CN102481351A - 工程改造的肉毒杆菌神经毒素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型改良BoNT/E催化结构域和其使用方法。在一个实施方式中，所述改良BoNT/E催化结构域的轻链残基224、或对应于残基224的残基变为天冬氨酸或谷氨酸。所述改良催化结构域切割SNAP23但不切割SNAP29或SNAP47，提供了治疗疾病的新方法，所述疾病包括但不限于哮喘、CF、慢性阻塞性肺病、胃酸流出病和炎症、有细胞因子成分的免疫失调或有细胞因子成分的癌症。

Description

工程改造的肉毒杆菌神经毒素
相关申请的交叉参考
本申请要求2009年4月14日提交的美国临时专利申请号61/169,031的优先权，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明在美国政府支持下由以下机构资助进行：NIH基金1-U54-AI-057153。美国政府享有本发明的某些权利。
发明背景
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生七种不同神经毒素(BoNT)，其在血清学上通过缺少抗血清的血清交叉中和来区分。已知BoNT是对人类最有效的毒素，且是肉毒中毒病的病原体(1)。BoNT发挥作用是通过在神经肌肉连接处抑制所述神经递质乙酰胆碱的释放，引起松弛性瘫痪状态。BoNT通过靶向神经元并切割神经元特异的SNARE蛋白而引起神经元特异的松弛性瘫痪。
SNARE蛋白(可溶性NSF附着蛋白受体)是一个大的蛋白超家族。SNARE蛋白的主要功能是介导神经递质分子胞外分泌到突触后连接。SNARE较小、含量丰富且是囊泡和质膜结合蛋白。
BoNT是含二硫键连接的100kDa重链和50kDa轻链的150kDa多肽链。BoNT分成3种功能结构域：N末端锌金属蛋白酶轻链(LC)、转运结构域(HCT)、C末端受体结合结构域(HCR)(1，2)。BoNT的毒性作用(神经中毒)通过三种关键事件的相互作用完成。一，受体与胆碱神经细胞在所述神经细胞膜上特异结合需要所述重链的羧基部分。结合后，所述BoNT的其他部分将更小的催化结构域移入所述细胞，其中所述催化结构域结合并切割神经元SNARE蛋白，“致毒”所述神经细胞，使其不能“发作”或发送信号。“催化结构域”指触发所述底物切割的所述分子的一部分。所述毒素通过受体介导的内吞作用内化入内涵体，且在突触囊泡和所述质膜的融和后，所述毒素结合突触囊泡相关蛋白的阈限结构域(liminal domains)(3-5)。简言之，BoNT内化入内涵体中且酸化反应后，所述LC转移到胞质中，SNARE蛋白在其内被切割(1，2)。
哺乳动物神经元胞外分泌由所述囊泡SNARE、VAMP2和所述质膜以及SNARE、SNAP 25和突触融合蛋白1a的蛋白复合体的形成来推动(6)。共有七种BoNT血清型(称为A-G)，其切割三种SNARE蛋白之一的特异残基：血清型B、D、F和G切割VAMP-2，血清型A和E切割SNAP 25，和血清型C切割SNAP25和突触融合蛋白1a(1)。因此，神经元特异性是基于BoNT结合神经元和切割所述SNARE蛋白的神经元同种型。例如，BoNT/A切割人SNAP25但不切割所述人非神经原同种型SNAP 23(7，8)。所述非神经元SNARE同种型涉及不同的细胞过程，包括细胞生长中的融合反应、膜修复、胞质***和突触传递。
BoNT中毒后，用新神经替换受毒素影响神经的肌肉功能的可逆性质(10，11)将BoNT从致死的试剂变为神经肌肉病症的新治疗方法。早在1989年，FDA批准BoNT/A用于治疗斜视、脸痉挛、偏侧面肌痉挛以及之后用于宫颈肌张力障碍、美容用途、眉间皱纹和腋窝多汗(12)。BoNT/A在肌张力障碍和其他疾病中的效果与不随意骨骼肌活性有关，伴随令人满意的安全概况，并促进在各种分泌物和疼痛和美容病症中的经验性/标示外应用(13)。
BoNT的临床应用限于靶向影响神经肌肉活性的伤害(12，13)。BoNT结构-功能关系的阐明可以设计使BoNT重靶向独特神经元和非神经元细胞的新疗法。用神经生长因子、鸡冠刺桐(Erythrina cristagalli)的凝集素、或表皮生长因子替代BoNT HCR结构域可使BoNT/A重靶向神经元或非神经元细胞如疼痛传入和气道上皮细胞(14-16)。然而，通过BoNT进行神经元特异SNARE蛋白的选择性切割限制了这些非神经元***的新疗法的开发。开发新疗法的先决条件需要所述BoNT催化活性重靶向非神经元SNARE同种型。
因此，需要切割非神经元SNARE蛋白的工程改造的BoNT和其使用方法。
发明概述
在一个实施方式中，本发明提供改良的BoNT/E催化结构域，其中轻链残基224、或对应残基224的残基被改变。在一个实施方式中，所述残基224改变为天冬氨酸或谷氨酸。所述的改良催化结构域切割SNAP23但不切割SNAP29或SNAP47。
