CN102440961B

CN102440961B - 一种具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束及其制备方法

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Publication number: CN102440961B
Application number: CN 201110405688
Authority: CN
Inventors: 帅心涛; 王伟伟; 程度; 巩发明
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2031-12-08
Also published as: CN102440961A

Abstract

本发明涉及一种具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束及其制备方法，所述的聚合物胶束是核壳结构，外壳的亲水段末梢接有靶向配体分子，内核的疏水段负载疏水性抗癌药物，内核和外壳之间存在着一层可负载负电量子点的酸敏响应亚表层，在pH5.0时酸敏层亲水，在pH7.4时酸敏层疏水。本发明通过靶向分子实现胶束的肿瘤靶向功能，通过酸敏亚表层负载的量子点实现显像功能，通过酸敏亚表层的低pH值响应性现实药物控制释放功能。本发明的胶束体系改善药物了释放行为，以期解决胶束体系在血液循环中过早释放的问题，通过靶向分子介导的内吞行为增强了药物的治疗效果，通过负载的量子点可以实现治疗过程中的监测。

Description

一种具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束及其制备方法

技术领域

本发明涉及化学、药学和生物医学工程领域，具体来说是一种具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束的制备及在药物控制释放和显像方面的应用。

背景技术

肿瘤严重威胁着人类的健康，且死亡率居高不下。肿瘤治疗有三种主要手段：外科手术、放射治疗和化学药物治疗（化疗），其中前两种为局部性治疗，当肿瘤发生扩散和转移时通常采取化疗。而临床上常用的化疗药物多为疏水型药物，在水中的溶解度非常低，限制了它们的应用。临床使用时多采用小分子表面活性剂对疏水型化疗药物乳化增溶，但该剂型血液稳定性很差，添加的辅料毒副作用也很大，而且释放行为不容易控制。聚合物胶束是一种新型的药物载体，它是由两亲性共聚物在水中自主装形成的以疏水性段为内核亲水段为壳的核壳结构，疏水型的药物负载到胶束的核中。聚合物胶束能负载疏水性药物而显著增加药物的溶解度、提高药物的生物利用度。

常规的胶束载药体系存在着两大问题，一是药物在血液循环中过早的释放，二是肿瘤部位药物聚集和释放浓度不够。药物在血液循环中过早的释放使得有效药量减少，同时全身毒副作用也会增加，药物在肿瘤部位聚集或释放浓度不够会使药物疗效大大降低。因此减少体内循环时药物的释放，控制载药体系到达肿瘤细胞后再释放药物是减小全身毒副作用、提高药物的治疗效果的一种有效方式。

避免药物在血液中的过早释放，就要改善药物释放行为，这方面环境响应型胶束优势十分明显。其中酸敏型胶束是十分重要的一种。医学研究中已经发现，血液的生理环境pH值约为7.4，而细胞内溶酶体的pH值则为4.5~5.0。根据这两种状态下pH值的不同，设计酸敏型胶束可以做到在血液中胶束稳定药物不释放，而到达细胞溶酶体后，药物才开始释放出来发挥疗效。这样就可以减少药物在血液中释放带来的毒副作用，又避免了药物在血液循环中的损失。

解决药物在肿瘤部位的聚集浓度不够通常采用靶向修饰的药物传输体系。在聚合物胶束表面引入肿瘤细胞表面或肿瘤组织血管表面过表达其受体的配体作为靶向分子（如叶酸、多肽或抗体等），增强肿瘤细胞对载药体系的内吞作用，从而提高药物在肿瘤部位的聚集浓度和释放量。

