CN102421892A - 二鸟苷酸环化酶、其生产方法及其在制备环化-di-GMP及其类似物中的应用 - Google Patents
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Abstract
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2009年3月2日申请的美国临时专利申请号61/156,826的利益和优先权,其内容援引加入本文。
发明领域
本发明涉及一种新的二鸟苷酸环化酶、其制备方法以及其在生产环化-di-GMP及环化-di-GMP类似物中的应用。
发明背景
C-di-GMP或者双-(3′-5′)-环化二聚体鸟苷一磷酸(环化-di-GMP或者c-di-GMP)是在细菌中发现的进行胞内信号转导的第二信使(1,2)。积累的证据提示c-di-GMP调节多种细菌行为,如生物膜形成、能动性以及毒力表达(2)。c-di-GMP在生物膜形成和毒力表达中的关键作用表明c-di-GMP在由一些病原菌导致的慢性和急性感染中起关键作用。环化-di-GMP是广泛的细菌信使分子,具有作为治疗细菌感染的治疗剂的潜力。环化-di-GMP及其类似物作为治疗剂的潜在应用包括:抑制金黄色葡萄球菌(S.aureus)建群和生物膜形成;抑制人结肠癌细胞增殖;免疫调节分子以及对于抗体产生具有强力作用,及在医疗设备和装置中如在肺吸入器、心脏支架、心脏瓣膜、肠道插管等中防止生物膜形成或者促进生物膜分散。
鉴于越来越多的c-di-GMP信号传导与细菌发病机制之间的明显关联,在微生物学界特别感兴趣鉴别和鉴定c-di-GMP信号网络的成分。同时,也探索了c-di-GMP直接作为治疗细菌感染的治疗剂的应用。据报道外源c-di-GMP可以降低体外细胞-细胞相互作用以及革兰氏阳性病原体金黄色葡萄球菌包括人甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株和动物临床分离株的生物膜形成(9)。在乳腺炎感染的鼠模型中发现c-di-GMP抑制金黄色葡萄球菌建群和生物膜形成,导致宿主清除该病原体的能力增强(10)。研究表明c-di-GMP可以通过抑制人结肠癌细胞的基础增殖和生长因子诱导的增殖而调节宿主细胞应答(11)。研究还提示c-di-GMP是具有强力免疫预防性质和对抗体产生具有疫苗佐剂作用的免疫调节分子(12)。
参与c-di-GMP信号传导的大分子包括酶和受体的生物化学鉴定需要使用c-di-GMP作为生物化学测定的底物或者配体。C-di-GMP也可以用作起始材料以合成c-di-GMP类似物作为化学探针或者抑制剂。尽管c-di-GMP可以直接得自细菌细胞,但是c-di-GMP的较低细胞内浓度使得这种方法不适于c-di-GMP生产。
环化di-GMP是由具有二鸟苷酸环化酶活性的蛋白质合成。这些蛋白质典型具有特征性GGDEF基序,其是指5个氨基酸的保守序列。所述GGDEF基序位于已经在681个细菌菌种中观测到的GGDEF结构域内。关于该结构域的信息可见于Pfam蛋白质家族数据库(http://pfam.sanger.ac.uk/family?acc=PF00990)。目前使用已知的二鸟苷酸环化酶(DGC)蛋白质通过酶学合成c-di-GMP的产量低。环化di-GMP也是Gluconacetobacte.xylinus中纤维素合酶的别构抑制剂。已经发现c-di-GMP在许多细菌中起作用,这通过大量含有GGDEF、EAL和HD-GYP结构域的蛋白质的存在而证实(3,4)。GGDEF结构域发挥二鸟苷酸环化酶(DGC)功能,催化从GTP合成c-di-GMP(5,6),EAL和HD-GYP结构域发挥磷酸二酯酶(PDE-A)功能,降解c-di-GMP(7,8)。
目前在研究实验室中c-di-GMP是经化学或者酶法少量合成。溶液和固相化学合成方法由于合成途径的多个步骤而是昂贵且耗时的(13-17)。另一方面,通过使用含有DGC结构域的蛋白质经酶学产生c-di-GMP的方法仅包括两个GTP分子的单缩合(6)。所述酶方法已经由一些实验室用于产生c-di-GMP以通过使用WspR、PIeD或者VCA0956进行生物化学测定,WspR、PieD和VCA0956是分别来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的三个含有嗜中温DGC结构域的蛋白质(18-21)。先前我们已经发现通过使用嗜中温DGC蛋白质如WspR制备c-di-GMP仅产生有限量的c-di-GMP(8)。
已知DGC蛋白质由细胞c-di-GMP浓度紧密调节。推测这种调节涉及PIeD中的I-位点(22,23)。PIeD和WspR的晶体结构已经显示所述I-位点含有RXXD基序(23,24)。
因为其作为细菌信号分子的作用及其在细菌毒力、发病机制和生物膜形成中的重要性,目前对c-di-GMP及其类似物特别感兴趣。作为主要的研究和开发焦点,需要产生大体积的c-di-GMP或者类似物。使用熟知的DGC蛋白质如WspR和PA290生产c-di-GMP的主要限制之一是在c-di-GMP制备期间酶活性明显丧失。目前可利用的方法有所不足,仅产生有限量的c-di-GMP。能获得大量环化di-GMP是开发该分子作为抗菌剂的前提条件。先前用于合成环化di-GMP的方法成本太高或者太耗时/耗力。
发明概述
本发明一方面提供了包含GGDEF基序和I-位点的二鸟苷酸环化酶多肽,其中I位点的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换,形成不结合c-di-GMP的突变体二鸟苷酸环化酶。
优选所述中性氨基酸是非极性氨基酸或者不带电荷的极性氨基酸。在一个实施方案中,所述非极性氨基酸是丙氨酸。在一个实施方案中,所述不带电荷的极性氨基酸是谷氨酰胺。
在优选的实施方案中,所述二鸟苷酸环化酶多肽包含这样的氨基酸序列,其与分离自嗜热细菌的包含GGDEF基序的二鸟苷酸环化酶多肽具有至少90%同源性。优选所述嗜热细菌选自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、泉生热袍菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、多节闪烁杆菌(Fervidobacteriumnodosum)、Thermosipho melanesiensis、thermotoga petrophila或者热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)。在一个实施方案中,所述嗜热细菌是海栖热袍菌。
优选所述突变体二鸟苷酸环化酶包含在溶液中的单体。
在优选的实施方案中,所述突变体二鸟苷酸环化酶包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示或者SEQ ID NO:3所示序列。
在一个实施方案中,所述二鸟苷酸环化酶与支持物偶联。在一个实施方案中,所述支持物是sol-gel。
