CN102443585A - 玉米赤霉烯酮核酸适体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与玉米赤霉烯酮高特异性和高亲和力结合的核酸适体及其应用，该核酸适体可以用于玉米赤霉烯酮的检测分析和分离富集，具有特异性好、亲和力高、品质均一、稳定性好、开发周期短、生产成本低、使用方便的特点。本发明还涉及所述核酸适体序列的衍生序列，包括修饰后的序列。

Description

玉米赤霉烯酮核酸适体及其应用

(一)技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术----SELEX技术设计和制备一种与玉米赤霉烯酮高特异性和高亲和力结合的玉米赤霉烯酮核酸适体及其应用。

(二)背景技术：

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，是主要由镰刀菌产生的一种类***样真菌毒素，为2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，最初于1962年由Stob等人从污染了镰刀菌的发霉玉米中分离得到，广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、大米等谷类作物和奶中。研究表明，ZEN具有很强的生殖毒性和致畸作用，在1nmol/L～10nmol/L浓度时即能刺激***受体的转录，引起动物流产、死胎、返情等生殖异常现象，还能降低家畜的耗料量，导致生长下降、免疫抑制、繁殖障碍，现在已经成为养猪业的第二杀手；同时，它还可能诱发肿瘤，损伤中枢神经***、血液***和免疫***，对人和动物的健康存在极大的危害。

因ZEN污染而带来的经济损失越来越受到各国政府的重视，目前大部分国家对食品、谷物、饲料当中的ZEN含量都作了十分严格的规定，因此对谷物、饲料、食品等进行ZEN含量检测就显得十分重要。目前比较常用的ZEN检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱法、薄层层析法、高效液相色谱-质谱联用法、微生物检测法和免疫学检测法等。高效液相色谱等方法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，但检测效率低，对仪器的要求也很高；薄层层析法操作简单，成本低，无需价格昂贵的仪器，但其步骤繁琐，灵敏度欠佳。免疫学检测法测定ZEN具有特异性强、灵敏度高、成本低、无需大型昂贵仪器、适于大规模样品的快速检测等优点，越来越受到基层检验单位的欢迎。然而，对于ZEN这种毒性小分子，其抗体的制备周期长、生产成本高、技术难度大、批间差异大、克隆株(细胞)难以有效保存等难题，大大限制了其免疫学检测技术的快速发展。核酸适体(aptamer)作为一种特异性更好、亲和力更高、品质均一、稳定性好的抗体替代品，在检测分析领域中的应用已经被广为认可，并具有开发周期短、生产成本低、使用方便的特点，因此，核酸适体在ZEN这种毒性小分子的快速检测中具有良好的应用前景。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种采用新一代SELEX技术筛选得到的能够与玉米赤霉烯酮高特异性和高亲和力结合的结构转换信号适体，并提供玉米赤霉烯酮核酸适体在玉米赤霉烯酮检测分析和样品分离富集中的应用方法；具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适体具许多优势。

本发明的技术方案：一种玉米赤霉烯酮核酸适体，其特征在于为核苷酸序列

GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序所示的DNA分子。

所述玉米赤霉烯酮核酸适体的衍生物具有相同功能用途。

所述玉米赤霉烯酮核酸适体的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰。

所述玉米赤霉烯酮核酸适体的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。

一种玉米赤霉烯酮核酸适体的应用，其特征在于将玉米赤霉烯酮核酸适体用于玉米赤霉烯酮的检测分析，包括以下步骤：

(1)竞争板准备：50μg/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚赖氨酸100μl于4℃包被过夜，交联剂次亚苯基二异硫氰酸盐或戊二醛活化6h，200-2000pmol/ml NH₂-引物100μl偶联，0.2mol/L乙醇胺或甘氨酸封闭2h，硼氢化钠还原，1％BSA封闭，PBS洗涤后备用；

(2)检测步骤：

①玉米赤霉烯酮核酸适体5-10pmol，94℃3min、冰上5min变性；

②与0-100pmol靶标混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min；

③吸取50μl加入荧光板中，加入1∶200 OliGreen 100μl，作用5min；

④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。

标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。

灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。

重复性：标样重复测定5次，计算其测定离散度CV值。

回收率：以玉米甲醇提取物稀释50倍为样品，加入低、中、高浓度标准，重复测定3次，计算其回收率。

ZEN检测试剂盒：检测灵敏度：0.95ng/ml，重复性：CV＜6％

以玉米匀浆甲醇提取物为样品1∶50稀释，回收率见表：

一种玉米赤霉烯酮核酸适体的应用，其特征在于将玉米赤霉烯酮核酸适体用于从样品中分离、富集玉米赤霉烯酮，包括以下步骤：

(1)将偶联有玉米赤霉烯酮核酸适体的磁颗粒与待分离的含玉米赤霉烯酮的溶液充分混合；

(2)用磁分离器富集磁颗粒，并清洗，然后将玉米赤霉烯酮从偶联有核酸适体的磁颗粒上解离，得到玉米赤霉烯酮单组份。

一种玉米赤霉烯酮核酸适体的互补序列的应用，其特征在于应用于玉米赤霉烯酮检测分析中，包括以下步骤：

①玉米赤霉烯酮检测层析试纸条，其基本结构组成包括：支撑垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等；

