CN102460127A - 用于识别和定量分析被分析物，特别是真菌毒素的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于识别和定量分析被分析物的装置和方法以及它们用于识别和定量分析真菌毒素的应用。

Description

用于识别和定量分析被分析物，特别是真菌毒素的装置和方法
本发明涉及一种用于识别（Nachweis）和定量分析被分析物的装置和方法以及它们用于识别和定量分析真菌毒素的应用。
在生物化学和医学中，分析经常是基于检测以已知的量和位置存在的分子(分子探针)与待检测的未知分子(分子的目标或靶分子)之间的相互作用。
为了检测该相互作用，探针（通常固定到载体上）和与样品溶液中存在的靶分子接触和在规定条件下培养。作为所述的培养的结果，在探针和目标之间发生了特异性的相互作用，其能够以不同的方式探测。检测是基于这样的事实，即，靶分子仅仅会与特定的探针分子形成特异性结合。所述的结合明显比靶分子与对于该靶分子来说不是特异性的探针的结合更稳定。没有特异性结合的靶分子可以通过清洗除去，而该特异性结合的靶分子通过探针得以保留。
在现代的测定中，将多种探针以作为矩阵(阵列)的物质库形式以这样的方式设置到载体上，即，样品可以在多个探针上同时进行平行的分析(D. J. Lockhart，E. A. Winzeler，Genomics，gene expression and DNA arrays；Nature 2000，405，827-836)。
靶和它的探针之间的特异性相互作用因此可以基于人们所说的“标记物”，通过多种方法来进行，其通常取决于在该靶分子与探针所述的相互作用之前、之中或者之后所引入的标记物的类型。典型地，这样的标记物是荧光基团，并因此特异性的靶分子-探针相互作用可以以荧光-光学方式，用比其他常规检测方法，特别是质量敏感方法更高的空间解析度和更少的花费来读出(A. Marshall，J. Hodgson，DNA Chips：An array of possibilities，Nature Biotechnology1998，16，27-31；G. Ramsay，DNA Chips：State of the art，Nature Biotechnology 1998，16，40-44)。
在本上下文中特别有利的是使用渐逝场生物芯片作为探针分子的载体。渐逝场生物芯片包含光波导，其能够用于检测与该波导层毗邻介质的光学性能变化。当光是以引导模式在该波导层中传播时，在该介质/波导器界面处光场不会突然消失掉，而是在邻近该波导器的人们所说的检测介质中呈指数下降。这种指数下降的光场被称作渐逝场。在该渐逝场中，毗邻该波导器的介质的光学性能的变化可以通过合适的测量装置来检测。
因此，可以经由波导器/固定化的物质界面层的光学性能变化，来在对于固定到波导器上的探针特异性结合的靶分子进行检测。
优选给出的是检测该渐逝场中的荧光信号。该荧光标记的探针/靶分子结合对是通过渐逝场激励的。渐逝场生物芯片的一个例子在US5959292中给出。
取决于固定在载体上的探针的物质库和取决于靶分子的化学性质，基于这种测定原理，可以研究例如核酸与核酸之间，蛋白质与蛋白质之间，抗体与抗原之间，和核酸与蛋白质之间的相互作用。
为了能进行实际的快速检测方法，数年来已经尝试了小型化化学-和/或生物传感器装置和完成几乎全部的试剂(其要求在人们所说的分析盒中定性和/或定量测量样品)备用。更特别地，使用了微流体工艺，目标是制造可供使用的廉价的、可存储的和易于操作的一次性盒子，其能够实时传递可再现的结果。
关于分析盒的存储性和运输性，现有技术特别利用了干燥测定技术，在其中全部的试剂是以干燥状态提供在盒子中的，任选地提供到分开的室中。该样品液体通常依靠微流体通道从一个室传输到下一个室中。
