CN102488925A - 一种可注射的关节软骨组织修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可注射的关节软骨组织修复材料，其特点是该复合材料的起始原料由以下组分组成：I型胶原100重量份，透明质酸10～50重量份，其中，透明质酸的氧化度为20％～60％；所述修复材料内包埋有生物体内骨髓液中的单核细胞层，复合材料的厚度为1～5mm。用高碘酸钠将透明质酸氧化为氧化透明质酸；将胶原溶液、5×PBS和缓冲液按7∶2∶1的体积比混合调节pH至中性；将氧化透明质酸用超纯水溶解后加入已调至中性的胶原溶液中，搅拌均匀，4℃冰箱中静置；将用密度梯度离心法分离提取的生物体骨髓液中的单核细胞层与前述胶原-氧化透明质酸溶液混合均匀；将混合液放入37℃恒温培养箱中静置或注射到生物体关节软骨缺损处，形成复合材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种可注射的关节软骨组织修复材料及其制备方法，属于组织修复材料的制备领域。
技术背景
关节软骨缺损是一种常见的疾病，但临床上一直都没有非常有效的治疗手段，并且软骨组织细胞含量低、不能迁移，还缺乏血管、淋巴和神经等，自我修复能力非常有限。应用组织工程的手段构建软骨组织工程支架来对软骨缺损进行修复，将是一种非常有潜力的临床治疗方式。
胶原是动物体细胞外基质的重要成分，具有良好的生物相容性、生物降解性和弱抗原性，已成为生物医学领域中应用最广泛的材料之一。透明质酸作为天然软骨细胞外基质的一种成分，可以特异地与CD44受体结合，促进细胞与材料之间的相互作用并调节细胞行为，对软骨细胞表型的保持、细胞增殖、以及细胞外基质多糖的分泌等有着重要的作用，但是透明质酸作为一种多糖，是水溶性的，容易从支架材料中溶出。
添加或利用生物活性物质制备支架材料越来越多的应用于组织修复中，以达到更好的组织修复效果。水凝胶作为一种可注射的支架，可用于填充任何形状和尺寸的缺损，并且带来的创伤较小，含有大量的水分，可使溶于其中的物质以及低相对分子质量的物质从其间渗透扩散，以支持营养物质和细胞代谢产物的交换，此外，其特殊的结构特征使得种子细胞能够均匀地分布在三维支架材料内部，为种子细胞提供仿生的生长环境，它是一种很有优势的组织修复材料。
目前已有一些软骨组织工程材料的专利，中国专利03137617.7公开了一种新型软骨组织工程用可注射性水凝胶支架。是将引发剂、助引发剂、去离子水、生物相容性聚合物的单体按比例相混合配制成均匀溶液，在恒温水浴中反应，得到可用于软骨组织工程的可注射性水凝胶。但该专利公开的水凝胶支架中选用了引发剂、助引发剂等化学试剂。中国专利02113378.6公开了能移植到体内的骨骼材料，其用分子量为8-20万的L-乳酸聚合物和平均长度5-15mm的聚磷酸钙纤维，采用熔铸颗粒沥取法复合而成。中国专利200810150135.0公开了一种含有10％～15％的羟丙基甲基纤维素和浓度为5×106软骨种子细胞的注射用软骨组织工程支架材料。若选用自体软骨细胞作为软骨组织工程支架的种子细胞，由于不能立即得到软骨细胞且一次性提取量不大，需传代培养几次才能得到足量的种子细胞，所以这种种子细胞在临床中应用很不方便。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种可注射的关节软骨组织修复材料及其制备方法，其特点是该修复材料选用生物相容性良好的原材料，组分中不包含有化学凝胶中所添加的引发剂等，生物相容性和生物降解性良好，具有生物活性，水凝胶前驱物的流体性能好，易于注射，可以自我塑形，选用的种子细胞易于提取，便于临床应用。
本发明的目的有以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。
可注射的关节软骨组织修复材料的起始原料由以下组分组成：
I型胶原100份，
透明质酸10～50份，优选为12～45份，再优选为20～40份，再优选为30～40份；
其中，透明质酸的氧化度为20％～60％；所述修复材料内包埋有生物体内骨髓液中的单核细胞层，复合材料的厚度为1～5mm。
