CN102459610B - 表达pdh和fdh酶的遗传稳定性质粒 - Google Patents
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Abstract
提供了用于表达甲酸脱氢酶(FDH)和经修饰的苯丙氨酸脱氢酶(PDHmod)的双顺反子质粒。
Description
本申请涉及并要求2009年4月8日提交的美国临时申请系列号61/167,676的优先权,通过提及而将其公开内容收入本文。
序列表仅以电子格式(计算机可读形式)与本申请一起提交,并且通过提及而收入本文。在2010年4月7日创建序列表文本文件“09-203-SEQ_LIST”[大小为22,343个字节]。
发明背景
发明领域
本发明涉及用于表达甲酸脱氢酶(FDH)和经修饰的苯丙氨酸脱氢酶(PDHmod)的核酸分子、质粒(例如双顺反子质粒)、宿主细胞和方法。
发明背景
二肽基肽酶IV是一种膜结合的非经典的丝氨酸氨肽酶,其位于多种组织中,包括但不限于肠、肝、肺、和肾。此酶还位于循环T-淋巴细胞上,其中将它称为CD-26。二肽基肽酶IV在体内负责内源肽GLP-1(7-36)和胰高血糖素的代谢切割,并且已经在体外表明了其针对其它肽诸如GHRH、NPY、GLP-2和VIP的蛋白水解活性。
GLP-1(7-36)是一种源自胰高血糖素原在小肠中的翻译后加工的29个氨基酸的肽。此肽在体内具有多种作用。例如,GLP-1(7-36)刺激胰岛素分泌,并抑制胰高血糖素分泌。此肽还促进饱足,并减缓胃排空。已经显示了经由连续输注外源施用GLP-1(7-36)在糖尿病患者中是有效的。然而,对于连续治疗性使用,外源肽的降解太迅速。
已经开发出二肽基肽酶IV的抑制剂以加强GLP-1(7-36)的内源水平。美国专利No.6,395,767披露了基于环丙基稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制剂。在美国专利No.6,395,767中以及在文献中披露了用于化学合成这些抑制剂的方法。例如,参见Sagnard等Tetr.Lett.1995 36:3148-3152;Tverezovsky等Tetrahedron 1997 53:14773-14792;及Hanessian等Bioorg.Med.Chem.Lett.19988:2123-2128。美国专利No.6,395,767中所披露的抑制剂的例子是游离的碱,(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羟基-三环[3.3.1.1.3,7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮杂二环-[3.1.0]己烷-3-腈。
EP 0 808 824 A2中披露了用于制备在生成此二肽基肽酶IV抑制剂中所使用的中间体的方法。还可参见Imashiro和Kuroda Tetrahedron Letters 200142:1313-1315,Reetz等Chem.Int.Ed.Engl.1979 18:72,Reetz和HeimbachChem.Ber.1983 116:3702-3707,Reetz等Chem.Ber.1983 116:3708-3724。
可以在3-羟基-α-氧代三环-[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸向(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸的生物转化中使用酶甲酸脱氢酶(FDH)(例如来自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(ATCC 20864))和苯丙氨酸脱氢酶(PDH)(例如来自中间型嗜热放线菌(Thermoactinomyces intermedius)(ATCC 33205))的重组表达,然后将所述(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸化学转化成(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸,即DPPIV抑制剂沙克列汀(saxagliptin)合成中的一种起始材料。先前使用含有两个相同串联启动子(针对每个酶一个启动子)以驱动表达的单一质粒来表达FDH和PDH的尝试已经获得有限的成功。特别地,在先的尝试似乎已经生成了含有两种不同细菌细胞群体的细菌培养物:一种含有完整的质粒,而另一种含有FDH基因的质粒的一部分似乎已经进行过加工(截短)。对质粒的加工似乎已经随每个细胞世代而增加。
如此,虽然生物转化方法已经鉴定为用于生成复杂的化学前体的方法,但是上文所讨论的生物合成方法由于遗传不稳定性而遭受产物产率的降低。如此,需要备选的重组序列和方法以供生成在化合物诸如沙克列汀的最终生成中的合成前体分子。
发明概述
在一方面,公开内容涉及一种分离的核酸分子,其包含:
(a)包含与SEQ ID NO:1为95%相同的核苷酸序列的分离的核酸序列;或
(b)编码SEQ ID NO:4的多肽和SEQ ID NO:5的多肽的序列。
在一方面,公开内容涉及一种分离的核酸分子,其包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在一方面,公开内容涉及一种分离的核酸分子,其包含在严格杂交条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的互补物杂交的序列。
在一方面,公开内容涉及一种分离的核酸分子,其包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
在一方面,公开内容涉及一种质粒,其包含含有SEQ ID NO:1的核酸分子。
在一方面,公开内容涉及一种分离的宿主细胞,其包含含有SEQ ID NO:1的核酸分子。
在一方面,公开内容涉及一种分离的宿主细胞,其包含含有SEQ ID NO:2的核酸分子。
在一方面,公开内容涉及一种用于生成(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羧基]-氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(式I)的方法:
其中该方法包括:
(a)在合适的条件下培养权利要求8的宿主细胞以表达由SEQ ID NO:1的核酸分子编码的多肽;
(b)部分纯化包含所述多肽的酶浓缩物;并
(c)在如下条件下使培养物分离物与一定量的3-羟基-α-氧代三环-[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(式II)接触:
所述条件容许生成(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(式III):
并
(d)在容许生成(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羧基]-氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸的条件下使(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸与一定量的二-叔-丁基二碳酸酯接触。
在一方面,公开内容涉及一种制备苯丙氨酸脱氢酶(PDH)和甲酸脱氢酶(FDH)的部分纯化的酶浓缩物的方法,其中该方法包括制备含有包含如本文中所描述的核酸分子或质粒的细胞的发酵培养液。
鉴于以下详述的描述,上述方面及其它方面和实施方案对于本领域技术人员会变得显而易见。
附图简述
图1显示了双顺反子FDH/PDHmod质粒的示意图。
图2显示了FDH/PDHmod双顺反子质粒的核酸序列(SEQ ID NO:2)。编码FDH(SEQ ID NO:8)、核糖体结合位点(SEQ ID NO:3)和PDHmod(SEQ IDNO:9)的区域以粗体加下划线(SEQ ID NO:1)。
图3显示了双顺反子FDH/PDHmod质粒的EcoRI限制性消化的结果。
发明详述
