CN102471367A - 一种制备非线性梯度色谱法及其纯化的产物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种用于通过色谱技术纯化多肽的方法。提出的方法将帮助解决与纯化来自不断发展的生物技术产业新兴的生物蛋白质产物相关的问题。

Description

一种制备非线性梯度色谱法及其纯化的产物
技术领域
本发明公开了一种通过离子交换/反相色谱介质的制备色谱纯化蛋白质的方法。本发明一般涉及色谱法，以及更具体地，涉及非线性梯度制备色谱分离目标和副产物材料的方法，该方法提供更好的分离度用于分离从而获得更高纯度的目标化合物。另外，也公开了一种通过使用非线性梯度洗脱的RPHPLC纯化胰岛素类似物或衍生物的方法。
背景技术
从不断发展的生物技术产业新兴的生物蛋白质产物对通过色谱纯化处理存在新的挑战。通常，这些产物很大并且不稳定，具有分子量的范围为104至106道尔顿。这类产物从常常包含数百种污染物种(包括细胞碎片、各种溶质、营养成分、DNA和其他杂质)的混合物中纯化。蛋白质产物在收获液(harvest liquor)中的浓度有时低达1mg/l，但通常是大约100mg/l。存在于加工溶液(process liquor)中的蛋白酶和它们不稳定的性质常常要求尽可能快地进行纯化。
色谱是动态的分离方法，依赖于待分离的组分在两相(固定(或结合)相床和流动(或载体)相)之间的分布。流动相载着待分离的组分通过填充固定相的柱子。色谱技术包括基于离子交换、疏水相互作用等的分离。在反相色谱(RPC)中，溶液中的分子结合到色谱树脂的疏水表面或疏水配体。
可应用一些不同的色谱程序以获得关于纯度和产率的期望的最终结果。反相色谱是采用的利用疏水相互作用作为主要分离原理的纯化中的最有效的方法之一。反相液相色谱(“RP-LC”)和反相高效液相色谱(“RP-HPLC”)通常用于纯化分子，例如通过合成或重组方法生产的肽和蛋白质。RP-LC和RP-HPLC方法可以有效地分离紧密相关的杂质，并已用于纯化许多不同的分子(Lee等人，“Preparative HPLC，”8thBiotechnology Symposium，Pt.1，593-610(1988))。另外，RP-LC和RP-HPLC已成功地用于纯化分子，特别是，工业规模的蛋白质(Olsen等人，1994，J.Chromatog.A，675，101)。
根据离子交换树脂上配体的电荷，离子交换色谱原理包括两种不同的途径：阴离子交换和阳离子交换。传统的IEC纯化方法通常由一个或多个阶段(sections)组成：平衡阶段、施加或负载阶段(application or loadingsections)、冲洗阶段、洗脱阶段，和再生阶段(参考Remington’sPharmaceutical Sciences，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990，或Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(1995))。
US 6,451,987公开了一种用于从包含肽和相关杂质的混合物中纯化肽的离子交换色谱方法。
US 7,276,590公开了一种用于从包含肽和相关杂质的混合物中纯化肽的离子交换色谱方法。
制备***的成本已大大升级。此外，在这些高压下运行的这种***在日常的生产环境中使用，这可能是严重的危害。因此，该产业处于必须在缓慢并且具有有限的纯化能力的低压、低成本的***，或明显更昂贵并且对健康构成危害的高压、高效的***之间选择的位置。此外，当在制备溶液中时，热的或由于蛋白酶等的存在，生物制品可以及时降解，所以非常期望迅速分离。使用用于生物大分子的液相色谱分离方法获得的生产效率可以用术语产品量/美元(amount-of-product/dollar)描述。为了获得最佳的生产，目前没有很好满足的生产速度和能力是重要的考虑因素。因此，在色谱领域需要不凭借高压和相关的危害和高成本而能高效的***。
当该方法可以尽可能重复色谱方法的产率、纯度、产量和操作条件时，就满足了该需要，其中洗脱由选择的溶剂体系、pH范围和其他相关因素控制(conduct)。操作程序可以有利地用于商业分离。已作出努力创制通过更高的分离度来表征分离的离子交换/HPLC***。
