CN102470168A - 新组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含至少一种ISCOM复合物和至少一种内部抗原的组合物，所述内部抗原不是表面抗原并且不是完整微生物之部分的形式。所述内部抗原可为核蛋白或表现为将微生物分解后获得的成分组之成员。所述ISCOM复合物可为ISCOM或ISCOM基质复合物。所述组合物还可包含非内部抗原。本发明还涉及用作免疫刺激药物或疫苗的所述组合物，尤其是用于引发包括CTL应答的T细胞应答。本发明还涉及包含至少一种ISCOM复合物的组合物，其用作刺激年老者的树突状细胞的免疫刺激或免疫调节药物或疫苗。此外，本发明涉及制备组合物的方法，其中在不去除任何细胞成分的情况下将皂苷、胆固醇和脂质与细胞和增溶剂的裂解细胞悬液相混合，然后除去或稀释增溶剂。本发明还涉及试剂盒。

Description

新组合物

本发明涉及包含至少一种ISCOM复合物和至少一种内部抗原的组合物，所述内部抗原不是表面抗原并且不是完整微生物之部分的形式。本发明还涉及用作免疫刺激药物或疫苗的所述组合物，尤其是用于引发包括CTL应答的T细胞应答。本发明还涉及组合物，其用作用于低应答者的免疫刺激药物或疫苗。

本发明还涉及包含至少一种ISCOM复合物的组合物，其用作免疫刺激或免疫调节药物或疫苗以刺激年老者的树突状细胞。

此外，本发明涉及制备所述组合物的方法和试剂盒。

本发明包括ISCOM/ISCOM基质制剂，其用于增强和扩大免疫应答来增强对可获得之疫苗抗原或显露的隐藏在完整微生物/病毒中之抗原的免疫应答水平和/或质量，以及扩大对将完整微生物分解所显露的非表面抗原的免疫应答，以及回避由完整微生物(包括病毒)产生的免疫抑制。本发明还包括刺激多种亚类型的特异性抗体、细胞介导的免疫应答(包括Th1和Th2和细胞毒T细胞应答，即平衡的免疫应答)以实现免疫保护。本发明还包括需要情况下的快速免疫应答。本发明还包括ISCOM/ISCOM基质佐剂***在将不应答个体转变成免疫应答者中的用途。

现有技术

用佐剂来增强用于预防或治疗的疫苗。然而，现有疫苗需要改进的效果从而使得在多个疫苗领域中有效。需要进行效果改进的疫苗的例子为狂犬病疫苗、RSV疫苗和流感疫苗。这些需要通过降低不应答者和低应答者的数目来进行改进。流感病毒具有通过逃避突变体(escape mutant)来逃避现有疫苗所引发的免疫应答的强倾向性。狂犬病毒是感染后给予应当发挥功能的另一种病毒。缺乏有效疫苗的呼吸道合胞病毒(RSV，respiratory syncytial virus)主要在婴儿和年老者中引起问题，其中需要具有替代功能的疫苗。其他目标疫苗是疱疹病毒家族中的疫苗。

疫苗的特别用途与狂犬病疫苗感染相关。对人使用时，狂犬病疫苗主要在怀疑感染了狂犬病毒后(即感染后)施用。为了在感染后有效，疫苗需诱导快速且强大的免疫应答以先于疾病发挥作用，在狂犬病的情况下使得阻止死亡。

对于大部分种类的疫苗，高效佐剂不应仅诱导高水平的免疫应答，还应诱导高质量的应答(包括抗体和细胞介导的免疫应答，即正确类型的免疫)以实现免疫保护。特异性免疫是指针对疫苗意欲对抗之作用物(agent)的特异性成分的免疫应答。因此，疫苗必须含有并暴露所述成分(即疫苗抗原)，其可以是蛋白质、蛋白质的部分或通常与蛋白质(因而命名为糖蛋白)连接的糖。为常规疫苗选择的抗原和用于常规疫苗以诱导免疫保护的抗原通常是表面蛋白，其暴露于病原体的表面作为疫苗的靶标。

保护性抗体(即诱导免疫保护的抗体)通常暴露于作用物表面。对于病毒，保护性抗体通常是特征性病毒中和(VN，virus neutralizing)抗体。除抗体外还有其他重要免疫机制，即具有杀死被感染细胞的能力的细胞介导免疫(CMI，cell mediated immunity)，包括细胞毒T细胞(CTL，cytotoxic T-cell)，其不仅对于对抗病毒感染的保护尤其重要，而且对于对抗其他细胞内或任选地细胞内病原体/寄生生物也是重要的。因此，对于对抗细胞内寄生生物的保护，CMI也许甚至比抗体更为重要。应注意，与覆盖对抗多种病原体之特异性变体/亚型的免疫保护的抗体相比，对抗内部/细胞内保护性抗原/表位的CMI可诱导更广的免疫。因此，CMI可覆盖免疫***的抗体分支未覆盖的针对其他变体/分离株的交叉保护。

EP 0109942B1公开了通过溶解微生物来产生增溶剂和细胞或微生物片段的混合物而产生的ISCOM复合物。具有疏水区的带电荷的单体抗原蛋白与增溶剂连接复合。在一种或多种具有疏水和亲水区的糖苷存在下，或通过直接将下述项转移至所述糖苷，将带电荷的单体抗原蛋白与增溶剂分离来生产免疫原性复合物，所述糖苷存在的浓度至少为临界胶束浓度(critical micelle concentration)。在所述复合物生产之前、期间或之后除去剩余片段。这些ISCOM复合物将主要包含疏水的表面抗原或膜抗原，并且不含内部抗原。

发明概述

本发明揭示了除致病微生物(病原体)的外部暴露抗原外的内部抗原，并通过使用ISCOM基质制剂使其有免疫原性。所述病原体可以是完整的(完整的微生物，包括病毒)或分解的微生物。除非存在本发明佐剂，完整的微生物可不将内部抗原暴露于免疫***引发免疫应答。

扩大免疫应答以包括内部抗原来参与免疫保护也可有助于增加快速免疫保护(尤其在暴露后使用后)和持久免疫。

除包括缺乏外部抗原性质的内部抗原来增加免疫应答的效力外，本发明涉及包含至少一种ISCOM复合物和至少一种内部抗原的组合物，所述内部抗原不是表面抗原并且不是完整微生物之部分的形式。本发明还涉及用作免疫刺激药物或疫苗的组合物，尤其是用于引发T细胞应答包括CTL应答。

疫苗主要基于促进针对表面结构的免疫应答(包括抗体和T细胞应答两者)的完整微生物或亚单位。或者，疫苗抗原是亚单位(即最通常为表面蛋白)，但也是内部/细胞内蛋白质或甚至可在细胞载体中表达的非结构蛋白质。后者随后被用于激发T细胞应答，因为抗体不与内部蛋白相互作用，并且因此不能介导免疫保护。在本发明中，通过分解作用物(例如微生物)来显露内部蛋白以暴露具有免疫原性和免疫保护价值的其他蛋白质/抗原。分解例如通过作用物/微生物的溶解进行。

ISCOM技术的产物用于增强可获得抗原(即表面抗原)和通过破坏所制备的疫苗针对的作用物而显露的抗原的免疫原性。

本发明具有的优势是除激发针对常规疫苗所覆盖的抗原的免疫应答外，还覆盖内部抗原。这些可以是可能被显露(例如在用作免疫刺激表达载体的细胞中)的作用物(包括病毒和细胞内病原体)的核蛋白或细胞内非结构蛋白。因此，通过破坏包括病原体的细胞使内部抗原和细胞内抗原可接近或通过使用完整微生物使其可用于免疫诱导，获得了相对于或相比于本领域常规疫苗技术更广的作用。这些内部抗原与ISCOM制剂一起使用，并且将ISCOM技术适用作佐剂来增强对抗这些内部/细胞内抗原的CMI，导致扩大的免疫应答和免疫保护。本发明还针对使用配制ISCOM成分的不同方法(即以与破坏病原体相同的顺序或在制备最终的佐剂化疫苗时使用预形成的ISCOM基质)的疫苗生产方法。因此，本发明通过使可利用的保护性疫苗抗原的数目增加(即扩大免疫应答)和刺激CMI对疫苗进行改进。在该改进的抗原制剂中，佐剂通过增强免疫***的CMI分支和抗体介导免疫发挥关键作用。

ISCOM-经典的ISCOM是包含抗原的ISCOM颗粒，所述抗原物理性***到ISCOM结构中。术语“ISCOM”还具有更普遍的含义，包括ISCOM和ISCOM基质型制剂两者。

ISCOM基质-经典的基质颗粒是无***抗原的ISCOM。

Mari M-基质A(由皂苷级分A制成)与基质C(由皂苷级分C制成)颗粒的组合。

ISCOM免疫应答也涵盖免疫应答。

亚单位/成分是抗原、抗原部分、抗原决定簇/表位，包括任选地与糖部分连接的蛋白质/肽，即糖蛋白。

保护性免疫是指免疫保护或者免疫防御或防御。

免疫刺激包括对免疫保护的刺激。

变体(包括亚型、类型、亚血清型和血清型)是微生物/病毒的相似物种，在免疫保护中旨在包括对它们的更广的免疫应答。

疫苗抗原包括旨在诱导任何类型的免疫应答的完整微生物/病毒、亚单位、抗原决定簇、表位等。

作用物包括微生物的任何类型的微生物/病毒产物，如毒素和变应原。

免疫防御包括防御。

交叉保护是指对类似种类的微生物/病毒的其他变体、亚型、类型、亚血清型和血清型的免疫保护，常规疫苗不通过免疫保护覆盖它们。

鉴定可通过例如血清学检测或核苷酸分型或任何其他现有方法来进行。

病原体是指任何类型的微生物/病毒的部分，例如毒素或变应原。

寄生生物可包括任何类型的微生物/病毒，例如，病毒是细胞内寄生生物。

内部/细胞内是指病毒、微生物、细菌细胞、真核细胞(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞)中的成分。

应答者是对免疫/接种应答的个体，而不应答者是对免疫/接种不应答的个体。

破坏包括分解或者表示破坏细胞或病毒膜或拆开病毒或细胞的任何词。

扩大的免疫应答是指与常规疫苗制剂相比，其包括类似种类的微生物/病毒的其他变体、亚型、型、亚血清型和血清型，在免疫保护中旨在包括对它们的更广的免疫应答。

附图说明

图1.初次免疫后基质M和ISCOM配制的狂犬病疫苗已诱导IgG1和IgG2两种亚类型的高效价抗原特异性抗体。1A.IgG1，初次应答。1B.IgG2a，初次应答。基质M由83％的基质A和17％的基质C组成。

图2.与相应的无基质M的制剂相比，基质M和ISCOM配制的狂犬病疫苗诱导更高效价的抗原特异性IgG2a抗体。2A.IgG1，二次应答。2B.lgG2a，二次应答。基质M由83％的基质A和17％的基质C组成。

图3.用基质M佐剂化疫苗初次免疫后已在小鼠中检测到病毒中和(ELISA)血清抗体应答，并在加强后进一步增强。3A.初次应答。3B.加强后的二次应答。基质M由83％的基质A和17％的基质C组成。

图4.灰狐中狂犬病毒中和抗体效价(OIE批准的血清中和测试)。在第0天和第28天，给每组八只2-4岁的狐接种：(组1)WRV+AI(OH)3；(组2)WRV+基质M；(组3)市售佐剂化狂犬病疫苗(组4)未接种对照。在第0、21和42天取血清样品。基质M由83％的基质A和17％的基质C组成。

图5.用于小鼠免疫的(A)完整狂犬病毒(WRV，Whole Rabies Virus)和(B)分解的狂犬病毒(DiRV，Disintegrated Rabies Virus)抗原制剂在SDS-PAGE中的蛋白质谱。5A.Pitman Moore毒株的WRV。5B.TS80毒株的DiRV。

图6.用有(泳道3和5)和没有(泳道2和4)基质M佐剂的WRV(泳道2和3)或DiRV(泳道4和5)免疫的小鼠血清的Western印迹分析。6A，针对Pitman Moore毒株的WRV的印迹。6B，针对TS80毒株的印迹。基质M由83％的基质A和17％的基质C组成。

图7.添加或未添加基质M的狂犬病毒疫苗的IgG1和IgG2a应答。7A，初次IgG1应答。7B，初次IgG2a应答。基质M由83％的基质A和17％的基质C组成。

图8.添加或未添加基质M的狂犬病毒疫苗的IgG1和IgG2a应答。8A.IgG1，二次应答。8B.IgG2a二次应答。基质M由83％的基质A和17％的基质C组成。

图9.用基质M佐剂化疫苗初次免疫已在小鼠中检测到病毒中和(ELISA)抗体应答，并在加强后进一步增强。9A.初次应答。9B.二次应答。

图10.对WRV或DiRV(有或无基质M佐剂)接种的小鼠的脾细胞进行再刺激后的IL-2应答。用DiRV或基质M佐剂化的DiRV、WRV或基质M佐剂化的WRV皮下免疫BALB/c小鼠两次。在第二次免疫后第14天收集脾细胞，用纯化的狂犬病毒N蛋白或WRV再刺激72小时。用CBA(流式珠阵列(cytometric bead array))在测量脾细胞上清液中的IL-2。

图11.对WRV或DiRV(有或无基质M佐剂)接种的小鼠的脾细胞进行再刺激后的IFN-γ应答。用DiRV或基质M佐剂化的DiRV、WRV或基质M佐剂化的WRV皮下免疫Balb/c小鼠两次。在第二次免疫后第14天收集脾细胞，用纯化的狂犬病毒N蛋白或WRV再刺激72小时。用CBA(流式珠阵列)在测量脾细胞上清液中的IFN-γ。