另外，在肿瘤治疗中，实现实时监测将会对肿瘤的治疗有十分重大的意义。在外科治疗时，实时监测可以对精确定位肿瘤位置，使切除更加彻底。化疗中如能实现实时监测，则方便对化疗效果进行评价。目前临床中多采用核磁共振显像或超声显像进行实时监测。但核磁共振显像或超声显像只是对组织进行评价，荧光成像技术的出现使人们可以在细胞水平上对肿瘤进行研究，方便对细胞内结构、细胞间相互作用、细胞信号传导进行更加深入的了解。荧光成像技术和荧光探针的开发和研究有两大困难：一是无法有效的克服细胞在可见光区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖；二是荧光有机染料分子易发生光漂白，无法较好的实现对研究分子的长时间荧光标记观察。量子点作为新型的荧光试剂具有独特的光学性能：宽激发波长范围而发射波长却很窄、荧光寿命长、不容易受其它信号干扰有抗光漂白作用、发射波长可通过控制它的大小和组成来调整而且其尺寸特点也使得它非常适于在生物荧光成像中做荧光标记物。

发明内容

本发明的目的在于克服载药体系在血液循环中的过早释放问题，提供一种具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束。

为了克服现有技术的不足，本发明采用如下技术方案：

本发明的具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束是核壳结构，外壳的亲水段末梢接有靶向配体分子，内核的疏水段负载疏水性抗癌药物，内核和外壳之间存在着一层可负载负电量子点的酸敏响应亚表层，在pH 5.0时酸敏层亲水，在pH 7.4时酸敏层疏水。

胶束所用的聚合物为叶酸功能化的聚乙二醇亲水段、酸敏中间段和疏水段组成的三嵌段共聚物。在pH 5.0时将疏水型药物负载到胶束核中，此时酸敏段亲水，不负载药物；再将pH 调至7.4时，酸敏段疏水形成一层保护层，阻止药物在pH 7.4时释放，起到防止药物在血液循环中过早释放的问题。当载药体系通过叶酸介导的内吞作用进入肿瘤细胞后，在肿瘤细胞的溶酶体pH 4.5~5.0的酸性环境下酸敏层亲水，药物开始从胶束核中释放，发挥治疗作用。

所述的酸敏中间段可以是聚氨酰二异丙基乙二胺或聚丙烯酰二异丙基乙二胺，疏水段可以是聚酯或胆酸等疏水型分子。本发明实施例中采用叶酸聚乙二醇-聚天冬酰二异丙基乙二胺-胆酸三嵌段共聚物（FA-PEG-P(Asp-dip)-CA）。

所述的疏水型药物可以是紫杉醇（PTX）等疏水型抗肿瘤药物。

本发明的具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束能在化疗的同时提供实时监测功能，是兼具显像功能的载药体系。载药体系的显像功能是利用酸敏中间层在pH 5.0时带正电这一特征来实现的。在pH 5.0载药的同时，加入带负电的量子点，通过静电作用将量子点负载到酸敏层，再将pH 调至7.4，酸敏段疏水在载药胶束核的外层形成一层保护层，将负电量子点包裹在保护层。酸敏中间层在防过早释放的同时负载负电量子点起到可实时监测荧光成像的功能。

所述的负电量子点可以是羧基化的CdSe/ZnS或其它带负电的量子点。

本发明的另一个目的是提供上述具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束的制备方法，具体步骤如下：将10重量份叶酸封端的聚乙二醇-聚天冬酰二异丙基乙二胺-胆酸三嵌段共聚物和1重量份疏水性抗癌药物溶解在四氢呋喃中，在超声作用下缓慢加至酸性缓冲液中，将四氢呋喃自然挥发掉，过滤将疏水性药物聚集体除掉，用离心超滤管（MWCO=100 kD）离心超滤3次，加入负电量子点CdSe/ZnS (100 μL，8 μmoL/L)，混匀后静止30分钟，调节pH 到7.4，6000 r/min离心除去未负载的量子点。所得胶束形状均匀，光散射测出平均粒径为53.4 ± 0.8 nm，透射电镜测出粒径为40 nm左右。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