例如，WO2005/088300描述了一种整合的微流体分析盒，用于血液分析，其是由下物体部分和上物体部分组成的。两种元件是结构化的，具有室和通道(其是通过两个部分的拼合来封闭的)。该测试盒具有一个或多个用于制备样品的预处理的元件(预处理室)，一个或多个用于识别样品液体的一种或多种靶分子的多层干燥测定元件(检测室)，和一个或多个连接该预处理元件与该多层干燥测定元件的通道(平均≤3mm)。该预处理元件特别是过滤器元件或者是这样的具有多孔性能的元件，其为通道或者(微米/纳米)垫(其任选地带有干燥剂)形式。该样品首先行经该预处理元件，然后进入该多层干燥测定元件。该多层干燥测定识别元件具有至少一个带有探针的功能层，该探针用于定性和定量测定干燥和稳定形式的靶分子。这种试剂层由水吸收层组成，在其中可被激励的探针相当规则地分布在亲水聚合物结合材料(凝胶，琼脂糖等等)中。检测是经由穿过光透明窗的反射测光法，通过照亮该多层干燥测量元件中的检测层来进行的，在该层中，扩散有来自该识别反应的可光学激励液体。该样品是通过使用毛细管力或者压力来传输的。这种装置的缺点是该多层干燥测定元件设计的复杂性和被分析物与检测试剂的混合未经优化。此外，各个反应步骤精确的时间控制，特别是体积和培养时间的控制，是不可能的，因此测试结果不能定量再现。没有描述参考方式。
对于生物化学分析来说，侧向层析测定(LFA)工艺在多年以来就已经是已知的。侧向层析测定(LFA)利用了抗体-抗原反应的作用。另外，通过毛细管力将待分析的样品(溶液)沿着传感器表面牵引。为了依靠LFA来检测被分析物，例如直接竞争性免疫测定可以在硝化纤维条上进行，其中待分析的样品由于毛细管力而被牵引通过整个硝化纤维条。区域(抗-被分析物抗体已经固定在其中)被用作该条测定的检测区。检测真菌毒素(例如脱氧瓜萎镰菌醇)的LFA测定的一个例子是来自Neogen，Lansing，MI，USA的揭示测定(Reveal-Assay)(测试盒子)，具有相应的AccuScan阅读器。将分析盒***该阅读器中，该仪器记录了所述条测定的结果区的图像。该阅读器解释了该结果图像，并且当线已经识别时，进行了评价。该仪器消除了解释的主观性，并且提供了对于测试结果客观的、可实行的资料。所述的测定能够容易和相当快速地进行，并且不需要任何复杂的读出仪器。不利的是，该方法仅仅允许定性或者最多半定量进行真菌毒素检测。
WO2007/079893描述了一种快速检测真菌毒素的方法，其包含将用于真菌毒素的固定化的结合配偶体的经负载的物质库和/或用于真菌毒素的探针(在空间隔开的测量区域中)施加到薄层波导器的表面，将含有真菌毒素和所述真菌毒素的探针的样品与固定化的结合配偶体接触，和基于渐逝场中(即，在该波导器界面处)的信号变化，来检测所述的固定化的结合配偶体与该真菌毒素和/或所述真菌毒素的识别要素的反应。特别有利的是，该方法能够限制或者甚至完全免去清洗掉在信号检测之前荧光标记的结合配偶体或者含有标记的结合配偶体的样品或者溶液。这能够节约分析过程的时间和简化该过程，因为能免去提供清洗溶液。信号强度是基于测定照片，依靠合适的软件来确定的，计算样品中存在的真菌毒素的量也是如此。但是，该现有技术已经公开了合适的参考方法对于定量分析的可靠性是有利的。WO2007/079893没有描述这样的参考方法。
现有技术描述了利用一种或多种测量区域用于测量的校正。例如WO01/13096使用测量区域用于在多个沿着传感器平台分布的样品容器中参考相同的化学或者光学参数(例如局部可利用的激励光的强度)，使得能够确定所述参数在传感器平台上的局部分布。用于上述排列的测量区域中的参考用的测量区域的数目和位置是任意的。
EP-A0093613描述了一种方法，依靠传感器，基于光波导的渐逝场中荧光激励来校正样品液体中靶分子的定量测定，该传感器具有第一测量区域(测量区)，用于特异性结合第一标记(其的用量是样品中所存在的被分析物的函数)，和第二测量区域(校正区)，用于结合第二标记，其中所述两个标记的结合不受样品中被分析物存在的影响。该测量区和校正区利用了不同、但性质相似的结合对。该第二标记物在测定过程中在校正区中的量产生了用于在浓缩区域中的被分析物的预定浓度的信号值。两个测量区域是在相同的基础结构上紧靠着放置的，目的是使得由传感器可能的局部变化引起的差异最小化。用测量区的信号值除以紧邻着其放置的校正区的信号值，来校正该传感器对于该信号的非特异性作用。没有给出该传感器的构造和激励光束的方向的任何细节。
