CN102408466A

CN102408466A - 一种新盐角草皂苷及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102408466A
Application number: CN2011104340579A
Authority: CN
Inventors: 赵友谊; 王相云; 王鸣; 陈雨; 冯煦
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2031-12-22
Also published as: CN102408466B

Abstract

本发明涉及天然药物化学领域，公开了从盐角草中提取分离的一种新齐墩果酸皂苷类化合物的化学结构。以及该化合物的制备方法和在医药领域中的用途，尤其在抑制磷脂酶A2(PLA2)活性和在制备抗炎药物中的用途。

Description

一种新盐角草皂苷及其制备方法和用途

一、技术领域：

本发明涉及天然药物领域，具体涉及从药用植物盐角草中提取分离得到的一种新皂苷，其制备方法，以及该皂苷抑制磷脂酶A₂(PLA₂)活性和在制备抗炎药物中的用途。

二、技术背景：

盐角草(Salicornia europaea Linn.)为藜科(Chenopodiaceae)盐角草属植物，主要分布在盐碱地、盐湖旁及海边，《中华本草》记载平肝、利尿、降压的作用，民间常用来主治高血压和头痛。盐角草属植物中富含皂苷类成分，其苷元主要为齐墩果酸苷元。江苏省中国科学院药用植物研究开发中心在对盐角草中皂苷类成分的分离中，得到一个新皂苷化合物，明确了该化合物的结构，药理活性和用途。

磷脂酶A2(PLA₂)存在于各种生物体中.其生理功能是专一性水解磷脂Sn-2脂键，使之分解为脂肪酸和溶血磷脂。若脂肪酸为花生四烯酸(arachidonic acid)，则被环氧合酶(cyclooxygenase)和5-脂氧合酶(lipoxygenase)分别分解为***素(prostaglandins)和白三烯(leukotrienes)，***素是炎症的前体，而白三烯在引发哮喘的发病机理中起着重要的作用；溶血磷脂代谢成的血小板活化因子(platelet-activating factor)也是导致炎症的重要介质。PLA₂处于炎症调节因子生物合成的关键位置.如果能够有效地抑制PLA₂的活性，与炎症过程密切相关的三个调节因子的生物合成都将被抑制。高效专一的PLA₂抑制剂有可能发展成为新型的非甾体抗炎药。

三、发明内容：

技术问题

本发明的目的之一是提供一种新皂苷化合物(盐角草皂苷甲)及其制备方法以及该新化合物在制备PLA₂抑制剂和抗炎药物的新用途。按照本发明，可把该新化合物制备成药物，用于制备PLA₂抑制剂和炎症等相关疾病的治疗。

技术方案

本发明提供了一种新皂苷化合物及具制备方法。自盐角草中提取、分离、纯化得到的这种新皂苷化合物，命名为盐角草皂苷甲。

盐角草皂苷甲，化学名称为：3β，29-二羟基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸28-O-β-D-葡萄糖酯，

化学结构式为：

上述盐角草皂苷化合物的制备方法，其特征在于：以盐角草新鲜全草为原料，经水或有机溶剂或混合溶剂提取，水提取液直接过大孔树脂吸附，有机溶剂或混合溶剂提取液浓缩后加水溶解再经大孔树脂吸附或正丁醇萃取，大孔树脂吸附物或正丁醇萃取物经柱层析分离而得。其中，大孔树脂包括D101、AB-5、或HP-20；柱层析用担体选自硅胶、凝胶、氧化铝、聚酰胺、ODS和MCI中的一种或几种；有机溶剂包括甲醇、乙醇或正丁醇；提取温度低于100℃。

本发明提供了盐角草皂苷甲与医学上可接受的药用辅料组成药物组合物及其制剂。如，片剂、丸剂、膏剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂以及注射液粉针剂或水针液。

本发明提供了盐角草皂苷化合物制备PLA₂抑制剂和抗炎药物的应用。在体外，盐角草皂苷甲的IC₅₀值与吲哚PLA₂抑制剂的IC₅₀相近，体内实验表明盐角草皂苷甲20mg·kg^-1和40mg·kg^-1两剂量组可通过对PLA₂活性的显著抑制作用，从而减少炎症介质PGE的含量，提示盐角草皂苷甲有类似于PLA₂抑制剂的作用；此外，40mg·kg^-1和80mg·kg^-1两剂量组对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用。

