CN102462841A - 一种促进gp96蛋白的免疫活性的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进gp96蛋白的免疫活性的方法及其应用。本发明提供了免疫调节剂在提高gp96蛋白相关物质的免疫活性中的应用；所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种；所述gp96蛋白相关物质为序列表的序列1所示的gp96蛋白、N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示。本发明还提供了包括所述免疫调节剂和所示gp96蛋白相关物质的各种疫苗。本发明对于各种癌症，如乙肝、黑色素瘤等的治疗具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进gp96蛋白的免疫活性的方法及其应用。
背景技术
热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)具有独特的免疫学功能，其免疫学机制包括二方面：一是HSPs参与T细胞抗原呈递；二是HSPs有效激发天然免疫。
热休克蛋白存在于细胞浆和内质网膜内，由多个成员组成，如HSP60，HSP70，HSP90和gp96等。热休克蛋白一方面作为分子伴侣在蛋白折叠与运输过程中发挥重要作用；另一方面能结合细胞中5-25mer的抗原多肽，通过抗原呈递细胞(APC)表面CD91分子进入细胞并将结合的抗原表位呈递给MHC I类和II类分子，从而启动特异性T细胞免疫应答。
热休克蛋白本身是迄今为止发现的唯一的来源于哺乳动物细胞的天然佐剂，它可作用于APC及T细胞等其它免疫细胞，促进DC成熟，刺激细胞产生免疫因子IL-6、IL-12、TNF等，从而增强机体非特异性免疫反应。有研究表明gp96对于APC中Tol l样受体(Toll-likereceptors，TLRs)发挥免疫学功能起至关重要的作用，gp96基因缺失的DC细胞中TLRs丧失引发天然免疫的功能，导致转基因小鼠抵抗感染的能力明显降低。
热休克蛋白-多肽复合物治疗性疫苗已用于临床试验。由于肿瘤细胞是一种变异的细胞，因此外源性地给予非特异性或特异性免疫因子或细胞，增强或扩大机体的免疫力，可达到清除体内肿瘤细胞的目的。基于这个原理，多种非特异性免疫学治疗方法如给予外源性白介素2、干扰素、LAK细胞的输注等方法均已在临床使用，但疗效并不令人满意，主要原因之一是存在肿瘤免疫逃逸。肿瘤细胞常常丢失肿瘤抗原的表达或改变其抗原表达谱，使得针对已知肿瘤抗原而设计的肿瘤疫苗不能有效激发针对肿瘤细胞的免疫反应。研究表明肿瘤具有个体特异性，肿瘤的特异性不仅表现在肿瘤类型之间，还表现在不同个体之间，即同种类型肿瘤患者中，不同个体的肿瘤生物学和免疫学特性也存在显著差别。HSP天然结合肿瘤细胞中各种抗原，因此将热休克蛋白开发成个体化肿瘤疫苗，可以充分考虑到患者个体间的差异，以达到最佳治疗效果。开展个体化治疗亦是当今医学及药物学发展的必然方向之一。
近6年来，HSP gp96-多肽复合物用于临床试验相继在美国、英国、德国、意大利及俄罗斯等国的医院或癌症中心进行，主要用于胃癌、***癌、肾癌，黑色素瘤等肿瘤和HIV、生殖器泡疹等传染性疾病的治疗。目前肾癌和恶性黑色素瘤的治疗已完成临床III期，直肠癌和淋巴瘤已完成临床II期。该治疗方法在俄罗斯已经批准上市。从已有的临床资料看，gp96-抗原复合物作为自体疫苗***疗效无容置疑，肾细胞癌和黑色素瘤已经完成III期临床，接受治疗的患者数量大，并具有统计学意义，M1a和M1b期患者接受10次以上的免疫，平均存活期比医生选择的治疗延长18.4个月(31.2vs 12.8月，P＝0.03，危险比HR＝0.45)。对未转移肾癌患者治疗的III期临床资料发现中等风险患者(n＝362)(包括I/II期，III期的T1/2/3)接受gp96自体疫苗治疗，复发时间延长45％(P＜0.01，危险比HR＝0.55)，与对照相比复发时间延长约1.8年，同时接受治疗的患者存活期延长。
调节性T细胞(Treg)抑制了很多类型细胞的活化、增值、分化和效应功能，包括CD4+、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞及DC细胞。Treg是一类CD4+CD25+的T细胞。Treg分为两个主要类群：胸腺衍生的天然Treg(nTreg)和外周诱导的Treg(iTreg)。它们通过不同的途径来行使抑制调节功能，nTreg主要通过细胞-细胞的直接接触起作用，而iTreg通过高浓度的TGFβ1或者IL-10/TGFβ1发挥抑制功能。去除Treg细胞导致小鼠自发的产生自身免疫疾病。但也有证据表明，去除或者减少Treg细胞能增强机体针对病毒、肿瘤等疾病的免疫反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进gp96蛋白的免疫活性的方法及其应用。
本发明提供了免疫调节剂在提高gp96蛋白相关物质的免疫活性中的应用；所述gp96蛋白相关物质为序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸残基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物。
本发明还保护一种疫苗佐剂，为如下(a)或(b)或(c)：(a)由免疫调节剂和所述N355片段组成的疫苗佐剂；(b)由免疫调节剂和所述gp96蛋白组成的疫苗佐剂；(c)由免疫调节剂和所述含有gp96蛋白的提取物组成的疫苗佐剂。
本发明还保护一种乙肝疫苗和/或抑制乙肝病毒的疫苗，由所述gp96蛋白相关物质、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)和免疫调节剂组成。
本发明还保护一种乙肝疫苗和/或抑制乙肝病毒的疫苗，由gp96蛋白相关物质、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和免疫调节剂组成；所述乙肝表面抗原表位362-371如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白表位87-95如序列表的序列7所示；所述乙肝聚合酶表位140-148如序列表的序列8所示。
本发明还保护一种黑色素瘤疫苗，由所述gp96蛋白相关物质和免疫调节剂组成。
以上任一所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种。所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示。
以上任一所述含有gp96蛋白的提取物是将离体动物组织或离体肿瘤组织或离体肿瘤细胞的匀浆液依次进行ConA-Sepharose层析和HiTrap-Q Sepharose离子交换层析得到的；所述离体动物组织为离体小鼠肝脏、离体猪肝脏或离体人胎盘；所述肿瘤组织为乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌或胃癌；所述肿瘤细胞为人肝癌细胞HepG2或黑色素瘤细胞B16；所述ConA-Sepharose层析包括如下步骤：(1)将所述匀浆液上样于层析柱，流速为0.25ml/min；(2)用10倍层析柱柱体积的洗脱液甲洗涤步骤(1)的层析柱，流速为0.5ml/min；所述洗脱液甲的制备方法为：在NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS中加苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1mM；(3)用3倍层析柱柱体积的洗脱液乙洗涤步骤(2)的层析柱，流速为0.25ml/min，收集洗脱液，即为洗脱液丙；所述洗脱液乙的制备方法为：在NaCl浓度为200mMpH7.5的PBS中加α-D-吡喃葡萄糖至终浓度为10g/mL，加苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；所述HiTrap-Q Sepharose离子交换层析包括如下步骤：(a)将所述洗脱液丙上样于层析柱，流速为1ml/min；(b)用5ml NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS洗涤步骤(a)的层析柱，流速为1ml/min；(c)用10ml NaCl浓度为300mM pH7.5的PBS洗涤步骤(b)的层析柱，流速为1ml/min；(d)用3ml NaCl浓度为600mM pH7.5的PBS洗涤步骤(c)的层析柱，流速为1ml/min，得到的洗脱液即为含有gp96蛋白的提取物。
以上任一所述疫苗的各个组分均单独包装。