可注射的关节软骨组织修复材料的制备方法包括以下步骤：
(1)在冰水浴中，将胶原溶于浓度为0.003M的盐酸溶液中，缓慢搅拌，配制成浓度为9mg/ml的胶原溶液，置于温度4℃冰箱中静置；
(2)将透明质酸粉末溶于超纯水中，搅拌使之充分溶解，配制成浓度为10mg/ml的透明质酸溶液；
(3)将高碘酸钠粉末避光溶于超纯水中，搅拌配制成浓度为20mM的高碘酸钠溶液；
(4)在步骤(2)的透明质酸溶液中加入步骤(3)的高碘酸钠溶液，在室温下避光搅拌，反应5～10h，反应液用去离子水透析60～96h，冷冻干燥，得到氧化度为20％～60％的氧化透明质酸；
(5)将步骤(4)得到的氧化度为20％～60％的氧化透明质酸，用超纯水溶解，搅拌配成浓度为3.15～15.75mg/ml的氧化透明质酸溶液，该溶液用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；
(6)在冰水浴下，步骤(1)的胶原溶液中加入5×PBS溶液和缓冲液，缓慢搅拌均匀，得到的胶原混合溶液调节pH至中性，其中，5×PBS溶液浓度为0.05M，缓冲液的成分为NaOH-NaHCO3-Hepes，NaOH的浓度为50mM，NaHCO3的浓度为260mM，Hepes的浓度为200mM，缓冲液和5×PBS溶液均用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；胶原溶液、5×PBS溶液与缓冲液混合的体积比为7∶2∶1；
(7)在冰水浴下，步骤(6)的中性的胶原混合溶液中加入步骤(4)的氧化透明质酸溶液，搅拌均匀，放入温度4℃冰箱中静置6～20h；
(8)用密度梯度离心法分离提取生物体骨髓液中整个单核细胞层的细胞，制成密度为1×108个/ml的细胞悬液，从温度4℃冰箱中取出步骤(7)得到的胶原与氧化透明质酸的混合液与所述细胞悬液混合均匀；
(9)上述步骤(5)、(6)、(7)、(8)均在超净工作台上无菌操作；
(10)将步骤(8)得到的混合液放入温度37℃恒温培养箱中静置10～25min，得到复合材料。
(11)将步骤(8)得到的混合液注射到生物体关节软骨组织缺损处，利用生物体组织的生理温度使之原位形成水凝胶，具有良好的自我塑形能力。
可注射的关节软骨组织修复材料用于关节软骨组织的缺损，组织工程及临床医学领域。
性能测试：
1.用称重法测试修复材料的含水量、降解性能；
2.用化学方法测试复合材料中透明质酸的有效含量及胶原与透明质酸之间的交联度；
3.种子细胞包埋在材料中的体外和体内实验，用激光共聚焦显微镜观察种子细胞的生长状态；
4.用荧光分光光度法和紫外分光光度法检测种子细胞的增殖情况和基质分泌；
5.用组织学染色和免疫组化染色法检测软骨细胞外基质的分泌及特征性软骨陷窝的形成。
结果表明：修复材料具有很高的含水量，仿似生物体内软骨组织，良好的降解性能，透明质酸被有效的固定于修复材料中；对种子细胞的相关测试和观察表明，该复合材料中的原料组分对种子细胞有很好的成软骨诱导作用，有特征性的软骨陷窝形成、软骨细胞外基质的分泌。
本发明具有以下优点：
1、生物活性仿生材料胶原和透明质酸能够在关节软骨处原位诱导单核细胞层中的干细胞成软骨分化，分泌软骨细胞外基质，从而构建软骨组织以达到修复目的；
2、具有可注射性，能在缺损原位注射形成凝胶，对生物体造成的创伤小，避免造成二次创伤；
3、成凝胶性能良好，不需有机溶剂；
4、具有良好的生物安全性和生物相容性，无细胞毒性；
5、组织学染色和免疫组化染色显示，该水凝胶和种子细胞在体外复合培养可形成软
骨样组织，有软骨组织的细胞外基质分泌；
6、便于临床操作，制备方法操作简单，对环境友好。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1采用I型胶原为100份，氧化透明质酸为10份；氧化透明质酸的氧化度为20％，复合材料的厚度为3mm。
(1)在冰水浴中，将胶原溶于浓度为0.003M的盐酸溶液中，缓慢搅拌，配制成浓度为9mg/ml的胶原溶液，置于温度4℃冰箱中静置；
(2)将透明质酸粉末溶于超纯水中，搅拌使之充分溶解，配制成浓度为10mg/ml的透明质酸溶液；