WO2004/023142描述了一种方法，依靠传感器，基于光波导的渐逝场中荧光激励来校正样品液体中靶分子的定量测定，在该传感器上，识别元件和参考分子(Cy5-BSA，BSA=牛血清白蛋白)已经以垂直于渐逝场传感器平台中引导的激励光的传播方向的分别平行交替的微阵列，分别以测量点和参考点进行了点样。为了参考每个测量点的信号强度，将所述测量点的净信号强度除以同一排的相邻参考点(在激励光传播方向上排列)的平均净信号强度。这种参考补偿了垂直于光传播方向的可利用的激励光强度的局部差异，包括每个微阵列内的和不同微阵列之间二者。
当使用现有技术所述的参考方法时，已经表明不适于参考流体***中的测定。当使用点样的荧光蛋白质作参考时，它倾向于仅仅能够补偿***中的在传感器水平上发生的这些波动，例如诸如荧光的衰减或者阵列点中的波动。
由所述现有技术出发，一个目标是提供廉价的、可存储的和易于操作的手段，用于依靠负载在薄膜波导体(PWG生物芯片，PWG=平面波导)上在空间隔开的测量区域(免疫测定)中的固定化的结合配偶体的物质库，来定量分析被分析物，特别是真菌毒素。本发明的另一目标是使得能够进行所产生信号的绝对测量，即，参考。
这个目标根据本发明通过微流体分析盒来实现，该分析盒用于定性和/或定量分析被分析物，特别是真菌毒素，其包括进行该测定所需的干燥形式的全部试剂。本发明的分析盒具有结构化体，向其中已经引入了通过通道彼此连接的腔室。根据本发明，该分析盒具有至少一个用于引入包含真菌毒素的样品液体的入口，至少一个试剂室和至少一个检测室。该试剂室容纳着干燥形式的一种或多种标记的真菌毒素探针和标记的参考探针，所述真菌毒素探针用于与来自样品液体的真菌毒素反应，所述标记的参考探针用于与参考抗原反应。该检测室的底部是由薄膜波导体(PWG生物芯片)组成，其包含在第二光学透明层(b)上的第一光学透明层(a)，该层(b)的折射率低于层(a)，并且在其中引入了光栅，该光栅是垂直于激励光的光路来取向的，该激励光依靠所述光栅耦合到该薄膜波导体中。检测试剂是如下来固定到薄膜波导体表面上的：通过在成排的空间隔开的测量区域中施加用于真菌毒素和/或用于真菌毒素探针的固定化的结合配偶体的物质库形式的真菌毒素测定(免疫测定)，和包含固定化的参考抗原的独立的对照测定。该阵列是以这样的方式施加到PWG生物芯片上的，即，测量区域成排地平行于光栅取向。在激励光的方向上，在每排免疫测定的上面和下面各有一排对照测定(参见图1)，来使得能够如下来获得真菌毒素测定测量区域的参考的荧光强度：用该真菌毒素测定测量区域的荧光强度除以在激励光方向上相邻的对照测定测量区域的平均荧光强度。
令人惊讶地表明，在流体***中免疫测定的参考通过使用本发明的动态参考概念替代已知的静态参考概念带来相当大的改进。有利地，动态参考能够补偿流体***中的波动(例如在通道中的吸收，体积波动，垫子中抗体量的变化)和PWG生物芯片表面上的波动(例如衰减，斑点中的变化)二者。
因此，本发明的第一主题是一种用于识别和定量分析样品液体中的被分析物的分析盒(Kartusche)，其包含结构化体，向其中引入了通过通道彼此连接的腔室，所述分析盒具有至少一个用于引入包含被分析物的样品液体的入口，至少一个试剂室和至少一个检测室，其中
a. 在该试剂室中设置有干燥形式的一种或多种标记的被分析物探针和一种或多种标记的参考探针，所述被分析物探针用于与来自样品液体的被分析物反应，所述参考探针用于与参考抗原反应，
