CN102499998B - 真皮等同物的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种真皮等同物的构建方法。首先对其人羊膜进行无菌处理，将处理后的人羊膜和硝酸纤维素膜制备成人羊膜支架；取奶山羊耳部皮肤样本，去除赃物、消毒、冲洗，将处理后所得真皮层采用0.25%的胰酶进行消化、过滤收集细胞，将收集细胞进行培养，得到真皮成纤维细胞；将牛I型胶原溶液和DMEM溶液混合均匀，并用NaOH溶液调节混合溶液的pH值，加入所得真皮成纤维细胞混合均匀，得到胶原细胞混合液；将所得胶原细胞混合液滴加在人羊膜支架上，凝固后加入培养液中，置于培养箱中培养，培养后得到真皮等同物。本发明使用人羊膜做支架，在移植时可防止真皮等同物的撕裂，增加手术的可操作性，并且术后人羊膜和生物体组织有很好的相容性，在移植初期可以吸取生物体一些营养成分，促进皮肤的愈合。
Description
技术领域
本发明属于生物组织工程技术领域，具体涉及一种以人羊膜和胶原凝胶为支架，构建真皮等同物的方法，即一种真皮等同物的构建方法。
背景技术
1975年Rheinwald和Green发明了上皮培养技术，使得人工表皮的合成成为可能。但是，人工表皮只能用于表皮损伤和表皮及浅层真皮损伤，当全层或接近全层真皮损伤时，容易形成创面挛缩、伤疤或开放性创口。因此，研究开发真皮替代物又成为临床的需求。
目前，人工合成真皮主要采用胶原-氨基葡聚糖、胶原凝胶、聚羟基乙酸、尼龙网等作为真皮支架。例如：Biobrane外层为硅胶膜，内层为部分埋入其中的尼龙纤维网，网孔中充满化学交联的猪真皮Ⅰ型胶，以促进其与创面的粘附和纤维血管的长入。硅胶膜为半通透性的膜，其透气透水性能较正常皮肤稍强，有利于药物局部渗透及减少局部积液；另一方面可以减少体内水分的丢失。Dermagraft-TM则使用可降解的聚羟基乙酸作为真皮支架，移植后支架成分逐渐被降解，种植的Fb则产生新的真皮基质。临床证明，Demagraft可有效用于糖尿病溃疡的治疗。Integra是由Burke和Yannas根据材料科学和工程学原理设计的一种真皮替代品，它是利用胶原纤维和硫酸软骨素构成多孔支架。
单纯以胶原凝胶为支架制作的人工真皮时，随着真皮成纤维在凝胶内扩增并通过分泌自身的胶原和其他蛋白，形成新的真皮基质的同时，出现较明显的收缩，收缩的程度与胶原的浓度、凝胶成分及细胞密度有关。 Eun Kyung Yang等在用胶原凝胶做人工皮肤时，为降低胶原凝胶的收缩性，筛选了最佳细胞密度和最佳凝胶浓度，同时为了增加手术的可操作性，在胶原的下面制作了胶原网格来增加人工皮肤的韧性。然而，利用生物膜做支架，制作真皮等同物在国内外研究领域还属空白，本发明是以经过处理的人羊膜和牛Ⅰ型胶原为支架制作真皮等同物。
发明内容
本发明的目的是针对现有以胶原凝胶制作真皮等同物存在的收缩率较高的缺陷，提供一种以人羊膜和胶原为支架的真皮等同物的构建方法。本发明技术方案是以人羊膜做支架，将一定浓度的真皮成纤维细胞和凝胶混合后，滴加到人羊膜上，人羊膜能有效地阻止胶原凝胶的收缩，而且使用人羊膜做支架，在移植时可有效防止真皮等同物的撕裂，增加手术的可操作性，并且术后人羊膜和生物体组织有很好的相容性，在移植初期可以吸取生物体一些营养成分，促进皮肤的愈合。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种真皮等同物的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
a、人羊膜的无菌处理：