有益效果

本发明公开了从盐角草中提取分离的一种齐墩果酸皂苷类新化合物的化学结构，以及该化合物制备方法及在医药领域中的用途，尤其在制备磷脂酶A2(PLA₂)抑制剂和抗炎药物的用途。鉴于PLA₂抑制剂的研究可以为研究PLA₂在细胞及分子水平复杂的作用过程提供有力的手段，同时也为临床抗炎及多种自身免疫疾病的治疗开辟广阔的治疗前景，本发明对于充分开发利用盐角草中的皂苷类化合物具有十分重要的现实意义。

试验证明，在体外，盐角草皂苷甲的IC₅₀值与吲哚PLA₂抑制剂的IC₅₀相近，体内实验表明盐角草皂苷甲20mg·kg^-1和40mg·kg^-1两剂量组可通过对PLA₂活性的显著抑制作用，从而减少炎症介质PGE的含量，提示盐角草皂苷甲有类似于PLA₂抑制剂的作用；此外，40mg·kg^-1和80mg·kg^-1两剂量组对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用，说明盐角草皂苷甲可用于PLA₂抑制剂和抗炎药物的开发。

四、附图说明：

以下图可作为附件材料上报。

图1盐角草皂苷甲的ESI-MS谱

图2盐角草皂苷甲的HR-MS谱

图3盐角草皂苷甲的¹H-NMR谱

图4盐角草皂苷甲的¹³C-NMR谱

图5盐角草皂苷甲的COSY谱

图6盐角草皂苷甲的HMQC谱

图7盐角草皂苷甲的HMBC谱

图8盐角草皂苷甲的ROESY谱

图9盐角草皂苷甲的提取分离

图10盐角草皂苷甲的结构式

五、具体实施方式：

结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不仅仅限于所列举的实施方式。本发明自盐角草中提取、分离、纯化得到的这种皂苷类新化合物，命名为盐角草皂苷甲。

1.提取分离

本发明者将盐角草全草在本所中试工厂用90％乙醇回流提取浓缩得浸膏，取浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯萃取。得石油醚部、乙酸乙酯部和正丁醇部。

正丁醇部用大孔树脂进行吸附，再以水-乙醇***分段洗脱，合并含有皂苷的组分，得盐角草总皂苷。所得盐角草总皂苷进行硅胶柱层析，流动相依次为氯仿-甲醇(10∶1、4∶1、2∶1、1∶1)、甲醇。其中氯仿-甲醇(4∶1)部分经反复反相柱分离及凝胶柱纯化得到单体化合物盐角草皂苷甲。

2.结构鉴定

白色无定形粉末，易溶于甲醇。TLC浓硫酸-香草醛显***，放置后颜色减退。Molish反应和Liebermann-Burchard反应都呈阳性，可推断该化合物为三萜皂苷类化合物。

(c 0.11，MeOH)。根据低分辨质谱显示的数据，m/z 673.30([M+K]⁺)，657.30([M+Na]⁺)，669.25([M+Cl]^-)，67930([M+HCOO]^-)，633.25([M-H]^-)显示其分子量为634，结合¹H-NMR的氢信号和¹³C-NMR的碳信号数量，推断分子式为C₃₆H₅₈O₉，不饱和度为8。该分子式由高分辨质谱(HR-ESI-MS)，m/z 657.3991([M+Na]⁺)(计算值为657.3979)，进一步佐证。

¹H-NMR(C₅D₅N，500MHz，δ，ppm)显示6个角甲基(δ0.91，1.01，1.08，1.13，1.20和1.25)，一个烯氢质子(δ5.48，t-like)，以及糖端基质子信号(δ6.33，d，J＝8.1Hz)。¹³C-NMR(C₅D₅N，125MHz，δ，ppm)显示连接羟基的碳信号为δ_C78.1(C-3-OH)和一个羟亚甲基为δ_C 73.7，而这个羟亚甲基碳信号在HSQC谱上显示与δ_H 3.54上的两个氢的单峰相关。根据H-H COSY和ROESY谱H-3(δ3.40)和H-23(δ1.20)相关，证明C-3上氢质子的α位取向，因此推断3位上羟基为β位取向。除了E环和糖的部分，以上¹H-NMR和¹³C-NMR与齐墩果酸的谱图数据吻合。