gp96蛋白既可天然提取，也可利用大肠杆菌或酵母表达。
gp96蛋白、N355片段和含有gp96蛋白的提取物与乙肝抗原表位免疫小鼠可明显提高Treg的数量，同时Treg的功能也明显增强，包括对CD4+和CD8+T细胞生长的抑制和分泌IFN-γ的抑制功能明显增强，Treg与CD8+T、乙肝抗原特异性T细胞、分泌IFN-γ细胞呈负相关，说明Treg对T细胞有抑制作用。gp96蛋白一方面通过抗原呈递激活CTL，同时又能激活Treg，Treg反过来又抑制CTL活性，因此gp96对乙肝T细胞免疫有双向调节功能。在上述免疫中加入免疫调节剂，可清除gp96诱导产生的Treg，T细胞数量有明显提高，包括CD8+T、乙肝抗原特异性T细胞、分泌IFN-γ细胞数量有明显增加(P＜0.01)，说明免疫调节剂可显著增强gp96引发的乙肝特异性T细胞免疫应答。小鼠试验表明，本发明提供的乙肝疫苗能有效激活HBV特异性T细胞，小鼠免疫8周后血清中的HBV S抗原降低50％以上，肝脏细胞中病毒清除90％以上。以上研究表明疫苗有良好的抗HBV活性。给小鼠注射低剂量的环磷酰胺、抗CD25的抗体或下调Foxp3等抑制Treg，则疫苗对乙肝病毒复制的抑制能显著提高(P＜0.01)。将gp96与小鼠黑色素瘤抗原体外组装，制备gp96肿瘤疫苗。通过不同剂量的小鼠免疫试验，发现高剂量的gp96疫苗引发的对黑色素瘤的免疫排斥反应反而低于低剂量组。研究阐明了gp96免疫调控机制，一方面通过抗原呈递激活CTL杀伤肿瘤细胞，同时又能激活Treg抑制CTL活性，降低肿瘤免疫排斥反应。在gp96肿瘤疫苗免疫实验中同时注射低剂量的环磷酰胺，清除gp96诱导产生的Treg，则显著提高gp96肿瘤疫苗的活性。上述实验中，使用抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA(siRNA)同样能降低Treg的数量，达到增强gp96疫苗免疫活性的目的。
附图说明
图1为N355片段的鉴定图谱。
图2为rgp96蛋白的鉴定图谱；1：分子量标准；2：步骤(二)的发酵液；3：亲和层析后的洗脱液；4：离子交换层析后的洗脱液；5：rgp96蛋白的western blot。
图3为gp96提取物的鉴定图谱。
图4为实施例2中rgp96蛋白和gp96提取物的免疫活性比较(流式细胞检测结果)；A为HBc87-95，B为HBc87-95+gp96，C为HBc87-95+rgp96，D为HBc87-95+IFA。
图5为实施例4中T细胞活性检测和Tetramer检测的结果；A为流式细胞仪检测结果(免疫引发的乙肝病毒特异性CTL反应)，B为CD8+T细胞占脾细胞的比例(免疫引发的T细胞反应)，C为Tetramer阳性细胞占CD8+T细胞的比例(免疫引发的乙肝特异性T细胞反应)；1为第一组，2为第二组，3为第三组，4为第四组，5为第五组，6为第六组。
图6为复合物免疫的ELISPOT检测结果。
图7为实施例4中Treg检测结果；A为流式细胞仪检测结果(免疫引发的乙肝病毒特异性CTL反应)，B为Treg阳性细胞占CD4+T细胞的比例；1为第一组，2为第二组，3为第三组，4为第四组，5为第五组，6为第六组。
图8为免疫对小鼠Treg活性的促进；A：FACS检测Treg对CD4和CD8T细胞增殖的抑制；B：第一组、第二组和第五组免疫对CD4和CD8T细胞增殖的抑制作用；C：第三组、第四组和第六组免疫对CD4和CD8T细胞增殖的抑制作用；D：第一组、第二组和第五组免疫对分泌IFN-γ的细胞的抑制作用；E：第三组、第四组和第六组免疫对分泌IFN-γ的细胞的抑制作用；1为第一组，2为第二组，3为第三组，4为第四组，5为第五组，6为第六组。
图9为免疫小鼠中Treg与T细胞的相关性分析；A：Treg与总CD8+细胞；B：Treg与乙肝特异性T细胞；C：Treg与分泌IFN-γ的T细胞。
图10为实施例5的步骤一的1的结果。
图11为实施例5的步骤一的2的结果。
图12为实施例5的步骤二的结果。
图13为实施例5的步骤三的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。BALB/c小鼠：购自北京维通利华公司；HBV转基因鼠：购自广州解放军第458医院。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中均采用皮下注射进行免疫(实际应用中，也可随机选用其它免疫方式，如皮内注射或肌肉注射)。乙肝表面抗原(HBsAg)：购自北京天坛生物股份公司。乙肝核心蛋白(HBcAg)：购自abcam公司，产品编号ab49013。抗CD4的抗体：购自BioLegend，产品目录号100407。抗CD8的抗体：购自BioLegend，产品目录号100705。抗CD25的抗体：购自BioLegend，产品编号101906。抗FoxP3的抗体购自eBioscience，产品目录号77-5775。HBc87-95：是乙肝核心蛋白表位87-95，序列为SYVNTNMGL，由上海吉尔生化公司合成。HBsAg362-371：是乙肝表面抗原表位362-371，序列为WYWGPSLYSI，由上海吉尔生化公司合成。乙肝聚合酶表位140-148，序列为HYFQTRHYL，由上海吉尔生化公司合成。转录因子FoxP3是特异的Treg细胞的分子标志，对CD4+CD25+Treg细胞的发育和行使功能有着重要的作用；FoxP3的干扰RNA：5’-GGACACUCAAUGAAAUCUA-3’，由广州锐博公司合成。gp96蛋白(人热休克蛋白；GENBANK ACCESSION NO.AY040226)的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其编码序列如序列表的序列2所示。gp96蛋白片段(N355片段)为序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸残基组成的多肽，其编码序列如序列表的序列2自5’末端第1至1065位核苷酸所示。
实施例1、N355片段、gp96蛋白和gp96蛋白的提取物的制备
一、N355片段的制备
利用大肠杆菌表达N355片段，具体方法如下：
1、设计如下N355引物对，由上海英俊公司合成引物：
上游引物：5’-CGCGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGAT-3’；
下游引物：5’-CCGCTCGAGTTAAGTAAAGTGAATATAAGCCATG-3’。
2、提取人肝癌细胞HepG2(购自ATCC，产品号HB-8065)的mRNA，反转录合成cDNA。
3、以步骤2的cDNA为模板，用N355引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(含N355片段的编码序列)。
4、用限制性内切酶BarnHI和Xho I双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶BarnHI和Xho I双酶切pGEX-6P-1质粒(购自GE公司，产品编号27-4597-01)，回收载体骨架。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到连接产物。
7、将连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自天根生化科技公司，产品号CB101-03)感受态，挑取单菌落进行酶切鉴定，酶切鉴定阳性的菌落提取质粒进行测序鉴定。测序结果表明，得到了重组质粒pGEX-N355(骨架载体为pGEX-6P-1，在BarnHI和Xho I酶切位点之间***了N355片段的编码序列)。
8、将重组质粒pGEX-N355转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自天根生化科技公司，产品号CB105-02)感受态细胞，从平板上挑取单菌落接入含100mg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL)活化；取活化液(菌液)接入2×YT培养基，37℃培养至OD600值为0.6-1.0，然后加入IPTG(使其终浓度为1mmol/L)，37℃诱导4h，收集菌体。
9、菌体用PBS缓冲液(140mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4 1.8mmol/LKH2PO4；pH 7.3)重悬，冰浴条件下超声破碎(200W，破碎4s停6s，99次3个循环)，然后4℃12000转/min离心20min，收集上清。