在另一实施方式中，所述改良催化结构域还包含用于蛋白质递送***的靶向分子。
在另一个实施方式中，本发明提供含改良BoNT/E催化结构域的工程肉毒杆菌神经毒素E或肉毒杆菌神经毒素轻链或肉毒杆菌毒素催化结构域，其中轻链残基224被改变。
在另一实施方式中，本发明提供治疗需要肉毒杆菌毒素疗法的对象的方法，所述方法包括将治疗有效量的改良BoNT/E催化结构域给予对象的步骤，其中轻链残基224被改变。所述需要肉毒杆菌毒素疗法的对象可能患有但不限于哮喘、CF、慢性阻塞性肺病、胃酸流出病和炎症、有细胞因子成分的免疫失调或有细胞因子成分的癌症。
尽管本发明公开了多个实施方式，但是通过以下的详述，本发明的其它实施方式对本领域技术人员来说是显而易见的。显然，可以在不背离本发明精神和范围的前提下，对本发明各个方面进行修改。因此，详细说明在其本质上应当视作是说明性的而不是限制性的。
附图简要说明
图1.人SNAP23的K185有助于BoNT/E的底物识别。(a)LC/E的底物识别。SNAP25中的两种亚位点有助于底物结合“B”(Km)和催化“AS”(kcat)，其中P3、P2、和PI′残基有助于LC/E的识别。(b)人SNAP25(SN25)和人SNAP23(SN23)的序列比对。(c)(上图)LC/E SNAP25的模型复合物结构预测LC/E对SNAP25的P位点残基的识别。(下图)LC/E(K224D)-SNAP23的模型复合物结构预测LC/E(K224D)对SNAP23的P位点残基的识别。使用LC/E晶体结构(PDB:3d3x)通过SWISS-MODEL生成模型，并用PyMol生成图像。
图2.用LC/E(K224D)切割SNAP23。(a)5μm SNAP23与指示量的LC/E(K224D)一起孵育并进行SDS-PAGE(染色凝胶在***物中显示，SNAP23(152-211)称为(SN23(152-211))且所述切割产物SNAP23(152-186)标为*。用密度分析确定％SNAP23切割。(b)LC/E切割SNAP25和LC/E(K224D)切割SNAP23的动力学常数。
图3.LC/E(K224D)切割SNAP23的位点(a)5μm SNAP23与2μm LC/E(K224D)孵育并进行MALDI-TOF质谱。y轴的强度(100％)设为2812.5的条带且x轴代表荷质比单位m/z。(b)SNAP23(I187D)与指示量的LC/E(K224D)一起孵育并进行SDS-PAGE。考马斯蓝染色凝胶显示LC/E(K224D和SNAP23(I187D)的迁移(在左侧指示)。
图4.SNAP25同种型上的LC/E(K224D)和Wt-LC/E的序列比对和底物特异性。(a)SNAP23a，b、SNAP25a，b、SNAP29和SNAP47(ClustaIW2)在对应SNARE蛋白的区域的比对，所述SNARE蛋白与LC/E的结合区域和激活位点区域相互作用。指示SNAP25同种型之间的保守残基(*)和相似残基(:，.)。指示SNAP25的LC/E切割位点(箭头)和P位点残基。SNAP25的指示同种型的LC/E(K224D)(b)和Wt-LC/E(c)的线性速率分析。5μm SNAP25同种型与指示量的LC一起孵育、进行SDS-PAGE并用考马斯蓝染色凝胶。用密度分析确定SNAP25同种型切割量。
图5.TGF-α刺激的海拉(HeLa)细胞中LC/E(K224D)切割SNAP23并抑制粘蛋白和IL-8分泌。(A)用GFP-LC/E(K224D)或GFP-Wt-LC/E转染海拉细胞。24小时后，制备细胞裂解物并用SDS-PAGE分离，使用抗SNAP-23小鼠单克隆抗体用western印迹3检测SNAP23的切割。(B，C)。用编码GFP-LC/E(K224D)或GFP-Wt-LC/E的DNA转染海拉细胞。24小时后，用无血清MEM培养基清洗细胞两次且通过添加补充有20ng/ml TNF-α的无血清MEM培养基诱导分泌。36小时后，收集上清液并使用ELISA形式测量粘蛋白和IL-8分泌。对照细胞分泌的粘蛋白和IL-8含量调整为1.0并用作TNF-α处理细胞的参比。
图6.TGF-α刺激的海拉细胞中重组LC/E(K224D)切割SNAP23并抑制粘蛋白和IL-8分泌。用地高辛处理海拉细胞，然后与His-LC/E(K224D)或His-Wt-LC/E(3-Xflag标记蛋白)一起孵育。过夜孵育后，清洗细胞，然后用补充有20ng/mlTNF-α的无血清MEM培养基孵育36小时，然后收集细胞上清并制备细胞裂解物。(a)细胞裂解物进行SDS-PAGE并用Western印迹检测LC/E表达和SNAP23切割，分别使用α-3Xflag抗体和α-SNAP23抗体；*指示所述SNAP23切割产物的迁移。用ELISA检测培养物上清的IL-8(b)和粘蛋白(c)分泌，用1.0作为重组LC/E处理细胞的参比。