本发明另一方面提供了能表达突变体二鸟苷酸环化酶多肽的多核苷酸,所述多肽包含GGDEF基序及I-位点,其中I位点的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换。在一个实施方案中,权利要求10的多核苷酸包含SEQ ID NO:1所示序列。
本发明另一方面提供了包含本发明多核苷酸的表达载体,所述多核苷酸与能指导所述多核苷酸在宿主细胞中表达的调节序列可操纵地连接。
本发明另一方面提供了产生不结合c-di-GMP的本发明突变体二鸟苷酸环化酶多肽的方法。在一个实施方案中,所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽是化学合成的。在另一个实施方案中,所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽在具有本发明的多核苷酸的本发明的表达载体中产生。
本发明另一方面提供了制备环化di-GMP或者环化di-GMP类似物的方法,所述方法包括步骤:a)将本发明的突变体二鸟苷酸环化酶多肽与鸟苷-5′-三磷酸温育;及b)分离所述环化di-GMP或者环化di-GMP类似物。
在一个实施方案中,所述类似物包括6-硫代-环化di-GMP。在另一个实施方案中,所述类似物包括32P-放射性同位素标记的环化di-GMP。
本发明另一方面提供了通过本发明的方法制备的包含下式的类似物:
附图简述
图1:tDGC和突变体R158A的鉴定。A:tDGC和突变体R158A的吸收谱。插图:野生型和突变体tDGC的SDS-PAGE凝胶。B:来自tDGC和突变体R158A的变性上清的HPLC分析。
图2:在tDGC和R158A突变体的不同底物浓度下c-di-GMP合成对比。插图:tDGC活性的底物浓度依赖性。条件:50mM Tris-Cl(pH 8.0),20mMMgCl2,250mM NaCl,10μM酶,1mM DTT,55℃。
图3:通过大小排阻层析鉴定tDGC和R158A突变体。
图4:突变体R158A的酶活性的pH和盐依赖性。测定条件在材料与方法中描述。
图5:R158A突变体的热稳定性分析。将产量标准化为在0时间点的最高产量。测定条件在材料与方法中描述。
图6:野生型AxDGC2与D217A突变之间在I-位点GGDEF结构域与c-di-GMP结合的HPLC分析的对比。
图7:鉴别环化di-GMP受体的光交联策略。小球表示功能性环化di-GMP。
图8:通过tDGC酶合成的6-硫代环化di-GMP和32P-环化di-GMP。
图9:使用突变体二鸟苷酸环化酶酶促生产(A)环化di-GMP、(B)6-硫代环化di-GMP和(C)32P环化di-GMP的描述。
发明详述
在此我们报道了一种新的独立的二鸟苷酸环化酶多肽,其具有GGDEF基序和RXXD I位点,其中保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换,形成不结合c-di-GMP且因此不受c-di-GMP别构抑制的突变体二鸟苷酸环化酶。所述中性氨基酸可以是任一非极性氨基酸,如丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或者色氨酸。或者,所述中性氨基酸可以是不带电荷的极性氨基酸,如半胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸。优选所述非极性氨基酸是丙氨酸。优选所述极性氨基酸是谷氨酰胺。我们证实通过突变推定的c-di-GMP结合位点中的关键氨基酸残基可以基本上缓解产物抑制。严重限制产量的c-di-GMP产物抑制通过突变推定的调节性I-位点中的保守残基而显著缓解。
在一个实施方案中,所述二鸟苷酸环化酶多肽与其它嗜中温DGC蛋白质相比是具有显著改良的热稳定性的嗜热多肽。借助于改良的热稳定性及受阻抑的产物抑制,我们通过酶反应和产物纯化的优化程序可易于产生几百毫克的c-di-GMP。考虑到嗜中温DGC蛋白质的不良的热稳定性,我们认为嗜热DGC蛋白质更适于c-di-GMP生产。我们针对GGDEF结构域蛋白质搜索了在DOE微生物基因组数据库(http://microbialgenomics.energy.gov/)中可获得的所有嗜热微生物的基因组。在鉴别的GGDEF结构域蛋白质中,缺少完整GGDEF或者GGEEF基序的蛋白质排除在考虑之外。
突变体二鸟苷酸环化酶多肽
本发明的突变体二鸟苷酸环化酶多肽具有大约200-300个氨基酸,编码能大量合成c-di-GMP的二鸟苷酸环化酶。所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽在GGDEF结构域中也包含GGDEF基序及RXXD I-位点,其中保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换。本发明的突变体二鸟苷酸环化酶多肽还包括包含GGDEF基序及RXXD I-位点的二鸟苷酸环化酶多肽的片段和衍生物,其中保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换,且保留合成c-di-GMP的功能。特别地,所述片段或者衍生物基本上具有相同的合成c-di-GMP的生物活性,并且突变的I-位点不结合c-di-GMP。所述多肽可以通过重组或者化学合成方法制备。目前优选的突变体二鸟苷酸环化酶多肽包括包含SEQ ID NO:2、3、4所示氨基酸序列或者其变体、同系物(包括其片段)的那些多肽。优选的多肽由SEQ IDNO:2、4所示氨基酸序列的氨基酸1-188或者其变体、同系物或者片段组成。优选的多肽由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的氨基酸1-160或者其变体、同系物或者片段组成。
术语“多肽”是指氨基酸聚合物及其等价物,不是指特定长度的产物;因此,肽、寡肽和蛋白质均包含在多肽的定义内。该术语也不是指或者排除多肽的修饰,例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。该定义包括例如这样的多肽,其含有氨基酸的一或多个类似物(包括如天然氨基酸等)、具有取代的键以及本领域已知的其它修饰等。
