009-07-29 中国检验检疫科学研究院 一种可定量检测鼠疫耶尔森菌的蛋白质悬浮芯片方法
CN101493469A (zh) * 2009-03-04 2009-07-29 中国检验检疫科学研究院 一种可定量检测鼠疫耶尔森菌的蛋白悬浮芯片及其制备方法
CN101561436A (zh) * 2009-06-05 2009-10-21 中国检验检疫科学研究院 一种单增李斯特菌胶体金试纸条及其制备方法和应用
CN102128934A (zh) * 2010-01-13 2011-07-20 贵州省临床检验中心 流式微球检测人心肌钙蛋白t的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Monica K. Borucki等.Suspension Microarray with Dendrimer Signal Amplification Allows Direct and High-Throughput Subtyping of Listeria monocytogenes from Genomic DNA.《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》.2005,第43卷(第7期),
Suspension Microarray with Dendrimer Signal Amplification Allows Direct and High-Throughput Subtyping of Listeria monocytogenes from Genomic DNA;Monica K. Borucki等;《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》;20050731;第43卷(第7期);3255－3259 *
丁艳丽等.编码微球悬浮芯片与改良ELISA鼠疫杆菌检测方法的比较研究.《中国国境卫生检疫杂志》.2006,第29卷
杨永莉等.液相蛋白芯片法与BAS-ELISA法检测病原抗体的方法比较.《中国国境卫生检疫杂志》.2009,第32卷(第6期),
液相蛋白芯片法与BAS-ELISA法检测病原抗体的方法比较;杨永莉等;《中国国境卫生检疫杂志》;20091231;第32卷(第6期);441－444，448 *
编码微球悬浮芯片与改良ELISA鼠疫杆菌检测方法的比较研究;丁艳丽等;《中国国境卫生检疫杂志》;20060831;第29卷;35－37 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102507948A (zh) 2012-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102507949B (zh) 液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法
CN104894219B (zh) 一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法
CN103439495B (zh) 单核增生李斯特氏菌富集和快速检测方法
Sewell et al. The development of an efficient and rapid enzyme linked fluorescent assay method for the detection of Listeria spp. from foods
CN101865919A (zh) 一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法
CN106018806B (zh) 一种基于Au‑Fe3O4@Pd‑ZIF‑8标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用
CN108676842B (zh) 一种快速检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的方法
CN105259223B (zh) 一种基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法及应用
CN102507948B (zh) 液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
CN105891483B (zh) 一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫传感器的制备方法
CN113721024A (zh) 一种动物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒及其检测方法
CN108982842A (zh) 一种应用免疫磁珠技术的玉米赤霉烯酮前处理试剂盒
CN102520167B (zh) 液相芯片检测大肠杆菌o157的方法
CN102539754A (zh) 一种生物免疫传感器及其检测方法
CN102426233B (zh) 液相芯片检测空肠弯曲菌的方法
CN106771217A (zh) 一种单增李斯特氏菌的快速检测方法
CN105950471A (zh) 一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用
CN104133059B (zh) 一种合金负载分子筛电化学免疫传感器的制备方法及应用
Zhang et al. Highly sensitive and selective colorimetric determination of Staphylococcus aureus via chicken anti-protein A IgY antibody
CN105203756A (zh) 快速磁分离电化学免疫传感及检测金黄色葡萄球菌的方法
CN105259222B (zh) 一种基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器的制备方法及应用
CN109799273A (zh) 一种基于纳米Co3O4模拟酶催化作用的信号双放大的玉米赤霉烯酮阻抗传感器
CN104698167A (zh) 一种阪崎肠杆菌检测试剂及其制备方法
CN105301030A (zh) 一种单增李斯特菌检测试剂和检测方法
CN101113465A (zh) 一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20131204

Termination date: 20141115

EXPY Termination of patent right or utility model