预处理：取自剖腹产分娩产妇的胎盘，并检测胎盘的HIV、甲肝、乙肝以及梅毒血清学反应显示为阴性，将经过检测后的胎盘放入加有三抗的生理盐水中进行浸泡消毒，浸泡消毒的时间为3～4小时；
海绵层的去除：在无菌间内，钝性剥离附着在预处理后胎盘上的人羊膜，将剥离下的人羊膜用加有三抗的生理盐水反复冲洗，冲洗至血液及其它污物彻底洗掉，再用含三抗的PBS缓冲液冲洗人羊膜2～5遍，冲洗后钝性剥离人羊膜上的海绵层；
上皮细胞的去除：将去除海绵层的人羊膜用含三抗的PBS缓冲液冲洗1～3遍，然后将人羊膜分成数小块，上皮面向上分别平铺于玻璃平皿内，加入0.25%胰酶＋0.02% EDTA溶液，在4℃条件下冷消化12～20 h，将冷消化后的人羊膜用细胞刮去除上皮细胞，然后放入常规的DMEM培养液中培养2～5 min，再用含三抗的PBS缓冲液冲洗3～5遍，得到无菌处理后的人羊膜；
b、人羊膜支架的制作：将硝酸纤维素膜剪成中空的正方形，放于塑料袋内密封，密封后进行5～15磅高压消毒，消毒后待用；将步骤a无菌处理后的人羊膜基底面向上平铺于玻璃皿内，将处理好待用的硝酸纤维素膜附于其上，然后翻转，使其上皮面向上放入另一玻璃皿内，于恒温箱内进行干燥，干燥后得到人羊膜支架；
c、真皮成纤维细胞的制备：取奶山羊耳部皮肤样本0.5×0.5cm2，刮去皮肤表面赃物，用质量百分浓度为75％的酒精消毒2～4次，然后用常规D-Hank's液冲洗3～5次，每次冲洗5min，将消毒冲洗后的皮肤样本去除表皮层，将所得真皮层剪成糜状，然后加入3～5ml、质量百分浓度为0.25%的胰酶，在37℃条件下消化5～10min，消化后过滤离心收集细胞，将收集的细胞接种培养皿中，用含有质量浓度10%血清的DMEM培养液进行培养，培养3～4天，每2天换液一次，培养后得到真皮成纤维细胞；
d、真皮等同物的制备：将体积为7ml、浓度为4.5mg/ml的牛I型胶原溶液和1.5～2.5ml的5×DMEM（其含义为常规所用DMEM溶液浓度的5倍即5倍浓缩）溶液混合均匀，混合均匀后用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的pH值到6.8～7.5，然后加入1～2ml步骤c所得的真皮成纤维细胞混合均匀，混合均匀后得到胶原细胞混合液；
e、取4～5ml步骤d所得到的胶原细胞混合液滴加在直径为4cm的步骤b得到的人羊膜支架上，彻底凝固后得到结合有胶原细胞混合液的人羊膜支架，然后加入5～10ml含有质量百分浓度为20%血清的DMEM培养液中，然后置于CO2培养箱中培养10～15天，培养后得到真皮等同物。
根据上述的真皮等同物的构建方法，步骤a中所述加有三抗的生理盐水所采用的生理盐水为常规质量浓度为0.9%的NaCl溶液，其中加有的三抗为0.1 μl/mL青霉素、0.1 μl /mL链霉素和0.1 μl /mL庆大霉素。
根据上述的真皮等同物的构建方法，步骤a中所述含三抗的PBS缓冲液是指在常规的PBS缓冲液中加入0.1μl/mL青霉素、0.1 μl /mL链霉素和0.1 μl /mL庆大霉素。
根据上述的真皮等同物的构建方法，步骤a中所述分成数小块，其数小块的规格为15×15cm。
根据上述的真皮等同物的构建方法，步骤a中所述0.25%胰酶＋0.02% EDTA溶液为市场上销售的现有产品，其品牌为Vellgen，货号为N10341。
根据上述的真皮等同物的构建方法，步骤b中所述将硝酸纤维素膜剪成中空的正方形，其正方形的规格为4×4cm；所述于恒温箱内进行干燥时，恒温箱内的温度为30～38℃，干燥时间为30～120 min。
根据上述的真皮等同物的构建方法，步骤c中所述常规D-Hank's液的配制参照Pollard et al.1997。
