CN102422815A - 以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法,通过对大花香水月季中部枝条,切段、灭菌后进行继代培养一个月,再将大花香水月季无菌苗的叶片横切数刀,接种到愈伤诱导培养基上,待长出胚性愈伤组织;再在分化培养基上培养待胚性愈伤组织分化出不定芽;然后接种到壮苗培养基上,长高后接种到生根培养基上培养即形成完整植株。本发明所用的外植体采集方便,可以周年进行大花香水月季的扩繁和细胞的培养;所得到的胚性愈伤组织,可以作为遗传转化的良好受体,为大花香水月季遗传转化体系的建立提供受体;所建立的再生体系可以解决大花香水月季繁殖上的难题,以更好的保护和利用该资源。
Description
技术领域
本发明涉及一种植株的再生方法,尤其是一种以大花香水月季单芽茎段为外植体,通过器官发生途径进行大花香水月季植株再生的方法,属于植物组织培养技术领域。
背景技术
大花香水月季(R.odorata var. gigantea)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)落叶藤本,为单瓣花,乳白色,芳香,花径8~10cm。原产地是云南,是现代月季重要的原始亲本之一,是月季演化过程中的重要种源,也是培育大花品种和大型植株月季的种质资源。用传统的杂交育种方法选育新品种时,不仅周期长,工作量大,而且与其他野生种或品种杂交会出现不结实的问题;采用大花香水月季枝条扦插,则不会生根,而实生种子苗易发生变异,因此,繁殖很困难,制约着大花香水月季的繁殖及产业化发展。为了进行基因转化、诱变育种、快速繁殖和品种保存,必须建立植株的再生体系。目前,国内外还未见关于大花香水月季再生技术方面的报道。
发明内容
本发明针对大花香水月季存在的扦插不易生根、种子萌发率低、成活率低、实生苗后代易变异、难以通过外源基因进行遗传改良等问题,提出一种以大花香水月季单芽茎段为外植体,通过器官发生途径进行植株再生的方法,以解决大花香水月季快速繁殖的难题,为进行种质改良、资源保存以及新品种选育提供技术支持。
本发明通过下列技术方案实现:一种以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法,其特征在于经过下列各步骤:
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理后,接种在1.0~2.0mg/L 6-BA + 0.1~0.15 mg/L NAA + 6.2~7.0g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为5.8~6.1的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.01~0.02 mg/L NAA + 6.2~7.0g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于23~26℃、光照强度2000~3000Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养25~35天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 5~9mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.5~3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8~6.1,并在黑暗条件下培养,5~10天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+1.0~5.0 mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0~1.0 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 2.5~3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8~6.1,并在黑暗条件下培养10~15天,之后在光照强度为2000~3000Lx,光照时间为14h/d条件下,培养10~15天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.01~0.02mg/L NAA +0.3~0.5mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2~7.0g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出2~3cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.1~0.3mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.2~7.0g/L琼脂粉,pH值为5.8~6.1,并在光照强度为2000~3000Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,20~30天后即得植株。
所述步骤A的单芽茎段的消毒处理是:用0.1%升汞灭菌8~10min,再用无菌水冲洗干净,即可。
所述步骤B的愈伤诱导培养基中的2,4-D优选8mg/L。
所述步骤C的分化培养基中的TDZ优选3.0mg/L。
所述步骤C的分化培养基中的6-BA优选1.0 mg/L。
所述步骤D的壮苗培养基中的GA3优选0.3mg/L。
所述步骤D的生根培养基中的NAA优选0.1mg/L。
为了便于对本发明的理解,发明人对上述各个步骤中所用的培养基、培养基中所用到的植物激素做了如下定义:
1、培养基包括:胚性愈伤诱导培养基、胚性愈伤分化培养基、壮苗培养基和生根培养基。
2、植物激素包括:6-苄基腺嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、赤霉素(GA3)、噻重氮苯基脲(TDZ)。本发明所使用的基本培养基来源如下:MS培养基、1/2MS培养基(Murashige T.and F.Skoog. PHysiol. Plant,1962,15:473-497)。
本发明是以大花香水月季带腋芽的茎段为外植体,先诱导腋芽萌发,再用伸展的小叶诱导胚性愈伤组织,进一步获得分化正常的植株。其中,得到的胚性愈伤组织可以进行遗传转化,该再生体系的建立,不仅解决了大花香水月季繁殖困难的问题,同时为利用基因工程技术进行遗传改良奠定了基础。
本发明的积极效果和优点是:
1、本发明所用的外植体采集方便,可以周年进行大花香水月季的扩繁和细胞的培养;
2、本发明得到的胚性愈伤组织,可以作为遗传转化的良好受体,为大花香水月季遗传转化体系的建立提供受体;
3、本发明建立的再生体系可以解决大花香水月季繁殖上的难题,以更好的保护和利用该资源。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明,但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理,用0.1%升汞灭菌8min,再用无菌水冲洗干净后,接种在1.5mg/L 6-BA + 0.15 mg/L NAA + 6.2g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为6.0的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.01mg/L NAA + 6.2g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于25℃、光照强度2000Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养25天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 8 mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.5g/L植物凝胶,pH值为6.0,并在黑暗条件下培养,10天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+3.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 2.5g/L植物凝胶,pH值为6.0,并在黑暗条件下培养12天,之后在光照强度为2000Lx,光照时间为14h/d条件下,培养15天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.01mg/L NAA +0.5mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出2cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.1mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉,pH值为6.0,并在光照强度为2000Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,20天后即得植株。
实施例2
步骤A、C、D同实施例1,仅步骤B的2,4-D量为6mg/L。
实施例3
步骤A、C、D同实施例1,仅步骤B的2,4-D量为5mg/L。
实施例4
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理,用0.1%升汞灭菌9min,再用无菌水冲洗干净后,接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为6.1的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于23℃、光照强度3000Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养30天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 5mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶,pH值为6.1,并在黑暗条件下培养,8天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA + 30g/L葡萄糖 +3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养10天,之后在光照强度为2500Lx,光照时间为14h/d条件下,培养12天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.3mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出3cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉,pH值为6.1,并在光照强度为2500Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,25天后即得植株。(见表2中Ⅰ)