b. 该检测室的底部是薄膜波导体，其包含在第二光学透明层(b)上的第一光学透明层(a)，该层(b)的折射率低于层(a)，并且在层(a)或者(b)中引入了光栅，该光栅是垂直于激励光的光路来取向的，该激励光依靠所述光栅耦合到该薄膜波导体中，
c. 将免疫测定和独立的对照测定施加到所述薄膜波导体表面上，该免疫测定呈被分析物和/或被分析物探针的结合配偶体物质库的形式，该结合配偶体固定在成排的空间隔开的测量区域中；所述对照测定包含参考抗原，该参考抗原固定在成排的空间隔开的测量区域中，和
d. 各排是平行于该光栅取向的，并且在激励光的方向上，在每排免疫测定的上面和下面都存在一排对照测定。
优选如此选择该对照测定，以使得该参考抗原的分子量类似于被分析物，和该参考探针的结合性能类似于被分析物探针(亲合性，结合动力学)。此外，该对照测定不得表现出与该免疫测定的任何交叉反应性，并且该抗原不得自然产生于被测试基质中。
此外有利的是该对照测定和免疫测定的降解行为是类似的，来为生产批次提供校正曲线的长期稳定性。
在本发明一种特别的实施方案中，该被分析物是真菌毒素。
优选给出的是使用WO2007/079893所述的免疫测定，其内容在此引入作为参考。
优选作为免疫测定的是成排的真菌毒素-蛋白质缀合物例如真菌毒素-BSA缀合物。
对照测定的例子是对真菌毒素的测定，其不在测试基质中自然产生。该对照测定优选是这样选择的，即，检测≤1000g/mol的分子。特别优选给出的是在PWG生物芯片上施加用于荧光素的对照测定和一排对照-蛋白质缀合物，例如荧光素-BSA。
该PWG生物芯片例如由涂覆有五氧化二钽层的玻璃载体(Glasträger)组成。该层的厚度是40-160nm，优选80-160nm，特别优选120-160nm，非常特别优选155nm。该玻璃载体包含这样的光栅，其的光栅深度(Gittertiefe)是3-60nm，优选5-30nm，特别优选10-25nm，非常特别优选18nm，和光栅周期(Gitterperiod)是200-1000nm，优选220-500nm，特别优选318nm。优选该光栅具有单个周期，即，它是单衍射(monodiffraktiv)的。
该五氧化二钽表面通常涂覆有单层形式的十二烷基磷酸酯/盐。被分析物-蛋白质缀合物，优选真菌毒素-BSA缀合物，和参考抗原-蛋白质缀合物，优选荧光素-BSA-缀合物固定在这个表面上。为了固定化，通常向所述的表面上施加和在这里吸收下面浓度的蛋白质缀合物：0.1-5mg/ml，优选0.2-2mg/ml，特别优选0.5-1.5mg/ml，非常特别优选1mg/ml。
该蛋白质缀合物可以使用选自下面的一种或多种方法来施加：喷墨点样，使用针或者笔的机械点样，微接触印刷，测量区域与生物或者生物化学或者合成识别元件通过在压力差或者电或者电磁势作用下将后者供给到平行或者交叉的微通道中而进行的流体接触。
在蛋白质缀合物固定后，PWG芯片表面仍然空闲的区域是通过BSA处理来钝化的，目的是抑制非特异性结合。
该PWG生物芯片构成了本发明分析盒的检测室的底部，并且整合到所述的分析盒中。
该分析盒由结构化体组成，其中引入了腔室和通道，并且该腔室优选以这样的方式引入所述体中，即，它们通过施加密封单元而至少在一个面上形成。该结构化体是依靠密封单元在顶部和底部密封的，入口、检测室底部和任选的通风口除外。优选给出的是，在所述密封单元之前，使所述生物芯片就位，并通过该密封单元将所述生物芯片保持在所述位置上。该密封单元优选是密封膜。
优选给出的是在该通道和在该室中传输精确界定体积的样品液体，并且这通过通道和室的设计以及通过使用传输该样品液体的合适的期间而成为可能。反应时间在此同样能够精确控制，这提高了该分析的可再现性。所述室和通道的匹配设计确保了具有降低的死体积的最佳流动曲线，和任选的与固定化检测试剂的最佳接触。
通道将入口、试剂室和检测室彼此相连，并且通常直径是0.1-2.5mm，优选0.5-1.5mm，特别优选1mm。
在分析盒的一种特别的实施方案中，该试剂室具有试剂垫，在其上设置有被分析物探针和参考探针，特别是用于用于真菌毒素和荧光素的抗体。