10、将上清4℃进行亲和层析，载体为Glutathione-Sepharose 4B(购自GE公司，产品编号17-5132-01)，采用还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mmol/L reduced glutathione，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)洗脱，收集洗脱液。
11、将洗脱液用超滤浓缩法更换成酶切缓冲体系(50mmol/L Tri s-HCl，pH8.0；150mmol/LNaCl；1mmol/L DTT；1mmol/L EDTA，pH 8.0)，加入过量PreScission Protease酶(PSP蛋白；购自GE公司，产品编号27-0843-01)，4℃酶切16h。
12、将酶切后的酶切体系用超滤浓缩法更换成PBS缓冲液，然后进行亲和层析，载体为Glutathione-Sepharose 4B，采用PBS缓冲液进行洗脱，GST和PSP结合到层析柱上，收集洗脱液，即为N355片段。
13、将含有N355片段的溶液进行10％SDS-PAGE，然后进行考染，见图1的泳道1。N355片段的纯度达95％以上。将N355片段进行western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santacruz，产品号sc-56399)，见图1的泳道2。
二、重组gp96蛋白(rgp96蛋白)的制备
(一)重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的构建
1、提取人肝癌细胞HepG2的mRNA，反转录合成cDNA。
2、以步骤1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
上游引物：5’-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3’；
下游引物：5’-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3’。
3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pHFMDZ-R1A(购自Invitrogen公司，产品号V20520)，回收载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pHFMDZ-R1-gp96。
测序结果表明，重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架载体为pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位点之间***了gp96蛋白的编码序列)。
6、在重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的BglII酶切位点***LEU2片段(序列表的序列3所示的DNA)，BamHI酶切位点***α-淀粉酶报告***(序列表的序列4所示的DNA)，得到重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96。
(二)rgp96蛋白的表达
1、采用电转化法将重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96导入汉逊酵母(购自ATCC，产品号MYA-335)细胞，得到重组菌。
2、将重组菌接种于5mL SD液体培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号GMS12117.7)，37℃培养48h，然后转接到100mL SYN6培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号GMS12116.1)，30℃培养48h，得到种子培养液。
3、将两瓶种子培养液接种于含有2L SYN6培养基的5L发酵罐中，30℃培养；使用氨水控制pH维持在5.5；每4h检测1次发酵液中甘油含量，根据发酵液中甘油的浓度补加甘油，控制甘油终浓度在0.5％左右，同时控制溶氧在20％以上；根据菌体的生成情况检测菌体湿重，等菌体湿重达到180-200g/L的时候停止补加甘油，开始诱导重组rgp96蛋白产生(补加甲醇，使甲醇浓度维持在0.5-0.8％左右)，诱导开始72小时后停止发酵。
(三)rgp96蛋白的分离纯化
将步骤(二)的发酵液离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，在球磨机(DYNO-MILLmodel KDL)中，按照厂家提供的操作手册使用玻璃珠球磨的方法破碎细胞；破碎后的细胞12000转/min离心20min，收集上清液；上清液用0.45μm滤膜进行过滤，得到滤液，将滤液进行浓缩，得到浓缩液。
将滤液进行亲和层析，具体步骤如下：采用英俊公司(Invitrogen Corporation)的Ni-NTAPurification System进行亲和层析，主要步骤为：先用PBS平衡柱子2h；然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h；将浓缩液用PBS(含20mM咪唑)稀释后上样；用PBS(含20mM咪唑)冲洗柱子至OD值＜0.01；用PBS(含200mM咪唑)洗脱1.5h，收集洗脱液(即为rgp96蛋白)；所有操作在4C下进行，流速为0.5mL/min。
每升步骤(二)的发酵液纯化后可以获得50毫克纯度90％以上的rgp96蛋白。如果蛋白洗脱液中含有异源杂蛋白，可将亲和层析的洗脱液进行离子交换层析(Q柱)，主要步骤：200mMNaCl的PBS液平衡；上样；300mM NaCl的PBS液洗杂质；800mM NaCl的PBS液洗目的蛋白。
将步骤(二)的发酵液、亲和层析后的洗脱液(rgp96蛋白)和离子交换层析后的洗脱液进行10％SDS-PAGE，然后进行考染，见图2。rgp96蛋白的纯度达90％以上。将rgp96蛋白进行western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz，产品号sc-56399)，见图2。
三、gp96提取物的制备
用小鼠肝脏制备gp96提取物，方法如下：
1、组织匀浆
匀浆缓冲液配方：在pH7.0的碳酸氢钠缓冲液中加PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式为C7H7FO2S)至终浓度1mM(置于冰上的烧杯中配置；PMSF在水溶液中数小时内分解，该溶液不可过夜)。
取烧杯置于冰上，将BALB/c小鼠肝组织在烧杯中迅速用剪刀剪成直径约1-2毫米的碎块，然后加入组织8倍重量的匀浆缓冲液；将组织碎块搅匀倒入玻璃匀浆器，匀浆至底部组织块消失后再上下匀浆15次以上；匀浆液倒入离心管，50,000g离心60min，取上清加入1/10体积的10×PBS(pH7.5,200mM NaCl)，用于步骤2的ConA-Sepharose层析。
2、ConA-Sepharose层析
载体为ConA-Sepharose(购自GE公司，产品号17-0440-01)，按“1ml载体/4g组织”计算使用量。层析柱的内径和柱长是1.6×2.5cm。
将上清用蠕动泵上样，0.25ml/min。在PBS(pH7.5,200mM NaCl)中加PMSF至终浓度1mM，作为洗脱液甲；用蠕动泵将10倍柱体积的洗脱液甲过层析柱(0.5ml/min)，以去除未结合蛋白。在PBS(pH7.5,200mM NaCl)中加α-D-吡喃葡萄糖至终浓度10％(10g/mL)，加PMSF至终浓度1mM，作为洗脱液乙；用蠕动泵将3倍柱体积的洗脱液乙过层析柱(0.25ml/min)，收集洗脱液。
3、HiTrap-Q Sepharose离子交换层析
载体为HiTrap-Q Sepharose(层析柱为HiTrap Q HP；购自GE公司，产品号17-1153-01)。层析柱的内径和柱长是0.7×2.5cm。
将载体装柱后，先用5ml PBS(pH7.5,200mM NaCl)清洗(1ml/min)。将步骤2的洗脱液上样(1ml/min)；然后将5ml PBS(pH7.5,200mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，以去除未结合蛋白；然后将10ml PBS(pH7.5,300mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，以去除未结合蛋白；然后将3ml PBS(pH7.5,600mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，收集洗脱液，即为gp96提取物。