根据上述的真皮等同物的构建方法，步骤d中所述然后加入1～2ml步骤c所得的真皮成纤维细胞混合均匀，其中所加入的真皮成纤维细胞为步骤c所得真皮成纤维细胞调整后的产物，其细胞密度为5×106/ml。
根据上述的真皮等同物的构建方法，步骤e中所述取4～5ml步骤d所得到的胶原细胞混合液滴加在直径为4cm的步骤b得到的人羊膜支架上，该滴加过程分两个步骤进行，首先将所取胶原细胞混合液总量的45～55%滴加到步骤b得到的人羊膜支架上，20～25min后，再进一步滴加剩余的胶原细胞混合液。
根据上述的真皮等同物的构建方法，步骤e中所述CO2培养箱采用的是美国WTB CO2培养箱；所述培养箱内的条件为5%CO2、饱和湿度、37℃、每3天换液1次。
本发明的积极有益效果：
本发明技术方案是以人羊膜为支架，将一定浓度的真皮成纤维细胞和凝胶混合后，滴加到人羊膜支架上，人羊膜能够有效地阻止胶原凝胶的收缩；并且羊膜做支架有利于真皮成纤维细胞在胶原内的生长；使用人羊膜做支架，在移植时可有效防止真皮等同物的撕裂，从而增加手术的可操作性；手术后人羊膜和生物体组织有很好的相容性，在移植初期可以吸取生物体一些营养成分，促进皮肤的愈合。
四、附图说明：
图1 实施例1步骤e中CO2培养箱中培养15分钟后所得真皮等同物的细胞生长情况；
图2 实施例1步骤e中CO2培养箱中培养6天后所得真皮等同物的细胞生长情况；
图3 实施例1步骤e中CO2培养箱中培养10天后所得真皮等同物的细胞生长情况；
图4 实施例1步骤e中CO2培养箱中培养15天后所得真皮等同物的细胞生长情况。
五、具体实施方式：
以下实施例仅为了进一步说明本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1：
本发明一种真皮等同物的构建方法，所述构建方法的详细步骤如下：
a、人羊膜的无菌处理：
预处理：取自剖腹产分娩产妇的胎盘，并检测胎盘的HIV、甲肝、乙肝以及梅毒血清学反应显示为阴性，将经过检测后的胎盘放入加有三抗的生理盐水中进行浸泡消毒（加有三抗的生理盐水所采用的生理盐水为常规质量浓度为0.9%的NaCl溶液，其中加有的三抗为青霉素、链霉素和庆大霉素，加入生理盐水后青霉素、链霉素和庆大霉素的浓度分别为0.1 μl/mL、0.1 μl/mL和0.1 μl/mL），浸泡消毒的时间为3～4小时；
海绵层的去除：在无菌间内，钝性剥离附着在预处理后胎盘上的人羊膜，将剥离下的人羊膜用加有三抗的生理盐水反复冲洗（加有三抗的生理盐水同上），冲洗至血液及其它污物彻底洗掉，再用含三抗的PBS缓冲液冲洗人羊膜4～5遍（含三抗的PBS缓冲液是指在常规的PBS缓冲液中加入青霉素、链霉素和庆大霉素，加入后青霉素、链霉素和庆大霉素的浓度分别为0.1 μl/mL、0.1 μl/mL和0.1 μl/mL；其配制方法参照Pollard et al.1997），冲洗后钝性剥离人羊膜上的海绵层；
上皮细胞的去除：将去除海绵层的人羊膜用含三抗的PBS缓冲液（同上）冲洗3遍，然后将人羊膜分成数小块（数小块的规格为15×15cm），上皮面向上分别平铺于玻璃平皿内，加入0.25%胰酶＋0.02% EDTA溶液（该溶液为市场上销售的现有产品，其品牌为Vellgen，货号为N10341），在4℃条件下冷消化16h，将冷消化后的人羊膜用细胞刮去除上皮细胞，然后放入常规的DMEM培养液中培养5 min，再用含三抗的PBS缓冲液（同上）冲洗4遍，得到无菌处理后的人羊膜；
b、人羊膜支架的制作：将硝酸纤维素膜剪成中空的正方形（正方形的规格为4×4cm），放于塑料袋内密封，密封后进行10磅高压消毒，消毒后待用；将步骤a无菌处理后的人羊膜基底面向上平铺于玻璃皿内，将处理好待用的硝酸纤维素膜附于其上，然后翻转，使其上皮面向上放入另一玻璃皿内，于恒温箱内进行干燥（恒温箱内的温度为35℃，干燥时间为90 min），干燥后得到人羊膜支架；
