CN102482682A - 抗线虫的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供表达编码AP2/EREBP转录因子、发夹诱导蛋白质、TINY-样转录因子、膜联蛋白、漆酶、异黄酮-7-O-甲基转移酶、花色素-3-葡糖苷鼠李糖基转移酶、hsr201样、或AUX/IAA蛋白质的多核苷酸的抗线虫的转基因植物和种子。本发明也提供生产对植物寄生线虫具有增加的抗性的转基因植物的方法和在此类方法中使用的表达载体。

Description

抗线虫的转基因植物
发明领域
本发明涉及通过使用抗线虫的转基因植物和种子提高农业生产力，和制备此类植物和种子的方法。
发明背景
线虫是以2000多种行栽作物、蔬菜、水果和观赏植物为食的微小线虫动物，在全世界引起大约1千亿美元的作物损失。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根癌线虫(root-knot nematode)(RKN)、胞囊形成线虫(cyst-forming nematode)和病变形成线虫(lesion-forming nematode)。以在进食位点引起根虫瘿形成为特征的根癌线虫，具有相对广的宿主范围并因此在多种作物物种上是寄生的。胞囊形成线虫和病变形成线虫具有较为有限的宿主范围，但是仍在易感作物中引起相当大的损失。
寄生线虫目前遍及整个美国，在南部和西部的温暖、潮湿区域以及在沙质土壤中发生最为密集。1954年，首次在美国北卡罗莱纳州发现了大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode)(Heterodera glycines)，其是大豆植物最严重的害虫。一些地区受到大豆胞囊线虫(SCN)侵染太严重，以至于不采取控制措施，大豆产量将不再是经济上可行的。尽管大豆是受到SCN攻击的主要经济作物，但是SCN总共寄生大约50种宿主，包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草。
线虫损害的病征包括在炎热时期叶子的矮化和黄化，以及植物枯萎。然而，线虫感染可以在没有任何明显的地上疾病症状的情况下引起显著的产量损失。产量降低的主要原因是由于地下的根损伤。受到SCN感染的根会矮化或者发育不良。线虫感染也可以减少根上固氮根瘤的数量，并可以使根更易于受到其他土传植物线虫的攻击。
线虫的生活史具有三个主要的阶段：卵、幼体和成体。线虫物种之间生活史不同。SCN的生活史与其他植物寄生线虫的生活史相似。在最佳的条件下，SCN的生活史通常可以在24到30天内完成，然而其他物种可能需要1年或者更长以完成生活史。在春天，当温度和湿度水平变得有利的时候，在土壤中，虫状的幼体从卵中孵化。只有在幼体发育阶段的线虫能感染大豆根。
在渗透入大豆根后，SCN幼体移动穿过根直到它们接触到维管组织，在那时，它们停止迁移并开始进食。通过口针，线虫注射修饰某些根细胞的分泌物并将它们转变成专门的进食位点。根细胞在形态上被转化成作为线虫的营养来源的大型多核合胞体(或者在RKN的情况下为巨大细胞)。因此，主动进食线虫从植物中盗取基本营养物质，造成了产量损失。随着雌性线虫进食，它们开始膨大并最终变得太大以至于它们的身体突破了根组织并暴露于根的表面。
在一段时间的进食后，没有如成体雌性膨大的雄性SCN，迁移到根的外面进入土壤中并使增大的成年雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍依附于根***并继续进食。在膨大的雌性内的卵开始发育，最初在体外的团块(mass)或卵囊内，并然后随后在线虫体腔内。最终，整个成年雌性体腔都充满了卵，且线虫死去。死亡雌性的充满卵的身体称为胞囊。胞囊最终扩散并在土壤中可随意发现。胞囊的壁变得非常坚硬，为包含在其中的大约200至400个卵提供良好的保护。SCN的卵在胞囊中存活直到合适的孵化条件出现。尽管许多卵可以在第一年内孵化，但是许多卵也会在保护性胞囊中存活几年。
线虫在土壤中以其自身的能力每年仅可以移动几英寸。然而，线虫感染可以以多种方式传播相当远的距离。任何移动受感染土壤的东西都能传播感染，包括农业机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人。土壤的种子大小颗粒常常污染收获的种子。因此，当从受感染的田地的受污染的种子播种在未受感染的田地的时候，线虫感染可以传播。甚至有证据表明，某些线虫物种可以通过鸟类传播。这些原因中仅有一些可以预防。
用于管理线虫感染的常规方法包括：在受线虫感染的土地中保持合适的土壤营养和土壤pH水平；控制其他植物疾病，以及昆虫和杂草害虫；仅在耕种了未感染田地后使用卫生实践，如线虫感染田地的耕作、种植和栽培；在受感染的田地作业后，用高压水或者蒸汽彻底清洁设备；不使用在受感染的土地上生长的种子用于种植未感染的田地，除非种子已经适当地清洁；轮作受感染的田地并用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和种植抗性植物品种。
已经提出了用于植物的基因转化的方法以赋予对植物寄生线虫增加的抗性。例如，美国专利号5,589,622和5,824,876涉及在受到线虫附着后在植物的进食位点内或者附近特异表达的植物基因的鉴定。许多方法涉及用能够抑制必需的线虫基因的双链RNA转化植物。其他农业生物技术方法提出超量表达编码对线虫有毒性的蛋白质的基因。
迄今，在任何国家中还没有解除对包含能够赋予线虫抗性的转基因的遗传修饰植物的管制。相应地，仍然存在使用农业生物技术鉴定用于控制植物寄生线虫的安全且有效的组合物和方法的需要。
发明概述
本发明人已经发现某些植物多核苷酸的转基因超量表达能够使得植物对寄生线虫是抗性的。特别地，选自下述的植物多核苷酸的超量表达：a)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：19相似的AP2/EREBP转录因子多核苷酸；b)与SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35，或SEQ ID NO：37相似的发夹诱导的多核苷酸；c)与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：45，或SEQ ID NO：47相似的TINY-样多核苷酸；d)与SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75，或SEQ ID NO：77相似的膜联蛋白多核苷酸；e)与SEQ IDNO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101，或SEQ ID NO：103相似的漆酶多核苷酸；f)与SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：107相似的苯甲酰转移酶多核苷酸；g)与SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113，或SEQ ID NO：115相似的鼠李糖基转移酶多核苷酸；h)与SEQ IDNO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123，或SEQ IDNO：125相似的异黄酮-7-O-甲基转移酶多核苷酸；和i)与SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131，或SEQ ID NO：133相似的AUX/IAA多核苷酸。相应地，本发明提供克服，或至少减轻有价值农作物的线虫侵袭的转基因植物和种子，以及方法。
在一个实施方案中，本发明提供用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述分离的多核苷酸选自：a)编码与SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20相似的AP2/EREBP转录因子的多核苷酸；b)编码与SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36，或SEQ ID NO：38相似的发夹诱导蛋白质的多核苷酸；c)编码与SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：48相似的TINY-样转录因子的多核苷酸；d)编码与SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76，或SEQ ID NO：78相似的膜联蛋白的多核苷酸；e)编码与SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102，或SEQ ID NO：104相似的漆酶的多核苷酸；f)编码与SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：108相似的苯甲酰转移酶的多核苷酸；g)编码与SEQ IDNO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114，或SEQ ID NO：116相似的鼠李糖基转移酶的多核苷酸；h)编码与SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124，或SEQ ID NO：126相似的异黄酮-7-O-甲基转移酶的多核苷酸；和i)编码与SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132，或SEQ ID NO：134相似的AUX/IAA蛋白质的多核苷酸。