因此，当单独使用或与标准提取和色谱技术组合使用时，本发明的提取方法允许本发明利用比传统方法所需更少的步骤以高产率和高纯度来分离分子。
因此，本发明的目的是提供一种用于高效分离和纯化的制备色谱***，该***具有小规模和低成本，没有传统的分离和纯化***的弊端。
更具体地，本发明涉及控制非常高效率的色谱分离方法，即，通过每单位体积色谱基质的高分离度和高产量表征的色谱技术。更具体地，本发明涉及特别是制备色谱，以及在迄今尚未实现的效率下控制色谱分离的方法。
本发明另外的目标、优势和新特征，连同从下面在并入本文作为参考并形成本文的组成部分的附图中所示的对本发明的描述中贡献的另外的特征和获得的优势，对本发明技术人员将是显而易见的。本发明的目标和优势可以用在随附的权利要求中特别指出的手段和组合来实现和获得。
发明内容
因此，本发明涉及一种用于从包含至少一种相关杂质的混合物中纯化多肽的制备色谱方法，所述方法包括步骤a)将多肽混合物经过色谱处理(chromatographic process)，其中树脂在略酸性pH的缓冲液和有机改性剂中冲洗和平衡，b)通过由缓冲液浓度在0.01M至1M范围内进行(running)具有从0至∞范围的陡度系数的陡度的凸形或凹形非线性梯度来洗脱；和c)目标杂质去除至少50％而回收多肽；根据上述方法纯化的IN-105具有至少95％的纯度；一种从包含至少一种相关杂质的混合物中纯化胰岛素和类似物的方法，所述方法包括步骤a)将混合物经过用有机改性剂冲洗和平衡的RPHPLC柱，b)通过由缓冲液浓度在0.01M至1M的范围内进行(running)具有从0至∞范围的陡度系数的陡度的凸形/凹形非线性梯度来洗脱，和c)目标杂质去除至少50％而回收胰岛素和类似物；根据上述任何方法纯化的胰岛素甲酯(Insulin methyl ester)具有至少85％的纯度；根据上述任何方法纯化的胰岛素甲酯具有至少90％的纯度；根据上述任何方法纯化的甘精胰岛素(glargine)具有至少90％的纯度；根据上述任何方法纯化的甘精胰岛素具有至少95％的纯度；根据上述任何方法纯化的门冬胰岛素(aspart)具有至少80％的纯度；根据上述任何方法纯化的门冬胰岛素具有至少84％的纯度；以及根据上述任何方法纯化的门冬胰岛素具有至少88％的纯度。
具体实施方式
本发明涉及一种用于从包含至少一种相关杂质的混合物纯化多肽的制备色谱方法，所述方法包括步骤：
(a)将多肽混合物经过色谱处理，其中树脂在略带酸性pH的缓冲液和有机改性剂中冲洗和平衡；
(b)通过缓冲液浓度在0.01M至1M范围内进行具有从0到∞范围的陡度系数的陡度的凸形或凹形非线形梯度来洗脱；和
(c)目标杂质去除至少50％而回收多肽。
在本发明实施方式中，色谱处理选自包括离子交换色谱或反相HPLC或其组合的组。
在本发明的另一个实施方式中，步骤a)中的树脂是离子交换树脂或C4至C18硅胶树脂。
在本发明的又一个实施方式中，使用的缓冲液是醋酸盐缓冲液。
在本发明的又一个实施方式中，pH范围是约2至约5。
在本发明的又一个实施方式中，多肽是胰岛素、胰岛素类似物或其衍生物。
在本发明的又一个实施方式中，胰岛素衍生物是IN 105。
在本发明的又一个实施方式中，胰岛素类似物是甘精胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素(lispro)、赖谷胰岛素(glulisine)或胰岛素甲酯(Insulinmethyl ester)。
在本发明的又一个实施方式中，目标杂质是去八肽(des-Octa)杂质、去苏氨酸(des thero)杂质、去八肽门冬胰岛素杂质(des octa aspart impurity)或侧翼(flank)和单糖基化门冬胰岛素(monoglycosylated aspart)或其任何组合。
在本发明的又一个实施方式中，多肽与树脂的比例按重量体积比(weight by volume ratio)的范围是0.1至50g/l。
在本发明的又一个实施方式中，多肽与树脂的比例按重量体积比的范围更优选1至25g/l。
在本发明的又一个实施方式中，回收的多肽具有至少95％的纯度。
本发明涉及根据任何前述实施方式具有至少95％的纯度的纯化的IN-105。
本发明涉及一种从包含至少一种相关杂质的混合物纯化胰岛素和类似物的方法，所述方法包括步骤：