在本发明中,同源序列包括在氨基酸水平在至少20、50、100、200、300或400个氨基酸与SEQ ID.No:2、3或4所示氨基酸序列至少60%、70%、80%或者90%相同、优选至少95%或者98%相同的氨基酸序列。特别地,对于已知是酶功能必需的序列的那些区域而不是非必需的邻近序列应典型被认为是同源的。因此,例如优选在相应于GGDEF结构域的区域和/或在SEQ ID NO:2、3或4所示氨基酸序列的I-位点的突变进行同源性对比。所述GGDEF结构域相应于分离自海栖热袍菌的天然嗜热TM1788的大约第88-241位氨基酸,其相应于SEQ ID NO:2和4的第24-181位氨基酸。所述GGDEF结构域相应于SEQ ID NO:3的大约第1-160位氨基酸。所述GGDEF基序相应于SEQ ID NO:2和4的大约第107-111位氨基酸,以及相应于SEQID NO:3的大约第83-87位氨基酸。突变的I-位点相应于SEQ ID NO:2和4的大约第98-101位氨基酸。突变的I-位点相应于SEQ ID NO:3的大约第74-77位氨基酸。本发明优选的多肽包含与SEQ ID NO:2、4的第24-181或者第107-111或者第98-101位氨基酸(其中包含中性氨基酸)或者SEQ IDNO:3的相应区域之一或多个具有高于50%、60%或者70%同源性、更有选高于80%或者90%同源性的连续序列。优选的多肽可以或者包含或者额外包含与SEQ ID NO:2或4的第24-181位氨基酸或者SEQ ID NO:3的相应区域具有高于80%或者90%同源性的连续序列。
尽管同源性可以是就相似性而言(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基),但是在本发明上下文中优选以序列相同性表示同源性。术语“基本同源性”或者“基本相同性”当是指多肽时表示所述多肽或者蛋白质与完全生物活性的蛋白质或者其一部分呈现出至少大约70%相同性,通常为至少大约80%相同性,优选至少大约90%或者95%相同性。
同源性对比可以通过目测或者更通常借助于易于获得的序列对比程序进行。这些可商购的计算机程序可以计算两或更多个序列之间的同源性百分比。
同源性百分比(%)可以在连续序列上计算,即将一个序列与另一序列排列对比,一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的相应氨基酸直接对比,一次一个残基。这种方法称作“无缺口(ungapped)”排列对比。典型地,这种无缺口排列对比仅对相对较少数目的残基进行(例如少于50个连续氨基酸)。
尽管这是非常简便且一致的方法,但是其未考虑到例如在一对其他均相同的序列中,一个***或者缺失将导致随后的氨基酸残基脱离排列对比,因此当进行整体排列对比时潜在地导致同源性百分比显著降低。因此,大多数序列对比方法被设计为产生考虑到可能的***和缺失而不过分地扣罚整体同源性得分的最佳对比。这通过在序列对比中***“缺口”以尝试使局部同源性最大化。
然而,这些更复杂的方法为排列对比中出现的每个缺口指定“缺口罚分”,由此对于相同数目的相同氨基酸,具有尽可能少的缺口的序列对比-反映出两个对比序列之间较高的相关性-将比具有较多缺口的序列对比达到更高的得分。典型使用“Affine gap costs”,其为缺口的存在收取相对较高的成本以及所述缺口中每个随后的残基较小的罚分。这是最常用的缺口得分***。高缺口罚分当然产生较少缺口的优化排列对比。大多数排列对比程序允许修改缺口罚分。然而,当使用这种软件进行序列对比时,优选使用默认值。例如,当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时,氨基酸序列的默认缺口罚分是一个缺口-12,每个延伸-4。
同源性百分比最大值的计算因此首先需要产生考虑到缺口罚分的最佳排列对比。进行这种序列排列对比的合适的计算机程序是GCG WisconsinBestfit程序包(University of Wisconsin,U.S.A.;Devereux et al,1984,NucleicAcids Research 12:387)。可以进行序列对比的其它软件的实例包括但不限于BLAST程序包、FASTA和GENEWORKS对比工具。BLAST和FASTA均可脱机和在线搜索。然而优选使用GCG Bestfit程序。
尽管最终的同源性百分比可以根据相同性测量,但是排列对比方法自身典型不基于全有或全无配对对比(all-or-nothing pair comparison)。取而代之的是通常使用分级的相似性得分矩阵,其基于化学相似性或者进化距离为每个成对对比赋分。举例的常用的这种矩阵是BLOSUM62矩阵-BLAST程序的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公开的默认值或者提供的自定义符号对比表(见用户手册进一步描述)。优选使用GCG程序包的公开的默认值,或者在其它软件的情况中使用默认矩阵,如BLOSUM62。
一旦所述软件已经产生最佳排列对比,则可以计算同源性百分比,优选序列相同性百分比。所述软件典型将其作为序列对比的一部分并产生数字结果。
突变体二鸟苷酸环化酶多肽同源物包括具有氨基酸序列的那些,其中所述一或多个氨基酸由另一氨基酸取代,所述取代基本上不改变GGDEF基序或者突变的I-位点的生物学活性。本发明的突变体二鸟苷酸环化酶多肽同源物优选与SEQ ID NO:2或4所示氨基酸序列具有80%或者更高的氨基酸序列相同性。举例的在本发明范围内的突变体二鸟苷酸环化酶多肽同源物包括SEQ ID NO:2或4所示氨基酸序列,其中:(a)一或多个天冬氨酸残基由谷氨酸取代;(b)一或多个异亮氨酸残基由亮氨酸取代;(c)一或多个甘氨酸或者缬氨酸残基由丙氨酸取代;(d)一或多个精氨酸残基由组氨酸取代;或者(e)一或多个酪氨酸或苯丙氨酸残基由色氨酸取代。
“突变体二鸟苷酸环化酶”或者“突变体二鸟苷酸环化酶多肽”是指由编码GGDEF基序和RXXD的I-位点的基因序列编码的蛋白质或者多肽,其中保守的编码的氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换。优选所述基因序列编码GGDEF结构域。优选编码突变体二鸟苷酸环化酶多肽的基因序列如SEQ ID NO:1、其变体或者片段所示。本发明还包括由在高或者低严格条件下与DNA编码核酸杂交的DNA编码的蛋白质,以及通过突变体二鸟苷酸环化酶多肽的抗血清挽回的密切相关多肽或者蛋白质。
“蛋白质修饰或者片段”在本发明中是指突变体二鸟苷酸环化酶多肽或者其片段,其与一级结构序列基本上同源,但是包括例如体内或者体外化学和生物化学修饰或者掺入非寻常氨基酸。这种修饰包括例如乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、遍在蛋白化、标记如用放射性核素标记,以及各种酶修饰,这些修饰为本领域技术人员熟知。本领域熟知为此目的的许多标记多肽的方法以及取代基或者标记,包括放射性同位素如32P,结合标记的抗配体(如抗体)的配体,荧光团,化学发光剂,酶,以及可作为标记的配体的特异结合配对成员的抗配体。标记的选择依赖于所要求的敏感性,与引物缀合的容易性,稳定性要求,以及可利用的仪器。标记多肽的方法为本领域所熟知。
多肽“片段”、“部分”或者“节段”是至少大约5-7个连续氨基酸的一段氨基酸残基,通常至少大约7-9个连续氨基酸,典型至少大约9-13个连续氨基酸,更优选至少大约20-30或者更多个连续氨基酸。