在一般意义上,公开内容涉及提供用于化学分子向期望的化合物(例如药物产品诸如DPPIV抑制剂沙克列汀)的生成中有用的合成前体分子和/或中间体的生物转化的核酸分子、质粒、载体、宿主细胞、和方法。核酸分子可以掺入载体诸如表达载体或质粒中,并且提供在宿主细胞(例如细菌细胞)中遗传稳定的重组构建体。细胞和质粒在包含甲酸脱氢酶和苯丙氨酸脱氢酶活性的方法中得到应用。
定义
在详细描述公开内容的各个方面和实施方案前,会定义许多术语。如本文中所使用的,单数形式“一个”、“一种”、和“该/所述”包括复数的提及物,除非上下文另有明确规定。例如,提及“核酸”意指一种或多种核酸。
注意到如“优选地”、“通常/常见”、和“典型地/通常地”等术语在本文中不用于限制如要求保护的本发明的范围或暗示某些特征对所要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的、或者甚至重要的。相反,这些术语的任何使用仅意图突出显示可以或不可以在具体实施方案中利用的备选或另外的特征。
在一些情况中,公开内容可以使用术语“基本上”或“约”来表示可以归因于任何定量比较、数值、测量、或其它表示的不确定性的固有程度。该术语还可以表示定量表示可以与规定的参照不同而不导致所讨论的主题的基本功能变化的程度。
如本文中所使用的,术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”、和“核酸分子”可互换使用,指包含DNA、RNA、其衍生物、或其组合的核酸分子。
术语“天然存在的”或“天然的”在结合生物学材料诸如核酸分子、多肽、宿主细胞等使用时指存在于自然界中并且没有被人为操作的材料。类似地,如本文中所使用的,“非天然存在的”或“非天然的”指不存在于自然界中或者已经人为在结构上修饰的或合成的材料。在结合核苷酸使用时,术语“天然存在的”或“天然的”指碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、和尿嘧啶(U)。在结合氨基酸使用时,术语“天然存在的”和“天然的”指20种氨基酸丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、和酪氨酸(Y)。
术语“苯丙氨酸脱氢酶”或“PDH”意指具有苯丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质,及其酶活性片段和变体。PDH的非限制性例子是“PDHmod”,其包含具有苯丙氨酸脱氢酶活性的SEQ ID NO:5,及SEQ ID NO:5的酶活性片段和变体。
术语“甲酸脱氢酶”或“FDH”意指具有甲酸脱氢酶活性的蛋白质,及其酶活性片段和变体。FDH的非限制性例子包括具有甲酸脱氢酶活性的SEQID NO:4,及SEQ ID NO:4的酶活性片段和变体。
核酸、质粒、和宿主细胞
一般地,本文中所使用的重组DNA方法是那些在Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)和/或Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等编,Green Publishers Inc.and Wiley and Sons 1994)中所列的。
在一方面,公开内容提供了一种包含SEQ ID NO:1的分离的核酸分子,或编码功能性甲酸脱氢酶和功能性苯丙氨酸脱氢酶的序列。在实施方案中,甲酸脱氢酶(FDH)可以包含来自任何特定物种的任何FDH序列,或其功能性片段。在实施方案中,苯丙氨酸脱氢酶(PDH)可以是来自任何特定物种的任何PDH序列,或其功能性片段。在一个实施方案中,FDH序列包含SEQ ID NO:4,或其功能性片段或变体。在一个实施方案中,PDH序列包含SEQ ID NO:5,或其功能性片段或变体。在一个实施方案中,核酸分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在实施方案中,所述核酸分子包含指导编码FDH和PDH的区域表达的单启动子区,其中所述启动子区如下文所描述的。
在实施方案中,所述核酸分子包含在编码FDH和PDH的分子的部分之间的区域。在实施方案中,该区域包含约10至约100个核苷酸(例如约10,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100个核苷酸碱基)的长度。在实施方案中,该区域包含核糖体结合位点,如下文所描述的。
术语“分离的核酸分子”指一种如下的核酸分子,其(1)已经与在自来源细胞分离总核酸时与其一起天然存在的蛋白质、脂质、碳水化合物、或其它材料的至少约50%分离,(2)不与在自然界中与所述“分离的核酸分子”连接的多核苷酸的整个或部分连接,(3)与在自然界中不与其连接的多核苷酸可操作连接,或者(4)在自然界中不以较大的多核苷酸序列的部分存在。因而,在多个实施方案中,分离的核酸分子基本上没有存在于其自然环境中的会干扰其在多肽生成中的用途或其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的任何其它污染性核酸分子或其它污染物。在某些实施方案中,分离的核酸分子包含在细胞内。
术语“核酸序列”或“核酸分子”指DNA或RNA序列。该术语涵盖自DNA和RNA的任何已知碱基类似物形成的分子,所述碱基类似物诸如但不限于4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基(aziridinyl)-胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异-戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、和2,6-二氨基嘌呤。
在一方面,公开内容提供了一种包含与SEQ ID NO:1为95%相同的核苷酸序列的分离的核酸序列。
如本领域中已知的,术语“同一性”指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列间的关系,如通过比较所述序列所确定的。在本领域中,“同一性”还意指核酸分子或多肽(视情况而定)间的序列关联性的程度,如通过两个或更多个核苷酸或两个或更多个氨基酸序列的字符串间的匹配所确定的。“同一性”测量相同匹配在两个或更多个序列中较小者间的百分比,其中使用通过特定数学模型或计算机程序(即,“算法”)解决的缺口比对(若存在的话)。
在一个实施方案中,所述分离的核酸序列包含于42℃在包含50%甲酰胺、5X SSC(0.75M NaC1、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、0.1%SDS、和10%硫酸葡聚糖的杂交缓冲液中,并且其后于42℃在包含0.2X SSC和0.1%SDS的杂交清洗缓冲液中与核苷酸序列SEQ ID NO:1的互补物杂交的核苷酸序列。
术语“高严格条件”指为了容许序列高度互补的DNA链杂交,并排除明显错配的DNA的杂交而设计的那些条件。杂交严格性主要由温度、离子强度、和变性剂诸如甲酰胺的浓度决定。杂交和清洗的“高严格条件”的例子是于65-68℃的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或于42℃的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠、和50%甲酰胺。参见Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring HarborLaboratory,1989);Anderson等,Nucleic Acid Hybridisation:A PracticalApproach第4章(IRL Press Limited)。
也可以使用更严格的条件(诸如更高的温度、更低的离子强度、更高的甲酰胺、或其它变性剂),然而,杂交速率会受到影响。为了降低非特异性和/或背景杂交的目的,杂交和清洗缓冲液中可以包含其它试剂。例子是0.1%牛血清清蛋白、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、0.1%焦磷酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、NaDodSO4、(SDS)、Ficoll、登哈特(Denhardt)氏溶液、超声处理的鲑精DNA(或另一种非互补DNA)、和硫酸葡聚糖,尽管也可以使用其它合适的试剂。可以在基本上不影响杂交条件的严格性的情况中改变这些添加剂的浓度和类型。杂交实验通常于pH 6.8-7.4实施;然而,在典型的离子强度条件,杂交的速率几乎不依赖于pH。参见Anderson等,Nucleic Acid Hybridisation:APractical Approach第4章(IRL Press Limited)。