(a)将混合物经过用有机改性剂冲洗和平衡的RPHPLC柱；
(b)通过缓冲液浓度在0.01M至1M范围内进行具有从0至∞范围的陡度系数的陡度的凸形/凹形非线形梯度来洗脱；和
(c)目标杂质去除至少50％而回收胰岛素和类似物。
在本发明的一个实施方式中，RPHPLC以约2至约5范围的pH冲洗和平衡。
在本发明的另一个实施方式中，回收的胰岛素类似物具有至少97％的纯度。
本发明涉及根据任何前述实施方式具有至少85％至90％的纯度的纯化的胰岛素甲酯。
本发明进一步涉及根据任何前述实施方式具有至少90％至95％的纯度的纯化的甘精胰岛素。
本发明涉及根据任何前述实施方式具有至少80％至88％的纯度的纯化的门冬胰岛素。
提供一种用离子交换和/或反相制备色谱法纯化包含IN-105的不纯制剂(preparation)的方法。在例示性实施方式中，色谱柱负载固定相，典型地是基于陶瓷的树脂(ceramic based resin)。典型的方法包括将粗制IN-105溶液供料至色谱柱，向色谱柱提供流动相，以及从色谱柱回收IN-105洗脱液。但是，每个分离的包含目标化合物的洗脱液已经有足够的回收率和纯度。
一种用于从包含至少一种相关杂质的混合物中纯化多肽的制备色谱方法，所述方法包括步骤：
(a)将多肽混合物施加于在略微酸性pH的缓冲液中冲洗和平衡的离子交换树脂。
(b)采用缓冲液浓度在0.01M至1M范围内进行从0至∞范围的陡度的凸形/凹形非线形梯度来洗脱。
(c)目标杂质去除至少50％而回收多肽。
更具体地，本发明重点涉及采用缓冲液浓度在0.01M至1M范围内进行从0至∞范围的陡度的凸形/凹形非线性梯度洗脱，导致目标杂质减少的范围为60-95％。因此，该方法使目标化合物的纯度在至少80％-97％的范围。
一种通过RP HPLC纯化包含胰岛素和类似物的不纯制剂的方法，其中所述方法包括：
a)先用适当比例的有机改性剂平衡RPHPLC柱。
b)在过载柱条件下将蛋白质样品注入到该柱上。
c)用一定比例的有机改性剂冲洗该柱以去除任何未结合的蛋白质。
d)接着在非线性条件下进行梯度洗脱。
e)分流(fractionated)并分析样品以评价总纯度。
f)将满足要求纯度的流分(fraction)汇集在一起从而形成洗脱汇集物，然后将该柱再生以去除任何可能被紧紧结合的蛋白质。
虽然本发明已参考其具体实施方案进行描述，本领域技术人员应该了解，在不背离本发明真正的精神和范围的情况下可以进行各种变化和替代等同物。
在此说明书中首先公开了制备色谱所需运行参数的性质和理论基础，接着是在色谱方法(色谱处理)优化中对具体实例有用的方程原理、在这种色谱的实践中有用的具体材料的公开，和这种程序的具体实施例。
普通技术人员在开发本文所述的方法和***中应该不需要额外的解释，但是仍然可以通过研究相关领域的标准参考著作在这些方法和***的制备中找到一些有用的指导。例如，普通技术人员可以选择浏览L.R.Snyder，“Gradient Elution”，出自High Performance Liquid Chromatography，Cs.Horvath(ed.)，Academic Press，1980，pp.207-316和M.A.Stadalius，H.S.Gold and L.R.Snyder，J.Chromatography，296(1984)，31-59，Cazes，J.，2005，“Encyclopedia of Chromatography”(pp 718).Marcel Dekker，第2版，卷1，其全部公开内容以引用的方式并入本文中。
术语的定义：
术语“离子交换”和“离子交换色谱”是指色谱方法(色谱处理)，其中混合物中感兴趣的溶质(如蛋白)与连接(如通过共价连接)到固相离子交换材料的带电化合物相互作用，使得感兴趣的溶质与带电化合物的非特异性相互作用比混合物中的溶质杂质或污染物的大或小。混合物中的污染溶质从离子交换材料的柱中洗脱比感兴趣的溶质更快或更慢，或者相对于感兴趣的溶质结合到树脂上或被树脂排出。“离子交换色谱”尤其包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式色谱。
术语“制备色谱分离”是指一种用于分开或分离化学混合物组分(例如，期望的组分)的色谱分离。制备色谱分离可以包括通过制备柱洗脱一种或多种组分。制备色谱分离可以由制备色谱参数表征和/或影响。