在HMBC谱图中，观察到δ_H3.54的两个氢的单峰与四个碳原子δ_C 19.7，28.9(C-21)，36.4(C-20)，41.0(C-19)交叉，表明C-29或者C-30被氧化。与文献核磁数据比较，推断C-29(δ_C 73.7)被氧化。

ROESY谱中δ_H 1.08和3.32(H-18，β-axial)交叉，证明30位碳是β位，因此C-29位于α位。

¹³C-NMR显示δ95.8(Glc-1)，74.2(Glc-2)，79.0(Glc-3)，71.2(Glc-4)，79.3(Glc-5)，62.3(Glc-6)，可能是一个吡喃葡萄糖糖基。水解生成的单糖经TLC检测为吡喃葡萄糖，又由其旋光值推断其为D-吡喃葡萄糖，由葡萄糖端基氢的偶合常数J＝8.1Hz，因此推断连接了β-D-吡喃葡萄糖，HMBC谱中糖端基的H(δ_H 6.33)和苷元C-28(δ_C176.5)相关，显示葡萄糖连接位置是三萜苷元C-28位。

综合以上分析，新皂苷结构定为3β，29-二羟基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸28-O-β-D-葡萄糖酯。

图1新皂苷的结构和主要的HMBC(H→C)和ROESY相关

表1新皂苷的核磁共振数据(δ，ppm，0＝TMS，C₅D₅N)

本发明的新化合物作为药物活性成分可以制成常规的药用剂型，如，片剂、丸剂、膏剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂以及注射液粉针剂或水针液。

3.体外抑制PLA₂作用

以SIBLINKS类似物为底物，以Lp-PLA₂(眼镜蛇蛇毒中提取的PLA₂)作为水解酶，吲哚PLA₂抑制剂5-甲氧基-1-苄基-1H-吲哚-3-乙酰胺为对照，通过酶标仪比色***测定水解的最大反应速率，进行抑制活性的定性定量比较，结果见表2。

表2对PLA₂抑制作用和SCORE的预测值

从表2的结果表明，盐角草皂苷甲的IC₅₀值与吲哚PLA₂抑制剂的IC₅₀相近，实验测定值与SCORE预测值呈对应关系，提示盐角草皂苷甲有类似于PLA₂抑制剂的作用。

4.抗炎作用

(1)对小鼠耳廓二甲苯炎症的影响

对雄性小鼠60只随机分5组，①对照组②盐角草皂苷甲I(20mg·kg^-1)、II(40mg·kg^-1)、III(80mg·kg^-1)三个剂量组③吲哚美辛组(8mg·kg^-1)，各组灌胃给药或给予等量的生理盐水，每天1次，连续3d，末次给药后30min，每鼠右耳廓内外侧滴涂20μl二甲苯致炎，左耳作为对照，致炎后30min脱颈椎处死小鼠，用直径7mm打孔器分别于左、右耳相同部位打下耳片，称重，以左、右耳片重量差值表示肿胀度，结果见表3。

表3盐角草皂苷甲对二甲苯所致小鼠耳廓炎症耳肿胀度的影响(

n＝15)

与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

实验结果表明，盐角草皂苷甲40mg·kg^-1和80mg·kg^-1两剂量组对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用，提示盐角草皂苷甲有一定抗炎作用。

(2)对角叉菜胶制备大鼠气囊滑膜炎炎症模型的影响

取健康SD雄性大白鼠，随机分为6组：①正常组；②模型组；③盐角草皂苷甲I(10mg·kg^-1)、II(20mg·kg^-1)、III(40mg·kg^-1)三个剂量；④***组(0.15mg·kg^-1)。各组动物***轻度麻醉，背部正中s.c无菌空气20ml，3d补充注射空气10ml维持气囊肿胀，6d气囊内注射角叉菜胶50mr·kg^-1致炎，正常对照组同法注射生理盐水等容积。各组动物于第3d开始灌胃给药①②组给予等容积生理盐水，6d致炎前30min再给药给药一次。致炎6h后动物i.p戊巴比妥钠25mg·kg^-1麻醉，气囊内注射无菌无钙镁Hank′s平衡盐液(HBSS)4ml灌洗，收集灌洗液，进行灌洗液中白细胞数和蛋白质含量的测定；采用微量酸滴定法测定PLA₂活性；采用放免法测定PGE的含量，结果见表4。