发明详述
I.概述
在本说明书和权利要求书中，术语“包括”和“包含”是开放式的术语，应认为其表示“包括，但不限于......”。这些术语涵盖了限定性更强的术语“主要由......组成”和“由......组成”。
本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。同样，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。还应当注意，术语“包括”、“包含”、“特征在于”以及“含有”可以互换使用。
除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。本文具体描述的所有出版物和专利都通过引用全文纳入本文并用于所有目的，包括描述和公开所述出版物报道的化学物质、设备、统计分析和方法，其可与本发明关联使用。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不具有先于在先发明公开内容的权利。
II.本发明
本发明提供切割非神经元SNARE蛋白的新型工程改造的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)和其使用方法。
由于毒性对神经元的趋向性和神经元SNARE蛋白的特异切割，所以BoNT对各种神经病症如斜视、脸痉挛、偏侧面肌痉挛和宫颈肌张力障碍是有效的治疗方法。改良BoNT以结合非神经元细胞需要使BoNT的催化剂活性重靶向非神经元SNARE同种型以提供有效的非神经元治疗。
在此，通过工程改造催化衍生物切割所述非神经元SNARE蛋白SNAP23，将其作为治疗非神经元人分泌疾病新方法的平台，我们扩大了BoNT/E的底物特异性。“非神经元人分泌疾病”指例如，过度的气道粘液分泌、粘液分泌过多的疾病或病症可导致粘液积累，其与人临床病症如哮喘和慢性阻塞性肺病相关联，其中粘液积累造成呼吸疾病。具体地，我们首次报道BoNT/E衍生物的工程改造，其切割一种非神经元SNARE蛋白SNAP23。
SNAP23介导囊泡-质膜融合过程，包括气道粘膜、抗体、胰岛素、胃酸和离子的分泌。本发明的突变BoNT/E轻链LC/E(K224D)显示出扩大的底物特异性以切割SNAP23和所述天然底物SNAP25，但没有显示出对SNAP29或SNAP47的特异性且也不对其切割。将蛋白直接递送到培养的人上皮细胞中后，LC/E(K224D)切割抑制粘蛋白和IL-8分泌的内源性SNAP23。这些研究首次显示了遗传改良的BoNT靶向非神经元SNARE蛋白的可行性，其用于治疗人过度分泌疾病如哮喘和慢性阻塞性肺病的新方法。
在一个实施方式中，本发明制备工程改造的肉毒杆菌神经毒素E的催化结构域，其可特异切割SNAP23。所述毒素优选切割SNAP25但不切割SNAP29或SNAP47。LC/E(K224D)可切割SNAP25和SNAP23，但约10倍低于Wt-LC/E切割SNAP25。
在一个优选实施方式中，本发明中改良的肉毒杆菌神经毒素E在轻链残基224或对应残基224的残基上有突变。“残基224”表示处于SEQ ID NO：7的224编号位置的赖氨酸。SEQ ID NO：7是没有第一个甲硫氨酸残基的DNA序列SEQ ID NO：1的蛋白转换。“对应残基224的残基”表示位于SEQ ID NO：7的残基210-240的基序内的赖氨酸。具体地，我们指残基MHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLI(SEQ ID NO：8)内突出显示的赖氨酸。其他E型肉毒杆菌亚型具有一样的对应残基和基序，尽管亚型间的编号可能不同。然而，所述基序残基将有至少90％对应于SEQ ID NO：8的基序。
可在GeneBank上找到登录号为X62089的肉毒杆菌毒素E亚型博鲁格株(Beluga)轻链的示例序列(SEQ ID NO：1)。我们期望其他亚型的血清型E可用作可切割SNAP23的工程改造LC的模板。可用如本发明所公开的相同方法改良任何肉毒杆菌毒素E亚型的编号224残基。
在一个优选实施方式中，本发明制备在轻链残基224上具有突变的改良肉毒杆菌毒素E。本发明的另一实施方式制备在轻链残基224上具有突变的肉毒杆菌神经毒素E轻链。本发明的另一实施方式制备在轻链残基224上具有突变的肉毒杆菌神经毒素催化结构域(残基1-400)。本发明的另一实施方式是所述催化结构域的截短片段，至少包括残基1-390，其包含改良的残基224。“改良的催化结构域”包括具有残基224修饰的所有形式(包括人源形式)的L/C BoNT催化结构域。