图12.对WRV或DiRV(有或无基质M佐剂)接种的小鼠的脾细胞进行再刺激后的IL-4应答。用DiRV或基质M佐剂化的DiRV、WRV或基质M佐剂化的WRV皮下免疫Balb/c小鼠两次。在第二次免疫后第14天收集脾细胞，用纯化的狂犬病毒N蛋白或WRV再刺激72小时。用CBA(流式珠阵列)在测量脾细胞上清液中的IL-4。

图13.对WRV或DiRV(有或无基质M佐剂)接种的小鼠的脾细胞进行再刺激后的IL-5应答。用DiRV或基质M佐剂化的DiRV、WRV或基质M佐剂化的WRV皮下免疫Balb/c小鼠两次。在第二次免疫后第14天收集脾细胞，用纯化的狂犬病毒N蛋白或WRV再刺激72小时。用CBA(流式珠阵列)在测量脾细胞上清液中的IL-5。

图14.在一次(A、C)或相隔4周的两次(B、D)皮下免疫后，Balb/c小鼠对有或无基质M佐剂的D-Flu抗原的抗体应答(ELISA)。A和B，初始和第二IgG1应答。C和D，初始和第二IgG2a应答。针对疫苗中的H1N1成分(A/New Caledonia/20/99)测量抗体应答。基质M由90％的基质A和10％的基质C组成。

图15.基质M对用RSV免疫的佐剂作用，血清中VN抗体水平增加。用1μg(实心圆)或5μg(实心正方形)基质M佐剂化的DiRSV免疫Cotton大鼠。基质M由83％的基质A和17％的基质C组成。包括两个对照组；顶部朝上的三角形表示第0天感染了活病毒，顶部朝下的三角形为在第46天攻击前未处理的对照组。

图16.基质M佐剂化DiRSV通过在上呼吸道和肺中减少病毒复制在Cotton大鼠人RSV模型中诱导免疫保护。灰色实心正方形表示鼻清洗液中的应答，而带点正方形表示肺灌洗液中的应答。

图17.在离体人DC模型中用基质M佐剂刺激后CD83细胞的比例(％)。用200、100和10mg基质A；10、1和0.1mg基质C和100、10和1mg基质M刺激细胞。基质M由87％的基质A和17％的基质C组成。

图18.在离体人DC模型中用基质佐剂刺激后CD86细胞的比例(％)。用200、100和10mg基质A；10、1和0.1mg基质C和100、10和1mg基质M刺激细胞。基质M由87％的基质A和17％的基质C组成。

图19.处理老年志愿者的单核细胞后的CD83阳性细胞比例(％)(见材料和方法)。N＝10名老年个体。

第0天未处理的单核细胞

iDC用GM-CSF和IL-4培养单核细胞5天后获得的未成熟的DC

MMD 1.0基质M 10μg+DiRSV 1μg

MMD 0.5基质M 10μg+DiRSV 0.5μg

LPS使用1μgLPS作为阳性对照

培养基培养基对照

图20.处理老年志愿者的单核细胞后的CD86阳性细胞比例(％)(见材料和方法)。N＝10名老年个体。

第0天未处理的单核细胞

iDC用GM-CSF和IL-4培养单核细胞5天后获得的未成熟的DC

MMD 1.0基质M 10μg+DiRSV 1μg

MMD 0.5基质M 10μg+DiRSV 0.5μg

LPS使用1μg LPS作为阳性对照

培养基培养基对照

图21. ISCOM佐剂化的新孢子虫(Neospora)疫苗制剂在小牛中诱导强抗体应答。通过在第11周用活新孢子虫感染来攻击所有动物。

组A-在第0天用活新孢子虫静脉内免疫小牛。

组B-在第0天和第42天，用与基质Q配制在一起的500mg分解的新孢子虫皮下免疫小牛。

组C-在第042天用500mg分解的新孢子虫皮下免疫小牛。

组D-仅给予750mg基质Q的对照小牛。

组E-给予PBS(疫苗稀释剂)的对照小牛。

图22.ISCOM基质佐剂化的新孢子虫疫苗制剂在小牛中诱导强IFN-γ应答，其不被后续感染下调。

组A-在第0天用活新孢子虫静脉内免疫的小牛。

组B-在第0天和第42天，用与基质Q配制在一起的500mg分解的新孢子虫皮下免疫小牛。

组C-在第042天用500mg分解的新孢子虫皮下免疫小牛。

组D-仅给予750mg基质Q的对照小牛

组E-给予PBS(疫苗稀释剂)的对照小牛

图23.用基质Q或Al(OH)3佐剂化S.A.菌苗(完整的死细菌)免疫的小母牛血清(A)和乳(B)中的平均IgG水平的动力学。分别以1/5000和1/500用PBS稀释血清样品和乳清用于ELISA。

图24.用两种不同制剂(S.A.菌苗和S.A.裂解物)接种的实验组的平均IgG血清效价的动力学。包括给予安慰剂(疫苗稀释剂)的组。分析抗菌苗(图24A)或细菌裂解物(图24B)的血清。

发明详述

本发明揭示了除致病微生物(病原体)的外部暴露抗原外的内部抗原，并通过使用ISCOM基质制剂使其有免疫原性。所述病原体可以是完整的(完整的微生物，包括病毒)或分解的微生物。实施例显示分解使隐藏的抗原显露。因为小量的抗原足以诱导免疫应答，与ISCOM制剂(例如ISCOM或ISCOM基质)一起的“隐藏”抗原被识别。

除非存在本发明佐剂，否则完整的微生物不会将内部抗原暴露给免疫***引发免疫应答。认为由于小比例的微生物自发分解使少量的抗原(也许会)显露。在实施例7b中，显然的是分解显露出金黄色葡萄球菌(Staphylcoccus aureus)的内部抗原，但如果使用完整菌苗而非分解的细菌，ISCOM制剂也提高免疫应答。

本发明涉及包含至少一种ISCOM复合物和至少一种内部抗原的组合物，所述内部抗原不是表面抗原。

根据一个实施方案，内部抗原不是完整微生物之部分的形式。

根据另一实施方案，内部抗原是完整微生物的形式。因此，本发明还涉及完整病原体，其中与现有疫苗相比，ISCOM复合物相当大地增加完整病原体/微生物的免疫原性，包括增强内部抗原激发免疫应答的能力。

内部抗原可包括(一种或多种)核蛋白、聚合酶，或者它可以是完整微生物分解后获得的成分组的成员。

因此，本发明的组合物可包含完整或分解的完整微生物和至少一种ISCOM复合物。这种完整微生物的分解浆含有并显露内部抗原性成分，其可以是蛋白质、蛋白质部分或包含与蛋白质连接的糖的糖蛋白。

内部抗原可以是纯化的内部抗原，其不是表面表位或表面抗原，而且不是具有表面表位的膜蛋白。内部抗原可以是从微生物表面无法获得的抗原。它可以是膜蛋白面向内侧的抗原性部分。

可以用酶、去污剂、增溶剂或通过物理力(例如通过压力法或机械法(例如用珠，例如重金属珠或小玻璃珠)、高压法或超声法)进行分解。用于分解的有用的增溶剂的例子在下文中提及。

分解常规地用于流感病毒的制剂以消除部分归因于高水平IFN-y的副作用，例如头痛、肌肉痛和恶心。在本发明中，目的不是对流感病毒描述的那样，而是另一作用安全，即分解病原体是通过杀死感染性颗粒来阻止增殖的最安全的方式。此外，有方法证实微生物/病毒的悬液中不存在完整颗粒，例如通过显微镜检查en EM(电子显微镜检查)。

本发明还涉及包含一种或多种分解的微生物浆和至少一种ISCOM复合物的组合物。

可使用与药用相容的或用于疫苗的增溶剂并且其在掺入后不需要除去。

因此，本发明还涉及组合物，其中至少一种内部抗原是用增溶剂分解微生物后获得的成分组的成员。这是包含至少一种增溶剂、至少一种分解型的微生物和至少一种ISCOM复合物的组合物。

本发明还包括其他添加的抗原，例如rDNA或合成生产的抗原或可被添加入组合物的任何上述抗原。

可在分解后将组合物中的增溶剂稀释2-100倍以生成适合的疫苗组合物。

ISCOM和ISCOM基质是组合物中的佐剂成分。

根据一个实施方案，ISCOM复合物是包含至少一种皂苷、至少一种脂质和至少一种类型的抗原物质的ISCOM。所述脂质至少是固醇如胆固醇，并且还任选地为磷脂酰胆碱。该复合物还可包含一种或多种其他免疫调节(佐剂活性)物质，并可如EP 0109942B1、EP 0242380B1和EP0180564B1所述来生产。此外，可使用转运抗原(transport antigen)和/或过客抗原(passenger antigen)，如EP 9600647-3(PCT/SE97/00289)所述。

在本发明的另一实施方案中，免疫原性复合物构成ISCOM基质复合物，并且所述ISCOM基质复合物与旨在引发针对所包含的抗原的特异免疫应答的一种或多种抗原一起使用，和/或所述ISCOM基质复合物和抗原是独立的实体(单位)，旨在以混合物施用或分别施用。ISCOM基质包含至少一种糖苷和至少一种脂质。所述脂质至少为固醇如胆固醇并且还任选地为磷脂酰胆碱。ISCOM复合物还可包含一种或多种其他免疫调节(佐剂活性)物质(不一定是皂苷)，并且可如EP 0436620B1所述生产。

ISCOM制剂或其成分(即皂苷和脂质(例如磷脂和胆固醇))可在分解的过程中或分解完成后添加。

ISCOM基质制剂可作为完全佐剂制剂(即ISCOM基质)添加。

佐剂成分优选皂荚树皂苷(quillaja saponin)，粗制备物或不排除其他皂苷(如人参皂苷或其级分，例如其他佐剂分子例如LPS/脂质A)的纯化级分。

皂苷选自皂荚树(Quillaia saponaria Molina)级分A、级分B、级分C，皂荚树的粗级分例如spicoside、级分Q、VAC、QA 1-23。当如本文中所述制备时，皂荚树的级分A、B和C每个代表具有可定义属性的化学上紧密相关分子的组或家族。获得它们的层析条件使得洗脱谱和生物活性的批间重复性高度一致。

术语“皂荚树的一种皂苷成分”在本说明书和权利要求书全文中用作以下的一般性描述：皂荚树的半纯化或确定的皂苷级分或基本纯的级分。重要的是，所述级分不以下述方式包含任何其他级分，即所述其他级分多到足以对使用基本包含一种级分的ISCOM或ISCOM基质混合物时所获得的良好结果有不利影响。如期望，皂苷制剂可包含小量(例如，多至40wt％，例如多至30wt％、多至25wt％、多至20wt％、多至15wt％、多至10wt％、多至7wt％、多至5wt％、多至2wt％、多至1wt％、多至0.5wt％、多至0.1wt％)的其他化合物如其他皂苷或其他佐剂物质。

WO 96/11711中描述了本发明的皂苷级分A、B和C，EP 0436620描述了B3、B4和B4b级分；EP 03632279B2描述了级分QA1-23。可使用EP 03632279B2的级分QA-1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20-21、22和23，尤其是QA-7、17-18和21。按照EP 03632279B2(尤其是第6页和第8和9页中实施例1)所述来获得它们。

可使用来自皂荚树的任何类型的皂苷粗级分。皂荚树的粗级分是基本无其他非皂苷成分的皂荚树的任何皂苷级分。此外，可使用通过选择或除去确定物质获得的部分纯化皂苷级分。也可使用Quil A的反相级分。可通过现代分离技术(例如，层析法或提取方法)来生产其中皂苷彼此之间不分离的这种粗级分。来自皂荚树的粗皂苷级分的例子为级分Q和Q-VAC和Spicoside和包含级分A、B和C并基本无其他非皂苷物质的任何级分；包含QS 1、2、3直至QS23(也称为QA 1-23)并基本无其他非皂苷物质的任何级分。Q-VAC是可购得的(Nor-Feed，AS Denmark)，皂荚树spicoside也是。WO 9003182和K Dalsgaard：Saponin Adjuvants III，Archiv fur die Gesamte Virusforschung 44，243-254(1974)中描述了皂荚树粗级分的例子。

WO 96/11711所述的级分A、B和C是从亲脂级分中制备的，所述亲脂级分这样获得：对粗皂荚树水提取物进行层析分离，并用约70％的乙腈水溶液洗脱以回收亲脂级分。随后通过半制备HPLC分离该亲脂级分，使用25％至60％梯度的乙腈酸性水溶液洗脱。本文中称为“级分A”或“QH-A”的级分是(或对应于)约39％的乙腈所洗脱的级分。本文中称为“级分B”或“QH-B”的级分是(或对应于)约47％的乙腈所洗脱的级分。本文中称为“级分C”或“QH-C”的级分是(或对应于)约49％的乙腈所洗脱的级分。

根据一个实施方案，使用皂苷的粗级分。

根据另一实施方案，皂苷的粗级分可与任何其他纯化的皂苷级分(例如上述不同皂苷级分)一起使用。

根据一个实施方案，提供了用于本发明用途的免疫原性复合物，其包含按重量计5～99％的一种级分(例如皂荚树级分A)和按重量计补至100％的另一级分，例如按照级分A和级分C的重量计的粗皂苷级分或皂荚树的级分C。

根据另一实施方案，提供了用于本发明用途的免疫原性复合物，其包含按重量计40％至99％的一种级分(例如皂荚树的级分A)和按重量计1％至60％的另一级分，例如按照级分A和级分C的重量计的粗皂苷级分或皂荚树的级分C。