c、真皮成纤维细胞的制备：取奶山羊耳部皮肤样本0.5×0.5cm2，刮去皮肤表面赃物，用质量百分浓度为75％的酒精消毒3次，然后用常规D-Hank's液（常规D-Hank's液的配制参照Pollard et al.1997）冲洗5次，每次冲洗5min，将消毒冲洗后的皮肤样本去除表皮层，将所得真皮层剪成糜状，然后加入5ml、质量百分浓度为0.25%的胰酶，在37℃条件下消化10min，消化后过滤离心收集细胞，将收集的细胞接种培养皿中，用含有质量浓度10%血清的DMEM培养液进行培养，培养4天，每2天换液一次，培养后得到真皮成纤维细胞；
d、真皮等同物的制备：用体积为7ml、浓度为4.5mg/ml的牛I型胶原溶液和2.0ml体积的5×DMEM（其含义为常规所用DMEM溶液浓度的5倍即5倍浓缩）溶液混合均匀，混合均匀后用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的pH值到7.2，然后加入1ml步骤c所得的真皮成纤维细胞混合均匀（其中所加入的真皮成纤维细胞为步骤c所得真皮成纤维细胞调整后的产物，其细胞密度为5×106/ml），混合均匀后得到胶原细胞混合液；
e、取4.8ml步骤d所得到的胶原细胞混合液滴加在直径为4cm的步骤b得到的人羊膜支架上（该滴加过程分两个步骤进行，首先将所取胶原细胞混合液总量的50%滴加到步骤b得到的人羊膜支架上，25min后，再进一步滴加剩余的胶原细胞混合液），彻底凝固后得到结合有胶原细胞混合液的人羊膜支架，然后加入5.0ml含有质量百分浓度为20%血清的DMEM培养液中，然后置于CO2培养箱中培养15天（采用的是美国WTB CO2培养箱；所述培养箱内的条件为5%CO2、饱和湿度、37℃、每3天换液1次），培养后得到真皮等同物。
实施例步骤e中：在CO2培养箱中培养真皮等同物的过程中，其培养15分钟、6天、10天和15天后所得真皮等同物的细胞生长情况详见附图1、附图2、附图3和附图4。
实施例2：
本发明一种真皮等同物的构建方法，所述构建方法的详细步骤如下：
a、人羊膜的无菌处理：
预处理：取自剖腹产分娩产妇的胎盘，并检测胎盘的HIV、甲肝、乙肝以及梅毒血清学反应显示为阴性，将经过检测后的胎盘放入加有三抗的生理盐水中进行浸泡消毒（加有三抗的生理盐水所采用的生理盐水为常规质量浓度为0.9%的NaCl溶液，其中加有的三抗为青霉素、链霉素和庆大霉素，加入生理盐水后青霉素、链霉素和庆大霉素的浓度分别为0.1 μl/mL、0.1 μl/mL和0.1 μl/mL），浸泡消毒的时间为3～4小时；
海绵层的去除：在无菌间内，钝性剥离附着在预处理后胎盘上的人羊膜，将剥离下的人羊膜用加有三抗的生理盐水反复冲洗（加有三抗的生理盐水同上），冲洗至血液及其它污物彻底洗掉，再用含三抗的PBS缓冲液冲洗人羊膜3～4遍（含三抗的PBS缓冲液是指在常规的PBS缓冲液中加入青霉素、链霉素和庆大霉素，加入后青霉素、链霉素和庆大霉素的浓度分别为0.1 μl/mL、0.1 μl/mL和0.1 μl/mL；其配制方法参照Pollard et al.1997），冲洗后钝性剥离人羊膜上的海绵层；
上皮细胞的去除：将去除海绵层的人羊膜用含三抗的PBS缓冲液（同上）冲洗2遍，然后将人羊膜分成数小块（数小块的规格为15×15cm），上皮面向上分别平铺于玻璃平皿内，加入0.25%胰酶＋0.02% EDTA溶液（该溶液为市场上销售的现有产品，其品牌为Vellgen，货号为N10341），在4℃条件下冷消化20h，将冷消化后的人羊膜用细胞刮去除上皮细胞，然后放入常规的DMEM培养液中培养4 min，再用含三抗的PBS缓冲液（同上）冲洗4遍，得到无菌处理后的人羊膜；