词语“色谱梯度模式”本文是指随时间的函数变化的流动溶剂组成(composition)，通常反应用户定义的分布。溶剂具有的组成可以是，例如，两种溶液的混合物，本文是指作为流动相缓冲液A和流动相缓冲液B。在优选的方面，该柱是强阴离子或强阳离子交换柱，这意味着该柱吸附剂的离子交换性能不会随着该柱的工作pH范围改变。
梯度色谱***使用与等度***(isocratic system)相同的通用组分，主要区别是在溶剂输送中，它必须输送其组分随着时间的函数不断变化的液体混合物。该梯度技术通常用于分离可能在等度模式中洗脱靠近在一起并需要在洗脱条件下微小变化来实现微分分离的峰。
通过改变在色谱运行期间从弱到强的洗脱液来进行梯度洗脱。在梯度洗脱中，洗脱方法(洗脱处理)从低置换能力的洗脱液开始，随着时间的推移用置换能力较强的洗脱液。这可以通过改变洗脱液的浓度和/或组成来实现。用于所描述的***的流速是典型的用于离子色谱。梯度洗脱被定义为通过改变在运行期间从弱到强的洗脱液进行的洗脱。这种洗脱液被称为梯度洗脱液。合适的梯度洗脱液的例子在Rocklin，R.D.等人(Journal ofChromatography 411(1987)107.)和Ion Chromatography，Small，H.(PlenumPress 1989)pp.187，213中说明。它们包括洗脱液强度随着时间的函数呈线性形状、凹形、凸形、台阶形、保持阶段线性和这些函数的组合增长。
阳离子交换色谱有助于基于它们的电荷差异从它的杂质中分离蛋白质。在大多数CIEX运行中，洗脱在始终具有相同浓度的缓冲液的等度梯度模式中进行。因为缓冲液的浓度随着时间逐渐改变，在洗脱过程中应用非线性梯度有助于紧密相关的杂质的分离。此外，非线性梯度的应用导致浓度急剧增加随后浓度逐渐上升，或浓度逐渐增加随后浓度急剧上升。这种非线性变化有助于提高紧密洗脱杂质的分离。
通过将初始缓冲液与不同浓度的第二缓冲液不断混合，同时增加的第二缓冲液的比重直到混合物达到期望的浓度从而生成外梯度(externalgradient)。形成缓冲溶液的每个浓度梯度可以由相同的缓冲组分或不同的缓冲组分组成。
这样，该梯度可以是“线性梯度”、“凸形梯度”、“凹形梯度”或“不连续梯度”，或本领域技术人员知道的任何其他合适的形式。
“凸形梯度”是指这样的梯度，其中缓冲液浓度变化逐渐超过初始相后急剧上升。
“凹形梯度”是指这样的梯度，其中缓冲液浓度在最初斜率急剧增加后逐渐上升。
“分离度(Resolution)”是***可以达到的纯化程度的度量。这个变量是由在处理溶液中溶质的性质和色谱介质的相互作用表面的化学性能来控制，也由影响流体动力学、扩散和吸附动力学的特征来控制。
术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”是指氨基酸的聚合物，并且不涉及该产物的具体长度；因而，肽、寡肽和蛋白质包括在多肽定义的范围内。该术语也不涉及或排除多肽的表达后修饰，但这些多肽的化学修饰或表达后修饰可作为具体实施方式被包括或排除。因此，例如，术语多肽明显包括对多肽的修饰，这些修饰包括糖基基团、乙酰基基团、磷酸酯基团、脂质基团等的共价连接。另外，带有这些修饰的多肽可指定为本发明包括或排除的单个种类。在一个实施方式中，该分子是多肽或它们的相关类似物或其衍生物。
术语从包括蛋白质和一种或多种污染物的组合物中“纯化”蛋白质，从而通过减少蛋白质组合物中至少一种污染物的含量来增大组合物中蛋白质的纯度。
“杂质”是与期望的多肽产物或感兴趣的蛋白质不同的材料。针对使用非线性梯度的阳离子交换色谱的主要杂质是去八肽IN-105。在酶促反应中，胰蛋白酶通过切割前导序列和连接子序列将胰岛素前体转换成胰岛素。在这个反应中，生成的杂质之一是去八肽IN-105，其中胰蛋白酶作用发生在远离B链的C末端的8个氨基酸。该杂质在十八烷基陶瓷柱上相对于产物的保留值的相对保留值为0.84。因此描述的该杂质被称为“目标杂质”。
术语“胰岛素类似物”是为了包含上述定义的任何形式的“胰岛素”，其中多肽链中的一种或多种氨基酸已被另一种替代氨基酸代替和/或其中一种或多种氨基酸已被缺失(删除)或其中一种或多种额外的氨基酸已被添加到多肽链上。胰岛素类似物选自包括门冬胰岛素、甘精胰岛素和胰岛素甲酯的组。