本发明的另一个实施方案提供由上述转基因植物生产的种子。种子对于转基因是不分离的，所述转基因包含选自下列的至少一个多核苷酸：a)编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18，或SEQ ID NO：20相似的AP2/EREBP转录因子的多核苷酸；b)编码与SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36，或SEQID NO：38相似的发夹诱导蛋白质的多核苷酸；c)编码与SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：48相似的TINY-样转录因子的多核苷酸；d)编码与SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76，或SEQ IDNO：78相似的膜联蛋白的多核苷酸；e)编码与SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQID NO：100、SEQ ID NO：102，或SEQ ID NO：104相似的漆酶的多核苷酸；f)编码与SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：108相似的苯甲酰转移酶的多核苷酸；g)编码与SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114，或SEQID NO：116相似的鼠李糖基转移酶的多核苷酸；h)编码与SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124，或SEQ IDNO：126相似的异黄酮-7-O-甲基转移酶的多核苷酸；和i)编码与SEQ IDNO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132，或SEQ ID NO：134相似的AUX/IAA蛋白质的多核苷酸，并且转基因的表达赋予生长自转基因种子的植物增加的线虫抗性。
在另一个实施方案中，本发明提供包含与多核苷酸有效连接的启动子的表达载体，所述多核苷酸编码至少一个选自下述的多核苷酸：a)编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20相似的AP2/EREBP转录因子的多核苷酸；b)编码与SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36，或SEQ ID NO：38相似的发夹诱导蛋白质的多核苷酸；c)编码与SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：48相似的TINY-样转录因子的多核苷酸；d)编码与SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76，或SEQ ID NO：78相似的膜联蛋白的多核苷酸；e)编码与SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQID NO：102，或SEQ ID NO：104相似的漆酶的多核苷酸；f)编码与SEQ IDNO：106或SEQ ID NO：108相似的苯甲酰转移酶的多核苷酸；g)编码与SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114，或SEQ ID NO：116相似的鼠李糖基转移酶的多核苷酸；h)编码与SEQ ID NO：118、SEQ IDNO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124，或SEQ ID NO：126相似的异黄酮-7-O-甲基转移酶的多核苷酸；和i)编码与SEQ ID NO：128、SEQ IDNO：130、SEQ ID NO：132，或SEQ ID NO：134相似的AUX/IAA蛋白质的多核苷酸。优选地，启动子是组成型启动子。更优选地，启动子能够特异性指导植物根中的表达。最优选地，启动子能够特异性指导被线虫感染的植物的合胞***点中的表达。
在另一个实施方案中，本发明提供生产抗线虫的转基因植物的方法，其中所述方法包括步骤为：a)用表达载体转化野生型植物细胞，所述表达载体包含有效连接于多核苷酸的启动子，所述多核苷酸选自：a)编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20相似的AP2/EREBP转录因子的多核苷酸；b)编码与SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36，或SEQ ID NO：38相似的发夹诱导蛋白质的多核苷酸；c)编码与SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：48相似的TINY-样转录因子的多核苷酸；d)编码与SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76，或SEQ ID NO：78相似的膜联蛋白的多核苷酸；e)编码与SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQID NO：102，或SEQ ID NO：104相似的漆酶的多核苷酸；f)编码与SEQ IDNO：106或SEQ ID NO：108相似的苯甲酰转移酶的多核苷酸；g)编码与SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114，或SEQ ID NO：116相似的鼠李糖基转移酶的多核苷酸；h)编码与SEQ ID NO：118、SEQ IDNO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124，或SEQ ID NO：126相似的异黄酮-7-O-甲基转移酶的多核苷酸；和i)编码与SEQ ID NO：128、SEQ IDNO：130、SEQ ID NO：132，或SEQ ID NO：134相似的AUX/IAA蛋白质的多核苷酸；b)从转化的植物细胞再生转基因植物；和c)与相同物种的对照植物相比就增加的线虫抗性选择转基因植物。
在另一个实施方案中，本发明提供增加作物植物产量的方法，方法包括步骤为用包含有效连接于多核苷酸的启动子的表达载体转化植物细胞，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20相似的AP2/EREBP转录因子；从转化的植物细胞再生转基因植物，并且与相同物种的对照植物相比就增加的根生长选择转基因植物。
附图简述
图1显示分配给对应的多核苷酸和启动子的SEQ ID NO的表。
图2显示适合于在本发明中使用的示例性的AP2/EREBP转录因子的氨基酸比对。在Vector NTI软件套件中实施比对(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位间隔罚分＝8)。
图3显示适合于在本发明中使用的示例性的发夹诱导蛋白质的氨基酸比对。在Vector NTI软件套件中实施比对(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位间隔罚分＝8)。
图4显示适合于在本发明中使用的示例性的TINY-样转录因子的氨基酸比对。在Vector NTI软件套件中实施比对(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位间隔罚分＝8)。
图5a-5b显示适合于在本发明中使用的示例性的膜联蛋白的氨基酸比对。在Vector NTI软件套件中实施比对(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位间隔罚分＝8)。
图6a-6c显示适合于在本发明中使用的示例性的漆酶蛋白质的氨基酸比对。在Vector NTI软件套件中实施比对(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位间隔罚分＝8)。
图7显示适合于在本发明中使用的示例性的苯甲酰转移酶的氨基酸比对。在Vector NTI软件套件中实施比对(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位间隔罚分＝8)。
图8显示适合于在本发明中使用的示例性的花色素-3-葡糖苷鼠李糖基转移酶的氨基酸比对。在Vector NTI软件套件中实施比对(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位间隔罚分＝8)。
图9显示适合于在本发明中使用的示例性的异黄酮-7-O-甲基转移酶的氨基酸比对。在Vector NTI软件套件中实施比对(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位间隔罚分＝8)。
