CN102422815A - 以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法，通过对大花香水月季中部枝条，切段、灭菌后进行继代培养一个月，再将大花香水月季无菌苗的叶片横切数刀，接种到愈伤诱导培养基上，待长出胚性愈伤组织；再在分化培养基上培养待胚性愈伤组织分化出不定芽；然后接种到壮苗培养基上，长高后接种到生根培养基上培养即形成完整植株。本发明所用的外植体采集方便，可以周年进行大花香水月季的扩繁和细胞的培养；所得到的胚性愈伤组织，可以作为遗传转化的良好受体，为大花香水月季遗传转化体系的建立提供受体；所建立的再生体系可以解决大花香水月季繁殖上的难题，以更好的保护和利用该资源。
Description
技术领域
本发明涉及一种植株的再生方法，尤其是一种以大花香水月季单芽茎段为外植体，通过器官发生途径进行大花香水月季植株再生的方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
大花香水月季（R.odorata var. gigantea）是蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）落叶藤本，为单瓣花，乳白色，芳香，花径8～10cm。原产地是云南，是现代月季重要的原始亲本之一，是月季演化过程中的重要种源，也是培育大花品种和大型植株月季的种质资源。用传统的杂交育种方法选育新品种时，不仅周期长，工作量大，而且与其他野生种或品种杂交会出现不结实的问题；采用大花香水月季枝条扦插，则不会生根，而实生种子苗易发生变异，因此，繁殖很困难，制约着大花香水月季的繁殖及产业化发展。为了进行基因转化、诱变育种、快速繁殖和品种保存，必须建立植株的再生体系。目前，国内外还未见关于大花香水月季再生技术方面的报道。
发明内容
本发明针对大花香水月季存在的扦插不易生根、种子萌发率低、成活率低、实生苗后代易变异、难以通过外源基因进行遗传改良等问题，提出一种以大花香水月季单芽茎段为外植体，通过器官发生途径进行植株再生的方法，以解决大花香水月季快速繁殖的难题，为进行种质改良、资源保存以及新品种选育提供技术支持。
本发明通过下列技术方案实现：一种以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法，其特征在于经过下列各步骤：
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理后，接种在1.0～2.0mg/L 6-BA + 0.1～0.15 mg/L NAA + 6.2～7.0g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为5.8～6.1的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.01～0.02 mg/L NAA + 6.2～7.0g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于23～26℃、光照强度2000～3000Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养25～35天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 5～9mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.5～3.0g/L植物凝胶，pH值为5.8～6.1，并在黑暗条件下培养，5～10天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+1.0～5.0 mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0～1.0 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 2.5～3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8～6.1，并在黑暗条件下培养10～15天，之后在光照强度为2000～3000Lx，光照时间为14h/d条件下，培养10～15天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.01～0.02mg/L NAA +0.3～0.5mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2～7.0g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出2～3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.1～0.3mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.2～7.0g/L琼脂粉，pH值为5.8～6.1，并在光照强度为2000～3000Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，20～30天后即得植株。
所述步骤A的单芽茎段的消毒处理是：用0.1%升汞灭菌8～10min，再用无菌水冲洗干净，即可。
所述步骤B的愈伤诱导培养基中的2,4-D优选8mg/L。
所述步骤C的分化培养基中的TDZ优选3.0mg/L。
所述步骤C的分化培养基中的6-BA优选1.0 mg/L。
所述步骤D的壮苗培养基中的GA3优选0.3mg/L。
所述步骤D的生根培养基中的NAA优选0.1mg/L。
为了便于对本发明的理解，发明人对上述各个步骤中所用的培养基、培养基中所用到的植物激素做了如下定义：
1、培养基包括：胚性愈伤诱导培养基、胚性愈伤分化培养基、壮苗培养基和生根培养基。
2、植物激素包括：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、α-萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、赤霉素（GA3）、噻重氮苯基脲（TDZ）。本发明所使用的基本培养基来源如下:MS培养基、1/2MS培养基（Murashige T.and F.Skoog. PHysiol. Plant,1962,15:473-497）。
本发明是以大花香水月季带腋芽的茎段为外植体，先诱导腋芽萌发，再用伸展的小叶诱导胚性愈伤组织，进一步获得分化正常的植株。其中，得到的胚性愈伤组织可以进行遗传转化，该再生体系的建立，不仅解决了大花香水月季繁殖困难的问题，同时为利用基因工程技术进行遗传改良奠定了基础。
本发明的积极效果和优点是：
1、本发明所用的外植体采集方便，可以周年进行大花香水月季的扩繁和细胞的培养；
2、本发明得到的胚性愈伤组织，可以作为遗传转化的良好受体，为大花香水月季遗传转化体系的建立提供受体；