除了功能相似性之外,修饰的多肽可具有其它有益的性质,如较长的半衰期。修饰的多肽的功能(活性)的相似性可以高于野生型二鸟苷酸环化酶多肽的活性。相对于二鸟苷酸环化酶多肽的同系物、变体、衍生物或者片段的功能/生物学活性可以例如通过生物测定确定。例如,当与鸟苷-5′-三磷酸(GTP)温育时,突变体二鸟苷酸环化酶多肽将至少10-80%的GTP转变为c-di-GMP。因此,一种突变体二鸟苷酸环化酶多肽活性测试是将其与GTP温育并确定是否形成大量的c-di-GMP。另一种突变体二鸟苷酸环化酶多肽测试是确定c-di-GMP是否在I-位点结合突变体二鸟苷酸环化酶多肽。优选的突变体二鸟苷酸环化酶多肽、其同系物、变体和片段不结合c-di-GMP。再一种突变体二鸟苷酸环化酶多肽测试是确定所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽在溶液中是否作为单体存在。优选的突变体二鸟苷酸环化酶多肽、其同系物、变体和片段在溶液中以单体形式存在。
修饰的多肽可以使用常规技术合成,或者由修饰的核酸编码及使用常规技术产生。修饰的核酸通过常规技术制备。核酸表达与上述修饰的蛋白质具有基本相似功能的多肽。
除了基本上全长的多肽之外,本发明提供了所述多肽的生物学活性片段。显著的生物学活性包括c-di-GMP的合成及与c-di-GMP不结合。
本发明的多肽如果可溶,则其可以与固相支持物偶联,所述固相支持物如硝化纤维、尼龙、柱填充材料(如Sepharose珠)、磁珠、玻璃丝、塑料、金属、聚合物凝胶(sol-gel)、细胞(cells)或者其它底物。这种支持物可以例如是珠、孔、浸渍片(dipsticks)或者膜的形式。
在一个实施方案中,通过使用温和条件将所述突变体二鸟苷酸环化酶捕获在Sol-Gel基质中,防止所述酶在固定期间变性。然后制备捕获有突变体二鸟苷酸环化酶的Sol-Gel珠。在所述珠内部的酶在环化di-GMP合成中是活性的,且具有几个月的贮存期限的高度稳定性。突变体二鸟苷酸环化酶被诱捕在Sol-Gel中被证实是一种改良环化di-GMP合成效力及降低生产成本的有效方法。
本发明还提供了融合多肽,其包含突变体二鸟苷酸环化酶多肽及片段。同源多肽可以是两或更多个突变体二鸟苷酸环化酶多肽序列之间的融合体或者突变体二鸟苷酸环化酶多肽序列与相关蛋白质的融合体。同样,可以构建异源融合体,其可以呈现出衍生的蛋白质的性质和活性组合。例如,配体结合或者其它结构域可以在不同的新融合多肽或者片段之间“交换”。这种同源或者异源融合多肽可以显示出例如改变的结合强度或者特异性。融合蛋白质典型通过如下文描述的重组核酸方法产生或者化学合成。
“蛋白质纯化”是指从其它生物学材料中分离突变体二鸟苷酸环化酶多肽的各种方法,如从用编码突变体二鸟苷酸环化酶多肽的重组核酸转化的细胞中分离,这些方法为本领域熟知。例如,这种多肽可以通过应用如特异于突变体二鸟苷酸环化酶多肽的抗体通过免疫-亲和性层析而纯化。各种蛋白质纯化方法为本领域熟知。
术语“分离的”、“基本上纯的”和“基本上均质的”可互换使用,描述已经从其在天然细胞状态中伴随的成分中分离出的蛋白质或者多肽。当单体蛋白质的至少大约60-75%的样品呈现出单一多肽序列时,则认为其是基本上纯化的。基本上纯化的蛋白质典型包含大约60-90%W/W的蛋白质样品,更通常大约95%及优选大约是99%以上纯的。蛋白质纯度或者均质性可以用本领域熟知的许多方式表示,如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳,随后基于凝胶染色观测单一多肽条带。对于某些目的,通过使用HPLC或者本领域熟知的其它可用方式提供更高的分辨率。
如本文所用,作为分离的和操纵的遗传序列的表达产物产生的多肽是“分离的多肽”,即使其在同源细胞类型中表达也如此。合成产生的形式或者由异源细胞表达的分子是固有分离的分子。
本发明的肽可以使用已知技术化学合成,如液相合成或者固相合成,如t-BOC或者Fmoc,或者BOP SPPS,或者本领域已知的任何化学合成方法。或者,所述肽可以在设计为使用肽合成的翻译和/或转录机制的细胞或者载体内进行生物学制备。
核酸构建体和载体
根据本发明,提供了分离的二鸟苷酸环化酶核酸分子,该分子典型编码包含GGDEF基序和RXXD的I-位点的二鸟苷酸环化酶多肽,其变体或者类似物,包括其片段。这种核酸分子然后可被突变以获得本发明的突变体二鸟苷酸环化酶核酸分子。本发明的所述突变体二鸟苷酸环化酶核酸分子表达包含GGDEF基序及RXXD的I-位点的突变体二鸟苷酸环化酶多肽,其中保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换。所述突变可以通过定点诱变或者本领域已知的任何其它突变方法实现。特别提供的是用于保证表达能合成c-di-GMP而不结合c-di-GMP的突变体二鸟苷酸环化酶多肽的DNA分子。所述DNA分子可包含:(a)SEQ ID NO:1所示DNA分子或者其片段;(b)与(a)中定义的DNA分子杂交的DNA分子或者其可杂交片段;以及(c)编码表达由任何前述DNA分子编码的氨基酸序列的DNA分子。
本发明优选的DNA分子包括包含SEQ ID NO:1所示序列或者其片段的DNA分子。
如果一种多核苷酸在其天然状态或当通过本领域技术人员熟知的方法操纵时可以被转录和/或翻译以产生mRNA和/或多肽或其片段时,则称该多核苷酸“编码”所述多肽。反义链是这种核酸的互补序列,从中可推导出编码序列。
“分离的”或者“基本上纯的”核酸(如RNA、DNA或者混合的聚合物)包含已经从其天然发生的环境中分离的核酸序列或者蛋白质,包括重组或者克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或者通过异源***生物合成的类似物。
本发明的多核苷酸可以掺入重组可复制载体中以导入原核宿主中。这种载体可典型包含由宿主识别的复制***,包括编码希望的多肽的指定多核苷酸片段,优选还包括与所述多肽编码节段可操纵地连接的转录和翻译起始调节序列。表达载体可包括例如复制起点或者自主复制序列(ARS)和表达控制序列,启动子,增强子及必需的加工信息位点,如核糖体结合位点,RNA剪接位点,聚腺苷酸化位点,转录终止子序列,以及mRNA稳定序列。这种载体可以通过本领域熟知及论述的标准重组技术制备。
选择合适的启动子及其它必需载体序列以在宿主中是功能化的,且适当时可包括与二鸟苷酸环化酶基因天然关联的那些。许多可用的载体为本领域已知,可以得自如Stratagene、New England Biolabs、Promega Biotech等。启动子如trp、lac和噬菌体启动子、tRNA启动子及糖酵解酶启动子可用于原核宿主中。适用的载体和启动子可以与可扩增的基因结合,以便可以产生所述基因的多个拷贝。对于合适的增强子及其它表达控制序列。
虽然这种表达载体可以自主复制,但是其也通过本领域熟知的方法***宿主细胞的基因组中而复制。
表达和克隆载体可以含有选择标记,这是编码用所述载体转化的宿主细胞存活或者生长必需的蛋白质的基因。这个基因的存在保证仅表达所述***物的那些宿主细胞生长。典型的选择基因编码这样的蛋白质,其a)赋予对抗生素或者其它毒性物质的抗性,例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤等;b)互补营养缺陷型缺乏;或者c)提供从复杂培养基中不可获得的关键营养物,例如编码芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。适当的选择标记的选择依赖于宿主细胞,不同宿主的合适标记为本领域熟知。