根据另一实施方案，提供了用于本发明用途的免疫原性复合物，其包含以重量计70％至95％的一种级分(例如皂荚树的级分A)和按重量计30％至15％的另一级分，例如按照级分A和级分C的重量计的粗皂苷级分或皂荚树的级分C，。

在一个实施方案中，提供了用于本发明用途的免疫原性复合物，其中来自皂荚树的皂苷级分选自QA 1-22中的任一种。

在一个实施方案中，用于本发明用途的组合物包含至少两种不同的选自ISCOM复合物和/或ISCOM基质复合物的免疫原性复合物，每个单独的复合物包含来自皂荚树的一种皂苷级分，其中一种复合物中的皂苷级分不同于另一种复合物中的皂苷级分。因此，一种类型的基本纯的皂苷级分或粗皂苷级分可整合入一种ISCOM或ISCOM复合物或颗粒，并且另一种类型的基本纯的皂苷级分或粗皂苷级分可整合入另一种ISCOM或ISCOM基质复合物或颗粒。组合物或疫苗可包含至少两种类型的复合物或颗粒，每种类型具有物理整合入不同颗粒的一种类型的皂苷。

可使用ISCOM和/或基质的混合物，其中一种皂荚树皂苷级分和另一种皂荚树皂苷级分被分别整合入不同的ISCOM复合物或基质。可使用分别基于一种级分(例如，级分A)和另一种级分(例如任何粗皂苷级分或皂荚树的级分C)的含量的不同ISCOM复合物的wt％的任何组合。混合物可包含按重量计0.1至99.9、5至95wt％、10至90wt％、15至85wt％、20至80wt％、25至75wt％、30至70wt％、35至65wt％、40至60wt％、45至55wt％、40至60wt％、50至50wt％、55至45wt％、60至40wt％、65至35wt％、70至30wt％、75至25wt％、80至20wt％、85至15wt％、90至10wt％、95至05wt％、50至99wt％、60至90wt％、70至90wt％、70-99wt％、75至85wt％的包含一种皂苷级分(例如皂荚树级分A)的ISCOM复合物和对于每种ISCOM复合物区间中剩余的补至100％的另一种皂苷级分，例如任何粗级分，例如以ISCOM复合物中皂荚树级分A和C总和的含量计的皂荚树的级分C。

上述数字涉及整合进入相同的不同ISCOM或ISCOM基质复合物或颗粒的任何皂荚树皂苷级分的组合，例如级分A与级分C、B和粗级分(例如级分Q)的任一个组合。

通过组合包含不同皂荚树级分的ISCOM复合物和/或ISCOM基质复合物，可以生产毒性较低的组合物。因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的组合物在相同或不同的ISCOM复合物和/或ISCOM基质复合物中包含级分A与级分C和Q的至少一种的组合。

根据一个实施方案，在相同或不同的颗粒中使用级分A和级分C的组合。这种组合可由30～70％、80～99％、80～95％、80～92％、83～99％、83～95％、83～92％的级分A和剩余的补至100％的级分C(以相同或不同颗粒中的皂苷级分的重量计)组成。当在不同的颗粒中时，这些皂苷组合物被称为基质M。

在另一实施方案中，提供了根据本发明使用的组合物，其还包含至少一种其他佐剂。这种其他佐剂可以是来自皂荚树的皂苷级分，它可能不连接或整合入免疫原性复合物。这样的未整合入ISCOM或ISCOM基质的其他佐剂和皂苷或糖苷可被混合入组合物中。

可整合进入ISCOM或ISCOM基质的其他佐剂的例子为任何具有期望的免疫调节作用的天然或合成佐剂，例如，胞壁酰二肽(MDP，muramyldipeptide)衍生物，例如脂肪酸、取代的MDP、MDP的苏氨酰类似物；DDA、聚阴离子例如硫酸葡聚糖、脂多糖例如皂苷(除Quil A外)，(“Future prospects for vaccine adjuvants”，Warren，H.S.(1988)CRCCrit.Rev.Immunol.8：2，83-101；“Characterisation of a non-toxicmonophosphoryl lipid A”，(1987)Johnson，A.G等，Rev.Infect.Dis.9：5，5512-5516；“Developmental status of synthetic immunomodufators”，Berendt，M.J.等(1985)，Year Immunol.193-201；“Immunopotentiatingconjugates”，Stewart-Tuli，D.E.，Vaccine，85，3：1，40-44)。

内部抗原可选自微生物中的内部成分，所述微生物如病毒、细菌、寄生生物、酵母细胞、真核细胞(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞)。

细菌的例子为，例如埃希氏菌(Escherichia)、葡萄球菌(Staphylococci)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和凝固酶阴性的葡萄球菌)、链球菌(Streptococci)(例如，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和***链球菌(Streptococcus uberis))、嗜血杆菌(Haemaophiius)(例如流感嗜血杆菌(H.influenzae))、博德特氏菌(Bordetella)(例如，百日咳博德特氏菌(B.pertussis))、弧菌(Vibrio)(例如，霍乱弧菌(V. cholerae))、沙门氏菌(Salmonella)(例如，伤寒沙门氏菌(S.typhi)、副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi))，优选大肠杆菌粘着因子(例如，pili K 88)以及例如沙门氏菌的孔蛋白或来自百日咳博德特氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白。

具有包膜的可用病毒的例子为正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如甲、乙、丙型流感病毒，RSV)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(尤其是麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感1、2、3和4病毒、犬瘟热病毒和牛瘟病毒)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(尤其是狂犬病毒)、逆转录病毒科(Retroviridae)(尤其是猫白血病病毒和牛白血病病毒)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(尤其是伪狂犬病毒、狂犬病毒，例如蝙蝠Lyssa病毒例如Duvenhagen毒株)、狂犬病内部N和P蛋白)、冠状病毒科(Coronaviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)(例如EEE.WEE.VEE(东方、西方和委内瑞拉马脑炎、黄热病病毒(尤其是牛病毒腹泻病毒和欧洲猪瘟病毒))、沙粒病毒科(Arenaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、虹彩病毒科(Iridioviridae)尤其是非洲猪瘟病毒，和未分类病毒以及马尔堡病/埃博拉病毒(Marburg/Ebola virus)。

具有非疏水蛋白的无包膜病毒的例子为小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如，***病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒)、腺病毒科(Adenoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)(例如，猫瘟疫病毒(feline pest virus)和猪细小病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，轮状病毒(Rotavirus)、圆环病毒(Circovirus))。支原体的例子是肺支原体(M.pnemoniae)、丝状支原体(M.mycoides)、牛支原体(M.bovis)、猪嗜血支原体(M.suis)、口腔支原体(M.orale)、唾液支原体(M.salvarium)、人型支原体(M.homtnis)和发酵支原体(M.fermentans)。

根据本发明可使用的寄生生物的例子为原生动物(Protoza)，例如弓形体(Toxoplasma)(例如，弓形虫(Toxoplasma gondii))、疟原虫(Plasmodium)(例如，间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫)、Teileriaparvum ovale和丝虫科(Filaroidae)(优选副丝虫属(Parafilaria)和盘尾属(Onchocerca))、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、微粒孢子虫属的(anaplasma)各种类型、血吸虫属(Schistosoma)(例如，埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、曼森氏裂体吸虫(Schistosomamansoni)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum))和锥虫属(Trypanosoma)，例如冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)、布氏锥虫(Trypanosoma brusei)或刚果锥虫(Trypanosoma congolesi)和犬新孢子虫(Neospora caninum)。

根据一个实施方案，内部抗原源自RSV病毒、狂犬病毒、流感病毒、新孢子虫(Neospora)或金黄色葡萄球菌。

根据另一实施方案，抗原是分解的完整细胞的形式，例如来自RSV病毒、狂犬病毒、流感病毒、新孢子虫或金黄色葡萄球菌，其可存在于用于分解的介质中，所述介质可按本文所述进行稀释。

根据另一实施方案，抗原隐藏于完整微生物中。因此，组合物还可进一步包含完整的微生物，其可为活和减毒的。这些微生物没有分解。

根据一个实施方案，抗原为完整细胞的形式，例如来自RSV病毒、狂犬病毒、流感病毒、新孢子虫或金黄色葡萄球菌。

内部抗原可被整合入ISCOM复合物、与ISCOM基质复合物混合或与ISCOM复合物混合或与ISCOM复合物或ISCOM基质复合物偶联。当内部抗原或完整微生物与ISCOM复合物混合时，ISCOM复合物可包含另一种抗原，其可以但不一定必需为内部抗原，并且可以是表面抗原。

本发明还涉及狂犬病毒内部抗原(例如N和P蛋白)、有或无增溶剂(其可被稀释)的分解的狂犬病毒细胞以及可以是减毒的完整狂犬病毒的的用途。这些可按照上述与ISCOM或ISCOM基质混合或整合入ISCOM复合物。任选地，用于抗原生成的细胞(例如昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9))表达疫苗抗原，例如，狂犬病毒的核蛋白(NP，nucleoprotein)非结构(NS，non-structural)蛋白。

本发明的组合物还可包含非内部抗原。这些可以是暴露于微生物表面的膜蛋白和决定簇。

组合物还可包含一种或多种添加剂，例如可药用赋形剂、载体和/或稀释剂。

药物组合物和疫苗制剂是本领域中技术人员公知的。合适的可药用载体和/或稀释剂包括任何或全部常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。这些介质和试剂在药物活性物质中的使用是本领域中公知的，并且例如在Remington ′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Pennsylvania，USA中描述。除与活性成分不相容的任何常规介质或试剂外，其在本发明药物组合物中的使用均被考虑。补充活性成分也可整合入组合物中。

本发明还涉及用作免疫刺激药物或疫苗的包含至少一种ISCOM复合物和至少一种内部抗原的组合物，所述内部抗原不是表面抗原。因此，本发明涉及本文所述组合物在制备免疫刺激药物或疫苗中的用途。组合物可被用于引发包括CTL应答的T细胞应答。另外，所述组合物用作低反应者的免疫刺激药物或疫苗。低反应者可为病人、老年人或青少年。

已发现本发明的组合物刺激免疫***的两个分支。因此，不仅激发免疫球蛋白(例如，IgG)的B细胞来源的免疫应答被刺激。而且来自T细胞的免疫应答被例如IL-2的产生触发，同样例如I FN-γ的产生触发TH1型细胞，以及例如IL-4和IL-5的产生触发TH1型细胞。

本发明还涉及制备包含至少一种ISCOM复合物和至少一种内部抗原的组合物的方法，所述内部抗原不是表面抗原并且不是完整微生物之部分的形式，其特征在于在不去除任何细胞成分的情况下将皂苷、胆固醇和脂质与细胞和增溶剂的裂解细胞悬液相混合，然后除去或稀释增溶剂。

组合物可用于施用给任何类型的哺乳动物，例如人或动物物种。可施用根据本发明制剂的动物物种的例子为伴侣动物，例如猫、狗、马、鸟(例如鹦鹉)，经济重要物种，例如家畜(例如牛物种、猪、绵羊、山羊)。

组合物可作为免疫调节或免疫刺激药剂或疫苗用于预防性治疗。因此，例如ISCOM基质可被用作例如用于年老者的免疫调节剂。ISCOM基质和抗原一起或者ISCOM可用作例如用于年老者的疫苗或免疫调节或免疫刺激剂。

组合物可作为疫苗用于感染后治疗。ISCOM基质与抗原一起或者ISCOM可用作对感染后抗狂犬病或流感的疫苗。

药物组合物可适用于口服、肠胃外或局部使用，并可以以片剂、胶囊、溶液、悬液等施用给患者。

对于肠胃外施用，本发明化合物可被掺入溶液或悬液。肠胃外施用是指不是通过消化道而通过注射经其他一些途径(如皮下、肌内)的施用。

这些制剂可包含至少0.1wt％的活性化合物。这种组合物中所含活性成分的量高至获得合适的剂量。

根据一个实施方案，至少1个国际单位(I.U.)可用于人(例如，至少约2I.U.用于人)，约0.5I.U.可用于犬(即，至少1I.U.用于犬)。技术人员将知晓如何根据体重为较大型动物调整剂量。

配制ISCOM基质的合适成分(包括皂荚树皂苷成分、脂质和去污剂)可被添加至含有抗原的分解的作用物中，或在分解之前添加。当去污剂保留皂荚树成分并除去溶解的脂质时，ISCOM基质或任选的ISCOM与整合的抗原一起形成。通过除去去污剂/分解剂或通过稀释混合物(作用物成分、去污剂/分解剂脂质和皂荚树成分)以使去污剂不能保留溶解的脂质和皂荚树成分，来完成复合物的形成。因此，完整的过程后，疫苗制剂含有具有ISCOM基质的复合佐剂制剂，但任选地也是ISCOM、ISCOM基质和包含来自被破坏作用物之疫苗抗原的成分的组合。