“IN-105”是在胰岛素B链B29位置的ε-氨基酸赖氨酸处与两亲性寡聚体(结构式CH3O-(C4H2O)3-CH2-CH2-COOH)结合的胰岛素分子。该分子可以在A1、B1和B29处单结合(monoconjugated)，在A1、B1和B29的多种组合处二结合(di-conjugated)，或者在A1、B1和B29的多种组合处三结合(triconjugated)。
针对使用非线性梯度的RPHPLC用于胰岛素和类似物的主要杂质包括：
去苏氨酸胰岛素(Des-Threo Insulin)-在酶促反应中，胰蛋白酶通过切割前导序列和连接子序列将胰岛素前体转换成胰岛素。在这个反应中，生成的杂质之一是去苏氨酸，其中胰蛋白酶作用发生在B链的第29氨基酸。该杂质在十八烷基硅胶柱上相对于产物保留值的相对保留值为0.98。
去八肽门冬胰岛素-在酶促反应中，胰蛋白酶通过切割前导序列和连接子序列将门冬胰岛素前体转换成门冬胰岛素。在这个反应中，生成的杂质之一是去八肽，其中胰蛋白酶在远离B链的C末端的8个氨基酸处切割。这种杂质在十八烷基硅胶柱上相对于产物保留值的相对保留值为0.9。
侧翼(Flank)：在门冬胰岛素中这也是看到的主要杂质之一。在酶促反应中，胰蛋白酶通过切割前导序列和连接子序列将门冬胰岛素前体转换成门冬胰岛素。在这个反应中，生成的杂质之一是侧翼，它在C肽(连接肽)不完全切割时发生。这种杂质在十八烷基硅胶柱上相对于产物保留值的相对保留值为0.96。
糖基化门冬胰岛素：已知宿主是进行翻译后修饰导致甘露糖基(mannosyl)添加至前体。相应产生的杂质是产物的糖基化形式，也被称为糖基化杂质。这种杂质在十八烷基硅胶柱上相对于产物保留值的相对保留值为0.91。
陡度系数是指相对于时间的浓度曲线的斜率。
本发明的一些实施方式可以采用非线性溶剂强度梯度(例如，分段线性溶剂强度梯度、凹形梯度形状或凸形梯度形状)用于分析和制备色谱分离。
本发明的一些实施方式可以包括首先优化或改善分析色谱分离的一些方面(例如，通过选择适当的分析梯度陡度参数的值)，之后使用制备色谱分离优化和/或改善所需的组分的分离。台阶梯度用于连续流操作通常是有效的。
用于分离和纯化本发明蛋白质的方法的典型实例包括以下步骤：
i.用约10mM的醋酸盐缓冲液平衡的基于陶瓷的树脂填充离子交换柱。
ii以约≤100-400cm/hr的流速将包含至少一种相关杂质的肽组合物负载在该柱上。
iii.采用缓冲液浓度在0.01M至1M范围内进行从0至∞范围的陡度的凸形/凹形梯度进行非线形梯度从该柱洗脱纯化的产物。
洗脱缓冲液的pH可以约2至约9，可替换地为约3至约8，约4至约8左右，或约5至约8，但用于洗脱的pH或pH范围将根据感兴趣的期望蛋白质和实际的色谱类型来确定。用于负载、冲洗或洗脱缓冲液的适宜的pH范围很容易通过标准方法来确定，使得感兴趣的蛋白质以活性形式回收。
在本申请公开的一个实施方式中，水性缓冲液***选自醋酸钠缓冲液***。在另一方面，醋酸水性缓冲液***也可以与一种或多种醋酸铵盐/离子交换化合物配对。在另一方面，氢氧化钠可以可选地用于调整pH或钠离子浓度。在优选的方面，在流动相的离子交换缓冲液/缓冲液盐离子交换化合物为醋酸铵/醋酸钠缓冲液***。
本发明另一个实施方式涉及分离梯度公式，方程式(i)和(ii)可用于非线性梯度的计算。如果溶剂浓度随时间的变化是线性的，梯度将是线性的。非线性梯度可以通过下列公式计算。如果θ是在任何时间t的溶剂分数，C是当时的溶剂浓度，C1是梯度开始时的浓度，C2是梯度结束时的浓度，以及tg是梯度的总时间，然后
(i)凹形梯度-θ＝(t/tg)^n；C＝(C2-C1)*θ+C1
(ii)凸形梯度-θ＝1-(1-t/tg)^n；C＝(C2-C1)*θ+C1
其中，n是陡度系数(N＝0至∞)。
在另一方面，本发明特征为一种纯化蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：经过包含至少一种相关杂质的蛋白质混合物，其包括将蛋白质混合物负载到包含陶瓷树脂离子交换的离子交换柱上，用略酸性pH的合适的缓冲液平衡，随后采用从缓冲液浓度在0.01M至1M范围内进行0至∞范围的陡度的凸形/凹形梯度来洗脱，导致目标杂质减少60-75％的范围。洗脱的蛋白质可以进一步经过高效液相色谱作进一步处理。