含有感兴趣的核酸的载体可以在体外转录,通过熟知方法将所得RNA导入宿主细胞中,例如通过注射,或者所述载体可以通过本领域熟知的方法被直接导入宿主细胞中,其根据细胞宿主的类型而不同,包括电穿孔,应用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或者其它物质的转染,微粒轰击,脂染,感染(其中所述载体是感染物质,如逆转录病毒基因组),及其它方法。通过本领域已知包括上述那些的任何方法将所述多核苷酸导入宿主细胞中在本文被称作“转化”。其中已经导入上述核酸的细胞也包括这种细胞的后代。
因此本发明提供了用本发明的核酸分子转化或者转染的宿主细胞。大量的本发明核酸和多肽可以通过在相容的原核宿主细胞中在载体或者其它表达运载体中表达突变体二鸟苷酸环化酶核酸或者其一部分而制备。最常用的原核宿主是大肠杆菌菌株,但是也可以使用其它原核生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或者假单胞菌(Psendomonas)。
因此,本发明还提供了制备突变体二鸟苷酸环化酶多肽的方法,所述方法包括:(a)在使得所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽表达的条件下培养上述细胞;及(b)回收所述表达的突变体二鸟苷酸环化酶多肽。这种方法也可附有步骤:(c)使用本领域已知的任何合适方式对所述多肽进行层析;及(d)通过例如凝胶过滤纯化所述多肽。
用本发明的多核苷酸转化的原核或者真核细胞可用于产生本发明的核酸和多肽。
突变体二鸟苷酸环化酶多肽在生产c-di-GMP和c-di-GMP类似物中的应用
将本发明的突变体二鸟苷酸环化酶多肽与GTP在合适条件下温育以合成c-di-GMP或者类似物。在80%以上的GTP被转变成c-di-GMP或类似物之后,补充新鲜的GTP。可以加入大约8-15批的GTP。在反应之后,沉淀蛋白质并移出。可以进一步纯化以获得高质量的c-di-GMP或者c-di-GMP或类似物。优选将所述c-di-GMP冻干以产生白色粉末以易于运输和使用。
在此我们报道了具有增强的耐热性的独立的嗜热二鸟苷酸环化酶结构域(tDGC)蛋白的过表达和鉴定。所述突变的嗜热DGC蛋白质在生物化学实验室中通过使用标准设备用于有效产生c-di-GMP。所述酶可用于合成放射性同位素标记的c-di-GMP以进行酶活性测定和结合测定。易于获得的c-di-GMP通过化学修饰c-di-GMP应促进合成结构类似物作为潜在抑制剂和化学探针。
如上述产生突变体二鸟苷酸环化酶多肽,然而在突变I-位点之前从嗜热细菌中选择二鸟苷酸环化酶多肽。对于突变体嗜热DGC,我们证实通过使用酶反应和产物纯化的优化程序,可易于制备几百毫克的c-di-GMP。所述嗜热酶是其它研究实验室进行c-di-GMP合成以及c-di-GMP衍生物制备的有利工具。
实施方案的实施例
嗜热二鸟苷酸环化酶蛋白质的选择
我们已经从如下细菌中鉴别了许多嗜热DGC蛋白质:海栖热袍菌,产乙醇热厌氧杆菌X514,泉生热袍菌,多节闪烁杆菌RT17-B1,Thermosiphomelanesiensis BI429,thermotoga petrophila rku-1和热醋穆尔氏菌)。由我们测试的一些嗜热DGC蛋白质在表1中列出。最成功的嗜热DGC蛋白质是分离自海栖热袍菌的含有GGDEF结构域的蛋白质(TM1788)。
表1:检测的嗜热DGC
在通过使用生物信息学工具评估产生可溶蛋白质的可能性之后,选择得自海栖热袍菌的含有GGDEF结构域的蛋白质(TM1788)。推测长度为241个氨基酸的TM1788含有一个GGDEF结构域(88-241aa),具有含有少许疏水性残基的N-末端节段(1-86)。我们将其命名为tDGC。
在I-位点中设计突变
对tDGC的序列和结构模型的检查提示tDGC含有R158RSD161基序,因此可能含有完整的I-位点。鉴于保守的RXXD基序的存在以及观测到tDGC紧密结合c-di-GMP,我们随后检测了I-位点中一或多个残基的突变是否能消除产物抑制而不影响蛋白质稳定性和折叠。针对突变体R158A观测到最佳结果。我们观测到R158A突变体的吸收光谱未呈现出256nm峰,表明c-di-GMP与所述蛋白质不再结合(图1)。重要的是所述突变体酶在测定条件下能将几乎100%的GTP底物转变为c-di-GMP,提示在突变后削弱了产物抑制。酶促测定示出所述突变体的产量在不同GTP浓度均比tDGC高得多(图2)。稳态动力学测量示出R158A突变体催化GTP缩合,在55℃的kcat为2.6min-1。在GTP达到ca.0.8mM之后,产量降低,提示与野生型tDGC较低底物抑制浓度(100μM)对比,在高底物浓度下酶促活性的抑制。感兴趣地,我们发现所述突变体酶呈现出在溶液中以单体存在,这与tDGC的二聚体形式相反(图3)。观测结果是令人惊奇的,因为从两个分子GTP合成c-di-GMP需要DGC蛋白质以其二聚体形式起作用。观测结果表明在I-位点的C-di-GMP的结合在稳定二聚体形式中起关键作用,c-di-GMP的合成通过溶液中蛋白质瞬时二聚体形成而实现。总之,观测结果提示R158A突变显著削弱产物抑制作用而不导致蛋白质稳定性明显降低,因此所述R158A突变体更适于c-di-GMP合成。
克隆和定向诱变
考虑到疏水性基序也许影响蛋白质溶解性,使用针对大肠杆菌过表达而优化的基因序列委托合成编码独立的GGDEF结构域(第82-241位氨基酸,称作tDGC)的基因构建体。编码TM1788基因C-末端的基因构建体由GenScript Inc商业合成,通过PCR扩增,并在NdeI与XhoI限制位点之间克隆进表达载体pET28b(+)(Novagen)中。将携带所述基因构建体及(His)6-Tag编码序列的质粒转化进大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。使用定向诱变II试剂盒(Stratagene)根据厂商指导手册产生突变体。使用BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit在ABI Prism 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)上证实突变。将细胞原种在-80℃贮存在20%甘油中。
随后将所述基因构建体克隆进pET28b(+)表达载体并转化进BL21(DE3)大肠杆菌菌株中进行蛋白质表达。在优化表达条件之后,大部分蛋白质可以作为可溶蛋白质以合理高产量(12-15mg/L培养物)被表达,小部分在包涵体中观测到。
突变体变异
鉴于荷正电荷的精氨酸由中性不带电的丙氨酸置换,我们推测带正电的精氨酸由任何中性氨基酸残基的置换均将消除c-di-GMP结合能力。为了检测,我们将精氨酸用谷氨酰胺置换R158Q。R158A(SEQ ID NO:2)和R158Q(SEQ ID NO:4)突变体均消除c-di-GMP结合能力。