去污剂或增溶剂可以是但不限于非离子、离子或两性离子的去污剂或基于过量使用的没食子酸的去污剂。适合的非离子去污剂的典型例子是聚乙二醇酯和具有脂肪族或芳基脂肪族的酸和醇的聚乙二醇酯。这些的例子是具有通式CnH2n(OCH2CH2)xOH(简称CnEx)的烷基聚氧乙烯醚；在烷基和聚氧乙烯链之间含有苯环的烷基苯基聚氧乙烯醚，缩写Cn4大于Ex，例如Triton(R)X-100＝tert.-CsEg.e-(聚环氧乙烷的辛基酚醚)、芳基聚氧乙烯酯；芳基聚氧乙烯失水山梨醇酯，缩写Cn失水山梨醇Ex，例如吐温(R)20，吐温(R)80，/3-D-烷基-糖苷，例如j8-D-辛基-糖苷，辛基糖苷(OG)。也可使用下文中提到的糖苷，尤其是皂苷。然而，这些是弱去污剂，并应当与其他去污剂一起使用。合适的离子去污剂的典型例子是胆酸去污剂，例如，去氧胆酸盐和胆酸盐。甚至可使用缀合的去污剂，例如牛磺脱氧胆酸盐、甘脱氧胆酸盐和甘胆酸盐。可用的两性离子去污剂是溶血卵磷脂和合成的溶血磷脂。甚至可使用上述去污剂的混合物。

也可用醇、有机溶剂或小的两亲分子(如庚烷-1，2，3-三醇、己烷-1，2，3-三醇、乙酸、其混合物)或用去污剂进行增溶。

本发明还涉及包含至少一种用作免疫刺激或免疫调节药物或疫苗之ISCOM复合物的组合物，其用于刺激免疫低应答者，例如不健康个体、遗传缺陷个体、青少年、婴儿或年老者。本发明尤其涉及刺激这种个体的树突状细胞。可使用有或无抗原(例如，与其混合)的ISCOM基质和有抗原的ISCOM复合物对年老者进行预防性治疗、接种或感染后治疗。树突状细胞可选自CD 80、CD 83、CD 86和趋化因子CCR 7(chimocine CCR7)。年老者可选自上述物种，例如人。

本发明还涉及包含至少两个区室的试剂盒，其中一个区室包含ISCOM复合物，所述复合物包含至少一种内部抗原，其不是表面抗原并且不是完整微生物之部分的形式，并且另一区室包含使用处方，或者其中第一区室包含ISCOM基质复合物，而另一区室包含至少一种内部抗原，其不是表面抗原并且不是完整微生物之部分的形式。

试剂盒中的至少一种内部抗原可以是将微生物分解后获得的成分组的成员。

涉及本发明一方面的上文中和权利要求中所述的细节和具体情况加以必要变更对本发明的其他方面适用。

因此对于实施例，关于皂苷级分的全部细节涉及以下两者：包含至少一种ISCOM复合物和至少一种内部抗原的组合物，所述内部抗原不是表面抗原(权利要求1)，用于制备包含至少一种ISCOM复合物和至少一种内部抗原的组合物的方法(权利要求21)试剂盒(权利要求22)，以及包含至少一种ISCOM复合物(例如ISCOM基质)的组合物，其用作用于刺激年老者树突状细胞的免疫刺激或免疫调节药物或疫苗(权利要求24)。

尽管本发明联系一些公开的实施方案进行描述，本领域技术人员可预见未具体提及但仍在所附权利要求范围内的其他实施方案、变化或组合。

本文引用的全部参考文献均通过整体引用并入本文。

本文中使用的词语“包含”应被理解为包括但不限于所列出的项目。

材料和方法

动物

用狂犬病毒核蛋白进行的接种和攻击实验(实施例1A)使用CDC提供的ICR小鼠，所有其他小鼠研究使用Balb/c小鼠。

使用由Pedro A.Piedra博士(Department of Pediatrics，BaylorCollege of Medicine，Houston，Texas，USA)惠赠的Cotton大鼠(50-100克)进行呼吸道合胞病毒的接种和攻击实验(实施例2)。

使用15只来自位于INTA-Balcarce，Argentina的肉牛牧场的5月龄Aberdeen Angus小牛(由D.P. Moore1博士(Instituto Nacional deTecnologia Agropecuaria(INTA)，Argentina)惠赠)进行犬新孢子虫速殖子(tachyzoite)的接种实验(实施例6)。2000年的血清流行病学数据显示实验牛群中新孢子虫病地方流行性低，即＜1％。小牛被分配到防狗围栏中，为牛提供可自由获取的水、标准干草和市售牛浓缩饲料。

在实验中使用了处于妊娠最后三个月的12只初次妊娠的Holstein小母乳牛，其属于INTA Rafaela实验站的奶牛群(实施例7)。在预产期前约40天和14天，在乳腺上***区域对动物进行皮下注射。实验中仅包括无金黄色葡萄球菌IMI并且在预产期前40天时有正常***发育的动物。在实验过程中动物饲养于放牧条件。

病毒

狂犬病毒：在VERO中繁殖的Pitman Moore(PM)、ERA、TS80和Pasteur RIV毒株，细胞在失活无佐剂条件下获得。从药房购得市售狂犬病毒疫苗。

呼吸道合胞病毒(RSV)：Tracy毒株由Pedro A.Piedra博士(Department of Pediatrics，Baylor College of Medicine，Houston，Texas，USA)惠赠。人RS病毒(ATCC VR-26)的Long毒株由Claes Orveil博士(Huddinge University Hospital，Stockholm)惠赠。RSV在HEP-2或MA 104细胞(ECACC编号85102918)中繁殖。

寄生生物

NC-1毒株的犬新孢子虫速殖子由D.P. Moore，Instituto Nacional deTecnologia Agropecuaria(INTA)，Argentina惠赠。

在单层VERO细胞中繁殖犬新孢子虫速殖子，并在80％细胞被感染时收获。通过经21、23、25和27号针将细胞单层连续传代来从细胞中释放速殖子，随后在无菌PBS中清洗，用血球计计数，最后用于配制活接种物或用于获得分解的抗原提取物。

实验疫苗抗原的制备

完整细胞狂犬病毒(WCRV，Whole cell rabies virus)

失活的完整狂犬病毒Pitman-Moore株由Osterhaus博士(UniversityRotterdam，The Netherlands)惠赠。

狂犬病毒重组核蛋白(N)

草地贪夜蛾(Sf9)细胞单层培养(Reid-Sanden FL，Sumner JW，SmithJS，Fekadu M，Shaddock JH，Bellini WJ，Rabies diagnostic reagentsprepared from a rabies N gene recombinant expressed in bacuiovirus.J Clin Microbiol.(1990)，28(5)：858-63)。在CDC Atlanta(US)制备狂犬病Challenge Virus Standard(CVS)毒株的重组质粒。重组病毒感染的Sf9细胞在28℃下生长4天，随后通过三次冻融循环进行裂解而分解(后续部分参见N蛋白ISCOM制剂制备)。

分解的狂犬病毒(DiRV)

通过常规的蔗糖密度超速离心纯化并浓缩在VERO细胞中繁殖的狂犬病毒(ERA-CB20M或TS80毒株)。将纯化浓缩的病毒重悬于PBS。通过氨基酸分析(Aminosyraanalys laboratories Uppsala，Sweden)测量病毒抗原的浓度。用0.2％β丙内酯(BPL)杀死浓缩的狂犬病毒制备物并通过脱氧胆酸盐处理进一步分解。调节PBS中的pH至7.7，添加脱氧胆酸钠至终浓度为1.25％，添加吐温80至终浓度为0.02％。在20℃下孵育病毒3小时。使用生物测定(EVL，Utrecht，The Netherlands)，以国际单位IU定量多种病毒制备物和疫苗。

市售狂犬病疫苗

两种市售狂犬病疫苗(犬疫苗)；根据以IU测量的抗原相对含量(EVL，The Netherlands)称为“狂犬病-高”和“狂犬病-低”。纯化的狂犬病N蛋白(用于脾细胞的体外再刺激)

从TS80的分解制备物中制备狂犬病核蛋白(N蛋白)。将冷冻干燥的TS80溶于1ml ddW中，根据氨基酸分析，终浓度为2.76mg/ml(18IU/ml，6.5IU/mg)。在6℃下，以30000rpm在Centrikon T-1075超速离心机(转子55∶5)中将层叠在10％蔗糖上的病毒进行密度离心2小时。分离上清液、蔗糖梯度和沉淀。将沉淀溶于200ml PBS中。使用Bradford测定估测蛋白质浓度，纯化蛋白级分的SDS-PAGE分析表明沉淀级分中存在蛋白质。

分解的RSV(DiRSV)

收集HEP-2细胞的细胞培养物，超声处理，并通过在4℃下以4000rpm离心30分钟(Sorvall)使其澄清。保留上清液并弃去沉淀。随后在4℃下，在GSA转子(Sorvall)中以5000rpm离心24小时以沉淀上清液。将沉淀的病毒以1/500重悬于磷酸盐缓冲溶液(PBS)(包含2μg/mL抑肽酶)中，在冰上放置8小时并轻柔混合。随后再次超声处理。将浓缩的病毒上样到梯度不连续的蔗糖(10至40％重量/体积)中，并在SW55Ti转子(Beckman)中以18000rpm离心3小时。用抗F抗体(Synagys)通过Western印迹分析六种级分和沉淀，并且对病毒培养验证了含有病毒的级分。选择含有病毒和F蛋白的级分6(从上到下)和沉淀进行下一步骤。在37℃下，在轻柔旋转下用2％的b-辛基糖苷(OG)使部分纯化的病毒分解1小时(存在2μg/mL的抑肽酶)。将分解的病毒上样到梯度不连续的蔗糖(10至30％重量/体积)上，并在SW55Ti转子(Beckman)中以42000rpm离心1小时。分析5个级分中的病毒并用Western印迹分析F蛋白的存在。选择显示F蛋白高信号的第二个级分(从上到下)。用硝酸银染色的SDS-PAGE和Western印迹显示，级分具有包括大部分病毒蛋白的复杂谱，它被命名为分解的病毒(DiRSV)。它还含有细胞蛋白。

流感抗原

获取的流感病毒(H3N2)是市售非佐剂化疫苗。

活和分解的速殖子的制备

使用sephadex层析柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)通过凝胶过滤对活速殖子(2×10⁹)进行部分纯化。以1500g离心来沉淀所收集的级分。所获得的活寄生生物被用于免疫组A的动物和感染攻击。将活寄生生物进一步加工成分解的制备物。寄生生物被悬于1ml含有2mM苯甲基磺酰氟(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的10mMTris-盐酸中，并在冰浴中用超声处理(Sonifier 450，Branson UltrasonicCo.，USA)进行破坏，在4℃下以10,000g离心20分钟。用Micro BCA蛋白测定法(Pierce，Rockford，USA)测定所回收沉淀的蛋白质含量，并且将上清液等分并冷冻保存于-80℃，以备用作分解的实验疫苗和IFN-γ测定中全血细胞刺激的抗原。

实验疫苗制剂

用基质M或基质Q佐剂配制多种抗原制备物(狂犬病、RSV、流感、新孢子虫和葡萄球菌)。通过简单混合根据各个实施例中提供的表格混合适当量的疫苗抗原和基质制备物。用PBS调节终体积。使用前在+2～8℃下储存实验疫苗制剂。

ISCOM制剂(DiRV、狂犬病N蛋白、DiRSV)

根据已发表的标准技术(例如，EP 0109942B1、EP 0242380B1和EP 0180564B1)来制备ISCOM。简言之，将1mg重组狂犬病N蛋白、DiRV或DiRSV与在20％MEGA-10中制备的各1mg胆固醇和磷脂酰胆碱和适当量的各个皂苷制备物(级分A、级分C或半纯化的“Quil A)混合。通过透析除去去污剂。将这些制备物通过0.2mm滤器过滤，分析抗原和皂苷的含量。

用基质Q佐剂配制分解的新孢子虫抗原

将活速殖子重悬于PBS中并调节至3ml PBS中的1×10⁸/小牛剂量，并装入5ml无菌注射剂。活寄生生物用于免疫(组A)或第11周的感染攻击(所有组)，在从组织培养物中收获后45分钟内，在室温(RT)下在密封盒中运输到给小牛施用的围栏。将分解的速殖子混合使其含有补充了750μg基质Q的500μg新孢子虫抗原(最终给药体积为2ml)(组B)或将其悬浮在无佐剂的PBS中(组C)。

用于实施例7a的S.A.菌苗疫苗的配制

实验疫苗由金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖株组成(Reynolds)。在-80℃下冷冻保存物中保存有机体，通过在35℃下在脑心输注液中过夜孵育活化。将100μl该培养物接种在添加了2％NaCl的胰蛋白胨大豆琼脂上，并在37℃下过夜孵育。用PBS(pH 7.4)清洗培养物，重悬以达到1×10⁹集落形成单位(cfu)/ml的最终浓度，并在37℃下用0.5％***失活24小时。通过一式两份地在血液琼脂板上铺板100μl来评价该制剂的无菌性。施用基于铝的佐剂***(疫苗1)和基于皂苷的基质Q佐剂来配制疫苗。用由无菌盐溶液组成的安慰剂作为对照。

用于实施例7b的S.A.菌苗和裂解物疫苗的配制

(1)疫苗1：金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖株(Reynolds)。在-80℃下将有机体在冷冻保存物中保存，通过在35℃下在脑心输注液中过夜孵育活化。将100μl该培养物接种在添加了2.5％NaCl的胰蛋白胨大豆琼脂中，并在35℃下过夜孵育。用PBS(pH 7.4)清洗培养物两次，重悬以达到1×10⁹集落形成单位(cfu)/mL的最终浓度，并在35℃下用0.3％***失活24小时。通过在一式两份的血液琼脂板上铺板100μl来评价该制剂的无菌性。用最终浓度为2mg/剂的基质Q配制疫苗。