实施例5
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理,用0.1%升汞灭菌9min,再用无菌水冲洗干净后,接种在2.0mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA +7g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为5.9的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于26℃、光照强度2500Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养30天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 9 mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.9,并在黑暗条件下培养,8天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+5.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA + 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.9,并在黑暗条件下培养12天,之后在光照强度为2500Lx,光照时间为14h/d条件下,培养12天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.3mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出3cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉,pH值为6.1,并在光照强度为2500Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,25天后即得植株。(见表2、表3中Ⅱ)
实施例6
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理,用0.1%升汞灭菌9min,再用无菌水冲洗干净后,接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为5.8的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于24℃、光照强度2800Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养30天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 7mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养,8天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+2.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA + 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养12天,之后在光照强度为2500Lx,光照时间为14h/d条件下,培养12天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.3mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出3cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉,pH值为6.1,并在光照强度为2500Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,25天后即得植株。(见表2中Ⅲ)
实施例7
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理,用0.1%升汞灭菌9min,再用无菌水冲洗干净后,接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为5.8的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于23℃、光照强度2500Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养30天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 6mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养,8天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+3.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA + 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养15天,之后在光照强度为2500Lx,光照时间为14h/d条件下,培养12天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.3mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出3cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉,pH值为6.1,并在光照强度为2500Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,25天后即得植株。(见表2、表3中Ⅳ)
实施例8
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理,用0.1%升汞灭菌9min,再用无菌水冲洗干净后,接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为5.8的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于23℃、光照强度2500Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养30天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 8mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养,8天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养15天,之后在光照强度为2500Lx,光照时间为14h/d条件下,培养12天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.4mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出3cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉,pH值为6.1,并在光照强度为2500Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,25天后即得植株。(见表2中Ⅴ)
实施例9
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理,用0.1%升汞灭菌9min,再用无菌水冲洗干净后,接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为5.8的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于23℃、光照强度2500Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养30天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 8mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养,8天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+1.5mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养12天,之后在光照强度为2500Lx,光照时间为14h/d条件下,培养12天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.4mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出3cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉,pH值为6.1,并在光照强度为2500Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,25天后即得植株。(见表2、表3中Ⅵ)
实施例10