图10显示适合于在本发明中使用的示例性的AUX/IAA蛋白质的氨基酸比对。在Vector NTI软件套件中实施比对(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位间隔罚分＝8)。
优选实施方案详述
通过参考以下详细的描述和本文包括的实施例可更容易地理解本发明。在本申请中，参考了多种出版物。所有这些出版物的公开和在那些出版物中引用的那些参考文献以其整体在此引入本申请中作为参考，以便更充分地说明本发明所属领域的现有状态。本文使用的术语的目的仅是描述具体的实施方案并且并不旨在为限制性的。如本文所用，单数形式(“a”或“an”)可以意为一个或者多个，取决于使用它的上下文。因此，例如，提到“细胞”可以意为使用至少一个细胞。如本文所用，单词“或”意为特别的列表中的任一成员并且也包括那个列表的成员的任意组合。
如本文所定义的，“转基因植物”是使用重组DNA技术改变以含有分离的核酸的植物，所述核酸否则将不存在于植物中。如本文所用，术语“植物”包括整个植物、植物细胞，和植物部分。植物部分包括但不限于茎、根、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子等。
如本文所定义的，术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的并指线性或分支的、单或双链的RNA或DNA，或其杂化物。术语也包括RNA/DNA杂化物。“分离的”核酸分子是从存在于核酸的天然源的其他核酸分子(即，编码其他多肽的序列)基本分离的核酸分子。例如，认为克隆的核酸是分离的。如果核酸已经由人为干预改变，或已经将核酸放置于不是其天然位点的基因座或位置，或如果通过转化将它引入细胞中，也认为核酸是分离的。此外，分离的核酸分子，例如cDNA分子，可以没有一些与其天然结合的其他细胞物质，或者通过重组技术产生时没有培养基，或者当化学合成时没有化学前体或其他化学物质。尽管它可以任选地包括位于基因的编码区的3’和5’末端的非翻译序列，但是优选地可以移除天然地位于其天然发生的复制子中的编码区侧翼的序列。
术语“基因”广泛地使用以指与生物学功能相关联的任何核酸片段。因此，基因包括如在基因组序列中的内含子和外显子，或仅如在cDNA中的编码序列和/或它们表达所需的调控序列。例如，基因涉及表达mRNA或功能性RNA，或编码特定蛋白质的核酸片段，并且所述核酸片段包括调控序列。
本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白质”以指连续的氨基酸残基的多聚物。
术语“有效连接”和“有效结合于”是可互换的并且如本文所用涉及分离的多核苷酸结合在单一核酸片段上如此使得一个分离的多核苷酸的功能受到另一个分离的多核苷酸影响。例如，如果2个DNA处于如此位置使得调控DNA影响编码DNA的表达，就说调控DNA“有效连接于”表达RNA或编码多肽的DNA。
如本文所用术语“启动子”指DNA序列，所述序列当连接于目标核苷酸序列时，能够调控目标核苷酸序列转录为mRNA。一般地，尽管非必需地，启动子位于目标核苷酸的5’(例如，上游)(例如，临近结构基因的转录起始位点)，并且提供用于转录起始的由RNA聚合酶和其他转录因子特异性结合的位点，所述目标核苷酸转录为mRNA受所述启动子控制。
如本文所用术语“转录调控元件”指能够调控有效连接的多核苷酸的转录的多核苷酸。它包括，但不限于，启动子、增强子、内含子、5’UTR，和3’UTR。
如本文所用，术语“载体”指能够运输已经与其连接的另一个核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指额外的DNA片段能够连接进入的环状双链DNA环。在本说明书中，由于质粒是载体最常用的形式，能够互换地使用“载体”和“质粒”。载体能够为双元载体或包含左边界和右边界并且其间可包括目标基因的T-DNA。如本文所用术语“表达载体”与术语“转基因”是可互换的并且意为能够指导在合适的宿主细胞中特定核苷酸表达的载体。核苷酸的表达能够为超量表达。表达载体包含与目标核酸有效连接的调控核酸元件，所述调控核酸元件任选地-有效连接于终止信号和/或其他调控元件。
如本文所用术语“同源物”指与由共同祖先DNA序列而来的另一个基因相关的基因。术语“同源物”可应用于由物种形成事件分隔的基因之间的关系(例如，直向同源物)或由遗传复制事件分隔的基因之间的关系(例如，旁系同源物)。
如本文所用，术语“直向同源物”指来自不同物种，但通过物种形成从共同祖先基因进化而来的基因。在进化过程中直向同源物保持相同的功能。直向同源物编码具有相同或相似功能的蛋白质。如本文所用，术语“旁系同源物”指通过基因组内复制相关的基因。旁系同源物通常具有不同的功能或新功能，但这些功能可为相关的。
如本文所用术语“保守区”或“保守结构域”指在异源多核苷酸或多肽序列中的区，在所述区中不同序列之间有相对高程度的序列同一性。例如，使用Clustal W算法从多序列比对能够鉴定“保守区”。
如本文所用术语“细胞”或“植物细胞”指单细胞，并且也包括细胞群体。群体可为包含一种细胞类型的纯群体。同样地，群体可包含多于一种细胞类型。在本发明含义内的植物细胞可被分离(例如，在悬浮培养物中)或包含在植物组织、植物器官或处于任何发育阶段的植物中。
如本文所用术语“不分离的”指对于特定性状的植物品种，如果对于该性状它达到下述程度的遗传纯合，所述程度为当不分离的品种自传粉时，在后代中未观测到显著量的性状的自由分离。
如本文所用术语“无效分离”指由于孟德尔分离不含有转基因的转基因植物的后代(或来自后代的系)。
如本文所用术语“野生型”指未经实验意义上的遗传修饰或处理的植物细胞、种子、植物组分、植物组织、植物器官，或整个植物。
如本文所用术语“对照植物”指用于与转基因或遗传修饰的植物对比来鉴定转基因或遗传修饰植物中增强的表现型或合乎需要的性状的植物细胞、外植体、种子、植物组分、植物组织、植物器官，或整个植物。在一些情况下“对照植物”可为包含空载体或标志物基因，但不含有在受评估的转基因或遗传修饰植物中存在的目标重组多核苷酸的转基因植物品系。对照植物可为与受测试的转基因或遗传修饰植物相同的品系或种类的植物，或其可为另一品系或种类，例如已知具有特定表现型、特征或已知基因型的植物。合适的对照植物将包括用于生成本文转基因植物的亲本品系的遗传未改变的或非转基因的植物。
如本文所用术语“合胞***点”指在线虫侵袭之后在植物根中形成的进食位点。该位点用作线虫的营养物源。合胞体是胞囊线虫的进食位点而巨大细胞是根癌线虫的进食位点。
在Index of Plant Diseases in the United States(美国农业部手册(U.S.Dept.of Agriculture Handbook)No.165，1960)；Distribution of PlantParasitic Nematode Species in North America(Society of Nematologists，1985)；和Fungi on Plants and Plant Products in the United States(American Phytopathological Society，1989)中列出作物植物和相应的寄生线虫。例如，由本发明靶向的植物寄生线虫包括，但不限于，胞囊线虫和根癌线虫。由本发明靶向的特定植物寄生线虫包括，但不限于，大豆异皮线虫(Heterodera glycines)、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)、水稻异皮线虫(Heterodera oryzae)、(Heterodera cajani)、三叶草异皮线虫(Heterodera trifolii)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)，或烟草球胞囊线虫(Globodera tabacum)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、北方根结线虫(M.hapla)、爪哇根结线虫(M.javanica)、纳西根结线虫(M.naasi)、短小根结线虫(M.exigua)、起绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、窄小茎线虫(Ditylenchus angustus)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫(Radopholuscitrophilus)、多带螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、弯曲针线虫(Paratylenchuscurvitatus)、玉米针线虫(Paratylenchus zeae)、肾形线虫(Rotylenchulusreniformis)、银莲花类毛刺线虫(Paratrichodorus anemones)、较小类毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、较小类毛刺线虫(Paratrichodoruschristiei)、小麦粒线虫(Anguina tritici)、燕麦胞囊线虫(Bidera avenae)、根瘿亚粒线虫(Subanguina radicicola)、塞恩霍斯特纽带线虫(Hoplolaimusseinhorsti)、哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus Columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、半穿刺小垫刃线虫(Tylenchulussemipenetrans)、蚤缀鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)、椰子红环线虫(Rhadinaphelenchus cocophilus)、长尾刺线虫(Belonolaimuslongicaudatus)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)、卡纳亚拟鞘线虫(Hemicriconemoides kanayaensis)、克来顿矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲剑线虫(Xiphinema americanum)、有害坏死线虫(Cacopaurus pestis)、玉米胞囊线虫(Heterodera zeae)、菲氏胞囊线虫(Heterodera filipjevi)等。