将gp96提取物进行10％SDS-PAGE，然后考染，见图3的泳道1。将gp96提取物进行westernblot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz，产品号sc-56399)，见图3的泳道2。
除了小鼠肝脏，也可用如下组织中制备gp96提取物：小鼠黑色素瘤(B16)、猪肝脏、人肝癌细胞系HepG2培养细胞、临床手术切除的人肿瘤组织(乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌、胃癌)和人胎盘；提取方法参照小鼠肝脏的提取。
实施例2、rgp96蛋白和gp96提取物免疫活性比较
将BALB/c小鼠随机分成四组，每组10只，分别进行如下免疫(免疫体积相等)：
第一组(HBc87-95)：用HBc87-95免疫小鼠，50微克/次；
第二组(HBc87-95+gp96)：用实施例1的步骤三制备的gp96提取物和HBc87-95一起免疫小鼠，gp96提取物20微克/次，HBc87-9550微克/次；
第三组(HBc87-95+rgp96)：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白和HBc87-95一起免疫小鼠，rgp96蛋白20微克/次，HBc87-9550微克/次；
第四组(HBc87-95+IFA)：用弗氏不完全佐剂和HBc87-95一起免疫小鼠，弗氏不完全佐剂20微克/次，HBc87-9550微克/次。
在1、2、3周各免疫一次，在第4周，用流式细胞仪检测T细胞活性(采用FITC标记的抗CD8的抗体和PE标记的Pentamer)。流式细胞仪检测结果见图4(上)。CD8和Pentamer-PE双阳性细胞即为HBc87-95肽特异性CD8+T细胞，计算其占CD8+T细胞的百分比，见图4(下)。rgp96蛋白和gp96提取物免疫均可显著提高T细胞反应，rgp96蛋白和gp96提取物免疫引发的CLT没有明显区别(P＞0.01)；第二组和第三组的乙肝特异性CTL数量显著高于第一组(P＜0.01)，也高于第四组。
实施例3、携带有gp96基因的表达载体与gp96提取物的免疫活性比较
将gp96蛋白的编码序列***表达载体pCDNA3.1(购自Invitrogen公司，产品编号V790-20)的EcoR I和Xho I酶切位点之间，得到重组质粒。
将BALB/c小鼠随机分成五组，每组10只，分别进行如下免疫(免疫体积相等)：
第一组：用HBc87-95免疫小鼠，50微克/次；
第二组：用重组质粒和HBc87-95一起免疫小鼠，重组质粒20微克/次，HBc87-9550微克/次；
第三组：用重组质粒和HBc87-95一起免疫小鼠，重组质粒50微克/次，HBc87-9550微克/次；
第四组：用重组质粒和HBc87-95一起免疫小鼠，重组质粒500微克/次，HBc87-9550微克/次；
第五组(HBc87-95+gp96)：用实施例1的步骤三制备的gp96提取物和HBc87-95一起免疫小鼠，gp96提取物20微克/次，HBc87-9550微克/次。
在1、2、3周各免疫一次，在第4周，用流式细胞仪检测T细胞活性。重组质粒免疫可显著提高T细胞反应，相对于第一组，乙肝特异性CTL数量有显著升高(P＜0.01)。重组质粒与gp96提取物免疫引发的CLT没有明显区别(P＞0.01)。
实施例4、rgp96蛋白或N355片段对免疫的双向调节
6-8周龄BALB/c小鼠分成五组，每组10只，分别免疫(免疫体积相等)如下：
第一组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；
第二组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；
第三组：用实施例1的步骤一制备的N355片段和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；
第四组：用实施例1的步骤一制备的N355片段和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；
第五组：用HBc87-95免疫小鼠，50微克/次；
第六组：用HBc87-95免疫小鼠，50微克/次。
在1、2、3周各免疫一次，在第4周，用流式细胞仪检测T细胞活性(采用FITC标记的抗CD8的抗体和Tetrame)，并进行ELISPOT检测和Treg检测。流式细胞仪检测见图5A，CD8阳性细胞占脾细胞的比例见图5B，Tetrame阳性细胞占CD8阳性细胞的比例见图5C。ELISPOT检测结果见图6。Treg检测结果见图7。rgp96蛋白或N355片段免疫可显著提高T细胞反应；相对于第五组和第六组，总T细胞和乙肝特异性CTL数量有显著升高(P＜0.01)；rgp96蛋白或N355片段免疫可显著提高乙肝病毒特异性CTL细胞活性(P＜0.01)；高剂量免疫对病毒特异性T细胞和总T细胞的激活明显低于低剂量组。rgp96明显提高Treg的数量，与对照相比，rgp96低剂量免疫或高剂量免疫Treg分别增加了13.86％或26.70％(P＜0.05或0.01)，N355低剂量免疫和高剂量免疫Treg分别增加了8.77％或12.54％，(P＜0.05)。免疫对小鼠Treg活性的促进见图8，包括对CD4+和CD8+T细胞生长的抑制(P＜0.05或0.01)和分泌IFN-γ的抑制(P＜0.05或0.01)功能明显增强。相关性分析发现rgp96蛋白或N355片段免疫的小鼠中Treg与T细胞呈负相关(见图9)，Treg与总CD8+T细胞(r＝0.84，P＜0.01)、乙肝特异性CTL(r＝0.94，P＜0.01)和分泌IFN-γ的CD8+T细胞(r＝0.79，P＜0.01)均呈显著负相关。综上所述，rgp96蛋白或N355片段的免疫调控机制如下：(1)通过抗原呈递激活CTL；(2)激活Treg，Treg反过来又抑制CTL活性。因此gp96蛋白(或其片段)对乙肝T细胞免疫有双向调节功能，如何控制平衡点对于提高gp96免疫活性有重要意义。
实施例5、免疫调节剂对rgp96蛋白或N355片段免疫活性的促进作用
一、环磷酰胺对rgp96蛋白或N355片段的免疫活性的促进作用
1、高剂量免疫
6-8周龄BALB/c小鼠分成六组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；
第二组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、HBc87-95和环磷酰胺一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次，环磷酰胺0.4毫克/次；
第三组：用实施例1的步骤一制备的N355片段和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；
第四组：用实施例1的步骤一制备的N355片段、HBc87-95和环磷酰胺一起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次，环磷酰胺0.4毫克/次；
第五组：用HBc87-95免疫BALB/c小鼠，HBc87-9550微克/次；
第六组：用HBc87-95和环磷酰胺一起免疫BALB/c小鼠，HBc87-9550微克/次，环磷酰胺0.4毫克/次。
在1、2、3周各免疫一次，第4周用流式细胞仪检测(采用PE标记的抗CD25的抗体和APC标记的抗FoxP3的抗体)。结果见图10；A为流式细胞仪检测结果；B为环磷酰胺对Treg的数量的抑制作用(CD25和FoxP3双阳性细胞占CD4阳性细胞的百分比)；C为环磷酰胺对CD8+细胞数量的促进作用(CD8阳性细胞占脾细胞的百分比)；D为环磷酰胺对乙肝特异性T细胞数量的促进作用(Tetrame阳性细胞占CD8阳性细胞的百分比)；E为环磷酰胺对分泌IFN-γ的T细胞数量的促进作用(IFN-γ阳性细胞占CD8阳性细胞的百分比)；1为第一组，2为第二组，3为第三组，4为第四组，5为第五组，6为第六组。环磷酰胺可以有效去除HBc87-95和高剂量rgp96蛋白(或N355片段)诱导产生的Treg，T细胞数量、乙肝特异性T细胞和分泌IFN-γ的T细胞数量有明显提高，联合使用环磷酰胺可使总T细胞、乙肝特异性T细胞和分泌IFN-γ的T细胞数量分别增长21.72％，52.99％和63.88％(P＜0.05或0.01)。
2、低剂量免疫
6-8周龄BALB/c小鼠分成六组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；