另一优选实施方式是突变的肉毒杆菌神经毒素E轻链或如下所述融合其他肽的改良催化结构域，其用于合适的治疗方法。
在另一实施方式中，本发明是编码本文所述工程改造的肉毒杆菌神经毒素或所述改良的催化结构域的DNA序列。
可在GeneBank上找到登录号为CR457212(SEQ ID NO：2)、NM_130811(SEQID NO：3)、CR456582(SEQ ID NO：4)和BC011145(SEQ ID.NO：5)的序列SNAP23、SNAP25、SNAP29和SNAP47的示例性参考。
本发明的其他实施方式中，残基224的其他突变也可能合适。LC/E内的被保护的突变是K224D，其识别SNAP23的P2赖氨酸残基。我们预期K224的谷氨酸突变也可产生切割SNAP23的功能性LC/E。我们生成了K224A突变，其具有切割SNAP23和SNAP25的能力，但效率低于K224D，这表明R基团的电荷和大小影响切割效率。因此，我们预期其他残基置换，如用谷氨酸置换SEQ ID NO：7的残基224的赖氨酸，也可提供具有切割SNAP23能力的突变LC/E。
在其他实施方式中，我们还预期其他残基置换，单用或与本发明的K224D突变联用，可产生具有切割SNAP 23的能力且不切割SNAP 25的LC/E。
治疗方法在其他实施方式中，本发明提供对需要用肉毒杆菌毒素处理的对象进行治疗的新方法。在一个实施方式中，本发明提供通过给予治疗有效量的上述改良催化剂结构域来治疗患有人分泌疾病的对象的方法。
“对象”指需要用肉毒杆菌毒素治疗的任何人。“治疗”或“处理”指管理和护理对象以用于对抗疾病、病症、或障碍目的。所述术语包括预防性的即预防和缓解性治疗。治疗包括给予本发明的化合物以防止所述症状或并发症的发作、缓解所述症状或并发症、或消除所述疾病、病症、或障碍。在一个实施方式中，我们预计本发明的方法至少能使症状减轻20-50％。我们预计有规律地进行治疗直到症状逆转。例如，在一个实施方式中，按需每天、每周或每月进行治疗。
“治疗有效量”指给予对象用于治疗疾病时，足以实现对疾病的治疗的化合物用量。根据所述化合物、治疗的疾病状态、治疗的疾病的严重程度、所述对象的年龄和相对健康状态、给药路径和方式、主治医生或兽医从业者的判断、和其他本领域技术人员已知的因素，所述“治疗有效量”可改变(40)。本方法涉及将本发明的工程改造肉毒杆菌毒素E的改良催化结构域给予对象。“给予”指将本发明的工程改造BoNT递送给对象。尽管所述催化结构域的优选形式是所述肉毒杆菌毒素E轻链，但是所述催化结构域可包括比所述轻链短的形式，如所述催化结构域C末端截短突变体为约1-390残基(41)，和比所述轻链大的形式且包括多至约残基F1200的所述转运结构域或所述转运结构域的片段，其包括所述HCR结构域N末端。在一个实施方式中，我们工程改造了1-400，其具有良好的可溶性和活性。
在一个实施方式中，所述催化结构域通过共价键或用其他结合方式如交联来络合连接靶向分子(靶向***)。所述靶向分子适于将所述毒素靶向感兴趣的细胞表面受体。
如上所述，我们预想多种形式的所述催化结构域作为K224D突变的有效潜在递送平台。例如，蛋白质溶解性可根据所述应用和工程改造的嵌合体而不同，因此不同大小的催化结构域在具体应用中可能更加有效。我们预期有效递送平台的量将会与临床疗法中所用的BoNT量相似，且基于LC/EK224D的催化本质，有效递送量可为分数。
在其他实施方式中，合适的递送***在一个实施方式中会靶向内化的特异细胞型或细胞表面受体并递送LC/E到胞质中，如抗体或生长因子。可被靶向的潜在细胞表面受体包括根据靶向疾病而不同的组织特异生长因子受体。例如，技术人员会理解如何基于本领域已知的材料在毛细胞白血病中靶向CD22(42)。
或者，基于脂质的直接蛋白递送***可用于直接将LC/E递送入所述宿主细胞溶质。例如，直接递送所述催化结构域蛋白或编码所述LC/EK224D蛋白的DNA的脂质体靶向递送(39)也是递送本发明的工程改造BoNT/E以治疗各种疾病的有效方法。例如，证明组装纳米颗粒用于有效递送和降低免疫原性的基于脂质的递送***可作为有用的靶向载体(43)。虽然所述不同递送方法基于靶向疾病可能不具有不同优点，但是所述递送***的特异性会是选择特异递送***的关键因素。
为了优化所述功效，我们预计使用本领域已知的多种可能方法之一来人源化所述改良催化结构域。
考虑多种递送***用于给需要治疗例如不分泌或高分泌疾病的对象治疗性递送LC/E(K224D)或其他合适毒素。示例性递送***包括但不限于单链蛋白嵌合体，其中所述改良的催化结构域优选LC/E(K224D)在DNA水平或通过蛋白质受体交联而融合(36)，或是通过双重蛋白递送***，其中所述催化结构域优选LC/E(K224D)连接由双蛋白递送***组成的融合蛋白(37，38)。例如，编码LC/E(K224D)的基因通常可遗传融合编码所述表皮生长因子的基因以靶向非小细胞肺癌。