我们设计的具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束是通过中间段为酸敏段的叶酸功能化的三嵌段共聚物在pH 5.0的条件下自组装形成的。利用胶束核负载疏水性药物；胶束核与壳之间存在着一段酸敏感的中间层，在pH 5.0的条件下，酸敏段带正电荷可以通过静电作用负载负电性量子点，在pH 7.4的环境下，酸敏段疏水在胶束核的外层形成一层保护层，将负电量子点包裹在保护层，同时该层能起到防止药物在pH 7.4的条件下释放的作用。当胶束通过叶酸靶向介导进入肿瘤细胞后，在细胞溶酶体的低pH 5.0的条件下酸敏段质子化变成亲水性，此时药物可以从胶束核中释放出来发挥疗效。该体系是集主动靶向、显像和防药物过早释放的新型多功能胶束载药体系。本发明的具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束不仅能解决载药体系在血液中的过早释放问题，提高了药物在肿瘤部位的聚集浓度和释放速度，还能同时实现实时监测。对肿瘤治疗和药物新剂型方面有很大的研究价值和应用前景。

附图说明

图1是实施例3中胶束粒径的动态光散射分布图。结果表明PEG- P(Asp-dip)₁₇-CA形成的胶束粒径为53.4±0.8 nm。

图2是实施例3中胶束透射电镜形貌图。pH 7.4时的量子点均匀分布在胶束内核的外层，胶束粒径均匀（40 nm），说明了结果表明量子点被成功的负载到胶束样品中，同时也证明了我们设计的胶束的确具有酸敏亚表层。

图3是实施例4中胶束体外药物释放图，实施例中所用聚合物的酸敏中间段地重复单元数为17， PEG- P(Asp-dip)-CA负载紫杉醇后样品在pH 7.4的缓冲液中释放量很低，而在pH 5.0的缓冲液中均表现出快速释放行为。药物体外释放结果表明所设计的胶束体系具有防止药物在pH 7.4中过早释放的功能。

图4是实施例5中负载FDA和QD的胶束在pH 5.0时的荧光释放图。结果表明在pH 5.0时，随时间延长，FDA逐渐释放，其的荧光强度逐渐增强；QD在酸性环境中逐渐荧光慢慢淬灭，其荧光强度逐渐减弱。

图5是实施例5中负载FDA和QD的胶束在pH 7.4时的荧光释放图。结果表明在pH 7.4时，随时间延长，FDA和QD稳定在胶束核中没有释放，FDA和QD的荧光强度基本不变。

图6是实施例6中不同胶束样品对Bel-7402细胞的毒性测试图。样品分别为：FA-micelles，PTX/micelles, PTX/FA-micelles, PTX/FA-micelles/QD；其中FA-micelles为空胶束，后三者样品中含紫杉醇的实验点系列浓度均为（5 nM，10 nM， 20 nM，30 nM，40 nM，50 nM，60 nM），培养时间为36 h。结果表明空胶束FA-micelles的细胞毒性最小，非靶向组PTX/micelles的细胞毒性次之，靶向组PTX/FA-micelles的细胞毒性较非靶向组高，同时负载PTX和QD的样品PTX/FA-micelles/QD与靶向组PTX/FA-micelles样品基本相当，说明引入QD后样品的毒性没有增加。

具体实施方式

以下实施例对本发明作了详细说明。

实施例 1

叶酸修饰的具有酸敏中间段的三嵌段共聚物FA-PEG-P(Asp-dip)-CA的合成

（1）一端为烯丙基另一端为羟基的聚乙二醇（Allyl-PEG-OH）的合成

将萘基钾（4 mL）的四氢呋喃溶液与丙烯醇（0.75 mL）混合均匀后在干燥的反应瓶中搅拌15分钟。然后在氩气保护下加入无水四氢呋喃（20 mL）和18-冠醚-6的四氢呋喃溶液（含1.5 g 18-冠醚-6和5 mL无水四氢呋喃），搅拌15分钟后将混合物置于冰盐浴中冷却，并缓慢通入干燥的环氧乙烷，维持低温24小时以使聚合反应持续进行，室温下继续反应72小时。