在一个实施方案中，本发明提供用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20中示出的转录因子相似的含有AP2/EREBP结构域的转录因子。如以下实施例1和2中所描述的，与对照品系相比较，表达分别具有SEQ ID NO：1、3，和7的AP2/EREBP多核苷酸的转基因大豆根品系显示对线虫感染增加的抗性。在图2中显示适于本实施方案使用的若干示例性含有AP2/EREBP结构域的转录因子的氨基酸比对。可如本文描述地使用任何编码含有与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20的AP2/EREBP结构域相似的AP2/EREBP结构域的蛋白质的多核苷酸以生产抗线虫的转基因植物。例如，可将编码在图2中示出的任何含有AP2/EREBP结构域的蛋白质的多核苷酸转化入易感线虫的植物中以生产抗线虫的转基因植物。
如以下实施例3中示出的，与对照品系相比较表达由SEQ ID NO：1和7编码的AP2/EREBP蛋白质的转基因大豆根品系也显示增加的根重量。在若干作物中根结构与产量相关。例如，玉米中遗传产量提高的生理基础的回顾分析显示较新的玉米杂种比数十年前较早的商业杂种耐受更高的种植密度并且此变化解释了过去几十年间通过植物育种达到的产量遗传增加的大部分。植物耐受与较高的种植密度关联的间作竞争的能力是胁迫耐受的形式。已经显示此胁迫耐受和随后的产量提高是为支持植物生长和发育从环境更有效的捕获和使用资源的结果。株冠结构和叶寿命的差异使得在植物的生活史期间能够捕获更多光(能量)导致更强的光合作用并且这反过来使得能够生产和以生物质或在种子中贮藏更多碳水化合物。此外，在与较高的种植密度相关联的竞争更强的条件下，更有效的根***使得更多摄入营养物和水。由田间实验证实的最近的计算机模拟研究表明增加水捕获的根***结构的改变对生物量积累和玉米产量比株冠结构的改变具有更大和更直接的影响。
基于植物生长的生物物理预测植物大小和通过根的水的摄入之间的关系。植物通过细胞伸展生长。这由细胞内和外之间水势的差异渗透驱动并且受细胞壁的弹性或伸展能力的抵抗。水势梯度由包括获取自土壤的钾和其他营养物的渗透活性的溶质的梯度产生。因此，细胞伸展能够受机械或液压约束(hydraulic constraint)或二者限制。由于水或渗透活性营养物量限制的液压约束可由在土壤中缺乏它们的可利用度(例如干旱)或由缺乏根穿透入包含水和营养物的土壤区引起。
根对于维持成熟时植物处于竖直位置使得能够收获也是重要的。由于茎断裂或由于植物从土壤***能够发生倒伏。在玉米中，特别地如果以高种植密度生长，冠根数或根分支程度的改善将改善林分/植丛建立(standestablishement)和直立性(standability)。因此在玉米中预期改善的根性质(包括结构、分支，和土壤穿透)提供增加的水和营养物获得以支持细胞延伸，提供增加的营养物摄入以支持包括蛋白质合成的代谢，和提供导致增加的可收获产量的减少的倒伏。为了促进营养物和水摄入，植物也从被称为根毛的根表面的表皮细胞进化形成微小突出物(microscopicprojections)。在作物植物中根毛将根表面扩大多达77％以支持水和营养物的摄入并且影响与非生物和生物根围的相互作用。尤其在玉米中，已经显示根毛在影响产量中的重要作用。根毛数、大小和形状变化能够导致对植物最适宜地摄入水和营养物的能力的显著的作用。随着急剧减少的根毛发育，玉米产量能够显示至多至约40％的损失，表明根毛生长对总体谷物产量的增加的作用。
因此，也可使用编码与图2的含有AP2/EREBP结构域的转录因子相似的AP2/EREBP蛋白质的多核苷酸以改善作物植物产量。如本文所用，术语“改善的产量”意为任何测量的植物产物(例如谷粒、果实或纤维)的任何产量改善。根据本发明，不同表现型性状的变化可改善产量。例如，且不限于，例如花器官发育、根起始、根生物量、种子数、种子重量、收获指数、对非生物环境胁迫的耐受、营养物(例如氮或磷)输入需求减少、叶形成、向光性、顶端优势，和果实发育的参数是改善的产量的合适的量度。根据本发明产量的任何增加是改善的产量。例如，产量改善能够包含任何测量的参数的0.1％、0.5％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的增加。例如，根据本发明，与在相同条件下培养的未处理的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量相比较，来自下述作物的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量增加，是增加的产量，所述作物包括本文描述的对于含有AP2/EREBP结构域转录因子是转基因的植物。
在另一个实施方案中，本发明提供用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：36，或SEQ ID NO：38中示出的多肽相似的发夹诱导蛋白质。如以下实施例1和2中所描述的，与对照品系相比较，表达具有SEQ ID NO：21的发夹诱导多核苷酸的转基因大豆根品系显示对线虫感染增加的抗性。在图3中示出适于本实施方案使用的若干示例性发夹诱导多肽的氨基酸比对。可如本文描述地使用编码与SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：38中示出的发夹诱导蛋白质相似的蛋白质的任何多核苷酸以生产抗线虫的转基因植物。例如，可将编码在图3中示出的任何发夹诱导蛋白质的多核苷酸转化入易感线虫的植物中以生产抗线虫的转基因植物。
在另一个实施方案中，本发明提供用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：48中示出的多肽相似的TINY-样转录因子。如以下实施例1和2中所描述的，与对照品系相比较，表达具有SEQ ID NO：39的蒺藜苜蓿(M.trunculata)TINY-样转录因子多核苷酸的转基因大豆根品系显示对线虫感染增加的抗性。在图4中示出适于本实施方案使用的示例性TINY-样转录因子的氨基酸比对。可如本文描述地使用编码与SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：46或SEQ ID NO：48的TINY-样转录因子蛋白质相似的蛋白质的任何多核苷酸以生产抗线虫的转基因植物。例如，可将编码在图4中示出的任何TINY-样转录因子蛋白质的多核苷酸转化入野生型植物中以生产抗线虫的转基因植物。
在另一个实施方案中，本发明提供用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：78中示出的膜联蛋白相似的膜联蛋白。如以下实施例1和2中所描述的，与对照品系相比较，表达具有SEQ ID NO：49的大豆(G.max)膜联蛋白多核苷酸的转基因大豆根品系显示对线虫感染增加的抗性。在图5中示出适于本实施方案使用的若干示例性膜联蛋白的氨基酸比对。可如本文描述地使用编码与SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：78的蛋白质相似的膜联蛋白的任何多核苷酸以生产抗线虫的转基因植物。例如，可将编码在图5中示出的任何膜联蛋白的多核苷酸转化入易感线虫的植物中以生产抗线虫的转基因植物。
在另一个实施方案中，本发明提供用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ IDNO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：104中示出的漆酶相似的漆酶。如以下实施例1和2中所描述的，与对照品系相比较，表达具有SEQ ID NO：79的大豆漆酶多核苷酸的转基因大豆根品系显示对线虫感染增加的抗性。在图6中示出适于本实施方案使用的若干示例性漆酶的比对。可如本文描述地使用编码与SEQ ID NO：80的蛋白质相似的漆酶的任何多核苷酸以生产抗线虫的转基因植物。例如，可将编码在图6中示出的任何漆酶蛋白质的多核苷酸转化入易感线虫的植物中以生产抗线虫的转基因植物。