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理,用0.1%升汞灭菌9min,再用无菌水冲洗干净后,接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为5.8的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于23℃、光照强度2500Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养30天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 5mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养,8天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+2.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养12天,之后在光照强度为2500Lx,光照时间为14h/d条件下,培养12天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.4mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出3cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉,pH值为6.1,并在光照强度为2500Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,25天后即得植株。(见表2中Ⅶ)
实施例11
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理,用0.1%升汞灭菌9min,再用无菌水冲洗干净后,接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为5.8的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于23℃、光照强度2500Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养30天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 6mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养,8天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+3.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8,并在黑暗条件下培养15天,之后在光照强度为2500Lx,光照时间为14h/d条件下,培养12天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.4mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出3cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉,pH值为6.1,并在光照强度为2500Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,25天后即得植株。(见表2、表3中Ⅷ)
实施例1、2、3的结果见表1,所示不同浓度的2,4-D对大花香水月季胚性愈伤诱导的影响:
表1 不同浓度的2,4-D对大花香水月季胚性愈伤组织的影响
2,4-D浓度(mg/L) | 愈伤诱导率(%) | 愈伤生长情况 |
8 | 97.00 | 小叶叶柄和叶脉切口处产生大量愈伤,疏松,颗粒状,较湿润 |
6 | 91.00 | 小叶叶柄和叶脉切口处产生大量愈伤,含水量较高,疏松,白色,有少量愈伤为胚性愈伤 |
5 | 83.00 | 小叶叶柄和叶脉切口处产生少量愈伤,白色,湿润,有少量不定根 |
小叶接种到愈伤诱导培养基上10天后,可以看到小叶柄切口处、叶脉切口处膨大,形成少量愈伤,20天后,可形成大量愈伤,超过30天胚性愈伤表面褐化,逐渐死亡。如表1所示,2,4-D浓度为 5.0mg/L时,小叶柄和叶片切口处有大量愈伤形成,愈伤白色,含水量较高,部分水渍化,有少量不定根产生,在继续培养过程中,不定根褐化死亡;2,4-D浓度为6.0mg/L时,小叶柄和叶片切口处均有大量愈伤和少量不定根形成,少量为胚性愈伤,白色,湿润,表面颗粒状;2,4-D浓度为8.0mg/L时,小叶柄切口处和叶脉切口处均能形成胚性愈伤组织,白色,湿润,表面颗粒状,有少量不定根形成。综上所述,8.0mg/L的2,4-D是大花香水月季诱导胚性愈伤的最佳激素浓度。
不同的2,4-D浓度对胚性愈伤组织分化的影响:在诱导愈伤阶段,不同的2,4-D浓度对后期愈伤分化有影响。在研究中发现,只有2,4-D浓度为5.0~9.0 mg/L时,才有胚性愈伤分化为不定芽,而且在2,4-D浓度为8.0mg/L时,分化率最高,为13.33%。
实施例4~11的结果见表2、3所示,不同浓度的TDZ和6-BA对大花香水月季胚性愈伤组织分化的影响
表2 大花香水月季分化培养基编号表
表3 大花香水月季适宜的分化培养基和暗培养时间
分化培养基编号 | 暗培养时间(天) | 愈伤分化率(%) |
Ⅱ | 12 | 3.33 |
Ⅳ | 15 | 13.33 |
Ⅵ | 12 | 3.33 |
Ⅷ | 15 | 6.67 |
TDZ 对木本植物的离体芽增殖具有显著的促进作用。在大花香水月季胚性愈伤组织分化阶段,使用MS基本培养基,附加激素为TDZ,NAA,GA3,NAA浓度为0.1mg/L,GA3浓度为1.0mg/L,TDZ设计5个浓度,分别为:1.0、1.5、2.0、3.0和5.0mg/L,结果如下表所示:只有TDZ浓度为1.5 mg/L和3.0 mg/L时,胚性愈伤分化出不定芽,TDZ浓度为3.0 mg/L比TDZ浓度为1.5 mg/L 时不定芽分化率高。TDZ浓度过高和过低都没有发现胚性愈伤组织分化现象。相反,随着培养时间的延长,愈伤逐渐褐化。因此,大花香水月季胚性愈伤组织分化的最佳TDZ浓度为3.0mg/L。
6-BA对于月季不定芽展枝效果好,在大花香水月季胚性愈伤组织分化阶段,6-BA浓度为0 mg/L时不定芽诱导率比1.0 mg/L时高,不同的TDZ和6-BA的分化培养基之间的差异极为显著。
Claims (7)
1.一种以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法,其特征在于经过下列各步骤:
A.选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条,并切成单芽茎段,经消毒处理后,接种在1.0~2.0mg/L 6-BA + 0.1~0.15 mg/L NAA + 6.2~7.0g/L琼脂 + 30g/L蔗糖,且pH值为5.8~6.1的MS基本培养基上,直至腋芽萌发后,再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.01~0.02 mg/L NAA + 6.2~7.0g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上,于23~26℃、光照强度2000~3000Lx,光照时间14h/d的条件下,进行继代培养25~35天,得到大花香水月季的无菌苗;
B.将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下,在小叶主脉处横切出伤口,叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上:MS基本培养基 + 5~9 mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.5~3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8~6.1,并在黑暗条件下培养,5~10天切口处膨大,可以观察到愈伤组织;
C.将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上:MS基本培养基+1.0~5.0 mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0~1.0 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 2.5~3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8~6.1,并在黑暗条件下培养10~15天,之后在光照强度为2000~3000Lx,光照时间为14h/d条件下,培养10~15天,使愈伤组织分化出不定芽;
D.将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上:MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.01~0.02mg/L NAA +0.3~0.5mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2~7.0g/L琼脂粉,pH值为6.0,培养至长出2~3cm高后,接种到下列生根培养基上:1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.1~0.3mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.2~7.0g/L琼脂粉,pH值为5.8~6.1,并在光照强度为2000~3000Lx条件下,光照时间为14h/d条件下,进行生根培养,20~30天后即得植株。
2.根据权利要求1所述的植株再生方法,其特征在于:所述步骤A的单芽茎段的消毒处理是:用0.1%升汞灭菌8~10min,再用无菌水冲洗干净,即可。
3.根据权利要求1或2所述的植株再生方法,其特征在于:所述步骤B的愈伤诱导培养基中的2,4-D优选8 mg/L。
4.根据权利要求1或2所述的植株再生方法,其特征在于:所述步骤C的分化培养基中的TDZ优选3.0 mg/L。
5.根据权利要求1或2所述的植株再生方法,其特征在于:所述步骤C的分化培养基中的6-BA优选1.0 mg/L。
6.根据权利要求1或2所述的植株再生方法,其特征在于:所述步骤D的壮苗培养基中的GA3优选0.3 mg/L。
7.根据权利要求1或2所述的植株再生方法,其特征在于:所述步骤D的生根培养基中的NAA优选0.1mg/L。
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