②胶体金结合垫上含有核酸适体与其互补序列组装的纳米颗粒聚集体(经生物素标记)6μl，硝酸纤维素膜上含有1-10mg/ml链霉亲和素2μl的检测线；

③检测时，将试纸条吸收板端***待测样品的溶液中，约20s，液体完全湿润连接板并进入膜，取出纸条，放在平台上让液体继续流动，若待测液中无靶标，聚集体较大，不能随液流进入硝酸纤维素膜，不显色，若待测液中有靶标玉米赤霉烯酮存在，可导致组装的聚集体解离而形成分散的纳米颗粒，分散的纳米颗粒随液流进入纤维素膜，纳米颗粒上的生物素标记物与膜上链霉亲和素结合，显红色，是为阳性结果，且显色程度与靶标浓度呈正比关系。

本发明一种玉米赤霉烯酮核酸适体的特性评测：

1、荧光定量PCR法评价玉米赤霉烯酮核酸适体的活性：

充分洗涤组装(通过其互补序列实现)有玉米赤霉烯酮核酸适体的磁颗粒，然后用终浓度1μM的玉米赤霉烯酮进行竞争，室温反应30min。以竞争反应产物为模板进行荧光定量PCR反应，采用Invitrogen公司的试剂盒PlatinumSYBR Green qPCR SuperMix-UDG，20μl体系中含模板2μl、引物P1、P2各20pmol，退火温度65℃。同时设置以溶剂甲醇作为竞争物的对照组。

结果：

可见玉米赤霉烯酮核酸适体对玉米赤霉烯酮具有特异性亲和能力。

2、染料法评价玉米赤霉烯酮核酸适体的活性：

充分洗涤组装(通过其互补序列实现)有玉米赤霉烯酮核酸适体的磁颗粒，然后用终浓度1μM的玉米赤霉烯酮进行竞争，室温反应30min。Oligreen染料用结合缓冲液按1∶200稀释后，等比例加入竞争反应液中，室温避光反应2-5min，用480nm光激发，测定520nm处的发射光。同时设置以甲醇作为竞争物的对照组和结合缓冲液本底对照组。

结果本底对照组未检测到发射光，实验组荧光强度显著高于甲醇对照组，可见玉米赤霉烯酮核酸适体对玉米赤霉烯酮具有特异性亲和能力。

3、经基团修饰的玉米赤霉烯酮核酸适体的活性评价：

依荧光定量PCR法评价玉米赤霉烯酮核酸适体的活性的方法，用荧光定量PCR法分别进行氨基化玉米赤霉烯酮核酸适体、巯基化玉米赤霉烯酮核酸适体、同位素化玉米赤霉烯酮核酸适体、生物素标记的玉米赤霉烯酮核酸适体、HRP标记的玉米赤霉烯酮核酸适体、AP标记的玉米赤霉烯酮核酸适体、地高辛标记的玉米赤霉烯酮核酸适体、TAMRA标记的玉米赤霉烯酮核酸适体、以及纳米发光材料Y₂SiO₅:Eu标记的玉米赤霉烯酮核酸适体的活性评价。

结果：

可见氨基化玉米赤霉烯酮核酸适体、巯基化玉米赤霉烯酮核酸适体、同位素化玉米赤霉烯酮核酸适体、生物素标记的玉米赤霉烯酮核酸适体、HRP标记的玉米赤霉烯酮核酸适体、AP标记的玉米赤霉烯酮核酸适体、地高辛标记的玉米赤霉烯酮核酸适体、TAMRA标记的玉米赤霉烯酮核酸适体、以及纳米发光材料Y₂SiO₅:Eu标记的玉米赤霉烯酮核酸适体对玉米赤霉烯酮均具有特异性亲和能力。

本发明的优点是：具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适体具许多优势：1)本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特异性；3)便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4)重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感。因此，核酸适体技术具有良好的应用前景，特别是在检测分析领域。

(四)具体实施方式：

实施例：一种玉米赤霉烯酮核酸适体，其特征在于为核苷酸序列

GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序所示的DNA分子。

本发明中用于SELEX的单链DNA随机库及引物由Takara公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列：