在另一个实施方案中，本发明提供用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：106和SEQ IDNO：108中示出的多肽相似的苯甲酰-辅酶A：苯甲醇/苯乙醇苯甲酰转移酶。如以下实施例1和2中所描述的，与对照品系相比较，表达具有SEQ IDNO：105的大豆苯甲酰-辅酶A：苯甲醇/苯乙醇苯甲酰转移酶多核苷酸的转基因大豆根品系显示对线虫感染增加的抗性。在图7中示出适于本实施方案使用的示例性苯甲酰转移酶的比对。可如本文描述地使用编码与SEQ IDNO：106或SEQ ID NO：108的蛋白质相似的苯甲酰转移酶的任何多核苷酸以生产抗线虫的转基因植物。例如，可将编码在图7中示出的任何苯甲酰转移酶蛋白质的多核苷酸转化入易感线虫的植物中以生产抗线虫的转基因植物。
在另一个实施方案中，本发明提供用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：110、SEQ IDNO：112、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：116中示出的鼠李糖基转移酶相似的花色素-3-葡糖苷鼠李糖基转移酶。如以下实施例1和2中所描述的，与对照品系相比较，表达具有SEQ ID NO：109的大豆花色素-3-葡糖苷鼠李糖基转移酶多核苷酸的转基因大豆根品系显示对线虫感染增加的抗性。在图8中示出适于本实施方案使用的若干示例性鼠李糖基转移酶的比对。可如本文描述地使用编码与SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ IDNO：114或SEQ ID NO：116的那些相似的鼠李糖基转移酶的任何多核苷酸以生产抗线虫的转基因植物。例如，可将编码在图8中示出的任何花色素-3-葡糖苷鼠李糖基转移酶蛋白质的多核苷酸转化入易感线虫的植物中以生产抗线虫的转基因植物。
在另一个实施方案中，本发明提供用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：118、SEQ IDNO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：126中示出的甲基转移酶相似的异黄酮-7-O-甲基转移酶。如以下实施例1和2中所描述的，与对照品系相比较，表达具有SEQ ID NO：117的大豆异黄酮-7-O-甲基转移酶多核苷酸的转基因大豆根品系显示对线虫感染增加的抗性。在图9中示出适于本实施方案使用的示例性异黄酮-7-O-甲基转移酶的比对。可如本文描述地使用编码与SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ IDNO：122、SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：126的蛋白质相似的甲基转移酶的任何多核苷酸以生产抗线虫的转基因植物。例如，可将编码在图9中示出的任何异黄酮-7-O-甲基转移酶蛋白质的多核苷酸转化入易感线虫的植物中以生产抗线虫的转基因植物。
在另一个实施方案中，本发明提供用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：128、SEQ IDNO：130、SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：134中示出的AUX/IAA蛋白质相似的AUX/IAA多肽。如以下实施例1和2中所描述的，与对照品系相比较，表达具有SEQ ID NO：127的大豆AUX/IAA多核苷酸的转基因大豆根品系显示对线虫感染增加的抗性。在图10中示出适于本实施方案使用的示例性AUX/IAA蛋白质的比对。可如本文描述地使用编码与SEQ IDNO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：134的AUX/IAA蛋白质相似的AUX/IAA蛋白质的任何多核苷酸以生产抗线虫的转基因植物。例如，可将编码在图10中示出的任何AUX/IAA蛋白质的多核苷酸转化入易感线虫的植物中以生产抗线虫的转基因植物。
本发明的转基因植物可表征为单子叶植物或双子叶植物。例如且不限于，本发明的转基因植物可为玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉、黑麦草(ryegrass)、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、马铃薯、番茄、棉花、烟草、胡椒、油菜(oilseed rape)、糖萝卜(sugar beet)、甘蓝、花椰菜、绿花椰菜(btoccoli)、莴苣、拟南芥、玫瑰，或适合转化的任何植物物种。本发明的转基因植物可为雄性不育的或雄性可育的，并可还包括包含本文描述的分离的多核苷酸的那些之外的转基因。
使用已知的植物育种的方法，本发明的转基因植物可与相似的转基因植物或与缺少上述多核苷酸的转基因植物或与非转基因植物杂交以制备种子。本发明也提供来自上述转基因植物的种子和部分，以及来自此类植物的后代植物，包括杂种和近交种。本发明也提供植物育种的方法，例如，以制备杂交的可育转基因植物。方法包括将包含本发明的特定表达载体的可育转基因植物自交或与第二个植物(例如缺少特定的表达载体的一个)杂交以制备包含特定表达载体的杂交的可育转基因植物的种子。然后种植种子以获得杂交的可育转基因植物。杂交的可育转基因植物可具有通过雌性亲本或通过雄性亲本遗传的特定表达载体。第二个植物可为近交植物。杂交的可育转基因植物可为杂种。本发明中还包括任何这些杂交的可育转基因植物的种子。本发明的种子能够从可育转基因植物收获并被用来种植本发明受转化的植物的后代，所述后代包括包含以上描述的赋予线虫抗性的多核苷酸的杂种植物品系。
根据本发明，可通过堆积任一本文描述的线虫抗性多核苷酸和至少一个本文公开的其他多核苷酸生产抗线虫的转基因植物。本发明的转基因植物可包含，和/或与包含一个或多个转基因的另一个转基因植物杂交，从而在植物和/或其后代中产生转基因的“堆积”(也称为“基因堆积”)。通过任何方法能够产生这些堆积的组合，所述方法包括但不限于通过常规方法或通过基因转化的杂交育种植物。如果通过基因转化堆积性状，能够顺序地或以任何次序同时地组合赋予性状的多核苷酸。例如如果待引入2个多核苷酸，2个序列能够包含于分开的转化盒或相同的转化盒。序列的表达能够由相同或不同的启动子驱动。
例如可堆积编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20的AP2/EREBP转录因子中任何两个或更多的多核苷酸以提供增强的线虫抗性或增强的产量。作为另一个实例，可堆积编码SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36，或SEQ ID NO：38的发夹诱导蛋白质中任何两个或更多的多核苷酸以提供增强的线虫抗性。备选地，可堆积编码SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：48的TINY-样转录因子中任何两个或更多的多核苷酸以提供增强的线虫抗性。在另一个堆积实施方案中，可堆积编码SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：78示出的任何两个或更多的膜联蛋白的多核苷酸以提供增强的线虫抗性。此外，可堆积编码SEQ IDNO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ IDNO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：104的漆酶中任何两个或更多的多核苷酸以提供增强的线虫抗性。在另一个实施方案中，可堆积编码SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：108的苯甲酰-辅酶A：苯甲醇/苯乙醇苯甲酰转移酶中任何两个或更多的多核苷酸以提供增强的线虫抗性。在另一个实施方案中，可堆积编码SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：116的花色素-3-葡糖苷鼠李糖基转移酶中任何两个或更多的多核苷酸以提供增强的线虫抗性。可堆积编码SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124和SEQ IDNO：126的异黄酮-7-O-甲基转移酶中任何两个或更多的多核苷酸以提供增强的线虫抗性。在另一个实施方案中，可堆积编码SEQ ID NO：128、SEQID NO：130、SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：134的AUX/IAA蛋白质中任何两个或更多的多核苷酸以提供增强的线虫抗性。
备选地，编码本文公开的AP2/EREBP转录因子的多核苷酸可与编码本文公开的发夹诱导蛋白质的多核苷酸、编码本文公开的TINY-样转录因子的多核苷酸、编码本文公开的膜联蛋白的多核苷酸、编码本文公开的漆酶的多核苷酸、编码本文公开的苯甲酰-辅酶A：苯甲醇/苯乙醇苯甲酰转移酶的多核苷酸、编码本文公开的花色素-3-葡糖苷鼠李糖基转移酶的多核苷酸、编码本文公开的异黄酮-7-O-甲基转移酶的多核苷酸、或编码本文公开的AUX/IAA蛋白质的多核苷酸堆积。可组合本文公开的多核苷酸的任何组合以生产抗线虫植物。此外，本文公开的任何多核苷酸可与已知的增强植物寄生线虫抗性的任何多核苷酸组合。