(3)将高碘酸钠粉末避光溶于超纯水中，搅拌配制成浓度为20mM的高碘酸钠溶液；
(4)在20ml步骤(2)的透明质酸溶液中加入5ml步骤(3)的高碘酸钠溶液，在室温下避光搅拌，反应5h，反应液用去离子水透析60h，冷冻干燥，得到氧化度为20％的氧化透明质酸；
(5)将步骤(4)得到的氧化度为20％的氧化透明质酸，用超纯水溶解，搅拌配成浓度为3.15mg/ml的氧化透明质酸溶液，该溶液用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；
(6)在冰水浴下，步骤(1)的胶原溶液中加入5×PBS溶液和缓冲液，缓慢搅拌均匀，得到的胶原混合溶液调pH至中性，其中，5×PBS溶液浓度为0.05M，缓冲液的成分为NaOH-NaHCO3-Hepes，NaOH的浓度为50mM，NaHCO3的浓度为260mM，Hepes的浓度为200mM，缓冲液和5×PBS溶液均用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；胶原溶液、5×PBS溶液与缓冲液混合的体积比为7∶2∶1；
(7)在冰水浴下，10ml步骤(6)的中性的胶原混合溶液中加入2ml步骤(4)的氧化透明质酸溶液，搅拌均匀，放入温度4℃冰箱中静置18h；
(8)用密度梯度离心法分离提取日本大耳白兔骨髓液中整个单核细胞层的细胞，制成密度为1×108个/ml的细胞悬液，从温度4℃冰箱中取出步骤(7)得到的胶原与氧化透明质酸的混合液与所述细胞悬液混合均匀；
(9)上述步骤(5)、(6)、(7)、(8)均在超净工作台上无菌操作；
(10)将步骤(8)得到的混合液放入温度37℃恒温培养箱中静置15min，得到复合材料。
(11)将步骤(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔关节软骨组织缺损处，利用生物体组织的生理温度使之原位形成水凝胶。
实施例2采用I型胶原为100份，氧化透明质酸为20份；氧化透明质酸的氧化度为20％，复合材料的厚度为3mm。
(1)在冰水浴中，将胶原溶于浓度为0.003M的盐酸溶液中，缓慢搅拌，配制成浓度为9mg/ml的胶原溶液，置于温度4℃冰箱中静置；
(2)将透明质酸粉末溶于超纯水中，搅拌使之充分溶解，配制成浓度为10mg/ml的透明质酸溶液；
(3)将高碘酸钠粉末避光溶于超纯水中，搅拌配制成浓度为20mM的高碘酸钠溶液；
(4)在20ml步骤(2)的透明质酸溶液中加入5ml步骤(3)的高碘酸钠溶液，在室温下避光搅拌，反应5h，反应液用去离子水透析60h，冷冻干燥，得到氧化度为20％的氧化透明质酸；
(5)将步骤(4)得到的氧化度为20％的氧化透明质酸，用超纯水溶解，搅拌配成浓度为6.3mg/ml的氧化透明质酸溶液，该溶液用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；
(6)在冰水浴下，步骤(1)的胶原溶液中加入5×PBS溶液和缓冲液，缓慢搅拌均匀，得到的胶原混合溶液调pH至中性，其中，5×PBS溶液浓度为0.05M，缓冲液的成分为NaOH-NaHCO3-Hepes，NaOH的浓度为50mM，NaHCO3的浓度为260mM，Hepes的浓度为200mM，缓冲液和5×PBS溶液均用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；胶原溶液、5×PBS溶液与缓冲液混合的体积比为7∶2∶1；
(7)在冰水浴下，10ml步骤(6)的中性的胶原混合溶液中加入2ml步骤(4)的氧化透明质酸溶液，搅拌均匀，放入温度4℃冰箱中静置10h；
(8)用密度梯度离心法分离提取日本大耳白兔骨髓液中整个单核细胞层的细胞，制成密度为1×108个/ml的细胞悬液，从温度4℃冰箱中取出步骤(7)得到的胶原与氧化透明质酸的混合液与所述细胞悬液混合均匀；
(9)上述步骤(5)、(6)、(7)、(8)均在超净工作台上无菌操作；
(10)将步骤(8)得到的混合液放入温度37℃恒温培养箱中静置15min，得到复合材料。