在另一方面，本发明特征为一种通过进行RP HPLC纯化胰岛素和类似物的方法。该方法包括用合适比例的有机改性剂平衡RP HPLC柱，此后在过载柱的条件下将样品注入到该柱上，然后用一定比例的有机改性剂冲洗该柱以去除任何未结合的蛋白质，接着是在目前的实施例中的非线性条件下进行梯度洗脱。此外，分流并分析该样品以评价整体的纯度，并将满足所需的纯度规格的流分汇集在一起从而形成洗脱汇集物。
根据本发明的一个方面，纯化的蛋白质产物没有或包含极少量的目标杂质。根据本发明的一个方面，纯化的蛋白质产物的纯度至少为95％，根据本发明的另一个方面，纯化的蛋白质产物的纯度至少为97％，根据本发明的又一个方面，纯化的蛋白质产物的纯度至少为98％，根据本发明的又一个方面，纯化的蛋白质产物的纯度至少为99％，根据本发明的又一个方面，纯化的蛋白质产物的纯度为100％。
根据本发明的另一方面，纯化的胰岛素和类似物没有或包含极少量的目标杂质。根据本发明的一个方面，纯化的胰岛素及类似物的纯度至少为80％，根据本发明的另一个方面，纯化的胰岛素及类似物的纯度至少为85％，根据本发明的另一个方面，纯化的胰岛素及类似物的纯度至少为90％，根据本发明的又一个方面，纯化的胰岛素及类似物的纯度为97％。
本发明的另一个方面涉及通过使用非线性梯度进行反相色谱与离子交换色谱结合实现有效的提高蛋白质的纯度(＞95％)。
在阅读本文提供的公开内容和权利要求的基础上，本发明这些和其他非限制的实施方式容易被本领域普通技术人员所了解。应了解，本发明不限于描述的特定的方法和过程，当然可以改变所需的蛋白质/多肽产物和方法。也应了解，本文所使用的术语只为描述特定的实施方式的目的，并不起到限制的作用。
应了解，使用如在实施例中描述的举例说明的纯化的方法以获取高分离度分离(与用于分离的组分配合)，使得以特别简单、方便和价廉的方式获得期望的肽特别高效。
本发明的上述具体实施方式的描述用于说明和描述的目的。不是排除性的或将本发明限制于所公开的确切形式中。按照上述教导内容，可以进行多种修改和改变。此外，可以作出许多修改使特定情况、材料、物质的组合物、工艺、工序或步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改的目的都将在本文所附的权利要求的范围内。
借助于下面的实施例来进一步详述本申请的技术。然而，这些实施例不应当解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1
粗制IN-105用5倍的水稀释，并将pH调整至3.5。将此负载在填充陶瓷Hyper-D S阳离子交换树脂的钢柱上。用pH 3.5的10mM醋酸铵缓冲液进行平衡和冲洗。负载纯度(load purity)为46.22％，包含5.6％的去八肽杂质。当采用陡度0.3的凸形梯度以10柱体积、浓度缓冲液为0.2M至0.64M的醋酸铵进行时，由此得到的洗脱汇集物显示纯度为59％，去八肽水平仅为4.4％，表明去八肽杂质水平近似减少50％。
实施例2
粗制IN-105用5倍的水稀释，并将pH调整至3.5。将此负载在填充陶瓷Hyper-D S阳离子交换树脂的钢柱上。用pH 3.5的10mM醋酸铵缓冲液进行平衡和冲洗。负载纯度为52.57％，包含9.1％的去八肽杂质。当采用陡度0.15的凹形梯度以10柱体积、缓冲液浓度为0.38M至0.64M的醋酸铵进行时，由此得到的洗脱汇集物显示纯度为63.31％，去八肽水平仅为5.14％，表明去八肽杂质水平近似减少71％。
实施例3
粗IN-105用5倍的水稀释，并将pH调整至3.5。将此负载在填充陶瓷Hyper-D S阳离子交换树脂的钢柱上。用pH 3.5的10mM醋酸铵缓冲液进行平衡和冲洗。负载纯度为55.46％，包含8.18％的去八肽杂质。当采用陡度0.15的凹形梯度以10柱体积、缓冲液浓度为0.2M至0.64M的醋酸铵进行时，由此得到的洗脱汇集物显示纯度为67.37％，去八肽水平仅为5.35％，表明去八肽杂质水平近似减少61％。
实施例4
粗IN-105用5倍的水稀释，并将pH调整至3.5。将此负载在填充陶瓷Hyper-D S阳离子交换树脂的钢柱上。用pH 3.5的10mM醋酸铵缓冲液进行平衡和冲洗。负载纯度为55.80％，包含7.71％的去八肽杂质。当采用陡度0.15的凸形梯度以10柱体积、缓冲液浓度为0.38M至0.64M的醋酸铵进行时，由此得到的洗脱汇集物显示纯度为70％，去八肽水平仅为3.85％，表明去八肽杂质水平近似减少75％。