（2）一端为烯丙基另一端为氨基的聚乙二醇（Allyl-PEG-NH₂）的合成

称取Allyl-PEG-OH（Mn=2000 Da，20g）于干燥的三口瓶中（250 mL），80℃抽真空干燥4 h，然后加入无水二氯甲烷（100 mL）、吡啶（50 mL）和对甲苯磺酰氯（TsCl，5g），室温下避光反应24 h。反应液用HC1（3 mol L-1）萃取洗涤，有机层用NaHCO3（5g）洗涤，将溶液慢慢滴加到大量无水***中，真空干燥得白色粉末PEG_2k-OTS。

将上述白色粉末（10 g）与浓氨水（500 mL，25%）置于1000mL容器中，室温下反应5天。用同体积的CH₂C1₂萃取后将其与同体积NaOH溶液（1.0 mol L^-1）充分混合搅拌2 h，将有机层用水洗至中性，真空干燥得Allyl-PEG_2k-NH₂。核磁计算出氨基转换率为80%。

（3）苄氧羰基天冬氨酸酸酐（BLA-NCA）的合成

在干燥的三口烧瓶内（250 mL）装入天门冬氨酸苄酯（25 g），然后加入新蒸的乙酸乙酯（100 mL）搅拌溶解。另将三聚光气（13.2948 g）用新蒸的乙酸乙酯（40 mL）溶解后转移至干燥的磨口恒压滴液漏斗中。将天门冬氨酸苄酯的乙酸乙酯溶液温度升至40℃后，搅拌并缓慢滴加三光气的乙酸乙酯溶液,待反应液转透明后搅拌熟化1小时，通氩气鼓泡除去溶液生产的氯化氢。

过滤去未反应的天门冬氨酸苄酯，在新蒸正己烷中进行重沉淀，充分摇振，待有晶体析出时放入冰箱冷冻至少12小时。冷冻后快速抽滤，用正己烷洗涤数次，真空干燥得到BLA-NCA晶体。

（4）聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物（PEG-PBLA）的合成

将PEG_2k-NH₂（1.0 g）加入反应瓶（50 mL）中，70℃真空干燥4 h，用DMF（10 mL）溶解，加入含1.9 g BLA-NCA的DMF（2 mL）溶液。混合均匀后于35℃下反应24 h。将溶液沉淀在冷***中，过滤抽干，得PEG_2k-PBLA_3.5k。

（5）聚乙二醇-聚天冬氨酸-胆酸（PEG-PBLA-CA）的合成

称取胆酸（0.05 g），EDC （0.03 g）和NHS（0.02 g）于反应瓶（50 mL）中，加DMF/HCCl₃（V：V=1：1，4 mL）溶解后，搅拌30min，加PEG2k-PBLA3.5k（0.55 g），室温反应24h。将溶液沉淀到无水乙醇中，过滤，水洗，真空干燥得到PEG-PBLA-CA。

（6）聚乙二醇-聚天冬酰二异丙基乙二胺-胆酸（PEG-P(Asp-dip)-CA）的合成

称取PEG-PBLA-CA（0.3 g）加入反应瓶（50 mL）中，用DMF（1.0 mL）溶解，加dip（4 mL），于35℃搅拌下反应48h。将溶液沉淀到无水***中，过滤，真空干燥得PEG-P(Asp-dip)-CA。

（7）叶酸功能化的聚乙二醇-聚天冬酰二异丙基乙二胺-胆酸（FA-PEG-P(Asp-dip)-CA）的合成

称取PEG-P(Asp-dip)-CA（0.3 g，1eq）置于两口烧瓶中，70℃真空干燥1 h，加入DMF（5 mL）溶解，然后加入巯基乙胺盐酸盐 (80 mg，15eq.)与偶氮二异丁腈（6 mg，0.8eq），在70℃反应24 h，沉淀在冷无水***中，得NH₂-PEG-P(Asp-dip)-CA。