(11)将步骤(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔关节软骨组织缺损处，利用生物体组织的生理温度使之原位形成水凝胶。
实施例3采用I型胶原为100份，氧化透明质酸为20份；氧化透明质酸的氧化度为40％，复合材料的厚度为3mm。
(1)在冰水浴中，将胶原溶于浓度为0.003M的盐酸溶液中，缓慢搅拌，配制成浓度为9mg/ml的胶原溶液，置于温度4℃冰箱中静置；
(2)将透明质酸粉末溶于超纯水中，搅拌使之充分溶解，配制成浓度为10mg/ml的透明质酸溶液；
(3)将高碘酸钠粉末避光溶于超纯水中，搅拌配制成浓度为20mM的高碘酸钠溶液；
(4)在20ml步骤(2)的透明质酸溶液中加入10ml步骤(3)的高碘酸钠溶液，在室温下避光搅拌，反应8h，反应液用去离子水透析72h，冷冻干燥，得到氧化度为40％的氧化透明质酸；
(5)将步骤(4)得到的氧化度为40％的氧化透明质酸，用超纯水溶解，搅拌配成浓度为6.3mg/ml的氧化透明质酸溶液，该溶液用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；
(6)在冰水浴下，步骤(1)的胶原溶液中加入5×PBS溶液和缓冲液，缓慢搅拌均匀，得到的胶原混合溶液调pH至中性，其中，5×PBS溶液浓度为0.05M，缓冲液的成分为NaOH-NaHCO3-Hepes，NaOH的浓度为50mM，NaHCO3的浓度为260mM，Hepes的浓度为200mM，缓冲液和5×PBS溶液均用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；胶原溶液、5×PBS溶液与缓冲液混合的体积比为7∶2∶1；
(7)在冰水浴下，10ml步骤(6)的中性的胶原混合溶液中加入2ml步骤(4)的氧化透明质酸溶液，搅拌均匀，放入温度4℃冰箱中静置12h；
(8)用密度梯度离心法分离提取日本大耳白兔骨髓液中整个单核细胞层的细胞，制成密度为1×108个/ml的细胞悬液，从温度4℃冰箱中取出步骤(7)得到的胶原与氧化透明质酸的混合液与所述细胞悬液混合均匀；
(9)上述步骤(5)、(6)、(7)、(8)均在超净工作台上无菌操作；
(10)将步骤(8)得到的混合液放入温度37℃恒温培养箱中静置15min，得到复合材料。
(11)将步骤(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔关节软骨组织缺损处，利用生物体组织的生理温度使之原位形成水凝胶。
实施例4采用I型胶原为100份，氧化透明质酸为50份；氧化透明质酸的氧化度为40％，复合材料的厚度为3mm。
(1)在冰水浴中，将胶原溶于浓度为0.003M的盐酸溶液中，缓慢搅拌，配制成浓度为9mg/ml的胶原溶液，置于温度4℃冰箱中静置；
(2)将透明质酸粉末溶于超纯水中，搅拌使之充分溶解，配制成浓度为10mg/ml的透明质酸溶液；
(3)将高碘酸钠粉末避光溶于超纯水中，搅拌配制成浓度为20mM的高碘酸钠溶液；
(4)在20ml步骤(2)的透明质酸溶液中加入10ml步骤(3)的高碘酸钠溶液，在室温下避光搅拌，反应8h，反应液用去离子水透析72h，冷冻干燥，得到氧化度为40％的氧化透明质酸；
(5)将步骤(4)得到的氧化度为40％的氧化透明质酸，用超纯水溶解，搅拌配成浓度为15.75mg/ml的氧化透明质酸溶液，该溶液用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；
(6)在冰水浴下，步骤(1)的胶原溶液中加入5×PBS溶液和缓冲液，缓慢搅拌均匀，得到的胶原混合溶液调pH至中性，其中，5×PBS溶液浓度为0.05M，缓冲液的成分为NaOH-NaHCO3-Hepes，NaOH的浓度为50mM，NaHCO3的浓度为260mM，Hepes的浓度为200mM，缓冲液和5×PBS溶液均用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；胶原溶液、5×PBS溶液与缓冲液混合的体积比为7∶2∶1；
(7)在冰水浴下，10ml步骤(6)的中性的胶原混合溶液中加入2ml步骤(4)的氧化透明质酸溶液，搅拌均匀，放入温度4℃冰箱中静置12h；