对该试剂垫如此选择：使得满足该检测室下面的要求：上清液溶液的液体体积和在所述溶液中各个组分的浓度。
该试剂垫通常是由纤维或者多孔材料，例如细粒子或者织物组成，试剂已经混入(通过在其上吸收，在其上固定，在其中分散，在其中干燥)其中。优选的试剂垫是由玻璃或者聚合物例如诸如纤维素组成的。例如，所用的试剂垫还用于人们所说的侧向层析测定中，并且其是不同形式的市售品。
优选的试剂室需要10-100µl，优选20-60µl，特别优选40µl的液体体积，并且溶解在其中的被分析物探针和参考探针的浓度是10-7 M-10-10M，优选纳摩尔浓度。
这种试剂室是通过选择试剂垫来填充的，其优选由来自Pall Corporation的特厚玻璃过滤器(孔径1 µm，典型的厚度1270µm(50密尔)，典型的水流速210ml/min/cm2，30kPa)组成，具有彼此叠置的两个圆形过滤片，该过滤片具有适配的直径(通常是5-10mm)。所形成的试剂垫通常浸渍有大约100µl的溶液，该溶液含有荧光标记的探针和通常用于支持所述浸渍的另外的组分。该浸渍例如是通过干燥或者冻干来进行。
该试剂垫通常是在分析盒中，以这样的方式来运行的，即，将它用大约80µl的样品液体(例如真菌毒素提取物)进行润湿。
在1-10min的预培养时间之后，通常将20-60µl的溶液传输到检测室中。
精确的体积控制对本发明是有利的，但并非必需的，因为不同的分析盒之间的变化可以通过本发明的参考方法来补偿。
本发明还涉及一种依靠本发明的分析盒来识别被分析物，特别是真菌毒素的方法。
本发明的第二主题是一种定量分析被分析物的方法，其包含以下步骤：
a. 任选地将被分析物从基质中萃取到样品液体中，
b. 在权利要求1-7任一项的分析盒中进行测定，其中在该样品液体已经引入该分析盒之后，将所述的样品液体传输到试剂室中，并且与施加到这里的标记的探针混合和/或反应，然后
c. 将该样品液体传输到检测室中，并且让该被分析物和/或该标记的探针与免疫测定和对照测定反应，随后
d. 照亮该薄膜波导体来激励免疫测定和对照测定的经标记的探针，用于发荧光和拍摄荧光图像，然后
e. 基于该对照测定来计算该免疫测定的参考的荧光强度，其中每个免疫测定测量区域的参考的荧光强度是如下来计算的：将所述的免疫测定测量区域的荧光强度除以在激励光方向上相邻的对照测定测量区域的平均荧光强度，和
f. 基于校正曲线来计算和显示该被分析物值。
如果该真菌毒素存在于固体基质中，后者通常在本发明方法的任选的第一步骤中经破碎，随后用合适的溶剂从基质中提取真菌毒素。提取剂的例子是甲醇、乙醇或者乙腈的水溶液。固体基质的例子是小麦，玉米，大麦，黑麦，花生，榛实等等。如果该提取物包含大于10%的非水性溶剂，则在填充分析盒之前通常需要稀释步骤。液体基质(牛奶，果汁，酒等)可以直接或者在合适的稀释之后加入到该分析盒中。
在另外的步骤中，用户将该提取物或者样品溶液填入到该分析盒中，并且密封该分析盒。该分析盒然后填入到阅读器中。该阅读器包含泵，其将空气泵入到该分析盒中，并且因此将溶液从样品入口传输到反应室中，在这里所述的溶液润湿了施加到这里的试剂垫。
当该试剂垫润湿时，借助于提取物将该抗体从试剂垫上溶出，并因此与所述的提取物进行混合。
提取物在该试剂垫中的培养时间优选是1-20min，特别优选3-7min。所述泵现在再次将空气泵入该分析盒中，并由此将液体体积移动到PWG生物芯片上面的检测室中。再次进行培养步骤，其通常持续1-100min，优选5-15min。
优选地，在所述方法过程中，将该分析盒加热到优选20-37℃，特别优选25℃的温度。
在标记的抗体在PWG生物芯片上的培养之后，将激光束耦合到光栅中。通过PWG生物芯片的面照明来激励标记的抗体，使其发荧光。该生物芯片的荧光图像是借助于照相机和合适的荧光滤光片来记录的。