下表描述了一些本发明工程改造毒素的合适应用和所述靶向结构域的合适靶标。
表1：受体/疾病
Figure BPA00001476497700091
药盒本发明的其他实施方式中，提供含本发明的改良催化结构域的用于治疗对象的药盒。在一个实施方式中，所述药盒含一定形式的本发明的工程改造BoNT及使用说明。在一个实施方式中，配制、递送和存储本发明的改良催化结构域以用在生理病症中。在一个优选的实施方式中，所述药盒还包括靶向***。所述改良的催化结构域已连接所述靶向***或所述药盒包含所述靶向***和连接说明。在其他实施方式中，所述药盒包含编码LC/E(K224D)的DNA，其可用于工程改造特异组织特异靶向分子的融合蛋白。
“使用说明”指发表物、记录、图表、或任何其他表达媒介，其用于传递本发明针对本文所述目的之一的实用性。例如，所述药盒的说明材料可固定在含本发明的容器上，或可与含本发明的容器一起运送。或者，所述说明材料可与所述容器分别运送或以互联网上的电子获取形式提供，旨在使所述接受者方便使用所述说明材料和所述生物相容性水凝胶。
III.实施例
提供以下实施例仅用于说明目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上，本发明所示和描述以外的各种变化通过以上描述以及以下的实施例对本领域技术人员显而易见，所述变化也包括在所附权利要求书的范围之内。
A.材料和方法。
分子建模。用SWISS-MODEL进行分子建模。如(19)所述获得所述LC/E-SNAP25(146-202)复合体的结构，使用LC/E(PDB:3d3x)的晶体结构。使用LC/E-SNAP25复合体结构作为模板，用PyMolTM建立LC/E(K224D)-SNAP23的结构模型。所示数据是至少3次实验的平均值。
质粒构建和蛋白表达。通过扩增编码肉毒梭菌血清型E博鲁格株(SEQ ID NO：1)的LC/E(1-400)的DNA并亚克隆到pET-15b中来构建BoNT LC/E表达载体。对于转染实验，LC/E(1-400)也亚克隆到pEGFP载体中以产生在CMV启动子下表达的EGFP-LC/E(1-400)融合蛋白。SNAP25(145-206)的蛋白等价物SNAP23(152-211)、SNAP29(202-259)和SNAP47(406-464)的表达载体通过PCR扩增和cDNA模板：人SNAP23(ATCC 2900640，SEQ ID NO：2)、SNAP29(ATCC10700609，SEQ ID NO：4)和SNAP47(ATCC 10468826，SEQ ID NO：5)构建并亚克隆到pGEX-2T中。用QuickChange(司查塔基公司(Stratagene))进行定点诱变。蛋白表达和纯化如前所述进行(32)。
用LC/E和LC/E(K224D)切割SNARE蛋白。如所述进行SNARE蛋白切割。
线性速率反应：反应包括(10μl)：5μM人SNARE蛋白、含20mM NaCl的10mM Tris-HCl(ph 7.6)、和指示量的LC/E和LC/E(K224D)。反应于37℃孵育10分钟，进行SDS-PAGE然后凝胶用考马斯蓝染色。用密度分析确定SNARE蛋白切割量。
动力学参数：用SNAP25同种型确定Wt-LC/E和LC/E衍生物的Km和kcat。LC浓度调整为在数种底物浓度下(1.5～18μM SNARE蛋白)切割＜10％的底物。反应于37℃进行10分钟，经SDS-PAGE并用密度分析计算切割的产物量。使用SigmaPlot IX(伊利诺斯州芝加哥)，用双倒数(Lineweaver-Burk)作图法将反应速率与底物浓度拟合米氏(Michaelis-Menten)方程。
人培养上皮细胞的LC/E和LC/E(K224D)活性。用6孔板在补充有10％新生牛血清的MEM中培养海拉细胞。使用Lipofectamine LTX(GIBCO/BRL)用0.5或1.0μg指示质粒转染亚融合细胞。
蛋白递送。如(33)所述(有所改变)进行蛋白递送。用1ml/孔的含30μM地高辛的通透缓冲液透化海拉细胞7分钟，并在含有和不含指示LC的通透缓冲液中孵育。
蛋白分泌实验：过夜孵育后，在2ml含20ng/ml TNF-α的无血清MEM中孵育转染和蛋白递送细胞。36小时后，收集1.5ml上清，13,000g离心1分钟，并用ELISA分析分泌的粘蛋白和IL-8。上清(150μl)与50μl的0.2M Na2CO3(pH 9.6)混合并加到96孔板中4℃孵育过夜。用含1％(w/v)BSA的50mM Na2CO3(pH 9.6)缓冲液冲洗并固定板。用100μl α-粘蛋白IgG(1/200稀释，阿柏堪穆公司(Abcam))或α-IL-8 IgG(1/200稀释，阿柏堪穆公司)冲洗板并室温孵育1小时。用α-小鼠辣根过氧化物酶偶联抗体(1∶10,000稀释，皮尔斯公司(Pierce))冲洗板3次并室温孵育1小时。用100μl的Ultra-TMB(皮尔斯公司)冲洗并室温显影20分钟且用100μl的1M H2SO4淬灭。A450用相对于对照上清中分泌的粘蛋白或IL-8的占比表示。