本发明的另一个实施方案涉及包含与本发明的一个或多个多核苷酸有效连接的启动子的表达载体，其中多核苷酸的表达赋予转基因植物增加的线虫抗性。在一个实施方案中，转录调控元件是能够调控有效连接的多核苷酸的组成型表达的启动子。“组成型”启动子指在植物的全部或几乎全部发育阶段期间在全部或几乎全部的植物组织中能够表达其所控制的开放阅读框或调控元件的启动子。组成型启动子包括但不限于来自植物病毒的35S CaMV启动子(Franck等人，Cell 21：285-294，1980)、Nos启动子(AnG等人，The Plant Cell 3：225-233，1990)、泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632，1992和18：581-8，1991)、MAS启动子(Velten等人，EMBO J.3：2723-30，1984)、玉米H3组蛋白启动子(Lepetit等人，Mol Gen.Genet 231：276-85，1992)、ALS启动子(WO96/30530)、19S CaMV启动子(美国5,352,605)、超级启动子(美国5,955,646)、玄参花叶病毒启动子(美国6,051,753)、稻肌动蛋白启动子(美国5,641,876)，和Rubisco小亚基启动子(美国4,962,028)。
在另一个实施方案中，转录调控元件是调控型启动子。“调控型启动子”指非组成型地，但以时间和/或空间的方式指导基因表达的启动子，并包括组织特异性启动子和诱导型启动子。不同启动子可指导在不同组织或细胞类型中，或处于发育的不同阶段，或应答不同环境条件的多核苷酸或调控元件的表达。
“组织特异性启动子”或“组织偏好性启动子”指不在全部植物细胞而仅在特定的器官(例如叶或种子)、特定的组织(例如胚或子叶)、或特定细胞类型(例如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)中的一种或多种细胞类型中表达的调控型启动子。这些也包括例如在早或晚胚发生中，在发育的种子或果实中果实成熟期间，在完全分化的叶中，或序列开始时受时间调控的启动子。合适的启动子包括来自油菜籽的油菜籽蛋白基因启动子(US5,608,152)、来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Baeumlein等人，MolGen Genet.225(3)：459-67，1991)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(WO98/45461)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(US5,504,200)、来自的芸苔属(Brassica)的Bce-4启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，Plant Journal，2(2)：233-9，1992)以及赋予种子在单子叶植物(如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等)中特异性表达的启动子。应当注意的合适的启动子为来自大麦的lpt2或lpt1-基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或那些在WO 99/16890中描述的(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻醇溶蛋白基因、小麦麦醇溶蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱kasirin基因和黑麦的黑麦醇溶蛋白基因)。适合在植物根组织中优先表达的启动子包括，例如，来自玉米nicotianamine合酶基因的启动子(US 20030131377)和稻RCC3启动子(US 11/075,113)。在植物绿色组织中对于优先表达合适的启动子包括来自基因例如玉米醛缩酶基因FDA(US 20040216189)、醛缩酶和丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)(Taniguchi等人，Plant Cell Physiol.41(1)：42-48，2000)的启动子。
“诱导型启动子”指通过外部刺激物(例如，化学品、光、激素、胁迫或线虫例如线虫)在一种或多种细胞类型中能够被开启的那些受调控的启动子。如果基因表达需要以时间特异性方式发生，化学诱导的启动子是特别适合的。此类启动子的实例为水杨酸诱导的启动子(WO 95/19443)、四环素诱导的启动子(Gatz等人，Plant J.2：397-404，1992)、来自核酮糖1，5二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光诱导的启动子，和乙醇诱导的启动子(WO 93/21334)。同样地，应答生物或非生物胁迫条件的合适的启动子是那些如线虫诱导的PRP1基因启动子(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22：361-366，1993)、来自番茄的热诱导的hsp80启动子(US 5187267)、来自马铃薯的冷诱导的α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)、玉米的干旱诱导的启动子(Busk等，Plant J.11：1285-1295，1997)、来自马铃薯的冷、干旱，和高盐诱导的启动子(Kirch，Plant Mol.Biol.33：897-909，1997)或来自拟南芥的RD29A启动子(Yamaguchi-Shinozalei等人，Mol.Gen.Genet.236：331-340，1993)、许多冷诱导的启动子例如来自拟南芥的cor15a启动子(Genbank登录号U01377)、来自大麦的blt101和blt4.8(Genbank登录号AJ310994和U63993)、来自小麦的wcs120(Genbank登录号AF031235)、来自玉米的mlip15(Genbank登录号D26563)、来自芸苔属的bn115，和创伤诱导的pinII启动子(欧洲专利号375091)。
本发明中有特别用的是合胞***点偏好的，或线虫进食点诱导的启动子，包括但不限于来自PCT/EP2008/051328中公开的Mtn3-样启动子，PCT/EP2007/051378中公开的Mtn21-样启动子、PCT/EP2007/064356中公开的过氧物酶样启动子、PCT/EP2007/063761中公开的海藻糖-6-磷酸磷酸酶样启动子和PCT/EP2008/051329中公开的At5g112170-样启动子。本文引入全部上述申请作为参考。
而本发明的另一个实施方案涉及生产抗线虫的转基因植物的方法，其中所述方法包括步骤为：a)用包含编码的多核苷酸的表达载体转化野生型植物；和c)就增加的线虫抗性选择转基因植物。
在例如，Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC Press，BocaRaton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993)；White FF(1993)Vectorsfor Gene Transfer in Higher Plants；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和Wu R编，Academic Press，15-38；Jenes B等人(1993)Techniques for Gene Transfer；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编，Academic Press，第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol42：205-225；Halford NG，Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1)：62-73中，将多核苷酸引入植物基因组和从植物组织或植物细胞再生植物的多种方法是已知的。
转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄取、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、用基因枪的生物射弹方法(Fromm ME等人，Bio/Technology.8(9)：833-9，1990；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2：603，1990)，电穿孔法、在包含DNA的溶液中孵育干胚，和显微注射。在这些直接转化方法的情况下，使用的质粒不需要满足任何特别的需求。能够使用简单的质粒，例如pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184等那些。如果待从转化的细胞中再生完整的植物，优选地在质粒上定位额外的可选择的标记基因。直接转化技术同等地适于双子叶植物和单子叶植物。