影响DNA双链体稳定性的因素包括碱基组成、长度、和碱基对错配的程度。本领域技术人员可以调节杂交条件以容纳这些变量并容许不同序列关联性的DNA形成杂交物。可以通过如下的等式来评估完全匹配的DNA双链体的解链温度:
Tm(℃)=81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)-600/N-0.72(%甲酰胺)
其中N是形成的双链体的长度,[Na+]是杂交或清洗溶液中的钠离子的摩尔浓度,%G+C是杂交物中的(鸟嘌呤+胞嘧啶)碱基的百分比。
对于不完全匹配的杂交物,对于每1%错配,解链温度降低约1℃。
术语“中等严格条件”指能够形成具有比在“高严格条件”下可以发生的更大程度的碱基对错配的DNA双链体的条件。典型的“中等严格条件”的例子是于50-65℃的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或于37-50℃的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠、和20%甲酰胺。举例而言,50℃在0.015M钠离子中的“中等严格条件”会容许约21%错配。
本领域技术人员应当领会,“高严格条件”与“中等严格条件”之间没有绝对的区别。例如,在0.015M钠离子(无甲酰胺),完全匹配的长DNA的解链温度是约71℃。通过于65℃清洗(在相同的离子强度),这会容许约6%错配。为了捕捉相关性更远的序列,本领域技术人员可以只是降低温度或提高离子强度。
对于长达约20nt的寡核苷酸探针在1M NaCl*中的解链温度的良好评估通过以下给出:
Tm=每个A-T碱基对2℃+每个G-C碱基对4℃
*6X盐柠檬酸钠(SSC)中的钠离子浓度是1M。参见Suggs等,Developmental Biology Using Purified Genes 683(Brown和Fox编,1981)。
寡核苷酸的高严格性清洗条件通常在比寡核苷酸在6X SSC、0.1%SDS中的Tm低0-5℃的温度。
在一方面,公开内容提供了包含SEQ ID NO:1的核酸分子的质粒。
在另一个方面,公开内容提供了包含编码SEQ ID NO:4的多肽和SEQ IDNO:5的多肽的序列的质粒。
术语“质粒”用于指用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(例如核酸、载体、或病毒)。
术语“表达质粒”指适合于转化宿主细胞,并且含有指导和/或控制***的异源核酸序列表达的核酸序列的质粒。表达包括但不限于诸如转录、翻译、和RNA剪接(若存在内含子的话)等过程。一般地,质粒分子(例如表达载体、宿主载体等)是本领域中已知的,并且是商品化的。
在实施方案中,将质粒设计为包含如本文中所描述的核酸,其中FDH和PDH的表达在单启动子的控制下。
在多个实施方案中,任何宿主细胞中所使用的表达质粒可以含有用于质粒维持和用于外源核苷酸序列的克隆和表达的序列。在某些实施方案中,此类序列(统称为“侧翼序列”)通常会包括下列核苷酸中的一种或多种:启动子、复制起点、转录终止序列、在表达可分泌蛋白质的情况中的用于分泌的前导序列、核糖体结合位点、用于***编码要表达的多肽的核酸的多聚接头区、和选择标志元件。
任选地,质粒可以含有“标签”序列,即位于FDH或PDHmod多肽编码序列的5’或3’端的寡核苷酸分子;寡核苷酸分子编码多聚His(诸如六His)、或存在商品化抗体的其它“标签”诸如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或myc。此标签可以在多肽表达时与多肽融合,并且可以充当一种用于自宿主细胞亲和纯化PHDmod或FDH多肽的手段。可以例如通过柱层析使用针对该标签的抗体作为亲和基质来实现亲和纯化。任选地,随后可以通过多种手段诸如使用用于切割的特定肽酶来自纯化的PHDmod或FDH多肽除去该标签。
转录终止序列通常位于多肽编码区末端的3’,并且用来终止转录。通常,原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段,接着有多聚-T序列。虽然所述序列容易自文库克隆或者甚至作为质粒的一部分商业购买,但是它也可以使用用于核酸合成的方法诸如那些在上文所描述的方法来容易地合成。
术语“可操作连接的”在本文中用于指侧翼序列的布置,其中将如此描述的侧翼序列配置或装配为使得执行其通常的功能。如此,与编码序列可操作连接的侧翼序列可能能够致使编码序列的复制、转录和/或翻译。例如,编码序列在启动子能够指导所述编码序列转录时与启动子可操作连接。侧翼序列不需要与编码序列是连续的,只要其正确发挥功能即可。如此,例如,居间的非翻译的但转录的序列可以存在于启动子序列与编码序列之间,并且仍可以认为该启动子序列与该编码序列“可操作连接”。
在一方面,公开内容提供了一种包含双顺反子质粒的分离的宿主细胞,其中质粒编码FDH和PDHmod。宿主细胞可以是任何合适的宿主细胞,并且可由技术人员基于期望的应用(例如为了扩增和/或多肽表达)而选择。
术语“宿主细胞”用于指已经进行过转化,或者能够用核酸序列转化,然后能够表达感兴趣的选定基因的细胞。该术语包括亲本细胞的子代,无论该子代在形态学或遗传构成上是否与初始亲本相同,只要选定的基因存在即可。
如本文中所使用的,术语“转化”指细胞遗传特征的变化,并且在已经将细胞修饰为含有新的DNA时它已经被转化。例如,在细胞自其天然状态经遗传修饰的情况中它被转化。在转染或转导后,转化DNA可以通过物理整合入细胞染色体中与细胞的DNA重组,可以作为附加体元件瞬时维持而不被复制,或者可以作为质粒独立复制。认为在DNA随细胞***而复制时已经将细胞稳定转化。
术语“转染”用于指细胞摄取外来或外源DNA,并且在已经将外源DNA导入细胞膜内部时已经将细胞“转染”。许多转染技术是本领域中公知的,并且在本文中披露。参见例如Graham等,1973,Virology 52:456;Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratories,1989);Davis等,Basic Methods in Molecular Biology(Elsevier,1986);及Chu等,1981,Gene 13:197。可以使用此类技术来将一种或多种外源DNA模块导入合适的宿主细胞中。
在某些实施方案中,通过在连续改变培养基中的选择剂浓度的条件下培养经转化的细胞来施加选择压力,由此导致选择基因和编码PDHmod和FDH多肽的DNA两者的扩增。因此,自扩增的DNA合成增加量的PDHmod和FDH多肽。
可以通过公知的方法,包括诸如氯化钙、电穿孔、微注射、脂转染或DEAE-葡聚糖法等方法来实现将PDHmod和FHD多肽的表达质粒转化或转染入选定的宿主细胞中。选定的方法部分会是要使用的宿主细胞类型的功能。这些方法和其它合适的方法是本领域中公知的,并且在例如Sambrook等,见上文中列出。
选择标志基因元件编码对于在选择培养基中培养的宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白质。典型的选择标志基因编码如下的蛋白质,其(a)为原核宿主细胞赋予对抗生素或其它毒素,例如氨苄青霉素、四环素、或卡那霉素的抗性,(b)补足细胞的营养缺陷型缺陷;或(c)供应自复合培养基不可获得的至关重要的营养物。选择标志的例子是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、和四环素抗性基因。也可以使用新霉素抗性基因用于在原核和真核宿主细胞中选择。
使用标准的连接技术来将编码PDH或PHDmod和FDH多肽的核酸分子***合适的表达质粒中。质粒可以选择为在所采用的特定宿主细胞中是功能性的(即,质粒与宿主细胞机构(machinery)相容,使得可以发生基因的扩增和/或基因的表达)。