蛋白质表达和纯化
对于蛋白质表达,将来自细胞原种的2ml接种物加入1升的LB培养基中。细菌培养物在37℃生长直至OD=0.8,之后用0.8mM IPTG在25℃诱导4小时。在离心后,将沉淀在含有50mM Tris-Cl(pH 8.0)、300mM NaCl、5%甘油、1%β-巯基乙醇和1mM PMSF的20ml裂解缓冲液中裂解。在25,000rpm离心30分钟后,过滤上清,然后与2ml Ni2+-NTA树脂(Qiagen)在4℃温育30分钟。将该树脂用50ml的W1缓冲液(具有20mM咪唑的裂解缓冲液)和20ml的W2缓冲液(具有50mM咪唑的裂解缓冲液)洗涤。使用含有20mM Tris(pH 8.0)、200mM NaCl、5%甘油和200、300和500mM咪唑的洗脱缓冲液使用分步梯度方法洗脱蛋白质。在SDS-PAGE凝胶分析之后,集合纯度高于95%的级分,使用大小排阻层析进一步纯化。
所述蛋白质的吸收光谱呈现出除了278nm蛋白质峰之外的在256nm的一个额外峰(图1A)。在热变性后对蛋白质溶液进行的HPLC分析提示256nm峰是由于紧密结合的c-di-GMP配体所致(图1B)。酶促测定示出所述独立的结构域当与GTP和Mg2+离子温育时通过产生c-di-GMP而是有酶促活性的。基于在30℃温育几天之后所述酶仍是活性的观测结果,所述酶与WspR和PA290相比示出显著增强的稳定性。然而,尽管热稳定性得以改良,但是我们发现甚至在高底物浓度及延长温育的条件下整体产量也低。
大小排阻层析
在4℃使用装备了Superdex 75HR 16/60柱(Amersham Biosciences)的AKTAFPLC***进行凝胶过滤。用于凝胶过滤的缓冲液包含50mM Tris-Cl(pH 8.0)、300mM NaCl、5%甘油、1mM DTT。含有重组蛋白质的级分通过使用Amicon浓缩器(Millipore)浓缩至终浓度为ca.5mg/ml,使用Bradford测定法测量。在使用液氮速冻之后,将浓缩的蛋白质在-80℃贮存。根据相同程序表达突变体蛋白质,纯化并贮存。所述蛋白质的分子量和寡聚体状态基于通过使用标准蛋白质产生的标准曲线估计,所述标准蛋白质包括白蛋白、卵清蛋白、糜蛋白酶原(chemotrypsinogen)和RNase A。对于野生型突变体酶,所述重组蛋白质的最终产率是12-15mg/L培养物。
二鸟苷酸环化酶(DGC)活性测定优化和稳态动力学测量
进行酶测定以确定DGC反应的最佳盐浓度,使用的缓冲液含有50mMTris-HCl(pH 8.0)、20mM MgCl2、100μM GTP、10μM酶以及0-500mM NaCl。进行酶测定以确定DGC反应的最佳pH浓度,使用的缓冲液含有50mMTris-HCl(pH 7.0-9.0)、250mM NaCl、20mM MgCl2、100μM GTP、10μM酶。将反应混合物在55℃水浴中温育15分钟。在95℃加热10分钟及在14,000rpm离心5分钟以除去蛋白质沉淀之后,过滤上清,之后加样于EclipseXDB-C18(4.6×150mm)柱上,监测从GTP向c-di-GMP的转换,使用AgilentLC 1200***(流动相:20mM三乙基碳酸氢铵(pH 7.0,使用乙酸调节pH),9%甲醇,流速:1ml/min)进行。对于热稳定性分析,将所述突变体蛋白质在45℃、55℃和65℃温育,在不同时间点取蛋白质溶液等份加入含有50mMTris-Cl(pH 7.5)、250mM NaCl、20mM MgCl2和100μM GTP的反应混合物中。使反应持续10分钟,之后终止,使用HPLC分析GTP转换。对于产物产量和稳态动力学测量,标准反应混合物包括50mM Tris-Cl(pH 8)、20mM MgCl2、300mM NaCl、1μM酶、5-800μM GTP。反应在55℃温育1-60分钟,获得进程的线性范围。对于稳态动力学,使用GraphPad(Prism)拟合数据,获得动力学参数。
进行pH、盐和温度的***筛选以优化突变体tDGC的反应条件。发现所述酶在pH 7.5及相对高盐浓度(250-300mM NaCl)条件下更有效(图4)。热稳定性分析示出所述酶的活性在温度升高(45、55和65℃)时随着时间而缓慢下降,在45℃有超过25小时的延长的半衰期(图5)。
大规模制备和产物纯化
通过将R158A突变体与GTP(Sigma,Cat No:G8877)在45℃在30或50ml反应混合物中温育合成c-di-GMP,所述反应混合物含有50mM Tris缓冲液(pH 7.5)、250mM NaCl、20mM MgCl2、0.75-1mM GTP、1mM DTT和5-10μM突变体酶。在通过HPLC分析估计95%以上的GTP转变为c-di-GMP之后,补充新鲜的GTP(0.75-1mM终浓度)。在10小时期间加入共8-15批GTP。在反应后,沉淀蛋白质并通过热处理除去,使用旋转蒸发器(Eyela)浓缩上清,水浴温度设定在45℃。将浓缩的上清加样于半制备EclipseXDB-C18(9.4×250mm)柱上,使用来自Agilent的LC 1200***纯化。自动进行样品注射和c-di-GMP峰收集,使用自动取样器(加样体积:1ml)和具有6ml收集瓶的级分收集器进行。使用上述相同流动相洗脱c-di-GMP,流速为3ml/min。集合含有c-di-GMP的级分,通过蒸发浓缩,并最终冻干产生白色粉末,将其溶解于5mM Tris缓冲液(pH 7.0)中,在-20℃贮存。产物的同一性通过MALDI-质谱仪证实并与商业来源的标准对比(Biolog,Germany)。消光系数(ε260)为26,100 OD M-1 cm-1,用于计算c-di-GMP浓度(15)。
所述R158A突变体蛋白质和优化的程序使得我们可以使用标准设备在生物化学实验室中易于合成几百毫克的c-di-GMP。例如,使用10mg的所述突变体酶,通过在几小时的时间内加入多批底物而能获得200mg以上的c-di-GMP。使用更多的酶及更长的反应时间,在产生以克为规模的c-di-GMP方面应没有任何困难。对比之下,使用突变体tDGC与WspR相比产量明显较高,先前使用50mg的WspR仅可获得10-20mg的c-di-GMP(8)。产生的c-di-GMP可以通过使用HPLC***纯化,所述HPLC***装备了自动取样器和级分收集器,以及半制备RP-C18柱和溶剂***,如材料与方法所述。为了产生克规模的c-di-GMP,我们推荐一种制备性HPLC***以缩短制备时间。通过使用冻干器或者旋转蒸发器除去HPLC溶剂之后获得白色粉末形式的终产物。
木醋杆菌(Acetobacter xylinum)的细胞质蛋白AxDGC2的I-位点的突变