转化也可以通过借助土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌感染(例如EP 0 116 718)、借助病毒载体的病毒感染(EP 0 067 553；US 4,407,956；WO 95/34668；WO 93/03161)或者借助花粉(EP 0 270 356；WO 85/01856；US 4,684,611)来实施。基于土壤杆菌属的转化技术(特别对于双子叶植物)是本领域熟知的。土壤杆菌属菌株(例如根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或者发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)包含质粒(Ti或者Ri质粒)和用土壤杆菌属感染后转移到植物中去的T-DNA元件。T-DNA(转移DNA)整合到植物细胞的基因组中。T-DNA可以定位在Ri或者Ti质粒上或者单独地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌属介导的转化的方法描述于，例如，Horsch RB等人(1985)Science 225：1229中。土壤杆菌属介导的转化最适合于双子叶植物，但是也已经被改良适应于单子叶植物。通过土壤杆菌转化植物描述于，例如，White FF，Vectors forGene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，第15-38页；Jenes B等Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant MolecBiol 42：205-225中。
能够将本文描述的多核苷酸直接转化进入质体基因组。质体表达利用优于核表达的基因的巨大的拷贝数以允许高表达水平，所述质体表达中通过同源重组将基因***到存在于每一植物细胞中的环状质体基因组的数千拷贝中。在一个实施方案中，将核苷酸***质体靶向载体并转化进入需要的植物宿主的质体基因组。获取对于含有核苷酸序列的质体基因组同质的植物，并且优选地所述植物能够高表达核苷酸。
例如，在美国专利号5,451,513、5,545,817、5,545,818，和5,877,462中在WO 95/16783和WO 97/32977中，以及在McBride等人(1994)PNAS91，7301-7305中广泛描述质体转化技术。
本发明的转基因植物可在控制由植物线虫的作物侵袭的方法中使用，所述方法包括步骤为从包含表达载体的种子生长所述作物，所述表达载体包含与多核苷酸有效连接的启动子，所述多核苷酸编码膜联蛋白、AUX/IAA、异黄酮7-OMT、花色素3-糖苷鼠李糖基转移酶-样、hsr201-样、漆酶、AP2-样、HI1或TINY-样多肽中的至少一种，其中表达载体被稳定地整合入种子的基因组中。
本发明还由以下实施例说明，所述实施例不应当以任何方式理解为对其范围加以限制。引入作为参考的是提交于2009年8月25日的美国临时专利申请号61/236624。
实施例1：载体构建
使用大豆靶多核苷酸的可获得的cDNA序列，使用PCR分离DNA片段，所述DNA片段用于构建表1中描述的且在实施例2中讨论的双元载体。将PCR产物克隆进入TOPO pCR2.1载体中(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并且通过测序确认***片段。使用此方法分离由多核苷酸GmAnnAt4-样(SEQ ID NO：49)、GmAux28(SEQ ID NO：127)、GmIsoflavone7OMT-9(SEQ ID NO：117)、GmAnUGT_47218626(SEQID NO：109)、Gmhsr201-样(SEQ ID NO：105)、MtTINY-样(SEQ IDNO：39)、GmLaccase1(SEQ ID NO：79)和GmHI1(SEQ ID NO：21)描述的开放阅读框。备选地，使用可获得的大豆基因组序列设计用于从大豆基因组DNA基因序列扩增的引物以构建表1中描述的且在实施例2和实施例3中讨论的双元载体。将大豆靶基因的DNA序列PCR扩增，克隆进入TOPO pCR2.1载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并且通过测序确认***片段。通过从大豆基因组DNA PCR扩增多核苷酸序列分离靶多核苷酸GmAP2-样1(SEQ ID NO：1)、GmAP2-样2(SEQ ID NO：3)和GmAP2-样3(SEQ ID NO：7)的基因片段。
对克隆的GmAnnAt4-样(SEQ ID NO：49)、GmAux28(SEQ ID NO：127)、GmAnUGT_47218626(SEQ ID NO：109)、Gmhsr201-样(SEQ IDNO：105)和GmLaccase1(SEQ ID NO：79)多核苷酸测序并将它们单独地亚克隆进入植物表达载体，所述表达载体含有来自拟南芥的TPP启动子(在图1中称为p-AtTPP启动子(SEQ ID NO：135))。对克隆的GmIsoflavone7OMT-9(SEQ ID NO：117)测序并将其单独地亚克隆进入植物表达载体，所述表达载体含有来自欧芹的泛素启动子(WO 03/102198；图1中p-PcUbi4-2启动子(SEQ ID NO：137))。对克隆的GmLaccase1(SEQ ID NO：79)、MtTINY-样(SEQ ID NO：39)多核苷酸测序并将其单独地亚克隆进入植物表达载体，所述表达载体含有来自大豆的MtN3-样启动子(在图1中称为p-MtN3-样(SEQ ID NO：136)，也被称为p-GmN3L)。对克隆的GmHI1(SEQ ID NO：21)、GmAP2-样1(SEQ ID NO：1)、GmAP2-样2(SEQ ID NO：3)和GmAP2-样3(SEQ ID NO：7)多核苷酸测序并将它们单独地亚克隆进入含有SUPER启动子(US 5,955,646)(图1中SEQ ID NO：138)的植物表达载体。转化的选择标志物是来自拟南芥的乙酰羟酸合酶(AHAS)选择基因的突变的形式(也称为AHAS2)(Sathasivan等人，Plant Phys.97：1044-50，1991)，其赋予对除草剂ARSENAL(Imazapyr，BASF Corporation，Mount Olive，NJ)的抗性。AHAS2的表达由来自欧芹的泛素启动子(WO 03/102198)(SEQ IDNO：137)驱动。表1描述了含有GmAnnAt4-样、GmAux28、GmIsoflavone7OMT-9、GmAnUGT_47218626、Gmhsr201-样、GmLaccase1、GmAP2-样1、GmAP2-样2、GmAP2-样3、MtTINY-样和GmHI1多核苷酸的构建体。
表1
  载体名称   启动子名称   多核苷酸名称  SEQ ID NO
  RTP2833   超级   GmAP2-样1  1
  RTP2834   超级   GmAP2-样2  3
  RTP2839   超级   GmAP2-样3  7
  RTP2766   超级   GmHI1  21
  RBM056   MtN3-样   MtTINY-样  39
  RTP2424   AtTPP   GmAnnAt4-样  49
  RTP1960   MtN3-样   GmLaccase1  79
  RTP1961   AtTPP   GmLaccase1  79
  RTP1433   AtTPP   Gmhsr201-样  105
  MSB126   AtTPP   GmAnUGT_47218626  109
  MSB131   Ubi   GmIsoflavone7OMT-9  117
  RTP1808   AtTPP   GmAux28  127
实施例2：线虫生物测定
使用在共有的共同未决USSN 12/001,234中公开的生根植物测定***实施评估由本文描述的多核苷酸赋予的线虫抗性的生物测定。在用实施例1中描述的双元载体转化后产生转基因根。将多重转基因根品系传代培养并以大约500J2/孔的水平，用表面净化的race3 SCN第二阶段幼虫(J2)接种。线虫接种后4周，计数每一孔中的胞囊数目。对于每一转化构建体，计算每一品系的胞囊数目以测定构建体的平均胞囊数和标准误差。将每一转化构建体的胞囊数值与平行测试的空载体对照的胞囊数值对比以确定测试的构建体是否导致胞囊数的减少。用载体RTP2424、RTP1808、MSB131、MSB126、RTP1433、RTP1960、RTP1961、RTP2833、RTP2834、RTP2839、RBM056和RTP2766转化的生根外植体培养物相对于已知的易感品种Williams82，显示了减少的胞囊数和雌性指数的一般趋势。
测定根面积量度以评估来自线虫接种后生长4周的每一亚培养品系的根物质的量。将每一构建体的根面积值与平行测试的空载体对照的根面积值对比，以测定测试的构建体是否导致根面积变化。用载体RTP2833、RTP2834，和RTP2839转化的生根外植体培养物显示比空载体对照增加的根面积的一般趋势。
实施例3：根生物量测定