(2)疫苗2由在相同条件下过夜生长的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖株组成。***失活后，用PBS洗细胞两次，将细胞密度调节为1×10⁹cfu/mL，并且将1mL的培养物重悬于8mL的50mM Tris pH7.5中。添加50mM Tris pH 7.5/145mM NaCl中的溶葡萄菌素(35U，SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo)，并在37℃下在水浴中振荡(100rpm)孵育6小时。通过定期测量OD₆₀₀的吸光度来监测反应，并且在75℃水浴中失活溶葡萄菌素15分钟。冷却混合物并通过0.45μm孔径的薄膜滤器过滤以除去完整细菌。通过在两个重复的血液琼脂板上铺板100μl来评价该制剂的无菌性。用最终浓度为2mg/剂的基质Q配制疫苗。

(3)使用由无菌盐溶液加基质Q(2mg/剂)组成的安慰剂作为对照。基质和ISCOM制剂的表征

使用电子显微镜(负染EM，动态光散射(DLS)或蔗糖密度梯度离心表征ISCOM/基质制备物。

已描述了基质M(WO 2004004762)，其中在物理上不同的ISCOM基质复合物颗粒中，组合物包含基于Quil A的级分A和C的ISCOM基质，Quil A的基质Q粗级分(WO 9003184)由Isconova AB提供的。

抗体应答分析

使用N-BV或完整狂犬病毒的抗原通过间接ELISA测定针对狂犬病 毒的抗体(Smith JS，Sumner JW和Ruomillat LF. Enzymen immunoassay for rabies antibody in hybridoma cultuture fluids and its applicationto differentiation of street and laboratory strains of rabies virus J Clin1984；19267-272)。

实验1中使用的全部小鼠均为雌性5周龄雌性(CDC-ICR)。使用前，测试全部小鼠的狂犬病毒中和(VN)抗体；在接种时，没有小鼠具有狂犬病毒抗体或VN抗体。在实验免疫期间以两周的间收集小鼠中血液，以通过ELISA测定VN抗体和抗N蛋白。

ELISA(狂犬病)

根据标准方案，使用HRP标记的抗小鼠IgG1和IgG2a抗体缀合物进行检测IgG1和lgG2a抗体的间接ELISA。使用50mM碳酸盐(pH9.6)将抗原包被到Nunc ELISA板上。使用TMB使该酶反应显现。

狂犬病毒中和抗体

根据OIE分析灰狐血清中的VN抗体。对于小鼠血清，使用基于阻断病毒中和单克隆抗体的可选体外测试(“VN-ELISA”)。该测试是根据Rooijakkers，E.，Groen，J.，Uittenbogarrd，J.，van Herwijnen，J. &Osterhaus，A.(1996).Development and evaluation of alternative testingmethods for the in vivo NlH potency test used for the quality control ofinactivated rabies vaccines.Developments in Biological Standardization86，137-145由EVL，The Netherlands进行。

Western印迹(狂犬病)

按组合并第一次免疫接种后三周和第二次免疫接种后两周所取得的血样(来自Ex 1b(3)用于对抗原特异性抗体进行ELISA评价)并进行Western印迹分析。

使用SDS-PAGE标准方案，用10％凝胶分离完整的狂犬病毒制备物(Pitman-Moore株)和DIRV(TS80病毒制备物)。此后，将蛋白质用考马斯蓝染色或转移至PVDF膜进行Western印迹分析。将膜用含有0.025％吐温-20和5％的奶粉的PBS封闭1小时。此后，在血清中孵育膜2小时。合并每组中全部个体的血清，并以1∶30用含有0.025％吐温的PBS(PBST)稀释。清洗膜并用辣根过氧化物酶缀合(HRP)的抗小鼠IgG抗体孵育1小时(Bio-Rad 1∶3000，PBST中)。最后清洗后，使用氯萘酚一步检测试剂盒(Thermo Scientific)对印迹进行显影。在室温下在三角桌(rocket table)上进行所有孵育。

ELISA(犬新孢子虫)

间接ELISA，其用以评价犬新孢子虫特异性血清IgG以及IgG₁和IgG₂亚型

将在0.06M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中稀释的1μg溶解的犬新孢子虫速殖子抗原分配，并吸附至每个平底96孔板(Polysorp，Nunc)中。将板密封并在28℃下过夜孵育，储存于-20℃直至使用(Echaide等，2002)。一旦融化，在37℃下孵育该板45分钟。清除缓冲液并用200μl/孔的封闭缓冲液(具有4％脱脂乳(

，Argentina)的0.06M碳酸盐/碳酸氢盐)替代，并在28℃下孵育45分钟。用0.01M PBS-0.05％吐温-20(PBS-T)加4％乳将孔清洗4次。在PBS/0.75M EDTA/EGTA(pH 6.3)加4％脱脂乳中以1/100稀释阴性和强阳性对照(C++)血清以及血清样品。分配100μl每种样品，并使用上述的振荡器孵育。一式两份地包括缀合物对照(无血清)。用PBS-T洗五次后，进行二择其一的操作。为了评价总牛IgG，将100μL 1/1000稀释的缀合有过氧化物酶的抗牛IgG多克隆抗体(Sigma，USA)加入到孔中，并在振荡器上孵育60分钟。清洗4次后，添加作为底物/发色团的100μl 3％H₂O₂/0.04M ABTS(2，2′-联氮基-双3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))(Sigma，St.Louis，USA)。当犬新孢子虫C++达到1.0±25％时，在405nm的光密度(OD₄₀₅)测定动力学读数(Multiskan RC，Labsystems，Helsinki，Finland)。血清的OD₄₀₅表示为根据下式的C++相关阳性百分比(PP，percentage 0f positivity)：PP＝(平均血清OD₄₀₅×100)/平均C++OD₄₀₅。所用的临界点为≥25PP。

为了评价IgG₁/IgG₂比率，将100μl PBS-T中的抗牛IgG₁或IgG₂mAb(Serotec^TM，Oxford，UK)的1/100稀释液加入到孔中，并孵育30分钟。用两种mAb在相同的板上同时评价每种血清。清洗4次后，添加100μl1/1000稀释的缀合了过氧化物酶的抗小鼠IgG mAb

并在振荡器上孵育30分钟。清洗4次之后，添加100μl 3％H₂O₂/0.04M ABTS。对于IgG₁和IgG₂，当具有抗IgG₁的犬新孢子虫C++达到1.0±25％时，在OD₄₀₅测定动力学读数。数据表示为IgG₁的OD值与IgG₂的OD值的比率。

ELISA(金黄色葡萄球菌)

简言之，在4℃下用PBS(pH 7.2)中的抗原溶液(菌苗或裂解物)(1μg/孔)过夜包被平底96孔微滴定板。每个步骤之间，用0.05％吐温20清洗板5次。首先，在37℃下用无抗体的含有5％低脂乳的PBS孵育经包被的板1小时。一式两份地分配以PBS 1/500稀释的小母牛检测血清，并在37℃下孵育1小时，而后用1/2000稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗母牛IgG(H+L)孵育。孵育后添加酶底物。室温下10分钟后，通过添加2N H₂SO₄终止反应。读取450nm的吸光度。抗体水平表示为ELISA指数，其通过用受试血清的吸光度读数除以合并的高效价的免疫小鼠血清的吸光度读数计算。

细胞应答分析

脾细胞的体外再刺激(狂犬病)

根据表3对10～12周龄的雌性小鼠(BALB/c)进行两次免疫。第二次免疫(加强)后约两周，处死小鼠，摘除脾，并制备单细胞悬液。将脾细胞(200μl，5×10⁵细胞/孔)铺入96孔板中，并用WCRV(2.5μg/ml)、或纯化的狂犬病N蛋白(0.1μg/ml)、或Con A(阳性对照)(2.5μg/ml)或无菌的RPMI培养基(阴性对照)刺激72小时。收集上清液并存储于-70℃，以备用流式珠阵列(CBA，BD Bioscience)分析以测定细胞因子的浓度。所分析的细胞因子对于一般T细胞；白介素(IL)-2，对于Th1细胞；干扰素(IFN)-γ，对于Th2细胞；IL-4和IL-5。用FACSCanto流式细胞仪进行数据收集和分析。

细胞增殖分析

用完整的失活狂犬病毒(Ab，2.5mg/ml、0.5mg/ml和0.1mg/ml)或狂犬病N蛋白(2.5mg/ml、0.5mg/ml和0.1mg/ml)，或狂犬病G蛋白(2.5mg/ml、0.5mg/ml和0.1mg/ml)，或伴刀豆球蛋白(ConA)(作为阳性对照)(2.5mg/ml)或无菌RPMI培养基(作为阴性对照)刺激脾细胞(100ml，2.5×10⁵细胞/孔)42小时。根据制造商的操作说明(Roche DiagnosticsGmbH，Germany)使用BrdU-ELISA检测(比色法)测量细胞增殖，即DNA合成。以370nm的测试波长和492nm的参照波长用分光光度计测量吸光度。

评价细胞因子分泌、Th1/Th2免疫 应答平衡

此外，在对体内免疫小鼠的脾细胞进行抗原刺激后，在培养基中体外测量分泌的细胞因子。将脾细胞(200ml，5×10⁵细胞/孔)铺到96孔板中，并用完整的失活狂犬病毒(2.5mg/ml、0.5mg/ml和0.1mg/ml)，或狂犬病N蛋白(2.5mg/ml、0.5mg/ml和0.1mg/ml)，或狂犬病G蛋白(2.5mg/ml、0.5mg/ml和0.1mg/ml)，或ConA(作为阳性对照)(2.5mg/ml)或无菌的RPMI培养基(作为阴性对照)刺激脾细胞72小时。收集上清液并存储于-70℃，以备用流式珠阵列(CBA)测定细胞因子的浓度。所分析的细胞因子对于一般的T细胞；白介素(IL)-2，对于Th1细胞；干扰素(IFN)-g，对于Th2；IL-4和IL-5。使用FACSCanto流式细胞仪进行数据收集和分析。

犬新孢子虫特异性IFN-γ应答的评价

按照Serrano-Martinez等，(2007)的描述进行免疫刺激。简言之，将0.9ml肝素化的全血分配进24孔组织培养板(Ceilstar Greiner，USA)的两个孔的每个中，并与0.1ml PBS(未刺激的对照)、10μg/ml伴刀豆球蛋白A(Con-A，Sigma，St.Louis，USA)(以确保细胞对刺激应答和分泌IFN-γ的能力)、以及与来自犬新孢子虫NC-1株的分解抗原(1μg/ml)一起培养。在37℃下，在5％的C0₂气氛中孵育肝素化的全血样本16小时。从每个孔中收获血浆并冷冻于-20℃直到检测。为了评价IFN-γ的产生，根据制造商建议使用市售ELISA试剂盒(Bovigam IFN-γ试剂盒，CSL，Australia)检测血浆样品。

Cotton大鼠中的RSV接种和攻击

以三周为间隔(第0和21天)用基质M(24μg/剂)佐剂化的按照上述制备的DiRSV(剂量1μg或5μg，总体积200μL)免疫大鼠两次(表5)。对每只大鼠腿肌内(i.m.)注射体积为100μL的疫苗或对照(安慰剂或感染性病毒)(见下表1)。在第46天在轻度麻醉(异氟烷)下，用100μL中的10⁵PFU RSV Tracy株感染攻击除组5外的所有组的动物。

本实施例包括5个组，每组6只动物。

分析在第0、21、46和50所取的血清中的抗RSV中和抗体。在第50天，对大鼠取血并处死，以分离上呼吸道(URT)中的病毒和肺病毒。

根据标准的和已发表的方法(参见，例如，Hu等，Clin Exp Immunol113p.235，1998)进行肺灌洗(肺和URT)、病毒分离和(PFU)以及病毒中和。

新孢子虫免疫和攻击

第0天，用10⁸活速殖子静脉内接种组A，而组B至E中的动物接受2次皮下接种，第0天在颈侧部，4周后的第二次施用至另一侧。在第11周，通过静脉内接种用1×10⁸NC-1株的速殖子攻击所有小牛。将15只5月龄的Aberdeen Angus小牛随机分成5个实验组，每组3只动物，整个实验过程中每天进行观察。

用于评价基质佐剂的离体人DC模型

细胞培养和刺激

对5个成年志愿者每人收集30ml血液。通过密度梯度(Lymphoprep；Nycomed)分离PBMC，在Neubauer小室中计数，并用台盼蓝染色排除法评价其活力。根据制造商建议(单核细胞分离Kittll，Miltenyi Biotecinc.)使用磁性分离通过负性去除(negative depletion)获得纯度为90-99％的单核细胞。在37℃下在5％C0₂中，在加入10％胎牛血清、50ng/mLGM-CSF和50ng/ml的IL-4的10⁶/ml浓度的AIM-V培养基培养单核细胞。培养5天后获取未成熟的树突状细胞(iDC)。在以下的存在下进一步培养未成熟的DC 24小时：在培养基、LPS(1μg/mL)、基质-A(200μg/mL、100μg/mL、10μg/mL)、基质-C(10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL)、基质M(100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL)。此后，使用单克隆抗体进行鉴定以及通过流式细胞仪(FACscan Beckton Dickinson，San JoseCalifornia，US)定量分析DC的如下表面蛋白：CD11c、CD14、CD83、CD86和HLADR。

实施例1。通过基质M佐剂制剂和病毒颗粒分解对传统狂犬病疫苗进行质量改进

狂犬病感染是温血动物中人畜共患的致命感染。对于动物和人，可获得的唯一保护方法是接种；其为预防性的以预防疾病，或者在预期的病毒暴露后，与高免疫血清一起作为暴露后处理。在疑似狂犬病毒暴露后对动物进行暴露后处理是不允许的或不实施的。