(8)用密度梯度离心法分离提取日本大耳白兔骨髓液中整个单核细胞层的细胞，制成密度为1×108个/ml的细胞悬液，从温度4℃冰箱中取出步骤(7)得到的胶原与氧化透明质酸的混合液与所述细胞悬液混合均匀；
(9)上述步骤(5)、(6)、(7)、(8)均在超净工作台上无菌操作；
(10)将步骤(8)得到的混合液放入温度37℃恒温培养箱中静置15min，得到复合材料。
(11)将步骤(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔关节软骨组织缺损处，利用生物体组织的生理温度使之原位形成水凝胶。
实施例5采用I型胶原为100份，氧化透明质酸为10份；氧化透明质酸的氧化度为60％，复合材料的厚度为3mm。
(1)在冰水浴中，将胶原溶于浓度为0.003M的盐酸溶液中，缓慢搅拌，配制成浓度为9mg/ml的胶原溶液，置于温度4℃冰箱中静置；
(2)将透明质酸粉末溶于超纯水中，搅拌使之充分溶解，配制成浓度为10mg/ml的透明质酸溶液；
(3)将高碘酸钠粉末避光溶于超纯水中，搅拌配制成浓度为20mM的高碘酸钠溶液；
(4)在20ml步骤(2)的透明质酸溶液中加入15ml步骤(3)的高碘酸钠溶液，在室温下避光搅拌，反应10h，反应液用去离子水透析96h，冷冻干燥，得到氧化度为60％的氧化透明质酸；
(5)将步骤(4)得到的氧化度为60％的氧化透明质酸，用超纯水溶解，搅拌配成浓度为3.15mg/ml的氧化透明质酸溶液，该溶液用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；
(6)在冰水浴下，步骤(1)的胶原溶液中加入5×PBS溶液和缓冲液，缓慢搅拌均匀，得到的胶原混合溶液调pH至中性，其中，5×PBS溶液浓度为0.05M，缓冲液的成分为NaOH-NaHCO3-Hepes，NaOH的浓度为50mM，NaHCO3的浓度为260mM，Hepes的浓度为200mM，缓冲液和5×PBS溶液均用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；胶原溶液、5×PBS溶液与缓冲液混合的体积比为7∶2∶1；
(7)在冰水浴下，10ml步骤(6)的中性的胶原混合溶液中加入2ml步骤(4)的氧化透明质酸溶液，搅拌均匀，放入温度4℃冰箱中静置6h；
(8)用密度梯度离心法分离提取日本大耳白兔骨髓液中整个单核细胞层的细胞，制成密度为1×108个/ml的细胞悬液，从温度4℃冰箱中取出步骤(7)得到的胶原与氧化透明质酸的混合液与所述细胞悬液混合均匀；
(9)上述步骤(5)、(6)、(7)、(8)均在超净工作台上无菌操作；
(10)将步骤(8)得到的混合液放入温度37℃恒温培养箱中静置15min，得到复合材料。
(11)将步骤(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔关节软骨组织缺损处，利用生物体组织的生理温度使之原位形成水凝胶。
实施例6采用I型胶原为100份，氧化透明质酸为50份；氧化透明质酸的氧化度为60％，复合材料的厚度为3mm。
(1)在冰水浴中，将胶原溶于浓度为0.003M的盐酸溶液中，缓慢搅拌，配制成浓度为9mg/ml的胶原溶液，置于温度4℃冰箱中静置；
(2)将透明质酸粉末溶于超纯水中，搅拌使之充分溶解，配制成浓度为10mg/ml的透明质酸溶液；
(3)将高碘酸钠粉末避光溶于超纯水中，搅拌配制成浓度为20mM的高碘酸钠溶液；
(4)在20ml步骤(2)的透明质酸溶液中加入15ml步骤(3)的高碘酸钠溶液，在室温下避光搅拌，反应10h，反应液用去离子水透析96h，冷冻干燥，得到氧化度为60％的氧化透明质酸；
(5)将步骤(4)得到的氧化度为60％的氧化透明质酸，用超纯水溶解，搅拌配成浓度为15.75mg/ml的氧化透明质酸溶液，该溶液用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；