SNAP23切割：通过Western印迹分析法用α-SNAP23小鼠IgG(阿柏堪穆(Abcam)公司，马萨诸塞州坎布里奇)分析与TNF-α孵育36小时的细胞裂解物的LC/E和LC/E(K224D)介导的内源SNAP23切割(19)。
递送***。用下述递送方法将所述突变BoNT给予对象：
靶向特异的细胞受体：分子生物学领域的技术人员可使用与聚合酶链式反应类似的操作方案工程改造融合靶向分子的LC/E(K224D)嵌合体。
基于脂质的：使用基于脂质的递送***的技术人员可通过将脂质用于蛋白基质开发用于所述LC有效内化的脂质LC/E(K224D)比例。
治疗方法。在一个实施方式中，将本发明的工程改造的BoNT给予对象用于治疗高分泌和不分泌疾病。技术人员会根据用于开发治疗毛细胞白血病中免疫毒素疗法的策略来鉴定用所述工程改造的BoNT治疗的对象、给予所述治疗、监控结果、并测定所述治疗的有效性。
B.结果
先前的研究鉴定残基167-186为SNAP25的最小最佳肽段，SNAP25是LC/E体外切割的206个氨基酸的蛋白(19)。SNAP25(167-186)包含两个亚位点，包括底物结合“B”区域和激活位点“AS”区域(图1a)。LC/E识别P3残基以促进SNAP25的P2和P1′残基的排列。LC/E的S1′口袋由F191、T159、和T208形成，LC/E的F191和SNAP25的P1′残基I181之间有疏水相互作用(20)。碱性S2口袋含K224，其通过预测的盐桥识别P2残基D179。SNAP25的P2和P1′残基靠入LC/E的激活位点口袋，将易切断键对齐以用于切割(19，20)。
已知BoNT/E不切割人SNAP23(8)，提供了鉴定BoNT的SNAP同种型特异性的框架。有助于LC/E识别SNAP25的残基中许多在人SNAP23中保守，除了T173/A179、D179/K185、M182/T188和E183/D189(图1b)。SNAP25中的T173对LC/E底物识别的作用有限(20)，且仅M182-D186的主链相互作用有助于LC/E底物识别。因此，SNAP25和SNAP23之间的T173/A179、D179/K185、M182/T188和E183/D189差异没有表现出使cle不能切割SNAP23。相反，SNAP25的P2残基D179通过有助于cle底物识别的碱性残基K224而被cle的碱性S2口袋识别(图1c，上图)。因此，本发明检测LC/E的K224和SNAP25的D179之间的盐桥是否有助于cle切割SNAP25的能力以及cle的K224和SNAP23的P2残基K185之间的电荷排斥作用是否使cle不能切割SNAP23。为了测试此假说，将点突变K224D引入LC/E内并检测其切割人SNAP23的能力(图1c，下图)。
LC/E(K224D)切割人SNAP23的Km为约3μM且kcat为约17S-1(图2)，是LC/E切割人SNAP25的Km的2倍和kcat的5倍。LC/E(K224D)切割SNAP23的特异活性与BoNT的B血清型切割VAMP-2相似，且比破伤风毒素切割VAMP-2快约10倍(21，22)。用MALDI-TOF MS鉴定LC/E(K224D)切割SNAP23的位点，在含SNAP23和LC/E(K224D)的反应混合物中鉴定到m/z值为2812.5的主峰，对应于人SNAP23的C末端25个氨基酸，IKRITDKADTNRDRIDIANARAKKLIDS(SEQ ID NO：6)。这表明LC/E(K224D)在186R-I187之间切割SNAP23。LC/E(K224D)不切割SNAP23(I187D)的测定(图3b)支持LC/E(K224D)在残基186R-I187之间切割人SNAP23。
SNAP25同种型包括SNAP25a、SNAP25b、SNAP23a、SNAP23b、SNAP29和SNAP47(23，24)。SNAP23和SNAP25分别在非神经元和神经元细胞中调整突触膜形式，而SNAP29和SNAP47与膜融合事件无关。SNAP29显示能抑制SNARE解体且与突触传递有关(25)。虽然SNAP47的功能尚不清楚，但SNAP47可在SNARE复合体形成和脂蛋白体形式中代替SNAP25。检测LC/E(K224D)对包括SNAP23a、SNAP25b、SNAP29和SNAP47在内的span25同种型的底物特异性。由于SNAP23和SNAP25的a-b同种型相同以及LC/E底物识别区域，没有检测SNAP23b和SNAP25a(图4a)LC/E(K224D)在SNAP23和SNAP25上显示出相似的活性(图4b)，但不切割SNAP29和SNAP47。Wt-LC/E切割SNAP25(图4c)，但不切割其他SNAP25同种型。还鉴定了其他LC/E K224突变(K224A)对SNAP23和SNAP25的特异性。LC/E(K224A)以相似的效率切割SNAP23和SNAP25，但比LC/E(K224D)速度低(数据未显示)。