第二组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、HBc87-95和环磷酰胺一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次，环磷酰胺0.4毫克/次；
第三组：用实施例1的步骤一制备的N355片段和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；
第四组：用实施例1的步骤一制备的N355片段、HBc87-95和环磷酰胺一起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次，环磷酰胺0.4毫克/次；
第五组：用HBc87-95免疫BALB/c小鼠，HBc87-9550微克/次；
第六组：用HBc87-95和环磷酰胺一起免疫BALB/c小鼠，HBc87-9550微克/次，环磷酰胺0.4毫克/次。
在1、2、3周各免疫一次。第4周用流式细胞仪检测。结果见图11；A为环磷酰胺对CD8+细胞数量的促进作用(CD8阳性细胞占脾细胞的百分比)；B为环磷酰胺对乙肝特异性T细胞数量的促进作用(Tetrame阳性细胞占CD8阳性细胞的百分比)；C为环磷酰胺的分泌IFN-γ的T细胞数量的促进作用(IFN-γ阳性细胞占CD8阳性细胞的百分比)；1为第一组，2为第二组，3为第三组，4为第四组，5为第五组，6为第六组。环磷酰胺可以有效去除HBc87-95和低剂量rgp96蛋白(或N355片段)诱导产生的Treg，T细胞数量、乙肝特异性T细胞和分泌IFN-γ的T细胞数量有明显提高(P＜0.05)。rgp96蛋白(或N355片段)和环磷酰胺混合使用，能有效提高rgp96蛋白(或N355片段)对T细胞的活化能力(P＜0.05或0.01)。
二、抗CD25的抗体对rgp96蛋白或N355片段的免疫活性的促进作用
6-8周龄BALB/c小鼠分成九组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；
第二组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、HBc87-95和抗CD25的抗体一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次，抗CD25的抗体30微克/次；
第三组：用实施例1的步骤一制备的N355片段和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；
第四组：用实施例1的步骤一制备的N355片段、HBc87-95和抗CD25的抗体一起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次，抗CD25的抗体30微克/次；
第五组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；
第六组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、HBc87-95和抗CD25的抗体一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次，抗CD25的抗体30微克/次；
第七组：用实施例1的步骤一制备的N355片段和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；
第八组：用实施例1的步骤一制备的N355片段、HBc87-95和抗CD25的抗体一起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次，抗CD25的抗体30微克/次；
第九组：用HBc87-95免疫BALB/c小鼠，HBc87-9550微克/次。
在1、2、3周各免疫一次；第4周用流式细胞仪检测(采用PE标记的抗CD25的抗体和FITC标记的抗CD4的抗体)。抗CD25的抗体可以有效去除HBc87-95和高剂量rgp96蛋白(或N355片段)诱导产生的Treg，T细胞数量、乙肝特异性T细胞和分泌IFN-γ的T细胞数量有明显提高；联合使用抗CD25的抗体可使总T细胞、乙肝特异性T细胞和分泌IFN-γ的T细胞数量分别增长31.52％，63.79％和75.75％(P＜0.05或0.01)。使用抗CD25的抗体有效去除HBc87-95和低剂量rgp96蛋白(或N355片段)诱导产生的Treg，T细胞数量、乙肝特异性T细胞和分泌IFN-γ的T细胞数量有明显提高(P＜0.05)；rgp96蛋白(或N355片段)和抗CD25的抗体混合使用，能有效提高rgp96蛋白(或N355片段)对T细胞的活化能力(P＜0.05或0.01)。第一组和第二组的结果见图12；A为流式细胞仪检测结果，B为抗CD25的抗体对Treg的数量的抑制作用(CD25阳性细胞占CD4阳性细胞的百分比)。CD25抗体处理可明显清除Treg，使Treg数量降低了9.2倍，差异极显著(P＜0.01)。
三、FoxP3的干扰RNA对gp96蛋白免疫活性的促进作用
6-8周龄BALB/c小鼠分成九组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；
第二组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、HBc87-95和FoxP3的干扰RNA一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-95 50微克/次，FoxP3的干扰RNA 500微克/次；
第三组：用实施例1的步骤一制备的N355片段和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；
第四组：用实施例1的步骤一制备的N355片段、HBc87-95和FoxP3的干扰RNA一起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次，FoxP3的干扰RNA 500微克/次；
第五组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；
第六组：用实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、HBc87-95和FoxP3的干扰RNA一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次，FoxP3的干扰RNA 500微克/次；
第七组：用实施例1的步骤一制备的N355片段和HBc87-95一起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；
第八组：用实施例1的步骤一制备的N355片段、HBc87-95和FoxP3的干扰RNA一起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次，FoxP3的干扰RNA 500微克/次；
第九组：用HBc87-95免疫BALB/c小鼠，HBc87-9550微克/次。
在1、2、3周各免疫一次；第4周用流式细胞仪检测(采用PE标记的抗CD25的抗体和APC标记的抗FoxP3的抗体)。FoxP3的干扰RNA可以有效去除HBc87-95和高剂量rgp96蛋白(或N355片段)诱导产生的Treg，T细胞数量、乙肝特异性T细胞和分泌IFN-γ的T细胞数量有明显提高；联合使用FoxP3的干扰RNA可使总T细胞、乙肝特异性T细胞和分泌IFN-γ的T细胞数量分别增长11.63％，42.67％和55.57％(P＜0.05或0.01)。使用FoxP3的干扰RNA有效去除HBc87-95和低剂量rgp96蛋白(或N355片段)诱导产生的Treg，T细胞数量、乙肝特异性T细胞和分泌IFN-γ的T细胞数量有明显提高(P＜0.05)；rgp96蛋白(或N355片段)和FoxP3的干扰RNA混合使用，能有效提高rgp96蛋白(或N355片段)对T细胞的活化能力(P＜0.05或0.01)。第一组和第二组的结果见图13；A为流式细胞仪检测结果，B为FoxP3的干扰RNA对Treg的数量的抑制作用。FoxP3的干扰RNA处理可明显清除Treg，抑制Treg的数量，使Treg数量降低了7.5倍，差异极显著(P＜0.01)。
实施例6、乙肝蛋白疫苗的制备和效果评价
一、乙肝蛋白疫苗甲的组成和效果评价
1、乙肝蛋白疫苗甲的组成
乙肝蛋白疫苗甲由实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)和环磷酰胺组成，各组分单独包装。
2、乙肝蛋白疫苗甲的效果评价
(1)疫苗前体的制备