图像分析软件(其安装在阅读器的计算机上)现在确定了真菌毒素和对照测定测量区域的荧光强度。真菌毒素测定测量区域的参考的荧光强度是如下来获得的：将真菌毒素测定测量区域的荧光强度除以在激励光方向上相邻的对照测定测量区域的平均荧光强度。
在真菌毒素测定测量区域的参考荧光强度与移液到分析盒中的溶液中的真菌毒素浓度之间的定量关系通常是通过记录校正曲线来建立的。所形成的数学关系式存储于阅读器的计算机上。
当测量样品时，参考的荧光强度是在拍摄荧光图像之后确定的，并且相应的真菌毒素浓度是基于校正曲线来计算的。该真菌毒素值然后显示在阅读器的屏幕上。
本发明的装置和本发明的方法将基于下面的实施例和附图进行更详细的说明，但不限于此。
附图：
图1：真菌毒素阵列的构造
图2：分析盒设计
图3：PWG生物芯片侧视图
图4：PWG生物芯片尺寸。
附图标记：
1 分析盒
2 入口
3 通道
4 具有试剂垫的试剂室
5 检测室
6 PWG生物芯片
7 光栅
8 玻璃板
9 波导层
10 十二烷基磷酸酯/盐/附着力促进层的单层
11 参考点/对照测定
12 真菌毒素-BSA缀合物点/免疫测定
13 参考点/对照测定
14 BSA。
分析盒(1)由结构化体组成，向其中已经引入了通道和腔室。
例如，本发明的分析盒是通过注塑法来生产的。所述的体是由黑色聚甲醛(POM)制成的板组成的，在其中已经钻孔和铣削出通道和室。
该分析盒(1)包含入口(2)（用于将含有待检测的被分析物的样品液体加入到分析盒(1)的样品室中），具有试剂垫(4)的试剂室（将样品液体经由通道(3)传输到其中），和检测室(5)（将样品液体经由另一通道(3)传输到其中，并且包含PWG生物芯片(6)）。
将反应室(4)包含的用荧光染料(该抗体对于来自样品液体的真菌毒素是特异性的)标记的抗体，和对于荧光素特异性的标记的抗体，浸渍到试剂垫上。
将PWG生物芯片(6)和试剂垫二者保持在POM板中的两个聚烯烃膜之间，该膜还充当了密封膜，用于密封所述测试盒。上密封膜的厚度是180µm，下部密封膜的厚度是80µm。
下膜在PWG生物芯片(6)中具有窗口，其提供了到达PWG生物芯片(6)的测量区的自由通路。
在测试开始时，将样品液体通过入口(2)引入到样品室中，并且入口(2)用合适的盖子气密性密封。将界定体积的空气在入口借助于传输单元引入到分析盒(1)中。这种体积的空气排挤样品液体，使得流入试剂室(4)和完全润湿该试剂垫。
由于向该试剂室(4)导入样品液体，因此抗体被溶解，与该样品液体混合和与所述的样品液体中存在的真菌毒素形成特异性结合(真菌毒素-抗体缀合物)。随着样品液体中的真菌毒素量的增加，抗体的自由结合位置变得逐渐饱和。
在25℃温度一定的停留时间(10分钟)之后，将该含有真菌毒素-抗体缀合物和用于荧光素的抗体的样品液体在接下来的步骤中传输到检测室(5)中。
在检测室(5)中，检测了该生物化学检测反应的过程或者端点。
该检测室(5)被该样品液体完全填充。整个通道***是排气的(entlüftet)。整个通道***的排气是通过施加到上密封膜上的排气孔来进行的。
检测室(5)包含PWG生物芯片(6)。图2示意性显示了PWG生物芯片(6)的顶视图，和图3示意性显示了PWG生物芯片(6)的侧视图。
检测室(5)中的PWG生物芯片(6)由厚度0.7mm的10mm×12mm玻璃板(8)(12.0+/-0.05mm×10.0+/-0.05mm×0.70+/-0.05mm)组成。Ta2O5(五氧化二钽)的薄的155nm波导层(9)位于PWG芯片(6)的一个面上。该芯片的测量区由中心10mm×6mm的矩形区组成。平行于这种测量区，这里存在着500µm宽度的新月形带子：用于耦合激励光的光栅(7)。光栅(7)相对于边缘的位置精确度是+/-0.05mm。该光栅深度是18nm，光栅周期是318nm，占空度是0.5。