在又一个实施方案中,核酸分子可以在原核宿主细胞中扩增和/或表达。宿主细胞可以是原核宿主细胞(诸如大肠杆菌)。在合适的条件下培养时,宿主细胞合成PDHmod和FDH多肽,其随后可以直接从生成它的宿主细胞收集。合适的宿主细胞的选择会取决于多种因素,诸如期望的表达水平、对于活性所期望或必需的多肽修饰诸如糖基化或磷酸化、和容易折叠成生物学活性分子。
细菌细胞作为适合于如本文中所描述的核酸分子和/或质粒的宿主细胞是有用的。在多个实施方案中,宿主细胞可以包含多种大肠杆菌菌株(例如,JM110、HB101、DH5、DH10、和MC1061)之任一种。在实施方案中,可以使用本领域中公知的标准培养基来培养包含核酸或质粒的细胞(即,经转化的或经转染的)。培养基通常会含有细胞生长和存活必需的所有营养物。适合于培养大肠杆菌细胞的培养基是例如Luria Broth(LB)和/或Terrific Broth(TB)。在数个实施方案中,将可用于经转染的或经转化的细胞的选择性培养的抗生素或其它化合物作为补充物添加至培养基。要使用的化合物会通过存在于用来转化宿主细胞的质粒上的选择标志元件来规定。例如,在选择标志元件是卡那霉素抗性的情况中,对培养基添加的化合物会是卡那霉素。用于选择性培养的其它化合物包括氨苄青霉素、四环素、和新霉素。
在一些实施方案中,核糖体结合位点(RBS)可以在原核生物中启动mRNA的翻译,并且以Shine-Dalgarno序列为特征。在实施方案中,RBS可以位于启动子的3’和要表达的PDH和FDH多肽的编码序列的5’。可以通过形成具有含有Shine-Dalgarno序列和/或mRNA起始密码子的区域的局部二级结构,使得核糖体不能启动翻译来抑制未融合状态的天然蛋白质的表达。在实施方案中,可以使用质粒来克服这种对含有真核序列的mRNA的翻译抑制(Yero等,Biotechnol.Appl.Biochem.,44:27-34,(2006);Schoner等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,83:8506-8510(1986))。
在多个实施方案中,表达和克隆质粒可以含有由宿主生物体识别,并且与编码FDH多肽的分子可操作连接的启动子。启动子是控制结构基因转录的位于结构基因的起始密码子上游(即,5’)的非翻译序列(一般在约100至1000bp内)。启动子常规地分组到两类之一:诱导型启动子和组成性启动子。诱导型启动子响应培养条件的一些变化,诸如营养物的存在或缺乏或温度变化而自在其控制下的DNA启动升高水平的转录。由多种潜在的宿主细胞识别的大量启动子是公知的。通过限制酶消化自来源DNA取出启动子,并将期望的启动子序列***质粒中,这些启动子与编码FDH多肽的DNA可操作连接。可以使用天然的FDH启动子序列来指导FDH和PDHmod DNA的扩增和/或表达。若与天然启动子相比,异源启动子容许所表达的蛋白质的更多的转录和更高的产率,并且若异源启动子与已经选定使用的宿主细胞***相容,则可以在某些实施方案中使用它。
适合于与原核宿主一起使用的启动子包括β-内酰胺酶(Villa-Kamaroff等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75:3727-31(1978))和乳糖启动子***;碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子***;和杂合启动子诸如tac启动子(DeBoer等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:21-25(1983))。其它已知的细菌启动子也是合适的。其序列已经得到了公开,并且是本领域中公知的。视需要使用接头或衔接头以供应任何所需的限制位点,可以将这些序列与期望的DNA序列连接。
可以在多个实施方案中使用与细菌宿主相容的数种质粒。此类质粒包括pCRII、pCR3、和pcDNA3.1(Invitrogen,San Diego,CA)、pBSII(Stratagene,LaJolla,CA)、pET15(Novagen,Madison,WI)、pGEX(Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)等。可以经由转化、转染、感染、电穿孔、或其它已知的技术来将重组分子导入宿主细胞中。
多肽生成
在多个实施方案中使用的FDH(SEQ ID NO:4)和PDHmod(SEQ ID NO:5)酶是催化NAD依赖性氧化反应的氧化还原酶。
在一方面,公开内容提供了一种用于生成SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的多肽的方法,包括在合适的条件下培养包含本文中所描述的质粒的宿主细胞以表达该多肽。
在一个实施方案中,公开内容提供了一种制备苯丙氨酸脱氢酶(PDH)和甲酸脱氢酶(FDH)的部分纯化的酶浓缩物的方法,其中该方法包括制备发酵培养液,其含有包含如本文中所描述的核酸分子或质粒的细胞;微流化发酵培养液,期间将所述发酵培养液的温度维持于约4℃-30℃以形成含有PDH和FDH的微流化培养液;如下使微流化的培养液澄清,即用絮凝剂处理培养液来凝固细胞碎片,并除去DNA和不想要的蛋白质,由此形成澄清的培养液;过滤澄清的培养液以提供滤液;并且任选地,浓缩滤液以提供所述部分纯化的酶浓缩物,其中所述浓缩物包含约400IU/ml至约1000IU/ml的PDH活性和约20IU/ml至约200IU/ml的FDH活性。在实施方案中,酶浓缩物能够将含酮化合物还原性氨化成手性含胺化合物,其中在不从酶浓缩物分离的情况中,所述手性含胺化合物能够受BOC保护。在实施方案中,任选地,澄清可以包括使微流化的培养液与硅藻土接触,而过滤包括用压滤机(filter press)过滤硅藻土。
在实施方案中,细胞包含含有与SEQ ID NO:195%相同的序列的核酸分子。在实施方案中,细胞包含含有SEQ ID NO:1的核酸分子。在实施方案中,细胞包含具有编码SEQ ID NO:4的多肽和SEQ ID NO:5的多肽的序列的核酸分子。在实施方案中,细胞包含含有如下序列的核酸分子,所述序列于42℃在包含50%甲酰胺、5X SSC(0.75M NaC1、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、0.1%SDS、和10%硫酸葡聚糖的杂交缓冲液中,然后于42℃在包含0.2X SSC和0.1%SDS的杂交清洗缓冲液中与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的互补物杂交。在实施方案中,细胞包含含有SEQ ID NO:2的核酸分子。
所述方法可以包括任何有效范围的用于微流化发酵培养液的压力,诸如例如在约12,000-约20,000psi范围内的任何压力。所述方法可以包括有效维持细胞的总体健康和/或PDH和FDH酶的活性的任何温度。虽然本领域技术人员可以确定温度范围,温度的非限制性例子包括约4℃-25℃或约8℃-25℃。方法中所使用的细胞可以是可以稳定含有本文中所描述的核酸分子和/或质粒,并在合适的条件下表达PDH和FDH的任何细胞。在实施方案中,细胞是大肠杆菌JM110。
所述方法可以包括本领域中已知的任何有效的过滤方法诸如例如使用超滤膜或盒的超滤。类似地,所述方法可以包括任何澄清方法步骤,其可以包括絮凝剂,和/或脱色剂,其有效除去DNA和不想要的蛋白质(例如,通过凝固细胞碎片来进行)。
术语“分离的多肽”指一种如下的多肽,其(1)已经与在自来源细胞分离时与其一起天然存在的多核苷酸、脂质、碳水化合物、或其它材料的至少约50%分离,(2)不与在自然界中与所述“分离的多肽”连接的多肽的整个或部分连接(通过共价或非共价相互作用),(3)与在自然界中不与其连接的多肽可操作连接(通过共价或非共价相互作用),或者(4)在自然界中不存在。优选地,分离的多肽基本上没有存在于其自然环境中的会干扰其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的任何其它污染性多肽或其它污染物。
可以使用本领域中已知的标准方法来评估由宿主细胞生成的PDHmod和FDH多肽的量。此类方法包括但不限于Western印迹分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、HPLC分离、免疫沉淀、和/或活性测定法诸如DNA结合凝胶移位测定法。