编码木醋杆菌的AxDGC2的基因得自Genscript,将其在相容限制位点之间连接进pET-26(bp)载体(Novagen)中。所得质粒用作分离的EAL结构域(AxDGC2306-574)的PCR扩增模板,使用引物5’-AAACATATGCGCAATCTGCGTGAACG-3’和5’-AAACTCGAGCAGGGTAACGC-3’。使用扩展的高保真试剂盒(Roche)进行PCR,也将扩增的DNA片段在相容限制位点之间克隆进pET-26(bp)载体中。使用Quik-Change诱变试剂盒(Stratagene)根据厂商指导进行定向诱变。诱变引物的序列如下所示:D217A突变,5′-CTGACCCATCCGGATGCGCCGGTGAGCCGTCTG-3’(正向引物)和5’-AGACGGCTCACCGGCGCATCCGGATGGGTCAG-3’(反向引物)。
蛋白质表达和纯化。将携带所述基因的质粒转化进大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)中。将细胞在Luria-Bertani(LB)培养基中在37℃强烈振荡(220rpm)生长直至OD600达到0.6-0.8。加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG,0.5mM)以诱导蛋白质表达,使培养物在16℃再生长16小时。通过在5000rpm离心10分钟收获细胞。冷冻所得细胞沉淀并在细胞裂解之前解冻,所述裂解是在40mL裂解缓冲液[50mM NaPi(pH 7.0)]、300mM NaCl(对于AxDGC2306-574为200mM)、5mM巯基乙醇(β-ME)、20mM咪唑、0.01%Triton X-100及0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)中通过超声裂解。将细胞提取物在18000rpm离心30分钟。下文描述的所有纯化步骤均在4℃进行。过滤上清并加样于已经预先充填在柱中的1mL的Ni2p-NTA树脂(GE Healthcare)上。收集流经液(flow-through)并再次经过该柱。将所述柱用50mL洗涤缓冲液(补加50mM咪唑的裂解缓冲液)洗涤。使用洗脱缓冲液(补加300mM咪唑的裂解缓冲液)洗脱所述蛋白质。在进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析之后,集合纯度>95%的级分,通过使用PD-10脱盐柱(GEHealthcare)或者Superdex 200凝胶过滤柱(GE Healthcare)以及AKTAFPLC***进行脱盐。基于用标准物产生的标准曲线估计所述蛋白质的分子量。使用Amicon浓缩器(Millipore)浓缩浅黄色蛋白质,在通过Bradford测定测量蛋白质浓度之后在-80℃贮存。野生型和突变体AxDGC2的典型蛋白质产量为1-2mg/L培养物。最终贮存缓冲液包含50mM Tris-HCl(pH 8.0)、50mMNaCl、5%甘油及1mM二硫苏糖醇(DTT)。
对于HPLC分析,将AxDGC2用1%TFA变性,通过离心除去蛋白质沉淀。将黄色上清加样于装备了XDBC18柱(4.6mm_150mm)的AgilentLC1200 HPLC***柱上。流动相是在100分钟从100%H2O至100%乙腈(具有0.045%TFA)梯度,流速为1mL/分钟;使用相同流动相将100μM标准物(Sigma)也用于该柱。分析由AxDGC2结合的c-di-GMP及其截短的构建体。
对来自变性的蛋白质溶液的提取物的HPLC分析揭示了由所述蛋白质结合的小配体。所述小配体经使用HPLC通过与标准物对比而被鉴别是c-di-GMP(图6A)。c-di-GMP最可能由GGDEF结构域在抑制位点(I-位点)结合。序列对比示出在I-位点c-di-GMP结合的关键残基。为了检测c-di-GMP是否确实在I-位点结合,我们突变了推定的I-位点中的保守残基(Asp217)。对突变体D217A的变性蛋白质溶液的HPLC分析示出所述蛋白质不再与c-di-GMP结合(图6B),因为c-di-GTP不能在AxDGC2突变体D217A的突变的I-位点结合。
使用tDGC酶产生放射性32P-环化di-GMP及其它类似物
我们还证实了tDGC酶可用于在研究实验室内产生具有潜在应用性的功能性环化-di-GMP衍生物。在环化-di-GMP信号领域中最重要的目标之一是鉴别结合环化-di-GMP的蛋白质受体或者靶。鉴别蛋白质靶的最有效的方法是使用光交联配体(图7)。因此,非常希望可以缀合所述蛋白质靶的功能性环化-di-GMP的开发。
两个合成的环化-di-GMP衍生物的结构在表2中示出。(图8)利用硫代鸟嘌呤组分的独特光化学性质设计6-硫代-环化-di-GMP(左侧结构)用作光交联剂。所述分子可用于鉴别直接结合环化-di-GMP的细胞蛋白。右侧的32P-放射性同位素标记的环化-di-GMP可用于确认环化-di-GMP的蛋白质受体以及检测环化-di-GMP水解酶。
表2:用tDGC酶经酶促产生的类似物
环化-di-GMP的酶促产生在图9中描述。6-硫代-c-di-GMP通过使用6-硫代GTP作为底物产生(图9B),而32P c-di-GMP通过使用32P标记的GTP作为底物经tDGC酶促转变为32P c-di-GMP而产生(图9C)。6-硫代c-di-GMP之前从未报道。先前尝试使用WspR或PleD产生32P标记的c-di-GMP,由于低转换而导致大多数32P-标记的GTP被浪费。tDGC对此是更有效的酶,因为其基本上转换所有的32P-标记的GTP。
tDGC在Sol-Gel基质中的固定以进行酶保持和持续生产
目前使用tDGC生产环化-di-GMP仍需要在酶促反应结束时分离所述酶和产物。所述酶的固定将使得可以连续生产环化-di-GMP而不用变性和分离所述酶。为此,我们通过使用防止酶在固定期间变性的适当条件将tDGC酶捕获在Sol-Gel基质中。我们已经制备了具有tDGC捕获在其内部的Sol-Gel珠。在所述珠内部的酶在合成环化-di-GMP中是活性的且在几个月的贮存期限是高度稳定的。已经证实tDGC酶被诱捕在Sol-Gel中是改良环化-di-GMP合成效力及降低生产成本的有用方法。
本领域技术人员将意识到本文描述的发明除了特别描述的那些之外可进行修改和改变。本发明包括所有这种改变和修改。本发明还包括在本说明书中单独或者集中提及或者指出的所有步骤特征、配制物和化合物,以及所有组合或者任何两或多个步骤或特征。
本文中列举的每个文献、参考书目、专利申请或者专利均以其全部内容援引加入本文,这意味着读者应将其作为本文的一部分加以阅读和考虑。本文中列举的文献、参考书目、专利申请或者专利为简便起见而在文中不再重复描述。
本文提及的任何产品的任何厂商指导、描述、产品说明书和产品手册或者本文援引加入的任何文献均援引加入本文,且可用于实施本发明。
本发明非限于由本文描述的任何特定实施方案的范围。这些实施方案只是举例说明本发明。功能等价产物、配制物和方法显然在本文所述本发明的范围内。
本文描述的本发明可包括一或多个值范围(例如大小、浓度等)。值范围应被理解为包括该范围内的所有值,包括定义范围的值以及该范围的邻近值,该邻近值与定义范围边界的值的紧邻值产生相同或者基本相同的结果。