将十二烷基磷酸酯/盐单层作为附着力促进层(10)施加到该PWG生物芯片(6)上。该附着力促进层(10)上以吸附方式滴加/固定化真菌毒素-BSA缀合物，其处于免疫测定(12)的形式，呈平行于光栅的成排的点的形式(阵列)。在每排真菌毒素-BSA 缀合物点(免疫测定(12))上面和下面是一排BSA-荧光素点(对照测定/参考点(11，13))(图1)。免疫测定(12)和对照测定之间的自由区是用BSA(14)闭塞的(钝化)。
在检测室(5)中，该真菌毒素-抗体缀合物和任选的，具有自由结合位置的抗体以及用于荧光素的抗体到达了固定化的被分析物-BSA缀合物的免疫测定(12)，和到达PWG生物芯片(6)上的对照测定(11，13)。具有自由结合位置的抗体形成了与对应的固定化被分析物-BSA缀合物的特异性结合。
所述溶液中存在的具有自由结合位置的抗体越多(即，样品液体中对应的被分析物的比例越低)，用荧光染料标记的抗体结合到PWG生物芯片上越多。用样品液体中的被分析物饱和的抗体保持在所述溶液中。
通过将电磁辐射耦合到该PWG生物芯片(6)中，可以在波导器的渐逝场中激励结合到固定化的被分析物-BSA缀合物上，并且用荧光染料标记的抗体发荧光。在溶液中存在的并用荧光染料标记的抗体在这种情况中没有被激励。在这种方式中，样品液体中存在的真菌毒素被间接定量测定。
真菌毒素点的参考的荧光强度是如下来获得的：将真菌毒素点的荧光强度除以参考点的平均荧光强度。
真菌毒素点的参考的荧光强度与移液到分析盒中的溶液中的真菌毒素浓度之间的定量关系是通过记录校正曲线来确定的。所形成的数学关系存储在阅读器的计算机上。
实施例 1
制备分析盒，用于测量 PWG 生物芯片上的脱氧瓜萎镰菌醇 (DON)
将24个PWG生物芯片(Unaxis，Liechtenstein)净化和用十二烷基磷酸酯/盐涂覆，所述生物芯片的外部尺寸：10mm×12mm，由玻璃制成，并且具有五氧化二钽的层(155nm)，该层中已经印刷有光栅(光栅深度18nm)。将脱氧瓜萎镰菌醇和牛血清白蛋白的缀合物(DON-BSA，Biopure，奥地利)以及牛血清白蛋白和荧光素的缀合物(BSA-FITC，Sigma，德国)借助于Nanoplotter(Ge-SIM，德国)类型的点样机施加到该生物芯片上。该点是以交替成排的形式施加到PWG生物芯片上的，在每排中各有16个BSA-FITC 缀合物点和BSA-DON 缀合物点，这样在每种情况中，所述的排平行于所述光栅。将所述点干燥，然后经历BSA水溶液的雾处理。将该PWG生物芯片清洗，然后干燥。将该PWG生物芯片使用双面胶带粘合到分析盒中。所述的分析盒包含用于容纳样品的样品室，具有玻璃纤维垫的试剂室和用于PWG生物芯片的检测室。所述室是通过通道彼此连接的。该玻璃纤维材料浸渍有抗体的纳摩尔浓度的溶液，该抗体是用荧光染料DY-647(Dyomics，德国)标记的，其中使用抗脱氧瓜萎镰菌醇和荧光素的单克隆抗体。该抗体已经溶解在含有BPS(=磷酸盐缓冲的盐水)，0.1%卵清蛋白，0.05%吐温和5%的蔗糖的缓冲液中。将所获得的试剂垫真空干燥，然后印刷到分析盒中。将该分析盒用密封膜在两个面上密封，来密封所述的通道。
实施例 2
记录标准曲线 ( 校正曲线 ) ，用于 DON 的定量测量
制备了浓度0-6000ppb的DON溶液，并且向17个分别的分析盒填入在每种情况中200µl所述的溶液。密封所述分析盒，然后填入到MyToLab 阅读器(Bayer Technology Services，德国)中。设定该阅读器，以使得该仪器的内部传输单元将填入到该分析盒中的液体首先传输到试剂垫中，并且预培养5分钟的时间后，传输到检测室中。在此期间，温度保持恒定在25℃。在芯片室中10min的培养时间之后，将激光耦合到该PWG生物芯片的光栅中。拍摄每个单个PWG生物芯片的荧光图像，积分时间2-3s。将所获得的每个DON点的荧光强度除以位于各DON点上面和下面的BSA-FITC点的平均荧光强度。确定了全部16个DON点的以此方式参考的平均荧光强度。将所获得的依赖于浓度的参考的荧光强度借助于计算机程序Origin 7G(Origin Lab Corporation，美国)通过S形拟合进行拟合。