3、本发明建立的再生体系可以解决大花香水月季繁殖上的难题，以更好的保护和利用该资源。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理，用0.1%升汞灭菌8min，再用无菌水冲洗干净后，接种在1.5mg/L 6-BA + 0.15 mg/L NAA + 6.2g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为6.0的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.01mg/L NAA + 6.2g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于25℃、光照强度2000Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养25天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 8 mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.5g/L植物凝胶，pH值为6.0，并在黑暗条件下培养，10天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+3.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 2.5g/L植物凝胶,pH值为6.0，并在黑暗条件下培养12天，之后在光照强度为2000Lx，光照时间为14h/d条件下，培养15天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.01mg/L NAA +0.5mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出2cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.1mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉，pH值为6.0，并在光照强度为2000Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，20天后即得植株。
实施例2
步骤A、C、D同实施例1，仅步骤B的2,4-D量为6mg/L。
实施例3
步骤A、C、D同实施例1，仅步骤B的2,4-D量为5mg/L。
实施例4
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理，用0.1%升汞灭菌9min，再用无菌水冲洗干净后，接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为6.1的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于23℃、光照强度3000Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养30天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 5mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶，pH值为6.1，并在黑暗条件下培养，8天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA + 30g/L葡萄糖 +3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8，并在黑暗条件下培养10天，之后在光照强度为2500Lx，光照时间为14h/d条件下，培养12天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.3mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH值为6.1，并在光照强度为2500Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，25天后即得植株。（见表2中Ⅰ）
实施例5
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理，用0.1%升汞灭菌9min，再用无菌水冲洗干净后，接种在2.0mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA +7g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为5.9的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于26℃、光照强度2500Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养30天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 9 mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶，pH值为5.9，并在黑暗条件下培养，8天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+5.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA + 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.9，并在黑暗条件下培养12天，之后在光照强度为2500Lx，光照时间为14h/d条件下，培养12天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.3mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH值为6.1，并在光照强度为2500Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，25天后即得植株。（见表2、表3中Ⅱ）
实施例6
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理，用0.1%升汞灭菌9min，再用无菌水冲洗干净后，接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为5.8的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于24℃、光照强度2800Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养30天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 7mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶，pH值为5.8，并在黑暗条件下培养，8天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+2.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA + 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8，并在黑暗条件下培养12天，之后在光照强度为2500Lx，光照时间为14h/d条件下，培养12天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.3mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH值为6.1，并在光照强度为2500Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，25天后即得植株。（见表2中Ⅲ）
实施例7