将实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心蛋白(HBcAg)进行体外组装，得到疫苗前体。组装体系的溶剂为水，溶质及其浓度如下：20mM HEPES(pH7.2)，20mM NaCl，2mM MgCl2，100mM KCl，1mM PMSF，2ug/ul rgp96蛋白，1ug/ul HBsAg，1ug/ulHBcAg；组装条件：45℃10分钟(也可采用45℃10-30分钟，或4℃30-120分钟)。
稳定性：-80℃保存，6个月后SDS凝胶电泳未见明显降解或形成多聚物。
(2)分组给药
8周龄HBV转基因鼠分成两组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：10微升疫苗前体和0.4毫克环磷酰胺混合，作为单次免疫剂量；
第二组：每次免疫10微升疫苗前体。
在1、2、3周各免疫一次；8周后检测小鼠血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达。血清中HBsAg含量采用ELISA检测(乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒，购自上海科华生物工程股份有限公司)。肝脏细胞中HBcAg的表达比例采用免疫组化检测(抗体为HBcAg兔多抗，购自北京康为世纪公司，产品号CWP196)。第一组小鼠血清中HBsAg含量(OD值0.66±0.13)明显小于第二组小鼠(1.21±0.23)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。第一组小鼠肝细胞中HBcAg的表达比例(9％±2)明显小于第二组小鼠(20％±3)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。说明本发明的疫苗中，由于添加了环磷酰胺，对乙肝病毒复制的抑制作用显著提高。
二、乙肝蛋白疫苗乙的组成和效果评价
1、乙肝蛋白疫苗乙的组成
乙肝蛋白疫苗乙由实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)和抗CD25的抗体组成，各组分单独包装。
2、乙肝蛋白疫苗乙的效果评价
(1)疫苗前体的制备
同步骤一的2的(1)。
(2)分组给药
8周龄HBV转基因鼠分成两组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：10微升疫苗前体和30微克抗CD25的抗体混合，作为单次免疫剂量；
第二组：每次免疫10微升疫苗前体。
在1、2、3周各免疫一次；8周后检测小鼠血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达。血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达比例的检测方法同步骤一的2的(2)。第一组小鼠血清中HBsAg含量(OD值0.60±0.11)明显小于第二组小鼠(1.30±0.25)，二者差异达到极显著水平(P＜0.01)。第一组小鼠肝细胞中HBcAg的表达比例(8％±3)明显小于第二组小鼠(18％±3)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。说明本发明的疫苗中，由于添加了CD25抗体，对乙肝病毒复制的抑制作用显著提高。
三、乙肝蛋白疫苗丙的组成和效果评价
1、乙肝蛋白疫苗丙的组成
乙肝蛋白疫苗丙由实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)和FoxP3的干扰RNA组成，各组分单独包装。
2、乙肝蛋白疫苗丙的效果评价
(1)疫苗前体的制备
同步骤一的2的(1)。
(2)分组给药
8周龄HBV转基因鼠分成两组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：10微升疫苗前体和500微克FoxP3的干扰RNA混合，作为单次免疫剂量；
第二组：每次免疫10微升疫苗前体。
在1、2、3周各免疫一次；8周后检测小鼠血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达。血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达比例的检测方法同步骤一的2的(2)。第一组小鼠血清中HBsAg含量(OD值0.80±0.11)明显小于第二组小鼠(1.30±0.25)，二者差异达到极显著水平(P＜0.01)。第一组小鼠肝细胞中HBcAg的表达比例(10％±3)明显小于第二组小鼠(18％±3)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。说明本发明的疫苗中，由于添加了FoxP3的干扰RNA，对乙肝病毒复制的抑制作用显著提高。
四、乙肝蛋白疫苗丁的组成和效果评价
1、乙肝蛋白疫苗丁的组成
乙肝蛋白疫苗丁由实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)、环磷酰胺和抗CD25的抗体组成，各组分单独包装。
2、乙肝蛋白疫苗丁的效果评价
(1)疫苗前体的制备
同步骤一的2的(1)。
(2)分组给药
8周龄HBV转基因鼠分成两组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：10微升疫苗前体、0.4毫克环磷酰胺和30微克抗CD25的抗体混合，作为单次免疫剂量；
第二组：每次免疫10微升疫苗前体。
在1、2、3周各免疫一次；8周后检测小鼠血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达。血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达比例的检测方法同步骤一的2的(2)。
第一组小鼠血清中HBsAg含量(OD值0.46±0.14)明显小于第二组小鼠(1.25±0.20)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。第一组小鼠肝细胞中HBcAg的表达比例(5％±2)明显小于第二组小鼠(20％±2)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。说明本发明的疫苗中，由于添加了环磷酰胺和抗CD25的抗体，对乙肝病毒复制的抑制作用显著提高。与未附加免疫调节剂进行给药的HBV转基因鼠相比，上述四种疫苗均引起HBV转基因鼠血清中的HBsAg抗原降低50％以上，肝脏细胞中病毒清除70-80％以上(HBcAg转阴)，差异均达到极显著(P＜0.01)。以上研究表明本发明的疫苗有良好的抗HBV活性。
实施例7、乙肝表位疫苗的组成和效果评价
一、乙肝表位疫苗甲的组成和效果评价
1、乙肝表位疫苗甲的组成
乙肝表位疫苗甲由实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和环磷酰胺组成，各组分单独包装。
2、乙肝表位疫苗甲的效果评价
(1)疫苗前体的制备
将实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95和乙肝聚合酶表位140-148进行体外组装，得到乙肝蛋白疫苗前体。组装体系的溶剂为水，溶质及其浓度如下：20mM HEPES(pH7.2)，20mM NaCl，2mM MgCl2，100mM KCl，1mMPMSF，2ug/ul rgp96蛋白，上述三种表位各3ug/ul；组装条件：45℃10分钟(也可采用45℃10-30分钟，或4℃30-120分钟)。
稳定性：-80℃保存，6个月后SDS凝胶电泳未见明显降解或形成多聚物。
(2)分组给药
8周龄HBV转基因鼠分成两组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：10微升疫苗前体和0.4毫克环磷酰胺混合，作为单次免疫剂量；
第二组：每次免疫10微升疫苗前体。
在1、2、3周各免疫一次；8周后检测小鼠血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达。血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达比例的检测方法同实施例6的步骤一的2的(2)。第一组小鼠血清中HBsAg含量(OD值0.62±0.11)明显小于第二组小鼠(1.11±0.20)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。第一组小鼠肝细胞中HBcAg的表达比例(8％±2)明显小于第二组小鼠(19％±2)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。说明本发明的疫苗中，由于添加了环磷酰胺，对乙肝病毒复制的抑制作用显著提高。