也使用在共有的共同未决USSN 12/001,234中公开的生根植物测定***以评估包含RTP2833、RTP2834，和RTP2839的未感染的转基因根的根生长。在琼脂平板上亚培养多个转基因根系和连接的子叶用于观测。亚培养时在平板背面标记根尖作为参考点。在光室中子叶侧孵育亚培养的根和子叶达6天。对于每一转化构建体记录根重量、根长度和侧根数。将每一转化构建体的根参数量度值与平行测试的空载体对照的根参数量度值比较，以测定测试的构建体是否导致根重量、根长度、根面积，和侧根数变化。用载体RTP2833和RTP2839转化的生根外植体培养物显示相对于空载体对照的增加的根重量的一般趋势。
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Claims (5)

1.用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述分离的多核苷酸选自：a)编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20相似的AP2/EREBP转录因子的多核苷酸；b)编码与SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：36，或SEQ ID NO：38相似的发夹诱导蛋白质的多核苷酸；c)编码与SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46，或SEQID NO：48相似的TINY-样转录因子的多核苷酸；d)编码与SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76，或SEQID NO：78相似的膜联蛋白蛋白质的多核苷酸；e)编码与SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ IDNO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102，或SEQ ID NO：104相似的漆酶的多核苷酸；f)编码与SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：108相似的苯甲酰转移酶的多核苷酸；g)编码与SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114，或SEQ ID NO：116相似的鼠李糖基转移酶的多核苷酸；h)编码与SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124，或SEQ IDNO：126相似的异黄酮-7-O-甲基转移酶的多核苷酸；和i)编码与SEQ IDNO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132，或SEQ ID NO：134相似的AUX/IAA蛋白质的多核苷酸。
2.对于包含至少一种多核苷酸的转基因不分离的种子，所述多核苷酸选自：a)编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20相似的AP2/EREBP转录因子的多核苷酸；b)编码与SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36，或SEQ ID NO：38相似的发夹诱导蛋白质的多核苷酸；c)编码与SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：48相似的TINY-样转录因子的多核苷酸；d)编码与SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76，或SEQ ID NO：78相似的膜联蛋白蛋白质的多核苷酸；e)编码与SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ IDNO：100、SEQ ID NO：102，或SEQ ID NO：104相似的漆酶的多核苷酸；f)编码与SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：108相似的苯甲酰转移酶的多核苷酸；g)编码与SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114，或SEQID NO：116相似的鼠李糖基转移酶的多核苷酸；h)编码与SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124，或SEQ ID NO：126相似的异黄酮-7-O-甲基转移酶的多核苷酸；和i)编码与SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132，或SEQ ID NO：134相似的AUX/IAA蛋白质的多核苷酸，其中转基因的表达赋予生长自转基因种子的植物增加的线虫抗性。
3.包含与多核苷酸有效连接的启动子的表达载体，所述多核苷酸编码至少一种选自以下的多核苷酸：a)编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20相似的AP2/EREBP转录因子的多核苷酸；b)编码与SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36，或SEQ ID NO：38相似的发夹诱导蛋白质的多核苷酸；c)编码与SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：48相似的TINY-样转录因子的多核苷酸；d)编码与SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76，或SEQ ID NO：78相似的膜联蛋白蛋白质的多核苷酸；e)编码与SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102，或SEQ IDNO：104相似的漆酶的多核苷酸；f)编码与SEQ ID NO：106或SEQ IDNO：108相似的苯甲酰转移酶的多核苷酸；g)编码与SEQ ID NO：110、SEQID NO：112、SEQ ID NO：114，或SEQ ID NO：116相似的鼠李糖基转移酶的多核苷酸；h)编码与SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124，或SEQ ID NO：126相似的异黄酮-7-O-甲基转移酶的多核苷酸；和i)编码与SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132，或SEQ ID NO：134相似的AUX/IAA蛋白质的多核苷酸。
4.生产抗线虫的转基因植物的方法，其中方法包括步骤：a)用包含与多核苷酸有效连接的启动子的表达载体转化野生型植物细胞，所述多核苷酸选自：a)编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：20相似的AP2/EREBP转录因子的多核苷酸；b)编码与SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36，或SEQ ID NO：38相似的发夹诱导蛋白质的多核苷酸；c)编码与SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：48相似的TINY-样转录因子的多核苷酸；d)编码与SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76，或SEQ ID NO：78相似的膜联蛋白蛋白质的多核苷酸；e)编码与SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ IDNO：100、SEQ ID NO：102，或SEQ ID NO：104相似的漆酶的多核苷酸；f)编码与SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：108相似的苯甲酰转移酶的多核苷酸；g)编码与SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114，或SEQID NO：116相似的鼠李糖基转移酶的多核苷酸；h)编码与SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124，或SEQ ID NO：126相似的异黄酮-7-O-甲基转移酶的多核苷酸；和i)编码与SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132，或SEQ ID NO：134相似的AUX/IAA蛋白质的多核苷酸；b)从转化的植物细胞再生转基因植物；和c)与相同物种的对照植物比较，就增加的线虫抗性选择转基因植物。
5.增加作物植物产量的方法，所述方法包括步骤用包含与多核苷酸有效连接的启动子的表达载体转化植物细胞，所述多核苷酸编码与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18，或SEQID NO：20相似的AP2/EREBP转录因子；从转化的植物细胞再生转基因植物，以及与相同物种的对照植物比较，就增加的根生长选择转基因植物。
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