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理，用0.1%升汞灭菌9min，再用无菌水冲洗干净后，接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为5.8的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于23℃、光照强度2500Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养30天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 6mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶，pH值为5.8，并在黑暗条件下培养，8天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+3.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA + 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8，并在黑暗条件下培养15天，之后在光照强度为2500Lx，光照时间为14h/d条件下，培养12天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.3mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH值为6.1，并在光照强度为2500Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，25天后即得植株。（见表2、表3中Ⅳ）
实施例8
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理，用0.1%升汞灭菌9min，再用无菌水冲洗干净后，接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为5.8的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于23℃、光照强度2500Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养30天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 8mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶，pH值为5.8，并在黑暗条件下培养，8天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8，并在黑暗条件下培养15天，之后在光照强度为2500Lx，光照时间为14h/d条件下，培养12天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.4mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH值为6.1，并在光照强度为2500Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，25天后即得植株。（见表2中Ⅴ）
实施例9
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理，用0.1%升汞灭菌9min，再用无菌水冲洗干净后，接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为5.8的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于23℃、光照强度2500Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养30天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 8mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶，pH值为5.8，并在黑暗条件下培养，8天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+1.5mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8，并在黑暗条件下培养12天，之后在光照强度为2500Lx，光照时间为14h/d条件下，培养12天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.4mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH值为6.1，并在光照强度为2500Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，25天后即得植株。（见表2、表3中Ⅵ）
实施例10
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理，用0.1%升汞灭菌9min，再用无菌水冲洗干净后，接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为5.8的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于23℃、光照强度2500Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养30天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 5mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶，pH值为5.8，并在黑暗条件下培养，8天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+2.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8，并在黑暗条件下培养12天，之后在光照强度为2500Lx，光照时间为14h/d条件下，培养12天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.4mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH值为6.1，并在光照强度为2500Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，25天后即得植株。（见表2中Ⅶ）
实施例11
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理，用0.1%升汞灭菌9min，再用无菌水冲洗干净后，接种在1.0mg/L 6-BA + 0.12 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为5.8的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA + 6.5g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于23℃、光照强度2500Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养30天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 6mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.8g/L植物凝胶，pH值为5.8，并在黑暗条件下培养，8天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+3.0mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8，并在黑暗条件下培养15天，之后在光照强度为2500Lx，光照时间为14h/d条件下，培养12天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.02mg/L NAA +0.4mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.2mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH值为6.1，并在光照强度为2500Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，25天后即得植株。（见表2、表3中Ⅷ）