接着检测LC/E(K224D)在海拉细胞中切割内源SNAP23的能力。虽然SNAP23在组成型胞外分泌中的作用不明显(26)，但是SNAP23有助于调节胞外分泌(27)。用LC/E(K224D)转染约60％海拉细胞群体导致了约45％的所述SNAP23切割，而当用Wt-LC/E或无质粒对照转染海拉细胞时，没有检测到SNAP23切割(图5)。这表明培养细胞中是LC/E(K224D)切割了内源SNAP23，而不是Wt-LC/E。通过分析TNF-α介导的粘蛋白和IL-8分泌，在LC/E(K224D)转染的海拉细胞中检测SNAP23切割对海拉细胞分泌的影响。加入TNF-α后对照海拉细胞分泌粘蛋白和IL-8，而LC/E(K224D)转染的海拉细胞分泌的粘蛋白和IL-8减少(图5b和c)。所述抑制是特异性的，因为Wt-LC/E转染的海拉细胞显示与对照细胞等量的粘蛋白和IL-8分泌且不切割内源SNAP23(图5)。
为了检测使用LC/E(K224D)作为蛋白疗法的可行性，用地高辛将重组LC/E(K224D)递送入海拉细胞。重组LC/E(K224D)切割内源SNAP23(图6)，这抑制了TNF-α介导的粘蛋白和IL-8分泌(图6b和c)。地高辛处理也将Wt-LC/E递送入海拉细胞，但Wt-LC/E处理的海拉细胞没有显示出可检测到的粘蛋白和IL-8分泌抑制且不切割内源SNAP23(图6)。这支持了上皮细胞中SNAP23在调节胞外分泌路径中的作用且表明LC/E(K224D)可用作研究SNAP23调节胞外分泌的研究工具(27)。
C.讨论。
理解肉毒杆菌神经毒素的底物特异性可实现具有广泛特异性的BoNT/E新型轻链衍生物的工程改造，为扩展BoNT疗法到神经学以外应用的医疗潜力的原理提供了证据。虽然气道粘液通过纤毛运动俘获和清除所述气道的外来碎片、细菌和病毒来保护上皮内膜，但是称为粘液纤毛清除(17，18)、过多气道粘液分泌、粘液高分泌的过程，可能引起与人临床病症如哮喘和慢性阻塞性肺病相关的粘液积累，所述病症中粘液积累造成呼吸疾病。粘液分泌是由数种分子调整的调节过程，所述分子包括SNARE蛋白、肉豆蔻酰化富丙氨酸蛋白激酶C底物(MARCKS)、和Munc蛋白，其调整含粘蛋白的囊泡停靠在所述分泌细胞质膜上用于胞外分泌(17，18)。由底物改良的BoNT靶向SNAP23可降低所述高分泌综合症的分泌过程。也可靶向SNAP23特异的BoNT以用于其他治疗应用，包括也含高分泌成分的糖尿病和炎症和免疫障碍(28，29)。
比对和生化分析可预测Wt-LC/E和LC/E(K224D)对SNAP25同种型的催化活性机制。SNAP29和SNAP47与SNAP25的活性位点区域内的总体低同源性和所述P1′位点缺少异亮氨酸解释了Wt-LC/E和LC/E(K224D)不能切割SNAP29和SNAP47。相反，除了所述P2、P2′和P3′残基，SNAP23和SNAP25之间总体同源性高，P2残基处变化最显著，其中SNAP25含天冬氨酸而SNAP23含赖氨酸。因此，Wt-LC/E不能切割SNAP23可能是由于SNAP23内的所述P2残基赖氨酸被LC/E的K224静电排斥。这可能降低所述S2口袋的稳定性并影响所述P1′残基排列入所述S1′口袋内。LC/E(K224D)切割SNAP23的能力可能是由于在SNAP23的P2残基Lys和所述突变的S2口袋残基D224之间引入盐桥。LC/E(K224D)也保留有切割SNAP25的能力，尽管速度比Wt-LC/E低约10倍。这说明SNAP25的P2残基天冬氨酸和所述突变S2口袋残基D224之间的排斥不足以抑制LC/E(K224D)的固定键切割。
由于LC/E(K224A)切割SNAP25和SNAP23但速度相对于LC/K224D降低，所以残基224的所述R基团的电荷和大小有助于优化易切断键的切割。总体上，LC/E和LC/E-K224衍生物的生化特性与有助于固定键切割效率的P2残基-S2口袋残基相互作用相一致。尽管与SNAP29和SNAP47结合。(While the to bindSNAP29 and SNAP47.)相反，除了所述P2、P2′和P3′残基，SNAP23和SNAP25之间总体同源性高，P2残基处变化最显著，其中SNAP25含天冬氨酸而SNAP23含赖氨酸。因此，Wt-LC/E不能切割SNAP23可能是由于SNAP23内的所述P2残基赖氨酸被LC/E的K224静电排斥。这可能降低所述S2口袋的稳定性并影响所述PI′残基排列入所述S1′口袋内。