可以使用多种技术来实现自溶液纯化PDHmod和FDH多肽。若已经合成多肽,使得它在其羧基或氨基端含有标签诸如六组氨酸或其它小肽诸如FLAG(Eastman Kodak Co.,New Haven,CT)或myc(Invitrogen),则它可以基本上在一步方法中通过使溶液通过亲和柱来纯化,其中柱基质具有对标签或直接对多肽(即,一种特异性识别PDHmod或FDH多肽的单克隆抗体)的高亲和力。例如,多组氨酸以较大的亲和力和特异性结合镍,并且如此可以使用镍的亲和柱(诸如QIAGEN镍柱)来纯化FDH或PDHmod多肽/多His。参见例如Current Protocols in Molecular Biology§10.11.8(Ausubel等编,John Wiley& Sons 1993)。
在没有附着的标签而制备FDH或PDH多肽,并且不可获得抗体的情况中,可以使用用于纯化的其它公知的规程。此类规程包括但不限于离子交换层析、分子筛层析、通过硫酸铵沉淀的分级、HPLC、与凝胶洗脱组合的天然的凝胶电泳、和制备型等电聚焦(“Isoprime”仪/技术,Hoefer Scientific)。在一些情况中,可以组合这些技术之两种或更多种以实现升高的纯度。
在一些情况中,FDH或PDHmod多肽在分离后可以没有生物学活性。可以使用用于将多肽“重折叠”或转化成其三级结构并产生二硫键的多种方法来恢复生物学活性。此类方法包括将溶解的多肽暴露于通常高于7的pH,并且在存在特定浓度的离液剂的情况中。离液剂的选择与包含体增溶所使用的选择非常类似,但是通常,离液剂以较低的浓度使用,并且不必与用于增溶的离液剂一样。在大多数情况中,重折叠/氧化溶液还会含有还原剂或特定比率的还原剂加上其氧化形式以产生特定的氧化还原电势,其容许在蛋白质的半胱氨酸桥的形成中发生二硫化物改组。一些常用的氧化还原对(couple)包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽(GSH)/二硫代双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇(DTT)/二噻烷DTT、和2-巯基乙醇(bME)/二硫-b(ME)。在许多情况中,可以使用共溶剂或可以需要共溶剂来提高重折叠的效率,并且更常见的用于此目的的试剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇、精氨酸等。
若在FDH或PDHmod多肽表达后不以显著程度形成包含体,则多肽主要会存在于细胞匀浆物离心后的上清液中,并且可以使用诸如下文所列的方法来自上清液进一步分离。
在优选地部分或完全纯化FDH或PDHmod多肽,使得其部分或基本上没有污染物的情况中,可以使用本领域技术人员已知的标准方法。此类方法包括但不限于通过电泳接着是电洗脱的分离、各种类型的层析(亲和、免疫亲和、分子筛、和/或离子交换)、和通过硫酸铵沉淀和/或高压液相层析的分级。在一些情况中,使用用于完全纯化的这些方法中的超过一种可以是优选的。
术语“相似性”是与同一性相关的概念,但是与“同一性”形成对比,“相似性”指包括相同匹配和保守取代匹配两者的关联性的量度。若两个多肽序列具有例如10/20个相同的氨基酸,而剩余部分均是非保守取代,则百分比同一性和相似性都会是50%。若在相同例子中,多出5个有保守取代的位置,则百分比同一性仍然是50%,但是百分比相似性会是75%(15/20)。因此,在存在保守取代的情况中,两个多肽间的百分比相似性会比那两个多肽间的百分比同一性高。
核酸序列的差异可以导致相对于氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的对氨基酸序列的保守和/或非保守修饰。
对SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列的保守修饰(及对编码核苷酸的相应修饰)会生成具有与FDH或PDHmod多肽的那些功能和化学特征相似的功能和化学特征的多肽。相反,可以通过选择SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的氨基酸序列中的如下取代来实现FDH或PDHmod多肽的功能和/或化学特征的实质修饰,所述取代在其对维持(a)取代区域中的分子主链的结构,例如作为片层或螺旋构象,(b)靶位点处的分子的电荷或疏水性、或(c)侧链体积(bulk)的影响方面显著不同。
例如,“保守氨基酸取代”可以牵涉将天然氨基酸残基用非天然残基取代,从而对所述位置处的氨基酸残基的极性或电荷具有很少的影响或没有影响。此外,多肽中的任何天然残基也可以用丙氨酸取代,如先前已经对“氨基酸扫描诱变”所描述的。
保守氨基酸取代还涵盖非天然存在的氨基酸残基,其通常通过化学肽合成,而不是通过生物学***中的合成来掺入。这些包括肽模拟物,和氨基酸模块的其它反向或倒转形式。
天然存在的残基可以基于共同的侧链特性而分类:
1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr;
3)酸性:Asp、Glu;
4)碱性:Asn、Gln、His、Lys、Arg;
5)影响侧链取向的残基:Gly、Pro;和
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
例如,非保守取代可以牵涉用这些种类之一的成员取代来自另一类的成员。
在进行此类变化中,可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。基于每种氨基酸的疏水性和电荷特性,已给每种氨基酸的亲水指数赋值。亲水指数是:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。
本领域中一般了解亲水氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用性生物学功能中的重要性(Kyte等,1982,J.Mol.Biol.157:105-31)。已知可以用某些氨基酸取代其它具有相似亲水指数或得分的氨基酸,并且仍保留相似的生物学活性。在进行基于亲水指数的变化中,在某些实施方案中,氨基酸取代是其亲水指数在±2内、在±1内、及在±0.5内的那些氨基酸的取代。
本领域中还了解,可以基于亲水性有效地进行如氨基酸的取代,特别是在由此创建的生物学功能等同的蛋白质或肽意图用于免疫学实施方案的情况中,如在本案中。蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性所决定的)与其免疫原性和抗原性,即与蛋白质的生物学特性相关联。
已经将下列亲水性值(hydrophilicity value)赋予这些氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。在进行基于相似亲水性值的变化中,在某些实施方案中,氨基酸的取代是其的亲水数值在±2内、在±1内、及在±0.5内的那些氨基酸取代。
还可以基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区域又称为“表位核心区”。
在期望此类取代时,本领域技术人员可以确定期望的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)。例如,可以使用氨基酸取代来鉴定本文中所描述的FDH或PDHmod多肽的重要残基。表I中列出了例示性的氨基酸取代。
表I
氨基酸取代
使用公知技术,熟练技术人员会能够确定如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中所列的多肽的合适变体。对于鉴定分子中可以改变而不破坏生物学活性的合适区域,本领域技术人员可以靶向据信对活性不重要的区域。例如,在已知具有来自相同种类或来自其它种类的相似多肽具有相似活性时,本领域技术人员可以比较FDH或PDHmod多肽与此类相似多肽的氨基酸序列。通过此类比较,可以鉴定在相似多肽间保守的分子中的残基和部分。应当领会,FDH或PDHmod分子区域中相对于此类相似多肽不保守的变化不太可能会不利地影响FDH或PDHmod多肽的生物学活性和/或结构。本领域技术人员还会知道,即使在相对保守的区域中,可以在保持活性的情况中用化学相似氨基酸取代天然存在的残基(保守氨基酸残基取代)。因此,即使可以对生物学活性或对结构重要的区域在不破坏生物学活性或者没有不利地影响多肽结构的情况中可以进行保守氨基酸取代。