实施例5
粗IN-105用5倍的水稀释，并将pH调整至3.5。将此负载在填充陶瓷Hyper-D S阳离子交换树脂的钢柱上。用pH 3.5的10mM醋酸铵缓冲液进行平衡和冲洗。负载纯度为55.99％，包含8.15％的去八肽杂质。当采用陡度0.15的凸形梯度以20柱体积、缓冲液浓度为0.38M至0.64M的醋酸铵进行时，由此得到的洗脱汇集物显示纯度为70.32％，去八肽水平仅为3.91％，表明去八肽杂质水平近似减少74％。
实施例6
粗IN-105用5倍的水稀释，并将pH调整至3.5。将此负载在填充陶瓷Hyper-D S阳离子交换树脂的钢柱上。用pH 3.5的10mM醋酸铵缓冲液进行平衡和冲洗。负载纯度为53.51％，包含9.29％的去八肽杂质。当采用陡度0.15的凸形梯度以20柱体积、缓冲液浓度为0.38M至0.64M的醋酸铵进行时，由此得到的洗脱汇集物显示纯度为68.41％，去八肽水平仅为4.79％，表明去八肽杂质水平近似减少75％。
实施例7
将粗IN-105负载在填充陶瓷Hyper-D S阳离子交换树脂的钢柱上，并进行(run)凸形梯度(洗脱)。将从阳离子交换获得的洗脱汇集物稀释并负载在包含10％的溶剂的硅胶C8树脂上。使用的流动相为0.25M的柠檬酸(缓冲液A)和乙腈(缓冲液B)。用10％的B进行平衡并用15％的B冲洗。负载纯度为78.26％。用以20柱体积、15％的B至23％的B的线性梯度进行洗脱，由此得到的洗脱汇集物显示纯度为96.33％。
实施例8
将粗IN-105负载在填充陶瓷Hyper-D S阳离子交换树脂的钢柱上，并进行凸形梯度(洗脱)。将从阳离子交换获得的洗脱汇集物稀释并负载在包含10％的溶剂的硅胶C8树脂上。使用的流动相为0.1M的Tris和0.02M的MgCl2(缓冲液A)和乙腈(缓冲液B)。用10％的B进行平衡和冲洗。负载纯度为65.06％。用以20柱体积、25％的B至32％的B的线性梯度进行洗脱，由此得到的洗脱汇集物显示纯度为92.87％。
实施例9
将TP(处理)后(Post TP)胰岛素甲酯(IME)晶体溶解在0.5N醋酸(HOAc)、50mM醋酸钠(Na-HOAc)和15％甲醇(MeOH)中使负载的浓度为1.5gpl。然后过滤并以20gpl(即每升树脂20克的IME)负载在基于C8硅胶树脂的RP柱上。负载纯度为74.51％，包含约9％的作为主要杂质的去苏氨酸人类胰岛素。使用醋酸钠缓冲液(缓冲液A)和甲醇(缓冲液B)进行RP HPLC。使用陡度为3的50-65％的B的凸形梯度，并且由此得到的产物包含0％的去苏氨酸人类胰岛素并且具有95.95％的总纯度。
实施例10a)
将酶促反应后的甘精胰岛素晶体溶解在2M HOAc和10％乙腈中使负载的浓度在0.8至0.95gpl。然后过滤该负载并在5.4gpl(即每升树脂5.4克的甘精胰岛素)的负载容量下负载在基于C18硅胶树脂的RP柱上。负载纯度为35％-40％，包含几种不同的杂质。使用250mM的柠檬酸(缓冲液A)和IP(缓冲液B)作为有机改性剂进行洗脱。随着不同的杂质的分离，最终EP纯度为96.02％。对于80.97％的总纯度，阶段产率增加至86.7％。使用陡度为0.5的10-20％的B的凸形梯度。
实施例10b)
将酶促反应后的甘精胰岛素晶体溶解在2M HOAc和10％乙腈中使负载的浓度在0.8至0.95gpl。然后过滤该负载并在5.4gpl(即每升树脂5.4克的甘精胰岛素)的负载容量下负载在基于C18硅胶树脂的RP柱上。负载纯度为35％-40％，包含几种不同的杂质。使用250mM的柠檬酸(缓冲液A)和IPA(缓冲液B)作为有机改性剂进行洗脱。随着不同的杂质的分离，最终EP纯度为96.02％。对于80.97％的总纯度，阶段产率增加至86.7％。使用陡度为0.5的10-20％的B的凹形梯度。
实施例11
将门冬胰岛素的酶促最终材料用乙酸和乙腈稀释使负载浓度高达0.8gpl。然后过滤该负载并在10gpl(即每升树脂10克的门冬胰岛素)的负载容量下负载在基于C4硅胶的RP柱上。负载纯度为71.03％，包含几种不同的紧密相关的杂质，诸如去八肽门冬胰岛素、侧翼、单糖基化门冬胰岛素等。使用250mM的pH4.0的醋酸钠(缓冲液A)和乙腈(缓冲液B)进行洗脱。使用陡度为0.5的15-30％的B的凹形梯度，并且由此得到的产物具有88.24％的总纯度。使用非线性梯度的主要优点是减少诸如侧翼(减少97％)和去八肽门冬胰岛素(减少70％)的杂质。