叶酸（0.044 g）加入两口瓶（50 mL）中，真空干燥4 h后，加入干燥的DMSO（15 mL），然后依次加入N-羟基琥珀酰亚胺0.023g (2eq)，N,N'-二环己基碳二亚胺0.041g (2eq)，避光反应12 h，离心去掉生成的DCU，然后活化的叶酸加入到溶有NH₂-PEG-P(Asp-dip)-CA（0.3 g）的5 ml DMF溶液中，然后用三乙胺把反应体系pH值调到8，避光反应24h，用MWCO=1k Da的透析袋在蒸馏水中透析48h，冷冻干燥得黄色粉末状产物FA-PEG-P(Asp-dip)-CA。

实施例 2

具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束的制备

（1）负载QD胶束样品制备：将FA-PEG-P(Asp-dip)-CA（2.0 mg）和PEG-P(Asp-dip)-CA（8.0 mg）的混合物溶于四氢呋喃（THF，1.0 mL）中，超声情况下滴加到PBS（10 mL，pH=5.0）中，搅拌过夜，将THF自然挥发掉，用孔径为0.22 μm的滤膜过滤后加入负电量子点CdSe/ZnS (100 μL，8 μmoL/L)，混匀后静止30分钟，调节pH到7.4，6000r/min离心除去未负载的量子点。

（2）负载QD和紫杉醇胶束样品制备：将FA-PEG-P(Asp-dip)-CA（2.0 mg）和PEG-P(Asp-dip)-CA（8.0 mg）的混合物与PTX（1.0 mg）溶于四氢呋喃（THF，1.0 mL）中，超声情况下滴加到PBS（10 mL，pH=5.0）中，搅拌过夜，将THF自然挥发掉，用孔径为0.45 μm的滤膜过滤将PTX聚集体除掉，用离心超滤管（MWCO=100 kD）离心超滤3次，加入负电量子点CdSe/ZnS (100 μL，8 μmoL/L)，混匀后静止30分钟，调节pH 到7.4。6000r/min离心除去未负载的量子点。

（3）负载QD和荧光素二乙酸酯（FDA）胶束样品制备：将FA-PEG-P(Asp-dip)-CA（2.0 mg）和PEG-P(Asp-dip)-CA（8.0 mg）的混合物与FDA（1.0 mg）溶于四氢呋喃（THF，1.0 mL）中，超声情况下滴加到PBS（10 mL，pH=5.0）中，搅拌过夜，将THF自然挥发掉，用孔径为0.45 μm的滤膜过滤将FDA聚集体除掉，用离心超滤管（MWCO=100 kD）离心超滤3次，加入负电量子点CdSe/ZnS (100 μL，8 μmoL/L)，混匀后静止30分钟，调节pH 到7.4。6000r/min离心除去未负载的量子点。

实施例 3 具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束的粒径和形貌测试试验：

负载QD胶束的粒径大小采用动态光散射***进行测量，测试结果见图1；其形态则通过透射电子显微镜来观察确定，测试结果见图2。

实施例 4

具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束（以负载紫杉醇的胶束为例）的体外释药试验

用透析的方法来做紫杉醇的体外释放实验。将新做的负载紫杉醇的PEG-P(Asp-dip)-CA胶束分成两份，一份维持其pH值为5.0，将另一份调至7.4。再将每个pH值的样品分成三份（平行实验）装到截留分子量为14000 Da的透析袋中，将透析袋放入100 mL的相同pH值的PBS缓冲液中。置于37℃的摇床中，75 r/min的转速下，设定的时间点取样，之后补加相同体积的新鲜缓冲液。用HPLC检测样品的浓度，计算出不同时间点的累积释放量。其中HPLC所用的色谱柱型号为welch materials公司的Ultimate^® AQ-C18，5 μm,4.6×250mm，流动相为乙腈和水（V:V=50:50），流速为1.0 mL min^-1，柱温为40℃，注射样品量为20 μL。以时间-累积释放量做图，得到体外PTX从胶束释放的曲线，测试结果如图3。