另外,本领域技术人员可以回顾结构-功能研究,从而鉴定相似多肽中对活性或结构重要的残基。鉴于此类比较,可以预测FDH或PDHmod多肽中与在相似多肽中对活性或结构重要的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择化学上相似的氨基酸来取代这些经预测对于FDH或PDHmod多肽重要的氨基酸残基。
本领域技术人员还可以分析相似肽中的三维结构和与那种结构相关的氨基酸序列。鉴于此类信息,本领域技术人员可以预测FDH或PDHmod多肽就其三维结构的氨基酸残基的比对。本领域技术人员可以选择不对预测为在蛋白质表面上的氨基酸残基进行根本的变化,因为此类残基可以牵涉与其它分子的重要的相互作用。此外,本领域技术人员可以生成在每个氨基酸残基处含有单一氨基酸取代的测试变体。可以使用本领域技术人员已知的活性测定法来筛选变体。可以使用此类变体来收集关于合适的变体的信息。例如,若发现对特定的氨基酸残基的变化导致破坏的、不期望地降低的、或不合适的活性,则会避免具有此类变化的变体。换言之,基于自此类常规实验收集的信息,本领域技术人员可以容易地确定如下的氨基酸,在这些氨基酸处应当避免无论是单独地还是与其它突变组合地进一步的取代。
许多科学出版物已经专用于预测二级结构。参见Moult,1996,Curr.Opin.Biotechnol.7:422-27;Chou等,1974,Biochemistry 13:222-45;Chou等,1974,Biochemistry 113:211-22;Chou等,1978,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47:45-48;Chou等,1978,Ann.Rev.Biochem.47:251-276;及Chou等,1979,Biophys.J.26:367-84。此外,计算机程序目前可用于帮助预测二级结构。一种预测二级结构的方法基于同源性建模。例如,具有大于30%的序列同一性,或大于40%的相似性的两种多肽或蛋白质经常具有相似的结构拓扑学。蛋白质结构数据库(PDB)的最近的发展已经提供了增强的对二级结构的可预测性,包括多肽或蛋白质结构内折叠的潜在数目。参见Holm等,1999,NucleicAcids Res.27:244-47。已经提示了给定的多肽或蛋白质中存在着有限数目的折叠,而且一旦解析出结构的临界数目,结构预测便会变得显著更精确(Brenner等,1997,Curr.Opin.Struct.Biol.7:369-76)。
预测二级结构的其它方法包括“穿引(threading)”(Jones,1997,Curr.Opin.Struct.Biol.7:377-87;Sippl等,1996,Structure 4:15-19)、“序型分析”(Bowie等,1991,Science,253:164-70;Gribskov等,1990,Methods Enzymol.183:146-59;Gribskov等,1987,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.84:4355-58)、和“进化联系(evolutionary linkage)”(参见Holm等,见上文,及Brenner等,见上文)。
通过已知方法容易计算相关核酸分子和多肽的同一性和相似性。此类方法包括但不限于那些记载于Computational Molecular Biology(A.M.Lesk编,Oxford University Press 1988);Biocomputing:Informatics and Genome Projects(D.W.Smith编,Academic Press 1993);Computer Analysis of Sequence Data(Part 1,A.M.Griffin and H.G.Griffin编,Humana Press 1994);G.von Heijne,Sequence Analysis in Molecular Biology(Academic Press 1987);SequenceAnalysis Primer(M.Gribskov和J.Devereux编,M.Stockton Press 1991);及Carillo等,1988,SIAM J.Applied Math.,48:1073的。
设计测定同一性和/或相似性的某些方法以给出所测试序列间的最大匹配。测定同一性和相似性的方法记载于公众可获得的计算机程序。测定两种序列间的同一性和相似性的某些计算机程序方法包括但不限于GCG程序包,包括GAP(Devereux等,1984,Nucleic Acids Res.12:387;Genetics ComputerGroup,University of Wisconsin,Madison,WI)、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Altschul等,1990,J.Mol.Biol.215:403-10)。BLASTX程序自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)和其它来源(Altschul等,BLAST Manual(NCB NLM NIH,Bethesda,MD);Altschul等,1990,见上文)可公开获得。也可以使用公知的Smith Waterman算法来测定同一性。
用于比对两种氨基酸序列的某些比对方案可以导致仅对两种序列中的较短区的匹配,并且此种小的比对区可以具有非常高的序列同一性,即使两种全长序列间没有显著的关系。因而,在一个实施方案中,选定的比对方法(GAP程序)会导致跨越所要求保护的多肽的至少50个连续氨基酸的比对。
例如,使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group,University ofWisconsin,Madison,WI),比对要测定百分比序列同一性的两种多肽以供其各自的氨基酸的最佳匹配(“匹配跨距”,如通过算法所确定的)。与算法一起使用缺口打开罚分(其以3X平均对角线计算;“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值;“对角线”是通过特定比较矩阵对每个完全氨基酸匹配赋值的得分或数目),和缺口延伸罚分(其通常是0.1X缺口打开罚分)及比较矩阵诸如PAM 250或BLOSUM 62。算法也使用标准的比较矩阵(参见Dayhoff等,5Atlas of Protein Sequence and Structure(增刊31978)(PAM250比较矩阵);Henikoff等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:10915-19(BLOSUM 62比较矩阵))。
可以用于多肽序列比较的参数包括下列各项:
算法:Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-53;
比较矩阵:BLOSUM 62(Henikoff等,见上文);
缺口罚分:12
缺口长度罚分:4
相似性阈值:0
GAP程序可与上述参数一起使用。前述参数是使用GAP算法来进行多肽比较(与没有末端缺口罚分一起)的缺省参数。
可以用于核酸分子序列比较的参数包括下列各项:
算法:Needleman和Wunsch,见上文;
比较矩阵:匹配=+10,错配=0
缺口罚分:50
缺口长度罚分:3
GAP程序与上述参数一起也是有用的。前述参数是核酸分子比较的缺省参数。
可以使用其它例示性的算法、缺口打开罚分、缺口延伸罚分、比较矩阵、和相似性阈值,包括那些在Program Manual,Wisconsin Package,第9版,1997年9月中所列的。要进行的特定选择对于本领域技术人员会是显而易见的,并且会取决于要进行的特定比较,诸如DNA-对-DNA、蛋白质-对-蛋白质、蛋白质-对-DNA;并且此外,比较在给定的序列对之间(在该情况中,可以使用GAP或BestFit)或是在一个序列与序列的大数据库之间(在该情况中,可以使用FASTA或BLASTA)进行。