b、人羊膜支架的制作：将硝酸纤维素膜剪成中空的正方形（正方形的规格为4×4cm），放于塑料袋内密封，密封后进行15磅高压消毒，消毒后待用；将步骤a无菌处理后的人羊膜基底面向上平铺于玻璃皿内，将处理好待用的硝酸纤维素膜附于其上，然后翻转，使其上皮面向上放入另一玻璃皿内，于恒温箱内进行干燥（恒温箱内的温度为30℃，干燥时间为120 min），干燥后得到人羊膜支架；
c、真皮成纤维细胞的制备：取奶山羊耳部皮肤样本0.5×0.5cm2，刮去皮肤表面赃物，用质量百分浓度为75％的酒精消毒4次，然后用常规D-Hank's液（常规D-Hank's液的配制参照Pollard et al.1997）冲洗4次，每次冲洗5min，将消毒冲洗后的皮肤样本去除表皮层，将所得真皮层剪成糜状，然后加入4ml、质量百分浓度为0.25%的胰酶，在37℃条件下消化8min，消化后过滤离心收集细胞，将收集的细胞接种培养皿中，用含有质量浓度10%血清的DMEM培养液进行培养，培养4天，每2天换液一次，培养后得到真皮成纤维细胞；
d、真皮等同物的制备：用体积为7ml、浓度为4.5mg/ml的牛I型胶原溶液和1.8ml体积的5×DMEM（其含义为常规所用DMEM溶液浓度的5倍即5倍浓缩）溶液混合均匀，混合均匀后用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的pH值到7.0，然后加入1.2ml步骤c所得的真皮成纤维细胞混合均匀（其中所加入的真皮成纤维细胞为步骤c所得真皮成纤维细胞调整后的产物，其细胞密度为5×106/ml），混合均匀后得到胶原细胞混合液；
e、取5.0ml步骤d所得到的胶原细胞混合液滴加在直径为4cm的步骤b得到的人羊膜支架上（该滴加过程分两个步骤进行，首先将所取胶原细胞混合液总量的50%滴加到步骤b得到的人羊膜支架上，22min后，再进一步滴加剩余的胶原细胞混合液），彻底凝固后得到结合有胶原细胞混合液的人羊膜支架，然后加入8.0ml含有质量百分浓度为20%血清的DMEM培养液中，然后置于CO2培养箱中培养15天（采用的是美国WTB CO2培养箱；所述培养箱内的条件为5%CO2、饱和湿度、37℃、每3天换液1次），培养后得到真皮等同物。
实施例3：
本发明一种真皮等同物的构建方法，所述构建方法的详细步骤如下：
a、人羊膜的无菌处理：
预处理：取自剖腹产分娩产妇的胎盘，并检测胎盘的HIV、甲肝、乙肝以及梅毒血清学反应显示为阴性，将经过检测后的胎盘放入加有三抗的生理盐水中进行浸泡消毒（加有三抗的生理盐水所采用的生理盐水为常规质量浓度为0.9%的NaCl溶液，其中加有的三抗为青霉素、链霉素和庆大霉素，加入生理盐水后青霉素、链霉素和庆大霉素的浓度分别为0.1 μl/mL、0.1 μl/mL和0.1 μl/mL），浸泡消毒的时间为3～4小时；
海绵层的去除：在无菌间内，钝性剥离附着在预处理后胎盘上的人羊膜，将剥离下的人羊膜用加有三抗的生理盐水反复冲洗（加有三抗的生理盐水同上），冲洗至血液及其它污物彻底洗掉，再用含三抗的PBS缓冲液冲洗人羊膜3～5遍（含三抗的PBS缓冲液是指在常规的PBS缓冲液中加入青霉素、链霉素和庆大霉素，加入后青霉素、链霉素和庆大霉素的浓度分别为0.1 μl/mL、0.1 μl/mL和0.1 μl/mL；其配制方法参照Pollard et al.1997），冲洗后钝性剥离人羊膜上的海绵层；