实施例 3
测量人工污染的小麦样品中的 DON
将小麦粒研磨，并将所形成的面粉用已知量的DON溶液处理，将其放置干燥。该均化的样品包含了888mg/kg(ppb)的DON。将5g面粉样品用25ml的70%甲醇通过强力震荡3min来提取。将提取物静置沉降，将上清液用缓冲液以1：3的比例稀释。将该稀释的提取物填入到7个不同的分析盒中。该分析盒然后如上所述在MyToLab 阅读器中测量，并且确定了DON点的参考的荧光强度。相对于上述标准曲线来确定DON浓度(单位：ppb)，这产生了1042，757，710，660，431，728和984ppb的值。DON测量的平均值是760ppb，具有27%的百分比标准偏差。

Claims (11)

1.用于识别和定量分析样品液体中的被分析物的分析盒，其包含结构化体，在其中引入了通过通道彼此连接的腔室，其中所述分析盒具有至少一个用于引入包含该被分析物的样品液体的入口，至少一个试剂室和至少一个检测室，其中
a. 该试剂室中设置有干燥形式的一种或多种标记的被分析物探针和一种或多种标记的参考探针，所述被分析物探针用于与来自所述样品液体的所述被分析物反应，所述参考探针用于与参考抗原反应，
b. 该检测室的底部是薄膜波导体，其包含在第二光学透明层(b)上的第一光学透明层(a)，该层(b)的折射率低于层(a)，并且在层(a)或者(b)中引入了光栅，该光栅垂直于激励光的光路取向，该激励光依靠所述光栅耦合到该薄膜波导体中，
c. 将免疫测定和独立的对照测定施加到所述薄膜波导体表面上，所述免疫测定为针对被分析物和/或被分析物探针的结合配偶体物质库形式，该结合配偶体固定在成排的空间隔开的测量区域中；所述对照测定包含参考抗原，该参考抗原固定在成排的空间隔开的测量区域中，和
d. 所述各排平行于该光栅取向，并且在激励光的方向上，在每排免疫测定的上面和下面都有一排对照测定。
2.权利要求1的分析盒，特征在于该参考抗原的分子量类似于该被分析物，该参考探针的结合性能类似于该被分析物探针，该对照测定不表现出任何对免疫测定的交叉反应性，和该参考抗原不存在于所测试的基质中。
3.权利要求1和2任一项的分析盒，其中该被分析物探针是抗体。
4.权利要求1-3任一项的分析盒，特征在于该被分析物是真菌毒素。
5.权利要求4的分析盒，其中该参考抗原在对照测定中≤1000g/mol。
6.权利要求4和5任一项的分析盒，其中该参考抗原是荧光素。
7.权利要求4-6任一项的分析盒，其中该免疫测定包括真菌毒素-蛋白质缀合物和/或该对照测定包括对照分子-蛋白质缀合物。
8.定量分析被分析物的方法，其包含以下步骤：
a. 任选地，将被分析物从基质中萃取到样品液体中，
b. 在权利要求1-7任一项的分析盒中进行测定，其中在该样品液体引入该分析盒之后，将所述样品液体传输到试剂室中，并且与施加到这里的标记探针混合和/或反应，然后
c. 将该样品液体传输到检测室中，并且使该被分析物和/或该标记的探针与免疫测定和对照测定反应，随后
d. 照亮该薄膜波导体来激励免疫测定和对照测定的标记的探针，用于发荧光和拍摄荧光图像，然后
e. 基于该对照测定来计算该免疫测定的参考的荧光强度，其中每个免疫测定测量区域的参考的荧光强度是如下来计算的：将所述的免疫测定测量区域的荧光强度除以在激励光方向上相邻的对照测定测量区域的平均荧光强度，和
f. 基于校正曲线来计算和显示该被分析物值。
9.权利要求8的方法，在其中在该方法的过程中，将该分析盒调节到20-37℃的温度。
10.权利要求8和9任一项的方法，其中步骤b.中的反应进行了1-20min的时间长度和/或步骤c.中的反应进行了1-100min的时间长度。
11.权利要求1-7任一项的分析盒和权利要求8-10任一项的方法用于识别和定量分析真菌毒素的用途。
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