人和动物的狂犬病疫苗是类似的，差别在于佐剂，即铝佐剂(Al(OH)₃或AlP0₃)用于大多数动物狂犬病疫苗，而人中不使用佐剂。现有的疫苗是常规的，它们主要诱导TH2型应答，并且在最近的50年中没有进展。对于狂犬病疫苗的注册和疗效评价(例如，批次许可)，仅需要并且仅进行了根据NIH测试的病毒中和抗体测试。实施例1A-D研究和证明了狂犬病毒疫苗中包含基质M诱导更广的保护性免疫应答的有益作用，(1a)还包括内抗原，例如狂犬病N蛋白；(1b)如Western印迹分析(3)和通过改进性能的两种商业上可获得的WRV疫苗(4)所证明的那样，提高小鼠(1)、灰狐(2)中抗体应答的程度和质量。

实施例1A。ISCOM制剂触发狂犬病内部N蛋白诱导的保护性免疫

设计本实施例以研究用强佐剂(例如基质M)佐剂化的病毒内部蛋白能否诱导免疫保护。使用以杆状病毒转化的昆虫细胞中产生的重组狂犬病毒核蛋白(N蛋白)(见材料和方法)，其中排除其他狂犬病毒成分的存在。以1和5μg的剂量给小鼠施用(皮下(SC)、肌内(IM)和腹腔内(IP))作为ISCOM(见材料和方法部分)疫苗配制的狂犬病N蛋白，并与25μg剂量(SC、IM)的未佐剂化N蛋白疫苗进行比较(实验的设定和结果见表1.1和1.2)。在第0和7天施用实验性疫苗进行初次免疫，这是根据NIH测试用于测试狂犬病疫苗的标准。因为初步实验表明需要25μg的剂量来根据NIH测试检测免疫保护，所以选择这样剂量的未佐剂化N蛋白疫苗。还在Balb/c小鼠(见表1.3)中测试N蛋白ISCOM的免疫原性。在第14、29、45、58和72天取血液样品获得血清。在ELISA中针对重组狂犬病N蛋白和狂犬病毒测试血清。

表1.1实验设定和对感染攻击¹的保护。用25μg未佐剂化狂犬病N蛋白免疫²小鼠。

¹第60天时，用狂犬病毒街毒(streetrabiesvirus)足垫攻击

²在第0、7和28天，根据狂犬病疫苗的NIH测试，用25μg未佐剂化狂犬病N蛋白接种CDC-ICR小鼠

表1.2实验设定。在用1和5μg ISCOM配制的狂犬病N蛋白ISCOM免疫的小鼠中对感染攻击实验的保护。

¹用狂犬病毒街毒足垫攻击

²在第0、7和28天，根据狂犬病疫苗的NIH测试接种小鼠

表1.3用ELISA在小鼠血清中测量非中和抗狂犬病抗体

¹在第0、7和28天，用1□接种²配制的狂犬病N蛋白接种Balb/c。

N-²ISCOM与上表1.2所示攻击研究中所使用的相同。

结果

用25mg未佐剂化N蛋白进行初次免疫程序(第0和7天)在SC或IM免疫后诱导的保护差(表1.1)。相比之下，初始IM免疫后14天，用1或5μg N蛋白ISCOM进行相同的初次免疫诱导完全保护(20/20小鼠)(表1.2)。SC和IP途径诱导稍低水平的保护，分别为19/20和17/20。加强之后，无论是何种施用方式，5μg N蛋白ISCOM在第一次施用后第60天对攻击诱导几乎完全的保护(表1.2)。1μg N蛋白ISCOM的剂量对第60天时的攻击的保护为约60-80％(表1.2)

在感染攻击中，未免疫的小鼠均未存活(表1.1)。

在ELISA中未检测到“经典的”病毒中和(VN)抗体(未显示)，而检测到了高水平的针对NP的抗体(表1.3)。

讨论和结论

该实施例显示，假若使用强佐剂，狂犬病毒N蛋白可诱导保护性免疫。因此，佐剂激活了另外的保护机制(除对G蛋白的病毒中和抗体之外)。N蛋白ISCOM引发保护性免疫不是由于保护性抗体应答，这是因为在攻击时N蛋白和WRV的抗体效价很低。保护性免疫必须依赖于细胞介导免疫，其最可能包括Th1和CTL应答。保护被迅速诱导的事实对于暴露后疫苗生效来说特别重要。本实施例证明，ISCOM配制后的狂犬病毒内部N蛋白可诱导快速的保护性免疫应答。因为将许可狂犬病疫苗批次的NIH测试方案用于免疫，所以未使用对ISCOM佐剂化实验疫苗最佳的免疫方案，即第0天第一剂和第4-6周加强。使用N蛋白的可能性很可能扩大保护性免疫，例如还包括对抗(B)蝙蝠Lyssa病毒(如Duvenhagen毒株)的保护。

鉴于如下原因该结果是新颖的：(I)不存在狂犬病G蛋白，(II)剂量(1～5μg)很低(与25μg的未佐剂化抗原相比)，(III)完成初次免疫后1周的时间间隔很短。此外，诱导了长期的免疫应答。

实施例1b.根据抗体应答程度和质量所衡量的，基质M改进了狂犬病毒疫苗制剂

(1)在小鼠中进行本实施例以研究基质M对表2∶1所述的不同狂犬病毒抗原制剂的有益作用。用或不用基质M或作为ISCOM配制狂犬病毒抗原WRV(完整病毒)、DiRV(分解的狂犬病毒)。结果见图1～3。用表2.1中的不同制剂在颈部皮下接种Balb/c小鼠。

表2.1用WRV或者基质M佐剂化或在ISCOM中配制的疫苗制剂进行免疫

^ATS80毒株

^BERA毒株

^pPitman Moore毒株(市售完整病毒疫苗)

¹基质M剂量(7.5mg)²皂苷含量和组成与基质M相同

结果

小鼠的第1次免疫(图1A和B)。通过ELISA(见材料和方法)来测量对狂犬病毒抗原的抗体应答(IgG1和IgG2a)。与对应常规狂犬病毒疫苗的未佐剂化WRV相比，配制成ISCOM²疫苗的DiRV一次免疫后所诱导最高抗体水平，其诱导高约50倍的IgG1效价。这两种基质M佐剂化制备物诱导比WRV约高5倍的抗体效价。更令人印象深刻的是，ISCOM和Matrix M佐剂化制剂诱导的IgG2a抗体应答达到比WRV的高约100倍的抗体水平。未佐剂化的DiRV制备物诱导中等水平的IgG1抗体和相对低水平的IgG2a抗体。

小鼠的第2次免疫(图2A和B)。所有制剂诱导类似水平的IgG1抗体，而ISCOM和基质M佐剂化制剂诱导相当高水平的IgG2a抗体(比未佐剂化的WRV或未佐剂化的DiRV高1～2log)。

小鼠的病毒中和抗体应答(“VN-ELISA”)(图3A和B)。VN抗体应答基本与IgG2a应答相同。第一次免疫之后，ISCOM和基质M佐剂化制剂诱导高水平的VN应答。第1次免疫后，WRV和未佐剂化DiRV都不诱导VN抗体。加强之后，ISCOM和基质M佐剂化制备物诱导的VN效价比WRV的高≥1log。

(2)在灰狐中进行第二个实验，以在相关目标动物物种中验证小鼠中的数据。用单独的WRV(完整的狂犬病毒)制备物或分别以Al(OH)₃和基质M佐剂化的WRV制备物免疫灰狐(见表2.2)。图4中显示本研究的结果。

表2.2用不同的实验基质M佐剂化狂犬病毒疫苗免疫灰狐

在第0和4周免疫动物，在第3和6周取血清样品。

结果

灰狐中的VN应答(根据OIE)(图4)。第一次免疫之后，用基质M佐剂化WRV免疫灰狐诱导出最高水平的VN抗体，但在加强之后最为显著，此时与市售(组3)和Al(OH)₃(组1)参照疫苗≤6相比，基质M佐剂化组的VN效价为16。灰狐中的结果支持小鼠中测得的结果。

(3)为了评价抗原制剂(即WRV或DiRV(即完整的相比于分解的病毒抗原制备物)的影响，对用WRV或DiRV(有或没有基质M)免疫的小鼠的血清进行Western印迹分析。结果见图5和6。因为WRV是Pitman More株而DiRV来自TS80株，针对从二个株(分别为A和B)中SDS分离的蛋白质测试血清。

结果、SDS-PAGE和Western印迹分析

以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析的蛋白谱

考马斯染色的WRV(图5A)和DiRV(图5B)病毒制备物表明，在两种病毒株中检测到了相同的蛋白谱，即全部5种病毒蛋白(L、G、N、P和M蛋白)(图5A和B)。

Western印迹分析

与用无基质M的WRV制剂免疫的小鼠的血清(图6A和B中泳道4)相比，用无基质M的DiRV制剂免疫的小鼠的血清(图6A和B中泳道2)检测到了更多的蛋白条带。因此，分解的病毒暴露更多刺激特异性抗体形成的蛋白(如N和P蛋白)。相比之下，在用未佐剂化的完整病毒粒免疫的小鼠中，未检测到作为内部蛋白的N蛋白或P蛋白。基质M佐剂化DiRV制剂免疫的小鼠的血清(图6A中的泳道3)未检测到另外的蛋白，即在WB中检测到得蛋白与用基质M佐剂化完整病毒颗粒免疫的小鼠的血清中检测到的(图6A中的泳道5)相似。用基质M佐剂化DiRV免疫的小鼠血清产生的图6B泳道3的印迹与用佐剂化WRV(完整病毒粒)免疫的小鼠的血清条带(图6B中泳道5)表现出类似的模式。这些结果表明，与完整病毒粒相比，未佐剂化的DiRV表现出刺激抗体应答的更多抗原。相比之下，在给病毒抗原补充了解释为强佐剂作用的基质M制剂后未检测到差异。

有趣的是，为了将免疫应答扩大到内部抗原，可使狂犬病毒分解。然而重要的是使用如基质M的强佐剂来刺激免疫***才使得对显露的抗原诱导免疫应答。可能的原因是基质M增强了小且低的狂犬病毒抗原的免疫原性。也刺激诱导对疫苗微量成分的免疫应答是佐剂的重要特征；以诱导免疫保护并节约疫苗中的抗原。

(4)在本实验中，用基质M增强两种不同的市售犬用疫苗产品。一种疫苗含有以IU(标准国际单位)衡量的大(高)量狂犬病抗原，而另一种产品含有以IU衡量的少(低)量的抗原。以两种方式施用所述疫苗；如表2.3中列出的那样1/10的犬剂量或1/10IU。结果见图7～9。

表2.3基质M佐剂化的两种犬用狂犬病疫苗制剂的比较。

高-含有3IU/剂量的疫苗

低-含有1IU/剂量的疫苗

结果

基质M极大增强小鼠对两种狂犬病疫苗的抗体应答。(图7～9)。具体而言，IgG2a和VN应答(通过封闭ELISA进行测量)被增强。添加基质M之后，抗体应答的发生也更快。第2次免疫后，在与没有基质M的相应制剂相比，两种基质M佐剂化疫苗诱导比第1次施用后更高的IgG2a和VN效价。因此，证明了剂量节省的潜力。

讨论和结论

一次(初始)免疫之后，基质M佐剂化狂犬病疫苗已经诱导高水平的抗体，包括功能保护病毒中和(VN)抗体。鉴于其用于在暴露后抑制怀疑的病毒感染这一事实，与其他疫苗相比，对于狂犬病毒快速功能性保护免疫应答更为重要。此外，免疫***的两个分支所发挥的联合免疫保护有叠加的免疫保护作用。此外，如实施例1a所示，对狂犬病毒N蛋白的免疫应答的加入扩大了免疫，以迅速诱导保护性免疫应答。

实施例1c.基质M佐剂化狂犬病毒制剂诱导小鼠中的T-辅助1(TH1)和TH2应答

在本实施例中，用添加或未添加基质M的完整狂犬病毒(WRV)或分解的狂犬病毒(DiRV)免疫小鼠后分析T细胞应答。IL-2的产生表明强的T细胞应答，IFN-γ产生是由TH1型T细胞引起，IL-4和IL-5是由TH2型T细胞产生的。IL-2和IFN-γ的联合产生是对抗病毒感染的关键Th1成分。

用表3中显示的不同制剂接种小鼠两次。第二次免疫后两周，用N蛋白或WRV再刺激脾细胞。筛选上清液中有IL-1、IFN-γ、IL-4和IL-5产生的被刺激的脾细胞。

表3.用不同的实验狂犬病毒制剂接种的小鼠中的T细胞应答

实验1b中描述TS80株的分解的狂犬病毒(DiRV)。完整狂犬病毒疫苗制备物含有Pasteur RIV株(WRV)。在PBS中稀释实验疫苗，并在颈部皮下注射给予200μl。

结果

以体外再刺激脾细胞后细胞因子产生特征来测量对实验狂犬病毒疫苗制剂的T细胞应答。

狂犬病毒N蛋白再刺激后IL-2的产生。图10清楚地证明用基质M佐剂化N-DiRV或WRV免疫的小鼠以增大的IL-2产生(用狂犬病N蛋白体外再刺激脾细胞后检测到的)进行应答，这证明用基质配制的DiRV和WRV两者均对狂犬病N蛋白诱导强T细胞应答。

完整狂犬病毒(WRV)再刺激后的IL-2的产生：用WRV再刺激脾细胞后获得以通过IL-2产生测量的类似结果(图10)。

狂犬病毒N蛋白再刺激后IFN-γ的产生：与IL-2的产生类似，很明显地证明用狂犬病N蛋白再刺激脾细胞之后，检测到基质M佐剂增强DiRV和WRV对IFN-γ产生的诱导(图11)。

狂犬病毒N蛋白或完整狂犬病毒(WRV)再刺激后Th2细胞因子IL-4和IL-5的产生。用狂犬病毒的N蛋白或WRV再刺激之后，基质M不增强IL-4或IL-5的产生(图12和13)。相反，与用基质M佐剂化制剂接种的小鼠相比，在用N蛋白或WRV再刺激之后，用未佐剂化DiRV或WRV接种的小鼠却产生稍高水平的IL-4和IL-5。

讨论和结论

基质M增强对WRV和DiRV病毒制剂两者的细胞介导TH1免疫应答，这由Th1/Th2比率反映。尽管注意到了增强的血清IgG1应答(见实施例1b(1)，细胞的TH2型应答不被基质M佐剂所增强。WRV和DiRV病毒制剂两者均引发高水平的抗体和细胞介导的免疫应答，其水平远高于现有的狂犬病疫苗所诱导的应答，并且高于预期。免疫应答的两个分支都是优化免疫保护以预防和在暴露后免疫治疗狂犬病毒感染的关键组分。

结论：Th1应答促进对病毒感染的免疫是公认的。因此，具有WRV和DiRV的两种实验性基质M制剂诱导比目前市售的狂犬病毒疫苗所诱导的免疫应答更强的对狂犬病毒抗原的免疫应答。

实施例2

设计该实验以研究在小鼠模型中基质M对市售分解的未佐剂化流感疫苗(D-FLU)的增强作用。考虑了免疫应答的水平、质量和抗原节约。此外，免疫应答的持续时间是另外的重要因素。

抗原和实验设计使用市售三价分解流感(D-Flu＝分解的Flu)疫苗作为抗原来源。表4中显示在小鼠中的实验设计。以人类剂量的1∶30的倍数减少小鼠抗原剂量，这是在小鼠中测试人疫苗的标准。此外，使用进一步降低至1∶300的剂量来研究使用基质M佐剂的抗原节约作用。

小鼠、免疫和取样：按照表4所示免疫18g的雌性Balb/c小鼠。在第0和4周皮下免疫小鼠。在第3和6周取血样用于测试。图14(A～D)中显示第3和6周时IgG1和IgG2a亚型的抗原特异性抗体应答。

表4.用市售流感疫苗和以基质M配制的相同疫苗皮下免疫的Balb/c小鼠的免疫实验设计。

^＊基质M制剂由90％ug基质A和10％基质C的混合物组成。

结果

一次皮下免疫之后，用基质M配制的30倍降低的人疫苗剂量(1.5μg)免疫的小鼠有明确的IgG1和IgG2a抗体应答。以市售的D-FLU疫苗制剂单独免疫的小鼠无IgG2a抗体应答，并且基本没有可检测水平的IgG1。以单独的或用基质M配制的300倍降低的人剂量(0.15μg)免疫的小鼠需要两次免疫来产生可检测的抗体应答。然而两次免疫后，基质M配制的D-FLU疫苗诱导高抗体水平，该水平几乎与10倍更高剂量的一样高(IgG1和IgG2a分别为93％和91％)，而单独的市售疫苗仅刺激较低水平的IgG1抗体，为基质佐剂化组的73％和65％，并且没有IgG2a抗体。在免疫小鼠中未记录到副作用。

讨论和结论

常规疫苗诱导低水平的抗体，即使以比基质M佐剂化D-FLU高10倍的剂量也是如此。总之，市售疫苗诱导低质量的免疫应答。该低水平在第一次免疫时尤其明显，此时市售疫苗制剂不诱导可检测的抗体应答。在未在之前接种或感染流感病毒的个体中，具有良好质量的免疫应答的早期应答是重要的，因为在该情况下，特别是年幼的儿童有对流感病毒天然感染发生非常严重的疾病的风险。基质M佐剂化的实验性疫苗只需低剂量来产生高水平和高质量的抗体不仅对快速应答是重要的，而且最重要的是还对抗体节约，降低生产成本和增加生产能力是重要的。对市售疫苗的低质量应答表现为缺乏IgG2a。因此，基质M配制的D-FLU引起市售疫苗质量的出乎意料的增加。在保护作用、免疫应答的持续期间需要每年重新接种和免疫应答的质量方面，现有FLU疫苗的质量不佳有大量纪录。除了幼童，现有市售流感疫苗的免疫原性较差的缺点在年老者中尤其显著。本实验证明，基质M佐剂化疫苗可满足如下未满足的需要：(I)抗体应答的质量、水平和持续时间，以及在未经免疫个体中的早期作用。实施例3-以基质M佐剂化的分解的实验RSV疫苗在cotton大鼠中诱导强免疫保护

呼吸道合胞病毒(RSV)在人中以及尤其是在婴儿和年老者中引起疾病，该疾病可以是严重的。到目前为止尚没有疗法或疫苗。

在该实验中，基质M佐剂化的分解的RSV(DiRSV)疫苗被证明在cotton大鼠中诱导高质量的免疫应答，包括病毒中和抗体和免疫保护作用，其通过肺和上呼吸道中病毒复制的显著降低而测量。选择cotton大鼠用于攻击研究，其是预测疫苗的人用潜力的可接受人感染模型。

实验设计

在第0和21天，以1μg或5μg剂量的基质M(24μg/剂量)佐剂化DiRSV(总体积为200μL)两次免疫cotton大鼠。在每个大鼠腿中肌内(i.m.)注射100μl体积的疫苗或对照(安慰剂或感染性病毒)(见表5)。，在第46天，在轻度麻醉(异氟烷)下，用100μL中10⁵PFU剂量的RSVTracy株感染攻击除第5组动物外的所有组的动物。

表5.用基质M佐剂化的分解的RSV(DiRSV)疫苗或对照免疫和攻击cotton大鼠的方案

在第0、21、46和50天，取血清用于抗RSV中和抗体分析。在第50天，对大鼠取血并处死以在上呼吸道(URT)和肺中分离病毒。

结果

在任何接种动物中都没有记录到局部或全身的副作用。

血清学应答：在每组的全部动物的血清样品中测量病毒中和(VN)抗体。一次免疫之后，组4中感染的动物以最高水平的血清VN抗体作出应答，该水平甚至在感染攻击后49天中几乎未改变。用1和5μg剂量的基质M佐剂化DiRSV免疫的动物在第21天以VN效价做出应答，较高的剂量诱导更高抗体水平。第21天的第二次免疫之后，VN抗体水平增加，并在第45天的感染攻击过程中和之后保持该水平。感染攻击后这些组中没有检测到回忆应答(图15)。

通过在上呼吸道和肺中分离病毒测量免疫保护，表示为洗鼻液和肺灌洗液中的PFU(图16)。较高剂量的DiRSV基质M制剂在肺中诱导的保护性免疫应答与感染所诱导的应答(即，与未免疫动物中的病毒排出相比，感染攻击后病毒排出降低260倍)程度相同。在URT中，病毒复制降低约50倍(与非免疫的动物相比)。人RSV感染之后的严重症状是由肺中的病毒复制所引起的。

讨论和结论

RSV感染在所有年龄段中均引起呼吸道感染，但在婴儿和年老者中感染通常变得严重并引起发病和偶发的死亡。没有直接靶向病毒感染的疗法。如我们目前所知，预防必须依赖于接种。然而，目前没有用于人的对抗RSV感染的疫苗。在兽医领域有疫苗，但其效力很低并且不常使用。有效RSV疫苗的开发很繁杂，超过50年的研究并没有获得保护性疫苗。认为与产生IFN-γ的T细胞平衡的Th1/Th2应答是进行病毒清除的重要特性。使用“经典的”RSV-ISCOM(整合的RSV抗原)的早期的研究表明，仅有黏膜(在此情况下是鼻内)免疫而非肠胃外免疫能够在肺和URT中诱导高水平的黏膜RSV特异性抗体应答(IgA应答)(Hu等ClinExp Immunol 1998，Chen等J of Immunol 2002，综述见Hu等；AdvDrug Deiiv Rev 2001)。预计黏膜免疫应答对RSV感染施加极佳的保护作用。在本实施例中，证明了基质M在RSV疫苗中作为佐剂的潜力。用基质M佐剂化DiRSV疫苗进行肌内免疫诱导血清中测得的高水平病毒中和抗体，并且最重要的是，感染攻击后肺和呼吸道中病毒复制的大大降低。cotton大鼠是用于人RSV感染的可接受的模型。因此，肺中观察到的保护作用是显著的，尤其是考虑到病毒在肺中复制引起严重疾病这一事实。因为仅5％的DiRSV抗原构成保护性的F蛋白，分解所暴露的其他病毒抗原很可能促进了免疫保护。基质M佐剂化DiRSV疫苗可能满足对强RSV疫苗的未满足需求。

实施例4-评价基质佐剂的离体人模型

在人用疫苗的开发中，在天然宿主(即人)中测试疫苗或其成分是无法接受的。因此，使用多数不是天然宿主模型(一个例外是狂犬病毒疫苗)的动物模型，因而这些模型具有局限性。在此，通过使用离体模型来研究免疫应答的起始引入了新构思以获取用于开发人疫苗的信息，特别是关于佐剂作用的知识。由此获得有价值的信息，缩短需要这种信息以确定人用或任何其他物种使用的制剂的途径(捷径)。

在本实施例中，在人未成熟树突状细胞(iDC)中分析的基质M的作用，iDC是人中免疫应答起始的主要作用物。未成熟的树突状细胞(iDC)摄取并加工抗原，随后它们迁移至引流***，其中已成熟的DC将加工的抗原呈递至起始特异性免疫应答的淋巴细胞。在本实施例中，我们通过测量CD83的表达测试了基质M起始iDC活化的能力，并且通过通讯分子CD86(即与淋巴细胞通讯以进入特异性免疫应答的表面分子)的表达测量分化。

按照材料和方法所述获取人iDC。

结果

通过分别用基质M、基质A和基质C培养iDC后测量CD83的表达来评价基质M及其成分基质A和基质C活化人iDC的能力。图17显示基质A和基质C两者均诱导CD83的表达，即活化iDC。

通过用基质M培养iDC后测量CD86的产生来评价基质M及其成分基质A和基质C分化人iDC以表达通讯分子的能力。图18显示基质M及其成分基质A和基质C诱导CD86表达，即分化iDC，促进与淋巴细胞的通讯。

讨论和结论

通过测量表面分子CD83和86(对于诱导需要的(即，特异性)免疫应答至关重要)，本实施例清楚地证明基质M及其成分活化、分化人DC。因为老年人的DC在表达CD86分子中存在障碍，导致免疫受损的个体在暴露于例如RSV或流感病毒或被其感染后倾向于发生严重疾病，所以选取CD86作为本实施例的读出。总之，我们证明基质M是有助于用于年老者(任选地也用于其他免疫缺陷的人或动物)之疫苗开发的新途径。

实施例5-基质制剂活化和分化来自老年人血液单核细胞的树突状细胞 (DC)

RSV感染所有人类年龄段，但主要在婴儿和老年人中引起疾病。超过50年的深入研究后，目前还没有人用RSV疫苗。在50多年前在婴儿中进行的灾难性疫苗试验后，尚没有研究带来疫苗的上市。一个障碍是在老年人中，主要由DC执行的抗原呈递严重受损。本实施例证明，ISCOM和基质技术克服了年老者中的DC障碍。

从10位匿名60岁或60岁以上的志愿者中收集白细胞。按照材料和方法中的描述，获取单核细胞并在GMC-SF和IL-4的存在下培养以获得未成熟的DC(iDC)。用以下刺激iDC：培养基、LPS、基质M、两个剂量的基质M佐剂化DiRSV或整合了RSV包膜蛋白的ISCOM制剂(描述于Hu等，Clin Exp Immunol.，113，p 325，1998)。此后，使用单克隆抗体鉴定并通过流式细胞仪定量分析DC的以下的表面蛋白：CD11c、CD14、CD80、CD83、CD86和(II类抗原(主要人组织相容性复合物，II类MHC)。

结果

培养核单细胞之后，CD14的表达被下调，因而表明获得了iDC。用DiRSV基质M疫苗或对照培养来自老年志愿者的iDC 24小时，并随后分析表面受体。用DiRSV基质M疫苗刺激24小时后，DC上的活化标志物的表达增加至与阳性对照(LPS刺激)相同的程度，这表明实验性疫苗活化iDC并使其分化为活化的DC。图19和20表明用ISCOM或基质M佐剂化DiRSV刺激iDC增加活化标志物CD83、辅助刺激分子CD86和CD80和HLADR的表达。这种分化对于DC起始针对RSV抗原之免疫应答的功能至关重要。

讨论和结论

本实施例表明，基于基质M的DiRSV疫苗在年老者中也有发挥作用的潜力。RSV感染后年老者发病的主要原因为年老者免疫中包含表达共刺激分子CD80和86的能力降低的DC，这些分子在作为抗原呈递细胞的DC和淋巴细胞之间发挥建立特异性免疫应答所必须的通讯作用。因此，由于细胞介导免疫(尤其是对抗RSV感染所必须的Th1应答)发生能力差，具有未成熟免疫***的新生儿和衰老引起免疫受损的年老者是严重RSV感染的高风险组。在此我们在人离体模型中证明，在用基质M佐剂化的实验性疫苗DiRSV或“经典的”ISCOM制剂刺激后，来自老年人(60岁或以上)单核细胞的iDC被活化(CD83)并分化为表达CD80和86的成熟DC。活化以CD83的表达为标志，且分化以辅助刺激分子CD80和CD86的上调为标志。因此，这些结果证明整合了病毒抗原的“经典的”ISCOM和基质M佐剂化DiRSV有潜力通过克服受损免疫***的障碍，满足用于年老者群体的有效RSV疫苗的这个尚未满足的需求。实施例6.用基质Q佐剂配制的分解的新孢子虫抗原是潜在的疫苗候选物

世界范围内，犬新孢子虫(Nc)的感染在牲畜中引起流产和经济损失。尽管在牲畜中尚没有治疗或经验证的疫苗来预防感染或疾病(Dubey等，2007)，但已证实在交配之前以活速殖子实验性接种的牲畜产生对抗垂直传播的保护性免疫(Innes等，2001)。此外，新孢子虫潜伏感染的母牛产生对抗胎儿病的保护性免疫，所述胎儿病是通过实验性接种(Williams等，2003)或天然地再次暴露于寄生生物(McAllister等，2000)所引起的。保护性机制与诱导1型免疫应答(包括IFN-γ的产生)相关联(Innes等，2002)。因此，开发有效的疫苗应当基于包括IFN-γ产生的免疫应答。本实施例证明这样的观点：使用分解的Nc为疫苗抗原与基质Q佐剂一起诱导高质量的免疫应答，其包括抗体和细胞介导免疫，尤其是预期贡献于免疫保护作用的IFN-γ的产生。

我们比较了在用活速殖子(建议为疫苗候选物)接种的小牛和用基质Q佐剂化的分解Nc抗原接种的小牛中诱导的一些免疫参数。表明相对于活疫苗，实验性基质Q疫苗制剂产生更好的免疫应答。

结果

以完整活速殖子或分解的速殖子免疫后的血清抗体应答

按照表6中的描述，用活的速殖子静脉内接种小牛一次或者用以未佐剂化的或基质Q佐剂化的分解速殖子皮下接种小牛两次。免疫后4周，通过ELISA的测量，以活的速殖子免疫的小牛和两种基质Q组中的小牛产生类似水平的IgG应答(通过ELISA测量)。与用活的速殖子接种的小牛相比，用基质Q佐剂化的分解速殖子进行第二次免疫之后，小牛产生显著更高的抗体应答(图21)。在一次或两次免疫后，未佐剂化的分解速殖子都不诱导可检测的抗体应答。

表6.实验设计

^＊通过静脉内接种用1×10⁸个NC-1株速殖子攻击全部小牛。

在第11周感染攻击后，除了组B中的小牛外，所有小牛均产生针对新孢子虫的抗体。用基质Q佐剂化的分解速殖子两次免疫的组B中的这些动物没有对感染攻击做出增加抗体水平的应答，即未记录到回忆应答。相比之下，所有其他组(包括以活寄生生物免疫的组)中的动物对感染攻击作出增加抗体水平的应答，即记录到了回忆应答。回忆应答表明速殖子复制显著地导致抗体应答增加。

多种接种后IgG1和IgG2抗体应答

表7中显示表示为IgG1/IgG2比例的犬新孢子虫特异性的IgG1和IgG2抗体应答。记录到了组A和B之间在抗体应答亚型分布上的明显差异。接受活速殖子的组A中的小牛的应答以IgG2主导为特征，即比例＜1。相比之下，在接受基质Q佐剂化的分解速殖子的组B小牛中记录到的比例＞1。感染攻击后(第12周)，两个组均保持类似的IgG1/IgG2比例。

表7.用活的(A)或基质Q佐剂化的分解(B)新孢子虫速殖子制剂免疫后小牛中IgG1/IgG2亚型抗体。

对多种接种物应答的IFN-γ产生

分析表6和图22所述以多种速殖子制剂接种的小牛的全血样品中IFN-γ的产生。在实验性感染的牛(组A)中检测到了特异性IFN-γ应答，并且当与第0周观察到的水平相比时，整个实验过程中所述应答都显著性地增加(P＜0.05)。组A中的最大IFN-γ产量发生在第4周；然而，其与第11和12周期间(即攻击之前和攻击一周之后)检测到的水平没有统计学上的差异(图22)。接受用基质Q佐剂化的分解速殖子的小牛以增加IFN-γ的生产来应答，与第0周相比，其在第4和11周更高(P＜0.05)。有趣的是，在第12周时，该组中的动物对感染攻击作出增加IFN-γ生产的应答(P＜0.05)。相反，以未佐剂化的活速殖子或分解的速殖子免疫的动物未作出被认为对免疫保护至关重要的IFN-γ生产应答。这些结果表明，所施用的没有强佐剂(例如基质Q)的Nc寄生生物抗原抑制对后续感染的IFN-γ应答。这一点也被在组D和E动物中观察到的针对第11周时的感染攻击产生IFN-γ的应答(在第12周时测量(P＜0.05)。

讨论和结论

在牛中，交配前接种活的速殖子不仅阻止流产，而且阻止垂直传播(Innes等，2001；Williams等，2007)。然而，接种活的速殖子不是市售疫苗的选择。新感染的传播和转变成致病性仅是使用活疫苗的很多缺点中的两个。仍然需要开发失活的疫苗以控制牛新孢子虫病，目前市售的疫苗基于失活的完整速殖子并且仅有约50％的效力。获得产生等同于活速殖子所诱导免疫之保护性免疫应答的失活免疫原意义重大。在此，我们证明基于基质Q佐剂化分解犬新孢子虫的疫苗诱导的免疫应答类似于或高于(加强之后)活速殖子接种所诱导的应答。用未佐剂化的分解抗原免疫的组中的小牛未能诱导Nc特异性的IgG应答，表明对强佐剂的需要。重要的是，在用基质Q佐剂化分解抗原进行免疫的组中观察到了与免疫保护相关联的显著的IFN-γ应答，所述应答也在以活的速殖子接种的动物中观察到。有趣的是，注意到攻击之后(第12周)，除接受无佐剂抗原的两个组外，所有组中IFN-γ应答增加至最大水平。因此，活的速殖子和未佐剂化的分解抗原明显地影响或下调促进感染的IFN-γ应答，这被基质佐剂克服。IFN-γ应答的重要性在于，在感染攻击之后以未佐剂化速殖子制剂免疫的动物产生与寄生生物感染相关的记忆应答。

总之，本研究证明在安全且失活的疫苗中使用分解的犬新孢子虫抗原和基质佐剂来诱导广的免疫应答(等同于接种活速殖子所诱导的免疫)的潜力。然而相对于在后续感染中下调IFN-γ应答的“活疫苗”制剂，基质佐剂化疫苗诱导质量更好的促进的IFN-γ应答的疫苗。

实施例7a.小母牛中对抗金黄色葡萄球菌CP5菌苗接种的免疫应答

本实施例的目的是比较血清和牛奶中针对用两种不同佐剂(基质Q或Al(OH)3)配制的5型葡萄球菌荚膜多糖菌苗的体液免疫应答。用由无菌盐水溶液组成的安慰剂作为对照。

本实验中使用24只处于妊娠最后三个月的初次妊娠的Holstein小母乳牛。动物被随机分入3个组。在预产期前约45和15天，每组于乳腺上***区域皮下注射给于不同制剂中的一种。按照表8所述取血清和牛奶样品。以ELISA测试样品中针对完整细菌的抗体应答。结果见图23A和B。

表8.样品类型和取样频率

结果和结论

在血清和牛奶两者中，基质Q佐剂增加对金黄色葡萄球菌CP5菌苗的抗体应答。在血清中该应答高得多并且持续时间更长。在牛奶中，Al(OH)₃完全不促进抗体应答。与之不同，基质Q佐剂化菌苗在牛奶中刺激高水平的抗体。没有任何佐剂的菌苗完全不诱导任何可检测的抗体。实施例7b.小母牛中对抗金黄色葡萄球菌CP5菌苗和CP5裂解物接种的体液免疫应答

本实施例的目的是评价由以下所产生的体液应答：(1)金黄色葡萄球菌CP5完整细胞疫苗和(2)金黄色葡萄球菌CP5裂解物疫苗(两者都是用基质Q佐剂配制)和(3)作为对照的由无菌盐水溶液加基质Q佐剂组成的安慰剂。按照材料和方法所述配制疫苗。实验中使用12只处于妊娠最后三个月的初次妊娠的Holstein小母乳牛。动物被随机分入3个组。在预产期前约40和14天，每组于乳腺上***区域皮下注射给于不同制剂的一种。按照表9所述取样。以ELISA测试血清针对完整细菌和细菌裂解物(分解的细菌)的抗体应答。结果见图24A和B。

表9.样品类型和取样频率

结果和结论

本研究结果见图23。无论是否针对以菌苗或裂解物形式的SA.抗原测量，在接受分解的SA实验性疫苗的小母牛中，血清抗体应答更高。三个实验组的平均血清IgG效价见图23。当针对SA裂解物测量抗体应答时，由于还暴露了内部抗原，所以细菌裂解物用于免疫时应答高得多，这证明全部范围的其他抗原变得有抗原性。总之，这证明与基质M佐剂化的未分解细胞(对未佐剂化的SA完整细胞更是如此)相比，基质M与分解的S.A.细胞联合增强并扩大抗体应答，并且基质M的强和免疫调节能力是必需的。

Claims (28)

1.一种组合物，其包含至少一种ISCOM复合物和至少一种内部抗原，所述内部抗原不是表面抗原并且不是完整微生物之部分的形式。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述至少一种内部抗原为完整微生物的形式。

3.根据权利要求1的组合物，其中所述至少一种内部抗原为核蛋白。

4.根据权利要求1和3的组合物，其中所述至少一种内部抗原为微生物分解后获得的成分组的成员。

5.根据权利要求3的组合物，其中所述至少一种内部抗原为用增溶剂将微生物分解后获得的成分组的成员。

6.根据权利要求5的组合物，其中在所述分解后所述组合物中的所述增溶剂已被稀释2至100倍。

7.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述ISCOM复合物为包含至少一种皂苷、至少一种脂质和至少一种抗原的ISCOM。

8.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述ISCOM复合物为包含至少一种皂苷和至少一种脂质的ISCOM基质。

9.根据权利要求7和8的组合物，其中所述至少一种脂质为胆固醇和至少一种磷脂。

10.根据权利要求1至9中任一项的组合物，其中所述皂苷选自皂荚树(Quillaja saponaria Molina)的粗皂苷提取物，级分Q和Q-VAC；皂荚树的级分C、B、B3、B4和B4b以及QA-1、QA-2、QA-3、QA-4、QA-5、QA-6、QA-7、QA-8、QA-9、QA-10、QA-11、QA-12、QA-13、QA-14、QA-15、QA-16、QA-17、QA-18、QA-19、QA-20和QA-22。

11.根据权利要求1至10中任一项的组合物，其中所述组合物包含选自ISCOM复合物和/或ISCOM基质复合物的至少两种不同免疫原性复合物，每单种复合物包含一种来自皂荚树的皂苷级分，其中一种复合物中的所述皂苷级分不同于另一种复合物中的皂苷级分。

12.根据权利要求1至11中任一项的组合物，其中所述内部抗原选自微生物的内部成分，所述微生物如病毒，细菌，寄生生物，酵母细胞，真核细胞，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞。

13.根据权利要求12的组合物，其中所述内部抗原来自RSV、狂犬病毒、流感病毒、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和新孢子虫。

14.根据权利要求1至13中任一项的组合物的至少一种ISCOM复合物，其还另外包含非内部抗原。

15.根据权利要求1至14中任一项的组合物，其还另外包含完整微生物，所述完整微生物可以是活的和减毒的。

16.根据权利要求1至15中任一项的组合物，其还另外包含一种或更多种添加剂可药用赋形剂、载体和/或稀释剂。

17.根据权利要求1至16中任一项的组合物，其用作免疫刺激药物或疫苗。

18.根据权利要求17的组合物，其用于引发T细胞应答，包括CTL应答。

19.根据权利要求17和18中任一项的组合物，其用作用于低应答者的免疫刺激药物或疫苗。

20.根据权利要求17至19中任一项的组合物，其中所述低应答者为病人、年老者或青少年。

21.用于制备包含至少一种ISCOM复合物和至少一种内部抗原的组合物的方法，所述内部抗原不是表面抗原并且不是完整微生物之部分的形式，所述方法的特征在于在不去除任何细胞成分的情况下将皂苷、胆固醇和脂质与细胞和增溶剂的裂解细胞悬液相混合，然后除去或稀释增溶剂。

22.一种包含至少两个区室的试剂盒，其中一个区室包含ISCOM复合物，所述ISCOM复合物包含至少一种内部抗原，其不是表面抗原并且不是完整微生物之部分的形式，并且另一区室包含使用处方，或者其中

第一区室包含ISCOM基质复合物，并且另一区室包含至少一种内部抗原，其不是表面抗原并且不是整个微生物之部分的形式。

23.根据权利要求22的试剂盒，其中所述至少一种内部抗原为将微生物分解后获得的成分组的成员。

24.一种包含至少一种ISCOM复合物的组合物，其用作免疫刺激或免疫调节药物或疫苗以用于在免疫低应答者中刺激树突状细胞，所述免疫低应答者如青少年、婴儿或老年人。

25.根据权利要求24的组合物，其中所述树突状细胞选自CD 80、CD 83、CD 86和趋化因子CCR 227。

26.根据权利要求24和25中任一项的组合物，其中所述免疫低应答者为哺乳动物，尤其是人。

27.根据权利要求24和25中任一项的组合物，其中所述ISCOM复合物为权利要求7至11中的任一项。

28.根据权利要求24至27中任一项的组合物，其还另外包含一种或多种根据权利要求16的添加剂。

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