(6)在冰水浴下，步骤(1)的胶原溶液中加入5×PBS溶液和缓冲液，缓慢搅拌均匀，得到的胶原混合溶液调pH至中性，其中，5×PBS溶液浓度为0.05M，缓冲液的成分为NaOH-NaHCO3-Hepes，NaOH的浓度为50mM，NaHCO3的浓度为260mM，Hepes的浓度为200mM，缓冲液和5×PBS溶液均用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；胶原溶液、5×PBS溶液与缓冲液混合的体积比为7∶2∶1；
(7)在冰水浴下，10ml步骤(6)的中性的胶原混合溶液中加入2ml步骤(4)的氧化透明质酸溶液，搅拌均匀，放入温度4℃冰箱中静置6h；
(8)用密度梯度离心法分离提取日本大耳白兔骨髓液中整个单核细胞层的细胞，制成密度为1×108个/ml的细胞悬液，从温度4℃冰箱中取出步骤(7)得到的胶原与氧化透明质酸的混合液与所述细胞悬液混合均匀；
(9)上述步骤(5)、(6)、(7)、(8)均在超净工作台上无菌操作；
(10)将步骤(8)得到的混合液放入温度37℃恒温培养箱中静置15min，得到复合材料。
(11)将步骤(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔关节软骨组织缺损处，利用生物体组织的生理温度使之原位形成水凝胶。
Claims (3)
1.一种可注射的关节软骨组织修复材料，其特征在于该修复材料的起始原料由以下组分组成，按重量计为：
I型胶原100份，
透明质酸10～50份；
其中，透明质酸的氧化度为20％～60％；所述修复材料内包埋有生物体内骨髓液中的单核细胞层，复合材料的厚度为1～5mm。
2.根据权利要求1所述可注射的关节软骨组织修复材料的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)在冰水浴中，将胶原溶于浓度为0.003M的盐酸溶液中，缓慢搅拌，配制成浓度为9mg/ml的胶原溶液，置于温度4℃冰箱中静置；
(2)将透明质酸粉末溶于超纯水中，搅拌使之充分溶解，配制成浓度为10mg/ml的透明质酸溶液；
(3)将高碘酸钠粉末避光溶于超纯水中，搅拌配制成浓度为20mM的高碘酸钠溶液；
(4)在步骤(2)的透明质酸溶液中加入步骤(3)的高碘酸钠溶液，在室温下避光搅拌，反应5～10h，反应液用去离子水透析60～96h，冷冻干燥，得到氧化度为20％～60％的氧化透明质酸；
(5)将步骤(4)得到的氧化度为20％～60％的氧化透明质酸，用超纯水溶解，搅拌配成浓度为3.15～15.75mg/ml的氧化透明质酸溶液，该溶液用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；
(6)在冰水浴下，步骤(1)的胶原溶液中加入5×PBS溶液和缓冲液，缓慢搅拌均匀，得到的胶原混合溶液调pH至中性，其中，5×PBS溶液浓度为0.05M，缓冲液的成分为NaOH-NaHCO3-Hepes，NaOH的浓度为50mM，NaHCO3的浓度为260mM，Hepes的浓度为200mM，缓冲液和5×PBS溶液均用0.22um过滤器过滤灭菌后备用；胶原溶液、5×PBS溶液与缓冲液混合的体积比为7∶2∶1；
(7)在冰水浴下，步骤(6)的中性的胶原混合溶液中加入步骤(4)的氧化透明质酸溶液，搅拌均匀，放入温度4℃冰箱中静置6～20h；
(8)用密度梯度离心法分离提取生物体骨髓液中整个单核细胞层的细胞，制成密度为1×108个/ml的细胞悬液，从温度4℃冰箱中取出步骤(7)得到的胶原与氧化透明质酸的混合液与所述细胞悬液混合均匀；
(9)上述步骤(5)、(6)、(7)、(8)均在超净工作台上无菌操作；
(10)将步骤(8)得到的混合液放入温度37℃恒温培养箱中静置10～25min，得到复合材料。
(11)将步骤(8)得到的混合液注射到生物体关节软骨组织缺损处，利用生物体组织的生理温度使之原位形成水凝胶，具有良好的自我塑形能力。
3.根据权利要求1所述可注射的关节软骨组织修复材料的用途，其特征在于该关节软骨组织修复材料用于关节软骨组织的缺损，组织工程及临床医学领域。
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