实施例1、2、3的结果见表1，所示不同浓度的2,4-D对大花香水月季胚性愈伤诱导的影响：
表1 不同浓度的2,4-D对大花香水月季胚性愈伤组织的影响
| 2,4-D浓度（mg/L） | 愈伤诱导率（%） | 愈伤生长情况 |
| 8 | 97.00 | 小叶叶柄和叶脉切口处产生大量愈伤，疏松，颗粒状，较湿润 |
| 6 | 91.00 | 小叶叶柄和叶脉切口处产生大量愈伤，含水量较高，疏松，白色，有少量愈伤为胚性愈伤 |
| 5 | 83.00 | 小叶叶柄和叶脉切口处产生少量愈伤，白色，湿润，有少量不定根 |
小叶接种到愈伤诱导培养基上10天后，可以看到小叶柄切口处、叶脉切口处膨大，形成少量愈伤，20天后，可形成大量愈伤，超过30天胚性愈伤表面褐化，逐渐死亡。如表1所示，2,4-D浓度为 5.0mg/L时，小叶柄和叶片切口处有大量愈伤形成，愈伤白色，含水量较高，部分水渍化，有少量不定根产生，在继续培养过程中，不定根褐化死亡；2,4-D浓度为6.0mg/L时，小叶柄和叶片切口处均有大量愈伤和少量不定根形成，少量为胚性愈伤，白色，湿润，表面颗粒状；2,4-D浓度为8.0mg/L时，小叶柄切口处和叶脉切口处均能形成胚性愈伤组织，白色，湿润，表面颗粒状，有少量不定根形成。综上所述，8.0mg/L的2,4-D是大花香水月季诱导胚性愈伤的最佳激素浓度。
不同的2,4-D浓度对胚性愈伤组织分化的影响：在诱导愈伤阶段，不同的2,4-D浓度对后期愈伤分化有影响。在研究中发现，只有2,4-D浓度为5.0～9.0 mg/L时，才有胚性愈伤分化为不定芽，而且在2,4-D浓度为8.0mg/L时，分化率最高，为13.33%。
实施例4～11的结果见表2、3所示，不同浓度的TDZ和6-BA对大花香水月季胚性愈伤组织分化的影响
表2 大花香水月季分化培养基编号表
表3 大花香水月季适宜的分化培养基和暗培养时间
| 分化培养基编号 | 暗培养时间（天） | 愈伤分化率（%） |
| Ⅱ | 12 | 3.33 |
| Ⅳ | 15 | 13.33 |
| Ⅵ | 12 | 3.33 |
| Ⅷ | 15 | 6.67 |
TDZ 对木本植物的离体芽增殖具有显著的促进作用。在大花香水月季胚性愈伤组织分化阶段，使用MS基本培养基，附加激素为TDZ，NAA,GA3,NAA浓度为0.1mg/L，GA3浓度为1.0mg/L，TDZ设计5个浓度，分别为：1.0、1.5、2.0、3.0和5.0mg/L，结果如下表所示：只有TDZ浓度为1.5 mg/L和3.0 mg/L时，胚性愈伤分化出不定芽，TDZ浓度为3.0 mg/L比TDZ浓度为1.5 mg/L 时不定芽分化率高。TDZ浓度过高和过低都没有发现胚性愈伤组织分化现象。相反，随着培养时间的延长，愈伤逐渐褐化。因此，大花香水月季胚性愈伤组织分化的最佳TDZ浓度为3.0mg/L。
6-BA对于月季不定芽展枝效果好，在大花香水月季胚性愈伤组织分化阶段，6-BA浓度为0 mg/L时不定芽诱导率比1.0 mg/L时高，不同的TDZ和6-BA的分化培养基之间的差异极为显著。
Claims (7)
1.一种以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法，其特征在于经过下列各步骤：
A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理后，接种在1.0～2.0mg/L 6-BA + 0.1～0.15 mg/L NAA + 6.2～7.0g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为5.8～6.1的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.01～0.02 mg/L NAA + 6.2～7.0g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于23～26℃、光照强度2000～3000Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养25～35天，得到大花香水月季的无菌苗；
B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 5～9 mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.5～3.0g/L植物凝胶，pH值为5.8～6.1，并在黑暗条件下培养，5～10天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；
C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+1.0～5.0 mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA3 + 0.1mg/L NAA +0～1.0 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 2.5～3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8～6.1，并在黑暗条件下培养10～15天，之后在光照强度为2000～3000Lx，光照时间为14h/d条件下，培养10～15天，使愈伤组织分化出不定芽；
D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.01～0.02mg/L NAA +0.3～0.5mg/L GA3 +30g/L蔗糖+6.2～7.0g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出2～3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.1～0.3mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.2～7.0g/L琼脂粉，pH值为5.8～6.1，并在光照强度为2000～3000Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，20～30天后即得植株。
2.根据权利要求1所述的植株再生方法，其特征在于：所述步骤A的单芽茎段的消毒处理是：用0.1%升汞灭菌8～10min，再用无菌水冲洗干净，即可。
3.根据权利要求1或2所述的植株再生方法，其特征在于：所述步骤B的愈伤诱导培养基中的2,4-D优选8 mg/L。
4.根据权利要求1或2所述的植株再生方法，其特征在于：所述步骤C的分化培养基中的TDZ优选3.0 mg/L。
5.根据权利要求1或2所述的植株再生方法，其特征在于：所述步骤C的分化培养基中的6-BA优选1.0 mg/L。
6.根据权利要求1或2所述的植株再生方法，其特征在于：所述步骤D的壮苗培养基中的GA3优选0.3 mg/L。
7.根据权利要求1或2所述的植株再生方法，其特征在于：所述步骤D的生根培养基中的NAA优选0.1mg/L。
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