5’GCATCACTACAGTCATTACGCATCG-(N35)-ATCGTGTGAAGTGCTGTCCC 3’，库容量为10¹⁴以上，引物1：5’GCATCACTACAGTCATTACGCA-3’，引物2：5’GGGACAGCACTTCACACGAT 3’，引物3：5’GCGTAATGACAAAAAAAAAAACAT-C6-NH23’，引物4：5’Biotin-GGGACAGCACTTCACACGAT 3’。玉米赤霉烯酮购自ALEXIS公司，磁珠购于invitrogen公司，寡核苷酸的纯化试剂购于Qiagen公司，PCR试剂盒和T载体购于普洛麦格(Promega)公司。

一种玉米赤霉烯酮核酸适体的筛选制备：

将初始文库通过互补序列偶联于磁颗粒上，以溶剂为反筛分子、玉米赤霉烯酮为筛选分子进行筛选。在玉米赤霉烯酮存在下，与其有结合能力的寡核苷酸序列从磁颗粒上解离，经PCR扩增后，采用亲和分离纯化法制备次级文库，重复筛选8轮，克隆测序，获得玉米赤霉烯酮的单克隆核酸适体。

一种玉米赤霉烯酮核酸适体的应用，其特征在于将玉米赤霉烯酮核酸适体用于玉米赤霉烯酮的检测分析，包括以下步骤：

(1)竞争板准备：多聚赖氨酸(50μg/ml，CBS)100μl于4℃包被过夜，戊二醛(2.5％，PBS)活化6h，NH2-引物(2000pmol/ml，PBS)100μl偶联，乙醇胺(0.2mol/L，pH8.0)封闭2h，硼氢化钠还原，BSA(1％，PBS)封闭，PBS洗涤后备用；

(2)检测步骤：

①玉米赤霉烯酮核酸适体5-10pmol，94℃3min、冰上5min变性；

②与靶标(0-100pmol)混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min；

③吸取50μl加入荧光板中，加入100μl OliGreen(1∶200，TAE)，作用5min；

④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。

标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。

灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。

重复性：标样重复测定5次，计算其测定离散度CV值。

回收率：以玉米甲醇提取物稀释50倍为样品，加入低、中、高浓度标准，重复测定3次，计算其回收率。

ZEN检测试剂盒：检测灵敏度：0.95ng/ml，重复性：CV＜6％

以玉米匀浆甲醇提取物为样品1∶50稀释，回收率见表：

一种玉米赤霉烯酮核酸适体的应用，其特征在于将玉米赤霉烯酮核酸适体用于从样品中分离、富集玉米赤霉烯酮，包括以下步骤：

将偶联有玉米赤霉烯酮核酸适体的磁颗粒与待分离的含玉米赤霉烯酮的溶液充分混合，用磁分离器富集磁颗粒，并清洗，然后将玉米赤霉烯酮从偶联有核酸适体的磁颗粒上解离，得到玉米赤霉烯酮单组份。

一种玉米赤霉烯酮核酸适体的互补序列的应用，其特征在于应用于玉米赤霉烯酮检测分析中，包括以下步骤：

①玉米赤霉烯酮检测层析试纸条，其基本结构组成包括：支撑垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等；

②胶体金结合垫上含有核酸适体与其互补序列组装的纳米颗粒聚集体(经生物素标记)6μl，硝酸纤维素膜上含有10mg/ml链霉亲和素2μl的检测线；

③检测时，将试纸条吸收板端***待测样品的溶液中，约20s，液体完全湿润连接板并进入膜，取出纸条，放在平台上让液体继续流动，若待测液中无靶标，聚集体较大，不能随液流进入硝酸纤维素膜，不显色，若待测液中有靶标玉米赤霉烯酮存在，可导致组装的聚集体解离而形成分散的纳米颗粒，分散的纳米颗粒随液流进入纤维素膜，纳米颗粒上的生物素标记物与膜上链霉亲和素结合，显红色，是为阳性结果，且显色程度与靶标浓度呈正比关系。

Claims (6)

1.一种玉米赤霉烯酮核酸适体，其特征在于为核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序所示的DNA分子。

2.根据权利要求1所述一种玉米赤霉烯酮核酸适体，其特征在于与所述玉米赤霉烯酮核酸适体具有相同功能用途的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰。

3.根据权利要求1所述一种玉米赤霉烯酮核酸适体，其特征在于与所述玉米赤霉烯酮核酸适体具有相同功能用途的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。

4.一种权利要求1所述玉米赤霉烯酮核酸适体的应用，其特征在于用于玉米赤霉烯酮的检测分析。

5.一种权利要求1所述玉米赤霉烯酮核酸适体的应用，其特征在于用于从样品中分离、富集玉米赤霉烯酮。

6.一种权利要求2或3所述玉米赤霉烯酮核酸适体衍生物的应用，其特征在于应用于玉米赤霉烯酮检测分析和分离富集中。