表4盐角草皂苷甲对大鼠气囊滑膜炎灌洗液中白细胞数、蛋白质和PGE含量及PLA₂活性的影响(

n＝8)

与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

在小鼠耳廓炎症实验的基础上，又进行了大鼠气囊滑膜炎症试验，结果与上次实验基本一致，盐角草皂苷甲可减少灌流液中白细胞的渗出和蛋白质的含量；与此同时，盐角草皂苷甲20mg·kg^-1和40mg·kg^-1两剂量组可通过对PLA₂活性的显著抑制作用，从而减少炎症介质PGE的含量，此实验结果与其体外抑制PLA₂作用一致，说明盐角草皂苷甲可用于PLA₂抑制剂和抗眼药物的开发。

结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不仅仅限于所列举的实施方式。

实施例1

盐角草新鲜全草50Kg，用90％乙醇回流提取三次，用量200升，每次3天，浓缩合并成无醇味的浓缩液，得总浸膏。再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正丁醇萃取物经柱层析分离后分别得到盐角草皂苷甲1克。(见附图9)

实施例2

盐角草全草10Kg，用水加热提取三次，水用量为20升，提取时间为1小时，提取温度为70℃，提取液经大孔树脂(D101、AB-5、HP-20等)吸附，用水，30％乙醇冲洗后用70％乙醇洗脱，70％乙醇洗脱液减压回收溶剂得皂苷混合物。混合物再经柱层析(硅胶柱层析：氯仿-甲醇***，RP-C18柱层析：水-甲醇***)分离后，分别得到盐角草皂苷甲0.2克。

实施例3

盐角草全草10Kg，用甲醇冷浸提取三次，甲醇用量为20升，提取时间为1天，提取液经大孔树脂(D101、AB-5、HP-20等)吸附。用水，30％乙醇冲洗后用70％乙醇洗脱，70％乙醇洗脱液减压回收溶剂得皂苷混合物。混合物再经柱层析(硅胶柱层析：氯仿-甲醇***，RP-C18柱层析：水-甲醇***)分离后，分别得到盐角草皂苷甲0.25克。

实施例4含本发明盐角草皂苷甲单体的片剂

取实施例1制得的盐角草皂苷甲化合物100mg与淀粉50mg，糊精50mg混合，用适量30％乙醇做湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入适量硬脂酸镁混合，制成片剂。

实施例5含本发明盐角草皂苷甲的胶囊剂

取盐角草皂苷甲化合物50mg与淀粉70mg，糊精10mg，糖粉10mg混合，用适量30％乙醇做湿润剂，制成软材，常规方法制粒，装入硬胶囊中。

实施例6含本发明盐角草皂苷甲的缓释胶囊剂

取盐角草皂苷甲化合物80mg与羟丙基甲基纤维素K15M 120mg，乙基纤维素45cps40mg，乳糖40mg混合，用10％乙烯吡咯烷酮k30乙醇溶液适量，制成软材，常规方法制粒，装入硬胶囊中制成缓释胶囊。

Claims

1.一种齐墩果酸皂苷类化合物盐角草皂苷甲，其特征在于化学名为3β，29-dihydroxy-olean-12-en-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester，化学结构式为：

2.制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于以盐角草为原料，经水、甲醇、乙醇或者甲醇-水、乙醇-水的混合溶液提取；水提取液直接过大孔树脂吸附，甲醇、乙醇或者甲醇-水、乙醇-水的混合溶液的提取液浓缩后加水溶解过大孔树脂吸附；大孔树脂吸附物经柱层析分离而得。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的大孔树脂为D101、AB-8、HP-20中的一种；柱层析用担体选自硅胶、凝胶、氧化铝、聚酰胺、ODS和MCI中的一种或几种。

4.权利要求1所述的化合物与医学上可接受的药用辅料组成药物制剂。

5.根据权利要求4所述的制剂剂型是片剂、胶囊剂和注射剂。

6.权利要求1所述的化合物在抑制磷脂酶A₂(PLA₂)活性和在制备抗炎药物中的用途。