在本说明书中,除非文中特别要求,则术语“包含”应被理解为是指包含指定整数或者整数组,但是不排除任何其它整数或者整数组。也应注意在本发明揭示及特别在权利要求书和/或段落中,如“包含”等术语可具有美国专利法所赋予的含义,例如其可意味着“包括”等;且如“基本上由……组成”等术语具有美国专利法所赋予的含义,例如其允许有未明确引用的元件,但是排除在现有技术中发现的或者影响本发明基本或者新特性的元件。
本文所用选择的术语的其它定义可见于本发明的详细描述及在全文中应用。除非特别定义,则本文所用所有其它科学和技术术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。
虽然本发明已经参考特定方法和实施方案加以描述,但是应意识到在不偏离本发明的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。
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8.Rao,F.,Yang,Y.,Qi,Y.,and Liang,Z.-X.(2008)J.Bacteriol.190,3622-3631.
9.Karaolis,D.K.R.,Rashid,M.H.,Chythanya,R.,Luo,W.,Hyodo,M.,and Hayakawa,Y.(2005)Antimicrob.Agents Chemother.49,1029-1038.
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14.Ross,P.,Mayer,R.,Weinhouse,H.,Aniikam,D.,Huggirat,Y.,Benziman,M.,de Vroom,E.,Fidder,A.,de Paus,P.,and Sliedregt,L.A.(1990)J.Biol.Chem.265,18933-18943.
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Claims (23)
1.包含GGDEF基序及I-位点的二鸟苷酸环化酶多肽,其中I-位点的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换,形成不结合c-di-GMP的突变体二鸟苷酸环化酶。
2.权利要求1的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述中性氨基酸是非极性氨基酸。
3.权利要求2的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述非极性氨基酸是丙氨酸。
4.权利要求1的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述中性氨基酸是不带电荷的极性氨基酸。
5.权利要求4的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述不带电荷的极性氨基酸是谷氨酰胺。
6.权利要求1或2的二鸟苷酸环化酶多肽,其包含与分离自嗜热细菌的包含GGDEF基序的二鸟苷酸环化酶多肽具有至少90%同源性的氨基酸序列。
7.权利要求6的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述嗜热细菌选自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterethanolicus)、泉生热袍菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、多节闪烁杆菌(Fervidobacterium nodosum)、Thermosipho melanesiensis、thermotogapetrophila或者热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)。
8.权利要求6的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述嗜热细菌是海栖热袍菌。
9.权利要求1-8任一项的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述突变体二鸟苷酸环化酶包含在溶液中的单体。
10.权利要求1-8任一项的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述突变体二鸟苷酸环化酶包含SEQ ID NO:2。
11.权利要求1-8任一项的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述突变体二鸟苷酸环化酶包含SEQ ID NO:3。
12.权利要求1-8任一项的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述突变体二鸟苷酸环化酶包含SEQ ID NO:4。
13.前述权利要求任一项的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述突变体二鸟苷酸环化酶与支持物偶联。
14.权利要求13的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述支持物是sol-gel。
15.一种多核苷酸,所述多核苷酸能表达包含GGDEF基序及I-位点的突变体二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述I-位点的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换。
16.权利要求15的多核苷酸,其包含SEQ ID NO:1的序列。
17.一种表达载体,其包含权利要求15或16的多核苷酸,所述多核苷酸与能指导所述多核苷酸在宿主细胞中表达的调节序列可操纵地连接。
18.权利要求1-14任一项的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽是化学合成的。
19.权利要求1-14任一项的二鸟苷酸环化酶多肽,其中所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽在权利要求17的表达载体中产生。
20.生产环化-di-GMP或者环化-di-GMP类似物的方法,包括步骤:
a.将权利要求1-14任一项的突变体二鸟苷酸环化酶多肽与鸟苷-5’-三磷酸温育;及
b.分离所述环化-di-GMP或者环化-di-GMP类似物。
21.权利要求20的方法,其中所述类似物包含6-硫代环化-di-GMP。
22.权利要求20的方法,其中所述类似物包含32P-放射性同位素标记的环化-di-GMP。
23.通过权利要求20的方法制备的类似物,其包含下式:
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