本发明的优选的实施方式已公开。然而，本领域普通技术人员应认识到一些修改将包括在本发明的教导内容内。因此，应研究下列权利要求以确定本发明的真正的范围和内容。

Claims (23)

1.一种用于从包含至少一种相关杂质的混合物中纯化多肽的制备色谱方法，所述方法包括步骤：
(a)将多肽混合物经过色谱处理，其中树脂在略酸性pH的缓冲液和有机改性剂中冲洗和平衡；
(b)通过由缓冲液浓度在0.01M至1M范围内进行具有从0到∞范围的陡度系数的陡度的凸形或凹形非线形梯度来洗脱；和
(c)目标杂质去除至少50％而回收多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述色谱处理选自包括离子交换色谱或反相HPLC或其组合的组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤a)中的所述树脂是离子交换树脂或C4至C18硅胶树脂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，使用的所述缓冲液是醋酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述pH范围为约2至约5。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽是胰岛素、胰岛素类似物或其衍生物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，胰岛素衍生物是IN 105。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，胰岛素类似物是甘精胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、赖谷胰岛素或胰岛素甲酯。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标杂质是去八肽杂质、去苏氨酸杂质、去八肽门冬胰岛素杂质或侧翼和单糖基化门冬胰岛素或其任何组合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽与树脂的比例按重量体积比的范围为0.1至50g/l。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽与树脂的比例按重量体积比的范围更优选1至25g/l。
12.根据权利要求1至11所述的方法，其中，回收的所述多肽具有至少95％的纯度。
13.根据前述权利要求中任一项纯化的具有至少95％的纯度的IN-105。
14.一种从包含至少一种相关杂质的混合物中纯化胰岛素和类似物的方法，所述方法包括步骤：
(a)将混合物经过用有机改性剂冲洗和平衡的RPHPLC柱；
(b)通过由缓冲液浓度在0.01M至1M范围内进行具有从0至∞范围的陡度系数的陡度的凸形/凹形非线形梯度来洗脱；和
(c)目标杂质去除至少50％而回收胰岛素和类似物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述RPHPLC以从约2至约5范围的pH冲洗和平衡。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，回收的所述胰岛素类似物具有至少97％的纯度。
17.根据前述权利要求中任一项纯化的具有至少85％的纯度的胰岛素甲酯。
18.根据前述权利要求中任一项纯化的具有至少90％的纯度的胰岛素甲酯。
19.根据前述权利要求中任一项纯化的具有至少90％的纯度的甘精胰岛素。
20.根据前述权利要求中任一项纯化的具有至少95％的纯度的甘精胰岛素。
21.根据前述权利要求中任一项纯化的具有至少80％的纯度的门冬胰岛素。
22.根据前述权利要求中任一项纯化的具有至少84％的纯度的门冬胰岛素。
23.根据前述权利要求中任一项纯化的具有至少88％的纯度的门冬胰岛素。
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