LC/E(K224D)切割SNAP23的能力可能是由于在SNAP23的P2残基Lys和所述突变的S2口袋残基D224之间引入盐桥。LC/E(K224D)也保留有切割SNAP25的能力，尽管速度比Wt-LC/E低约10倍。这说明SNAP25的P2残基天冬氨酸和所述突变S2口袋残基D224之间的排斥不足以抑制LC/E(K224D)的固定键切割。由于LC/E(K224A)切割SNAP25和SNAP23但速度相对于LC/K224D降低，所以残基224的所述R基团的电荷和大小有助于优化易切断键的切割。总体上，LC/E和LC/E-K224衍生物的生化特性与有助于固定键切割效率的P2残基-S2口袋残基相互作用相一致。虽然未测定天然LC/E结合SNAP23的能力，但LC/E与SNAP25和LC/E(K224D)与SNAP23的动力学值在两倍之内，表明相似的结合亲和力。
SNAP25和SNAP23在LC/E结合区域内的比对(图1)几乎一样，8个残基中有7个相同，且所述不同的配对为T:A；一种保守的取代配对，其也支持LC/E对SNAP25和SNAP23有相似的结合亲和力。SNARE蛋白是神经元分泌路径内膜融合和运输中的关键蛋白(9)。使用BoNT有助于理解神经元细胞中囊泡融合和神经递质释放机制。BoNT衍生物切割非神经SNARE的能力可提供研究非神经***中细胞内小泡运输和膜融合机制的有效工具。
尽管BoNT/A由于广泛的临床应用而被认为是可为新应用进行工程改造的合理血清型，但是SNAP25识别机制的分析表明LC/A需要更长底物以优化SNAP25识别，其具有比LC/E更多的残基相互作用数量(20)。较少复杂的SNAP25-LC/E相互作用使得BoNT/E可进行工程改造以改良底物识别。此外，人SNAP25和SNAP23的比对显示出这些蛋白在涉及LC/E识别SNAP25的P3和PI′位点具有高水平的同源性。因此，BoNT/E是工程改造影响SNARE蛋白识别的突变的有用平台。将LC/E(K224D)成功递送入细胞可抑制IL-8和粘蛋白分泌，这支持了LC/E(K224D)用作研究工具的作用，且还显示出调节人高分泌疾病如哮喘和炎症疾病的疗法的潜能。LC/EK224D的治疗特异性可基于如针对毒素嵌合体所述的受体结合成分，例如白喉毒素A片段-IL2(30)和外毒素A片段-IgG可变区片段(31)。总之，本研究提供了改变底物特异性以扩展BoNT到神经学伤害以外应用的原理的证据。
应注意上述描述、附图和其描述旨在说明而不是限制本发明。根据本公开内容，将本发明的许多主题和变化建议给本领域技术人员。所有这些主题和变化在本文的预期内。例如，虽然结合上述各示例性实施方式描述了本发明，但已知的或罕见的或可能目前无法预料的各备选方案、改进、变化、改善、和/或实质等价物对至少本领域普通技术人员显而易见。在不背离本发明的精神和范围下，可进行各种变动。因此，本发明旨在包括这些示例性实施方式的所有已知或随后开发的备选方案、改进、变化、改善、和/或实质等价物。
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Figure IPA00001476497100041
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Figure IPA00001476497100091
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Claims (8)

1.一种改良BoNT/E催化结构域，其特征在于，其中轻链残基224、或对应残基224的残基被改变。
2.一种包含如权利要求1所述的改良结构域的经工程改造的肉毒杆菌神经毒素E或肉毒杆菌神经毒素轻链或肉毒杆菌毒素催化结构域。
3.如权利要求1所述的改良催化结构域，其特征在于，所述催化结构域切割SNAP23。
4.如权利要求1所述的改良催化结构域，其特征在于，所述催化结构域切割SNAP25但不切割SNAP29或SNAP47。
5.如权利要求1所述的改良催化结构域，其特征在于，所述残基224、或对应于残基224的残基变为天冬氨酸或谷氨酸。
6.如权利要求1所述的改良催化结构域，其特征在于，所述结构域还包含用于蛋白质递送***的靶向分子。
7.一种治疗需要肉毒杆菌毒素疗法的对象的方法，所述方法包括将治疗有效量的如权利要求1所述的改良催化结构域给予对象的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述对象患有哮喘、CF、慢性阻塞性肺病、胃酸流出病和炎症、有细胞因子成分的免疫失调或有细胞因子成分的癌症。
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