实施例 5

具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束（以负载FDA和QD的胶束为例）的体外荧光释放试验

取pH为7.4的负载FDA和QD的1.0 mg mL^-1胶束溶液1 mL，调节pH为5.0，定容至2 mL。用荧光分光光度计测定荧光强度随时间变化图，荧光扫描的激发波长为430 nm，激发狭缝设置为10.0 nm，发射狭缝设置为10.0 nm，扫描速度为500 nm min^-1。测试结果如图4。

用同样的参数检测pH为7.4的负载FDA和QD的0.5 mg mL^-1胶束溶液的荧光强度随时间变化图，测试结果如图5。

实施例 6 具有酸敏亚表层的聚合物胶束的体外毒性试验：

用四唑盐比色法(MTT)检测胶束样品对Bel-7402细胞增殖能力的影响。所有实验结果重复三次。将Bel-7402细胞以1×10³细胞每孔接种于96孔板，然后将Bel-7402细胞在100 μL RPMI 1640（含10%FBS）培养基中37℃培养12h，接着换成不含FA以及血清的培养基，并加入不同的样品体系再培养36 h，其中样品组有：1）空胶束（FA-PEG-P(Asp-dip)-CA）FA-micelles ，2）PEG-P(Asp-dip)-CA胶束负载紫杉醇（PTX-micelles），3）叶酸靶向的胶束负载紫杉醇（PTX/FA-micelles），4）叶酸靶向的胶束同时负载紫杉醇和量子点（PTX/FA-micelles/QD）。最后，将培养基换成150 μL RPMI 1640并加入5 mg mL^-1 MTT溶液50 μL，37℃继续孵育4 h。终止培养，将孔内培养上清液吸取弃掉，在每孔内加入150 μL DMSO，震荡5 min，用酶联免疫检测仪监测各孔在OD570 nm的吸光度值。以空白对照组为基准，计算细胞增殖率。测试结果如图6。

Claims

1.一种具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束，所述的靶向聚合物胶束结构是核壳结构，其特征在于外壳的亲水段末梢接有靶向配体分子，内核的疏水段负载疏水性抗癌药物，内核和外壳之间存在着一层负载负电量子点的酸敏响应亚表层，在pH 5.0时酸敏层亲水，在pH 7.4时酸敏层疏水，所述胶束由靶向分子功能化的聚乙二醇-酸敏段-疏水段三嵌段共聚物构成，酸敏段为聚氨酰二异丙基乙二胺，疏水段为胆酸，所述的具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束的制备方法包括如下步骤：将2mg的叶酸封端的聚乙二醇-聚天冬酰二异丙基乙二胺-胆酸三嵌段共聚物和8mg的聚乙二醇-聚天冬酰二异丙基乙二胺-胆酸三嵌段共聚物的混合物与1mg的紫杉醇溶于1ml的四氢呋喃中，在超声情况下滴加到10ml的pH为5.0的PBS中，搅拌过夜，将四氢呋喃自然挥发掉，用孔径为0.45μm的滤膜过滤将紫杉醇聚集体除掉，用离心超滤管，MWCO=100 kD，离心超滤3次，加入负电量子点CdSe/ZnS，100μL，8μmoL/L，混匀后静止30分钟，调节pH到7.4，6000r/min离心除去未负载的量子点，即得。

2.如权利要求1所述的靶向聚合物胶束，其特征在于所述靶向配体分子为叶酸。

3.如权利要求1所述的靶向聚合物胶束，其特征在于所述疏水性抗癌药物是紫杉醇。