在一方面,公开内容涉及一种用于生成沙克列汀的前体的方法,包括:在合适的条件下培养含有如本文中所描述的核酸分子和/或质粒(例如双顺反子质粒)的宿主细胞以表达FDH和PDHmod;自培养物分离多肽;并使用分离的多肽来进行还原性氨化反应。
本文中所公开的质粒在9次连续传代培养(约60-70代)后仍然是遗传稳定的,这比从冷冻细胞库小瓶至生产发酵结束(约15-20代)更广。
在一方面,公开内容提供了一种用于生成(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羧基]-氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸的方法,包括:在合适的条件下培养本文中所描述的宿主细胞以表达多肽;分离包含所述多肽的培养物分离物;并在如下条件下使所述培养物分离物与一定量的3-羟基-α-氧代三环-[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸和一定量的二-叔-丁基二碳酸酯接触,所述条件容许生成(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羧基]-氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸。
在一个实施方案中,所述方法包括生成(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羧基]-氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(式I):
其通过在合适的条件下培养本文中所描述的宿主细胞以表达FDH和PDH多肽;分离包含所述多肽的培养物分离物;并在如下条件下使培养物分离物与一定量的3-羟基-α-氧代三环-[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(式II)接触:
所述条件容许生成(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(式III):
并在容许生成(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羧基]-氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸的条件下使(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸与一定量的二-叔-丁基二碳酸酯接触。可以在本文中所描述的方法中使用的多种反应条件已经在别处详述,并且是本领域中一般已知的。参见美国专利号7,420,079。以下实施例是公开内容的具体实施方案及其多种用途的例示。它们仅为了解释性目的而列出,而并不应理解为限制本发明,其在所附权利要求书中详述。通过提及而完整收录本文中提及的所有专利和非专利文献参考文献。
实施例1:双顺反子FDH/PDHmod质粒的构建
如下构建双顺反子FDH/PDHmod质粒,即将含有具有5’核糖体结合序列(SEQ ID NO:3)的PDHmod基因的PCR扩增片段***已经除去PDHmod基因和其相应的启动子的pBMS2000-PPFDH-PDHmod质粒。pBMS2000-PPFDH-PDHmod质粒最初披露于美国专利号7,420,079,其前体pBMS2000质粒最初披露于美国专利号6,068,991。通过提及而将这些专利都收入本文。
用BamHI和NotI限制酶消化pBMS2000-PPFDH-PDHmod质粒以除去PDHmod基因及其启动子。将经消化的DNA在琼脂糖凝胶上分离,并使用QIAGEN凝胶提取规程来分离5.5Kb片段。
将正向引物pdhmod1f (5’-AAGCGAGATCTGCGCACGACACTG-3’;SEQ ID NO:6)设计为扩增具有5’核糖体结合位点和供与载体的BamHI位点连接用的BlII位点的PDHmod序列。将反向引物pdhmod3r(5’-AATTAATTCGCGGCCGCCGCGGCTCG-3’;SEQ ID NO:7)设计为在模板质粒pBMS2000-PDHmod中的NotI位点的3’,从而对PCR产物的BglII/NotI双重消化产生可以刚好在经消化的载体中的FDH序列的3’***的片段。使用各10pmole正向和反向引物、载体模板pBMS2000-PDHmod、和HF聚合酶(CLONTECH)依照制造商的方案来实施PCR反应。在9700热循环仪(APPLIED BIOSYSTEMS)中实施反应。使用QIAGENPCR清除柱来纯化PCR产物,并在50μL TE中洗脱。将PCR产物用BglII和NotI限制酶消化,在琼脂糖凝胶上分离,并切出和纯化约1.2kb条带,其中使用QIAGEN凝胶提取试剂盒。
使用T4DNA连接酶来将含有PDHmod基因的经BglII/NotI消化的PCR片段与含有FDH基因序列和启动子的经BamHI/NotI消化的质粒连接。将1μL连接物转化至MachI感受态细胞(INVITROGEN),并铺板至具有30μg/mL卡那霉素的Luria Broth(LB)板。实施质粒微量制备,并通过琼脂糖凝胶分析来确认预期大小的质粒。
使用染料-脱氧终止剂化学(APPLIED BIOSYSTEMS)来对质粒DNA测序。将引物设计为对整个***PCR片段(BglII/NotI片段)和与经消化的载体序列的接合测序。FDH基因的终止子与PDHmod序列的开始之间的基因间序列如预期的。将双顺反子FDH/PDHmod质粒转化至大肠杆菌表达宿主JM110。
实施例2:双顺反子FDH/PDHmod质粒的稳定性的确认
将一瓶冷冻的用双顺反子质粒转化的大肠杆菌宿主JM110在冰上融化,并将100μL接种至20mL具有30μg/mL卡那霉素的LB培养基,并于30℃,250rpm温育过夜。将培养物向新鲜的20ml体积的LB+30μg/mL卡那霉素再转移9次(the cultures were transferred an additional 9 times to a fresh 20mLvolume of LB+30μg/mL kanamycin),并于30℃,250rpm温育8-20小时。使用QIAGEN迷你质粒试剂盒来自最终的20mL培养物分离质粒DNA。将质粒用EcoRI限制酶消化,并在琼脂糖凝胶上分析(图3)。观察到在6和7Kb分子量标志物之间的单一条带,即完整的线性化质粒的预期大小。在凝胶上没有观察到其它条带,指明质粒是稳定遗传的。
实施例3:具有双顺反子FDH/PDHmod质粒的大肠杆菌转化体的发酵
将pBMS2000-FDH/PDHmod转化入大肠杆菌JM110中,并提取质粒DNA,并用正确的限制酶消化样式来确认。将JM110(pBMS2000-FDH/PDHmod)+在BMS培养基(0.5%酵母提取物、0.22%葡萄糖、0.7%磷酸钾(二碱)、0.1%一水合柠檬酸、0.17%硫酸铵、0.003%七水合硫酸亚铁、023%七水合硫酸镁、和30μg/mL硫酸卡那霉素)中发酵。对于4,000-L发酵罐,如下制备接种物:将1mL冷冻的JM110(pBMS2000-FDH/PDHmod)+融化,并添加至含有400L具有30μg/ml卡那霉素的BMS培养基的600-L发酵罐。于30℃,以150rpm(旋转/分钟)的搅动、80Lpm(升/分钟)的充气、和7psi的排出压力(head pressure)运行发酵罐达21小时。当OD600达到约1.1时,将75L培养物转移至含有1,700L BMS培养基的4,000-L发酵罐。最初将发酵罐于30℃以105-150rpm的范围搅动、1,000-2,000Lpm的范围充气和7psi的排出压力下培养。温度和压力在运行过程中保持恒定。当CO2大于废气中的0.3%时,开始营养物补料(10%酵母提取物和20%葡萄糖)。当OD600达到20-25时,通过添加经滤器灭菌的1M异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度30μM来诱导两种基因的表达,并继续发酵达总共48小时。