二、乙肝表位疫苗乙的组成和效果评价
1、乙肝表位疫苗乙的组成
乙肝表位疫苗乙由实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和抗CD25的抗体组成，各组分单独包装。
2、乙肝表位疫苗乙的效果评价
(1)疫苗前体的制备
同步骤一的2的(1)。
(2)分组给药
8周龄HBV转基因鼠分成两组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：10微升疫苗前体和30微克抗CD25的抗体混合，作为单次免疫剂量；
第二组：每次免疫10微升疫苗前体。
在1、2、3周各免疫一次；8周后检测小鼠血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达。血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达比例的检测方法同实施例6的步骤一的2的(2)。第一组小鼠血清中HBsAg含量(OD值0.54±0.09)明显小于第二组小鼠(1.19±0.18)，二者差异达到极显著水平(P＜0.01)。第一组小鼠肝细胞中HBcAg的表达比例(7％±3)明显小于第二组小鼠(17％±2)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。说明本发明的疫苗中，由于添加了CD25抗体，对乙肝病毒复制的抑制作用显著提高。
三、乙肝表位疫苗丙的组成和效果评价
1、乙肝表位疫苗丙的组成
乙肝表位疫苗丙由实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和FoxP3的干扰RNA组成，各组分单独包装。
2、乙肝表位疫苗丙的效果评价
(1)疫苗前体的制备
同步骤一的2的(1)。
(2)分组给药
8周龄HBV转基因鼠分成两组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：10微升疫苗前体和500微克FoxP3的干扰RNA混合，作为单次免疫剂量；
第二组：每次免疫10微升疫苗前体。
在1、2、3周各免疫一次；8周后检测小鼠血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达。血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达比例的检测方法同实施例6的步骤一的2的(2)。第一组小鼠血清中HBsAg含量(OD值0.90±0.08)明显小于第二组小鼠(1.30±0.25)，二者差异达到极显著水平(P＜0.01)。第一组小鼠肝细胞中HBcAg的表达比例(12％±3)明显小于第二组小鼠(18％±3)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。说明本发明的疫苗中，由于添加了FoxP3的干扰RNA，对乙肝病毒复制的抑制作用显著提高。
四、乙肝表位疫苗丁的组成和效果评价
1、乙肝表位疫苗丁的组成
乙肝表位疫苗丁由实施例1的步骤二制备的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148、环磷酰胺和抗CD25的抗体组成，各组分单独包装。
2、乙肝蛋白疫苗丁的效果评价
(1)疫苗前体的制备
同步骤一的2的(1)。
(2)分组给药
8周龄HBV转基因鼠分成两组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：10微升疫苗前体、0.4毫克环磷酰胺和30微克抗CD25的抗体混合，作为单次免疫剂量；
第二组：每次免疫10微升疫苗前体。
在1、2、3周各免疫一次；8周后检测小鼠血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达。血清中HBsAg含量和肝脏细胞中HBcAg的表达比例的检测方法同实施例6的步骤一的2的(2)。第一组小鼠血清中HBsAg含量(OD值0.41±0.13)明显小于第二组小鼠(1.02±0.19)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。第一组小鼠肝细胞中HBcAg的表达比例(5％±2)明显小于第二组小鼠(19％±3)，二者差异达到显著水平(P＜0.05)。说明本发明的疫苗中，由于添加了环磷酰胺和抗CD25的抗体，对乙肝病毒复制的抑制作用显著提高。
与未附加免疫调节剂进行给药的HBV转基因鼠相比，上述四种疫苗均引起HBV转基因鼠血清中的HBsAg抗原降低60％以上，肝脏细胞中病毒清除80-90％以上(HBcAg转阴)，差异均达到极显著(P＜0.01)。以上研究表明本发明的疫苗有良好的抗HBV活性。
实施例8、黑色素瘤疫苗的组成和效果评价
一、gp96提取物的制备
用黑色素瘤细胞B16(购自ATCC，产品号CRL-6475)制备gp96提取物，方法如下：
1、组织匀浆
培养黑色素瘤细胞B16，收集细胞，加入组织8倍重量的匀浆缓冲液；将组织碎块搅匀倒入玻璃匀浆器，匀浆至底部组织块消失后再上下匀浆15次以上；匀浆液倒入离心管，50，000g离心60min，取上清加入1/10体积的10×PBS(pH7.5，200mM NaCl)，用于步骤2的ConA-Sepharose层析。
2、ConA-Sepharose层析
同实施例1的步骤三的2。
3、HiTrap-Q Sepharose离子交换层析
同实施例1的步骤三的3。
二、黑色素瘤疫苗的组成
黑色素瘤疫苗甲由步骤一制备的gp96提取物和环磷酰胺组成，各组分单独包装。
黑色素瘤疫苗乙由步骤一制备的gp96提取物和抗CD25的抗体组成，各组分单独包装。
黑色素瘤疫苗丙由步骤一制备的gp96提取物和FoxP3的干扰RNA组成，各组分单独包装。
三、分组免疫
C57BL/6J小鼠(6-8周龄，购自北京维通利华公司，品系C57BL/6J))分成四组，每组10只，分别免疫(体积相等)如下：
第一组：每只皮下注射5×104个黑色素瘤细胞B16；10天后开始免疫，每次同时免疫黑色素瘤疫苗甲的两个组分，gp96提取物20微克/次，环磷酰胺0.4毫克/次，每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后称量肿瘤重量。
第二组：每只皮下注射5×104个黑色素瘤细胞B16；10天后开始免疫，每次同时免疫黑色素瘤疫苗乙的两个组分，gp96提取物20微克/次，抗CD25的抗体30微克/次，每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后称量肿瘤重量。
第三组：每只皮下注射5×104个黑色素瘤细胞B16；10天后开始免疫，每次同时免疫黑色素瘤疫苗丙的两个组分，gp96提取物20微克/次，FoxP3的干扰RNA 500微克/次，每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后称量肿瘤重量。
第四组：每只皮下注射5×104个黑色素瘤细胞B16；10天后开始免疫，每次免疫步骤一制备的gp96提取物20微克/次，每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后称量肿瘤重量。
第一组小鼠肿瘤重量为0.92g±0.17，第二组小鼠肿瘤重量为0.62g±0.15，第三组小鼠肿瘤重量为1.25g±0.27，均明显小于第四组小鼠肿瘤重量(3.12g±0.35)，三个疫苗处理组与第四组差异均达到极显著水平(P＜0.01)。
注射黑色素瘤细胞B16开始计时，45天后统计各组小鼠的存活率。第一组小鼠的存活率为45％，第二组小鼠的存活率为45％，第三组小鼠的存活率为45％，第四组小鼠的存活率只有15％，三个疫苗处理组与第四组比较均具有显著差异(P＜0.05)。说明注射环磷酰胺、抗CD25的抗体或FoxP3的干扰RNA均能显著提高gp96提取物对肿瘤抑制效果。
Claims (10)
1.免疫调节剂在提高gp96蛋白相关物质的免疫活性中的应用；所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种；所述gp96蛋白相关物质为序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸残基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述含有gp96蛋白的提取物是将离体动物组织或离体肿瘤组织或离体肿瘤细胞的匀浆液依次进行ConA-Sepharose层析和HiTrap-Q Sepharose离子交换层析得到的；所述离体动物组织为离体小鼠肝脏、离体猪肝脏或离体人胎盘；所述肿瘤组织为乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌或胃癌；所述肿瘤细胞为人肝癌细胞HepG2或黑色素瘤细胞B16；
所述ConA-Sepharose层析包括如下步骤：
(1)将所述匀浆液上样于层析柱，流速为0.25ml/min；
(2)用10倍层析柱柱体积的洗脱液甲洗涤步骤(1)的层析柱，流速为0.5ml/min；所述洗脱液甲的制备方法为：在NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS中加苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；
(3)用3倍层析柱柱体积的洗脱液乙洗涤步骤(2)的层析柱，流速为0.25ml/min，收集洗脱液，即为洗脱液丙；所述洗脱液乙的制备方法为：在NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS中加α-D-吡喃葡萄糖至终浓度为10g/mL，加苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；
所述HiTrap-Q Sepharose离子交换层析包括如下步骤：
(a)将所述洗脱液丙上样于层析柱，流速为1ml/min；
(b)用5ml NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS洗涤步骤(a)的层析柱，流速为1ml/min；
(c)用10ml NaCl浓度为300mM pH7.5的PBS洗涤步骤(b)的层析柱，流速为1ml/min；
(d)用3ml NaCl浓度为600mM pH7.5的PBS洗涤步骤(c)的层析柱，流速为1ml/min，得到的洗脱液即为含有gp96蛋白的提取物。
3.一种疫苗佐剂，为如下(a)或(b)或(c)：
(a)由免疫调节剂和N355片段组成的疫苗佐剂；所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种；所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示；所述N355片段序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸残基所示；
(b)由免疫调节剂和gp96蛋白组成的疫苗佐剂；所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示；
(c)由免疫调节剂和含有gp96蛋白的提取物组成的疫苗佐剂；所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种；所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示。
4.一种乙肝疫苗，由gp96蛋白相关物质、乙肝表面抗原、乙肝核心蛋白和免疫调节剂组成；所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种；所述gp96蛋白相关物质为序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸残基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示。
5.一种抑制乙肝病毒的疫苗，由gp96蛋白相关物质、乙肝表面抗原、乙肝核心蛋白和免疫调节剂组成；所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种；所述gp96蛋白相关物质为序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸残基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示。
6.一种乙肝疫苗，由gp96蛋白相关物质、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和免疫调节剂组成；所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种；所述gp96蛋白相关物质为序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸残基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示；所述乙肝表面抗原表位362-371如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白表位87-95如序列表的序列7所示；所述乙肝聚合酶表位140-148如序列表的序列8所示。
7.一种抑制乙肝病毒的疫苗，由gp96蛋白相关物质、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和免疫调节剂组成；所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种；所述gp96蛋白相关物质为序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸残基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示；所述乙肝表面抗原表位362-371如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白表位87-95如序列表的序列7所示；所述乙肝聚合酶表位140-148如序列表的序列8所示。
8.一种黑色素瘤疫苗，由gp96蛋白相关物质和免疫调节剂组成；所述免疫调节剂为环磷酰胺、抗CD25的抗体和Foxp3的干扰RNA中的至少一种；所述gp96蛋白相关物质为序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸残基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述Foxp3的干扰RNA如序列表的序列5所示。
9.如权利要求3所述的疫苗佐剂或权利要求4至8中任一所述的疫苗，其特征在于：所述含有gp96蛋白的提取物是将离体动物组织或离体肿瘤组织或离体肿瘤细胞的匀浆液依次进行ConA-Sepharose层析和HiTrap-Q Sepharose离子交换层析得到的；所述离体动物组织为离体小鼠肝脏、离体猪肝脏或离体人胎盘；所述肿瘤组织为乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌或胃癌；所述肿瘤细胞为人肝癌细胞HepG2或黑色素瘤细胞B16；
所述ConA-Sepharose层析包括如下步骤：
(1)将所述匀浆液上样于层析柱，流速为0.25ml/min；
(2)用10倍层析柱柱体积的洗脱液甲洗涤步骤(1)的层析柱，流速为0.5ml/min；所述洗脱液甲的制备方法为：在NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS中加苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1mM；
(3)用3倍层析柱柱体积的洗脱液乙洗涤步骤(2)的层析柱，流速为0.25ml/min，收集洗脱液，即为洗脱液丙；所述洗脱液乙的制备方法为：在NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS中加α-D-吡喃葡萄糖至终浓度为10g/mL，加苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；
所述HiTrap-Q Sepharose离子交换层析包括如下步骤：
(a)将所述洗脱液丙上样于层析柱，流速为1ml/min；
(b)用5ml NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS洗涤步骤(a)的层析柱，流速为1ml/min；
(c)用10ml NaCl浓度为300mM pH7.5的PBS洗涤步骤(b)的层析柱，流速为1ml/min；
(d)用3ml NaCl浓度为600mM pH7.5的PBS洗涤步骤(c)的层析柱，流速为1ml/min，得到的洗脱液即为含有gp96蛋白的提取物。
10.如权利要求9所述的疫苗或疫苗佐剂，其特征在于：所述疫苗的各个组分均单独包装。
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