上皮细胞的去除：将去除海绵层的人羊膜用含三抗的PBS缓冲液（同上）冲洗3遍，然后将人羊膜分成数小块（数小块的规格为15×15cm），上皮面向上分别平铺于玻璃平皿内，加入0.25%胰酶＋0.02% EDTA溶液（该溶液为市场上销售的现有产品，其品牌为Vellgen，货号为N10341），在4℃条件下冷消化14h，将冷消化后的人羊膜用细胞刮去除上皮细胞，然后放入常规的DMEM培养液中培养5 min，再用含三抗的PBS缓冲液（同上）冲洗3遍，得到无菌处理后的人羊膜；
b、人羊膜支架的制作：将硝酸纤维素膜剪成中空的正方形（正方形的规格为4×4cm），放于塑料袋内密封，密封后进行8磅高压消毒，消毒后待用；将步骤a无菌处理后的人羊膜基底面向上平铺于玻璃皿内，将处理好待用的硝酸纤维素膜附于其上，然后翻转，使其上皮面向上放入另一玻璃皿内，于恒温箱内进行干燥（恒温箱内的温度为38℃，干燥时间为40 min），干燥后得到人羊膜支架；
c、真皮成纤维细胞的制备：取奶山羊耳部皮肤样本0.5×0.5cm2，刮去皮肤表面赃物，用质量百分浓度为75％的酒精消毒4次，然后用常规D-Hank's液（常规D-Hank's液的配制参照Pollard et al.1997）冲洗3次，每次冲洗5min，将消毒冲洗后的皮肤样本去除表皮层，将所得真皮层剪成糜状，然后加入4.5ml、质量百分浓度为0.25%的胰酶，在37℃条件下消化7min，消化后过滤离心收集细胞，将收集的细胞接种培养皿中，用含有质量浓度10%血清的DMEM培养液进行培养，培养4天，每2天换液一次，培养后得到真皮成纤维细胞；
d、真皮等同物的制备：用体积为7ml、浓度为4.5mg/ml的牛I型胶原溶液和2.2ml体积的5×DMEM（其含义为常规所用DMEM溶液浓度的5倍即5倍浓缩）溶液混合均匀，混合均匀后用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的pH值到7.2，然后加入1.6ml步骤c所得的真皮成纤维细胞混合均匀（其中所加入的真皮成纤维细胞为步骤c所得真皮成纤维细胞调整后的产物，其细胞密度为5×106/ml），混合均匀后得到胶原细胞混合液；
e、取5.0ml步骤d所得到的胶原细胞混合液滴加在直径为4cm的步骤b得到的人羊膜支架上（该滴加过程分两个步骤进行，首先将所取胶原细胞混合液总量的50%滴加到步骤b得到的人羊膜支架上，25min后，再进一步滴加剩余的胶原细胞混合液），彻底凝固后得到结合有胶原细胞混合液的人羊膜支架，然后加入7.0ml含有质量百分浓度为20%血清的DMEM培养液中，然后置于CO2培养箱中培养15天（采用的是美国WTB CO2培养箱；所述培养箱内的条件为5%CO2、饱和湿度、37℃、每3天换液1次），培养后得到真皮等同物。
Claims (1)
1.一种真皮等同物的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
a、人羊膜的无菌处理：
预处理：取自剖腹产分娩产妇的胎盘，并检测胎盘的HIV、甲肝、乙肝以及梅毒血清学反应显示为阴性，将经过检测后的胎盘放入加有三抗的生理盐水中进行浸泡消毒，浸泡消毒的时间为3～4小时；
海绵层的去除：在无菌间内，钝性剥离附着在预处理后胎盘上的人羊膜，将剥离下的人羊膜用加有三抗的生理盐水反复冲洗，冲洗至血液及其它污物彻底洗掉，再用含三抗的PBS缓冲液冲洗人羊膜2～5遍，冲洗后钝性剥离人羊膜上的海绵层；
上皮细胞的去除：将去除海绵层的人羊膜用含三抗的PBS缓冲液冲洗1～3遍，然后将人羊膜分成数小块，上皮面向上分别平铺于玻璃平皿内，加入0.25%胰酶＋0.02% EDTA溶液，在4℃条件下冷消化12～20 h，将冷消化后的人羊膜用细胞刮去除上皮细胞，然后放入常规的DMEM培养液中培养2～5 min，再用含三抗的PBS缓冲液冲洗3～5遍，得到无菌处理后的人羊膜；
b、人羊膜支架的制作：将硝酸纤维素膜剪成中空的正方形，放于塑料袋内密封，密封后进行5～15磅高压消毒，消毒后待用；将步骤a无菌处理后的人羊膜基底面向上平铺于玻璃皿内，将处理好待用的硝酸纤维素膜附于其上，然后翻转，使其上皮面向上放入另一玻璃皿内，于恒温箱内进行干燥，干燥后得到人羊膜支架；
c、真皮成纤维细胞的制备：取奶山羊耳部皮肤样本0.5×0.5cm2，刮去皮肤表面赃物，用质量百分浓度为75％的酒精消毒2～4次，然后用常规D-Hank's液冲洗3～5次，每次冲洗5min，将消毒冲洗后的皮肤样本去除表皮层，将所得真皮层剪成糜状，然后加入3～5ml、质量百分浓度为0.25%的胰酶，在37℃条件下消化5～10min，消化后过滤离心收集细胞，将收集的细胞接种培养皿中，用含有质量浓度10%血清的DMEM培养液进行培养，培养3～4天，每2天换液一次，培养后得到真皮成纤维细胞；
d、真皮等同物的制备：将体积为7ml、浓度为4.5mg/ml的牛I型胶原溶液和1.5～2.5ml的5×DMEM溶液混合均匀，混合均匀后用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的pH值到6.8～7.5，然后加入1～2ml步骤c所得的真皮成纤维细胞混合均匀，混合均匀后得到胶原细胞混合液；
所述然后加入1～2ml步骤c所得的真皮成纤维细胞混合均匀，其中所加入的真皮成纤维细胞为步骤c所得真皮成纤维细胞调整后的产物，其细胞密度为5×106/ml；
e、取4～5ml步骤d所得到的胶原细胞混合液滴加在直径为4cm的步骤b得到的人羊膜支架上，彻底凝固后得到结合有胶原细胞混合液的人羊膜支架，然后加入5～10ml含有质量百分浓度为20%血清的DMEM培养液中，然后置于CO2培养箱中培养10～15天，培养后得到真皮等同物；
步骤e中所述取4～5ml步骤d所得到的胶原细胞混合液滴加在直径为4cm的步骤b得到的人羊膜支架上，该滴加过程分两个步骤进行，首先将所取胶原细胞混合液总量的45～55%滴加到步骤b得到的人羊膜支架上，20～25min后，再进一步滴加剩余的胶原细胞混合液。
2．根据权利要求1所述的真皮等同物的构建方法，其特征在于：步骤a中所述加有三抗的生理盐水所采用的生理盐水为常规质量浓度为0.9%的NaCl溶液，其中加有的三抗为0.1 μl/mL青霉素、0.1 μl /mL链霉素和0.1 μl /mL庆大霉素。
3．根据权利要求1所述的真皮等同物的构建方法，其特征在于：步骤a中所述含三抗的PBS缓冲液是指在常规的PBS缓冲液中加入0.1μl/mL青霉素、0.1 μl /mL链霉素和0.1 μl /mL庆大霉素。
4．根据权利要求1所述的真皮等同物的构建方法，其特征在于：步骤a中所述分成数小块，其数小块的规格为15×15cm。
5．根据权利要求1所述的真皮等同物的构建方法，其特征在于：步骤a中所述0.25%胰酶＋0.02% EDTA溶液为市场上销售的现有产品，其品牌为Vellgen，货号为N10341。
6．根据权利要求1所述的真皮等同物的构建方法，其特征在于：步骤b中所述将硝酸纤维素膜剪成中空的正方形，其正方形的规格为4×4cm；所述于恒温箱内进行干燥时，恒温箱内的温度为30～38℃，干燥时间为30～120 min。
7．根据权利要求1所述的真皮等同物的构建方法，其特征在于：步骤c中所述常规D-Hank's液的配制参照Pollard et al.1997。
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