实施例4:使用分离的(部分纯化的)PDH/FDH酶浓缩物经由(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸自3-羟基-α-氧代三环-[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸的(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸的套叠生成(telescoped production)
PDH/FDH酶浓缩物的分离
自4,000-L发酵(使用与实施例3相似的规程来制备)获得大肠杆菌JM110(pBMS2000-FDH/PDHmod)+的发酵培养液(30L),并通过微流化仪(microfluidizer)(Microfluidics M-110Y型,操作压力12,000-20,000psi)(一次通过)以自细胞释放活性,其中将所述培养液的温度保持在40℃以下。微流化培养液的PDH/FDH活性对于PDH为32IU/mL且对于FDH为8IU/mL。
为了澄清整个培养液,将4.5kg Celite添加至充分搅动的培养液。然后,添加0.201L 30%含水聚乙烯亚胺,并混合30分钟。然后,使用压滤机(ErtelAlsop8-ESSC-10型)来过滤所述混合物,并获得18L滤液。将过滤饼用12L水清洗以使体积回到30L。步骤收率是具有31IU/mL的活性的PDH的97%活性回收和8IU/mL的FDH活性。
将澄清的培养液超滤通过100,000MWCO滤盒(filter cassette)(MilliporePellicon 2单元,聚醚砜低蛋白质结合盒,0.5m2过滤面积)。泵的循环率是400mL/分钟。将澄清的滤液浓缩至1.5L,并得到具有567IU/mL的PDH效价和136IU/mL的FDH效价的酶浓度。测定渗透物,并且没有发现活性。浓缩物中的总体酶活性回收率是84%。
还原性胺化
将3-羟基-α-氧代三环-[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(1.00Kg;4.46mol)添加至20-L容器,接着添加水(5L)。搅动混合物,并用10N NaOH将pH调节至pH约8以得到溶液。添加Darco KBB碳(100g),并搅动混合物达5分钟,然后过滤通过具有5μ滤纸的布氏漏斗。将滤器用水(2x 1L)清洗,并将滤液和洗液组合以得到澄清的溶液。
随着搅动添加甲酸铵(0.562Kg;8.92mol),并用10N NaOH将pH再调节至约7.5。添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(2.65g)和二硫苏糖醇(1.54g)。在固体已经溶解时,添加PDH/FDH酶浓缩物(1.03L;500,000IU PDH)。于环境温度用10NNaOH将pH再调节至约8.0。
然后,将混合物加热至约40℃,并用水稀释至总体积10L。在42小时里将pH维持于7.7-8.3,同时进行搅动。所得的溶液含有0.955Kg(95.1%)产物(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸。
BOC-保护
将二-叔-丁基二碳酸酯(1.022Kg;4.68mol)添加至(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(477.5g;2.12mol)的溶液的一部分。在环境温度搅动此混合物,其中用恒pH滴定仪使用10N NaOH将pH调节并维持于10。在Boc2O添加后4小时完成反应,此时剩余小于1.0%起始材料。
用35%H2SO4将混合物的pH调节至约8,并将i-PrOAc(5.0L)添加至混合物。然后,用35%H2SO4将混合物的pH调节至2.0,并维持于此pH达5-10分钟。添加Dicalite(250g);将混合物搅动约10分钟,然后过滤通过布氏漏斗中的滤纸上的Dicalite(250g)垫。进一步将Dicalite垫用2.5L i-PrOAc清洗。
用10N NaOH将滤液调节至pH 8。在沉降1小时后,弃去包括界面的有机层。对水层添加i-PrOAc(7.5L)。用35%H2SO4酸化混合物至pH约2,然后在温和搅动的情况中加热至约40℃,并维持于约40℃达4小时。分开各层,并保存有机提取物。用i-PrOAc(3.75L)提取具有界面的水层,并于40℃在2小时后将各层再次分开。用i-PrOAc(3.75L)再提取具有界面的水层,并于40℃在2小时后将各层分开。
通过蒸馏至约4.5L来浓缩组合的有机提取物(约15L)。然后,在10-15分钟里向此溶液添加庚烷(约10L),期间将温度维持于约82-89℃。将反应器套温度设置于70℃,并于此温度维持1小时。冷却后不久发生结晶。然后,将反应器套温度设置于40℃,并于此温度维持30分钟。
将悬浮液冷却至环境温度,然后进一步冷却至0-5℃。于0-5℃搅动1小时后,将产物过滤。用庚烷(2.5L)清洗产物,然后于40℃真空干燥以得到607.0g(88%收率)(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸。
应当理解,前述公开内容强调某些具体的实施方案,而且其所有的修饰或备选等同方案在本发明的精神和范围内,如所附权利要求书中所列的。
Claims (6)
1.分离的核酸分子,其由如下组成:
(a)由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成的分离的核酸序列,其中所述序列进一步仅具有单启动子区;或
(b)编码SEQ ID NO:4的多肽和SEQ ID NO:5的多肽的序列,其中所述序列进一步仅具有单启动子区。
2.分离的核酸分子,其由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成。
3.质粒,其包含权利要求1的核酸分子。
4.分离的宿主细胞,其包含权利要求3的质粒。
5.权利要求4的宿主细胞,其是原核细胞。
6.用于生成(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羧基]-氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(式I)的方法:
其中该方法包括:
(a)在合适的条件下培养权利要求5的宿主细胞以表达由SEQ ID NO:1的核酸分子编码的多肽;
(b)部分纯化包含所述多肽的酶浓缩物;并
(c)在如下条件下使培养物分离物与一定量的3-羟基-α-氧代三环-[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(式II)接触:
所述条件容许生成(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(式III):
并
(d)在容许生成(αS)-α-[[(1,1-二甲基乙氧基)羧基]-氨基]-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸的条件下使(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸与一定量的二-叔-丁基二碳酸酯接触。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: ASTRAZENECA AB Free format text: FORMER OWNER: SQUIBB BRISTOL MYERS CO. Effective date: 20140603 |
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C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20140603 Address after: Swedish Sodertalje Applicant after: Astrazeneca (Sweden) AB Address before: new jersey Applicant before: Squibb Bristol Myers Co. |
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C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |