CN102406665A - 物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗关节炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗关节炎药物中的应用。本发明经动物实验证实物理改性后的中华眼镜蛇总毒在（ 10-3000μg/kg ）范围内能抑制炎性疼痛、炎性增生和佐剂性关节炎有明显的治疗作用，其能减轻关节肿大，疼痛和关节损伤等症状，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点。

Description

物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗关节炎药物中的应用

技术领域

本发明药物新用途技术领域，具体涉及一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗关节炎药物中的用途。 

背景技术

蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物。新鲜毒液呈蛋清样粘稠液体，具有特殊的腥味。不同蛇种毒液色泽各异，中华眼镜蛇蛇毒呈淡黄色。蛇毒的干物质中90％以上是蛋白质，是其毒性和其生物学活性的主要成分。中华眼镜蛇蛇毒成分主要有眼镜蛇蛇毒因子(1％-2％)、心脏毒素(又名细胞毒素40％-50％)、神经毒素(10％)等其它类蛋白质。祖国传统医学认为眼镜蛇及其毒性成分可通经络，祛风湿，并具有强身健体之功效。早在二十世纪初，人们就开始应用蛇毒来缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛，随后出现一系列关于蛇毒有类似***样镇痛作用的报道。随着研究的不断深入，现在，蛇毒及其制品已应用于临床，除了镇痛作用外，研究发现在抗风湿、抗肿瘤以及在神经***疾病治疗方面都有很好的疗效。 

临床上观察发现眼镜蛇蛇毒对类风湿关节炎患者有明显疗效，特别能明显改善晚期类风湿关节炎患者关节疼痛。 

发明内容

本发明目的在于提供一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗关节炎药物中的应用，提供了一种治疗关节炎的新思路、新方法。 

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是： 

本发明目的是：提供改性中华眼镜蛇蛇毒在制备治疗炎性增生和关损伤药物中的用途。 

一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗关节炎药物中的应用。 

优选的，所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒是将眼镜蛇蛇毒用去离子水溶解后加热变性，加热温度在50～100℃之间，加热时间为1min～30min后得到的。 

优选的，所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒选自物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒或物理改性后的泰国眼镜蛇蛇毒。 

优选的，所述关节炎包括具有炎性增生或关节损伤的疾病。 

优选的，所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒的给药剂型选自口腔速溶药膜、口服液、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂。 

优选的，所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒与其他药物活性成分组成复方制剂或物理改性后的眼镜蛇蛇毒与药用辅料形成单方制剂。 

本发明中眼镜蛇蛇毒为眼镜蛇总毒，将其物理改性后可用于制备治疗炎症性增生和关节损伤药物。 

所述的眼镜蛇蛇毒为中华眼镜蛇总蛇毒，根据成份和药效的相同性，所述蛇毒还包括泰国眼镜蛇蛇毒。所述药物可以制备成选自以下的剂型：口腔速溶药膜、口服液、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂。当然，所述药物还包括各种单方和复方制剂。 

本发明涉及中华眼镜蛇蛇毒在制备治疗炎症性增生和关节炎药物中的用途。本发明经动物实验证实物理改性后的中华眼镜蛇总毒在药学上有效量(如大鼠10-3000μg/kg，人1～1000μg/kg)范围内能抑制炎性疼痛、炎性增生，并对佐剂性关节炎有明显的治疗作用，其能减轻关节肿大，疼痛和关节损伤等症状，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点。 

本发明通过中华眼镜蛇总毒经物理方法处理达到减毒增效目的，物理处理后的眼镜蛇毒有抑制无菌棉球诱导的炎症性肉芽增生、抑制免疫佐剂诱发的关节肿胀，疼痛和关节损伤，因此具有治疗关节炎的作用，其疗效超过未经处理的眼镜蛇毒或纯化的神经毒素(Cobratoxin)。所述药物包括口服液、口腔速溶药膜、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂等，所述药物还包括各种单方和复方制剂。 

中华眼镜蛇蛇毒在临床上已用于治疗风湿和缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛等，但都用纯化的神经毒素、多种蛇毒的混合制剂或眼镜蛇毒和其它中药的复方制剂。鉴于中华眼镜蛇毒毒性比较大，蛇毒中的药用成分主要是蛋白质，其结构和生物活性可以被理化因素改变。蛇毒在用过氧化氢处理后，二硫键被打开，其毒性大大降低，但是镇痛作用也几乎消失，提示生物学活性被破坏。而蛋白质加热后可发生可逆性变性，变性后空间结构发生了改变，或部分大分子蛋白质因加热部分分解为小分子量蛋白质。小鼠试验证 明这种加热变性之后的蛇毒毒性明显减少，而药效增加。本发明人发现加热变性的中华眼镜蛇蛇毒对甲醛引起的炎性疼痛、鸡蛋清引起的肿胀、无菌纸片引起的肉芽肿、完全弗氏佐剂导致的动物关节肿胀、疼痛和关节损伤有明显的缓解作用，提示对风湿、类风湿性关节炎有很好的治疗作用。这一发现，将对炎性疼痛、炎性增生性疾病、风湿类风湿性关节炎的研究和药物开发产生重大的影响，并有临床实用价值，为中华眼镜蛇蛇毒开辟临床新的用途。 

所述的眼镜蛇总毒是在用去离子水溶解的情况下，加热温度为50～100℃之间，时间在1min～30min后得到的。 

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是： 

1.采用经物理改性的中华眼镜蛇总毒，毒性低而药效高。 

2.中华眼镜蛇蛇毒不仅能改善甲醛所致的炎性疼痛、鸡蛋清所致的足肿胀，还能减轻纸片引起的肉芽肿重量。 

3.中华眼镜蛇蛇毒不仅能改善原发性关节炎足肿胀，还能提高对机械性痛的阈值。 

4.中华眼镜蛇蛇毒不仅能改善继发性关节炎关节肿大、足肿胀和疼痛等症状，还能改善软骨和滑膜的病理改变。 

5.中华眼镜蛇蛇毒不仅能降低继发性关节炎炎性因子肿瘤坏死因子-α水平，还能提高抗炎因子白细胞介素-10的水平。 

6.中华眼镜蛇蛇毒用量少，有效范围大，从10～3000μg/kg都有很好的治疗类风湿性关节炎的作用。人用剂量约为1～1000μg/kg。 

7.加热变性之后的中华眼镜蛇蛇毒组药效优于雷公藤治疗组，并且优于不加热处理组和神经毒素。 

本发明公开了中华眼镜蛇蛇毒在制备治疗炎性增生和关节炎药物中的用途。本发明发现改性中华眼镜蛇总毒在(10-3000μg/kg)范围内能抑制炎性疼痛、炎性增生和佐剂性关节炎有明显的治疗作用，其能减轻关节肿大，疼痛和关节损伤等症状，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点。 

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述： 

图1为中华眼镜蛇蛇毒给药6h后对甲醛致炎致痛添足时间的影响； 

图2为中华眼镜蛇蛇毒对纸片诱导的肉芽肿重量的影响； 

图3为各种药物对比治疗类风湿性关节炎大鼠软骨的药效病理切片结果； 

图4为各种药物对比治疗类风湿性关节炎大鼠滑膜的药效病理切片结果。 

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体实验的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 

实施例物理处理后的中华眼镜蛇毒的动物药效学实验 

在中华眼镜蛇蛇毒在治疗类风湿性关节炎中的动物实验中，实施例采用灌胃给药，给药剂量在10-3000μg/kg，一天一次。 

本实施例动物实验研究情况如下： 

甲醛致炎性痛模型是化学伤害性刺激引起的持续疼痛的有效模型，广泛应用于疼痛机制的研究及镇痛药的筛选。将KM小鼠随机分为6组(n＝12)雌性各半，体重18-22g：生理盐水对照组、中华眼镜蛇蛇毒加热小剂量组(30μg/kg)、中剂量组(90μg/kg)、大剂量组(270μg/kg)、中剂量不加热组(90μg/kg)、Cobratoxin(30μg/kg)。单次给予中华眼镜蛇蛇毒6h后，于小鼠右侧足底皮下注射5％甲醛溶液20μl致痛，立即放回透明观察容器内，用计时器分别记录小鼠添足时间(秒)，记录两个时相。第I时相为急性期即致痛后的0～5min，第II时相为强直期即致痛后20～30min。蛇毒中剂量和大剂量蛇毒明显减少甲醛所致的炎性疼痛小鼠的添足时间，优于中剂量不加热组和Cobratoxin。结果见图1为中华眼镜蛇蛇毒给药6h后对甲醛致炎致痛添足时间的影响 

n＝12)；与对照组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01。 

炎症往往伴有红、肿、热、痛。总体来说炎症分为三个时相。第一个时相是血管渗透性增加引起血管内容物渗入到组织间隙所致，称之为急性阶 段。第二个时相是白细胞从血液渗透到组织间隙中，称之为亚急性阶段。第三个时相是肉芽肿形成阶段，称之为慢性修复性阶段。 

鸡蛋清是含有很多成分的异物，通过足底皮下注射形成急性非特异性炎症，观察给予蛇毒对足肿胀的影响。10％鸡蛋清右足足底皮下注射0.1ml引起足肿胀，于注射之前连续五天灌胃预防给药，在注射蛋清之前测量大鼠右足的足体积为基础值，并连续测量注射蛋清后0.5h、1h、2h、4h这四个时间点的右足足体积，观察指标为四个时间点的右足足体积与蛋清注射之前的足体积差值。0.5h肿胀最为明显，在1h中剂量和大剂量蛇毒能明显改善足肿胀，在其余的时间点具有改善足肿胀的趋势。结果见表1。 

表1中华眼镜蛇蛇毒对鸡蛋清所致大鼠足肿胀的影响 

n＝8)

与对照组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01。 

在慢性炎症修复这个阶段，通过植入纸片的方式来形成肉芽肿，观察蛇毒对肉芽肿重量的影响。10μl的7％甲醛浸润的纸片在两侧腋下无菌植入。手术之后给予青霉素G预防感染，连续3天。当天立即灌胃给药，连续7天。第七天处死大鼠，取出肉芽肿，称量湿重和干重。中剂量和大剂量蛇毒在减轻肉芽肿重量方面最为明显，优于雷公藤治疗组。结果见图2。图2为中华眼镜蛇蛇毒对纸片诱导的肉芽肿重量的影响 n＝10)；与对照组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01，^＊＊＊P＜0.001。 

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种进行性、***性，以侵犯骨关节为主，呈多发性和对称性的自身免疫性疾病。佐剂性关节炎模 型是类风湿性关节炎的最为经典的免疫性炎症模型，适合于从免疫调节的角度研究防治类风湿性关节炎的药物，且造模成功率高，所以选用佐剂性关节炎模型来研究中华眼镜蛇蛇毒对类风湿性关节炎的治疗作用。 

试验前，大鼠在实验场所饲养至少2天以上。原发性关节炎试验中，大鼠随机分为七组，预防给药五天，第四天用足趾容积测量仪测定大鼠的右足足体积作为基础值，于第五天在无菌条件下，大鼠右足垫皮下注射0.1ml完全弗氏佐剂，于注射之后第6h、24h、72h再测量大鼠的右足足体积，与基础值的差值即为肿胀的程度。采用Von Frey丝测定右后肢机械性痛阈。继发性关节炎试验中，大鼠随机分为七组，在无菌条件下，大鼠右足垫皮下注射0.1ml完全弗氏佐剂，注射之后的第十一天开始给药，在注射前和注射后的第10天、12天、16天、20天、24天、32天用软尺测定大鼠右足踝关节周长，与第十天的周长差值即为踝关节周长差。足趾容积测量仪测定大鼠的右足足体积，与第十天的足体积差值即为足肿胀的程度。采用Von Frey丝测定右后肢机械性痛阈。第33天，将全部大鼠麻醉，腹主动脉取血，静置30分钟后3000转4℃离心10分钟后取上层血清，-80℃冻存。然后处死大鼠，取大鼠右足踝关节，置于10％甲醛溶液中，病理切片，HE染色，镜下观察。 

在原发性关节炎试验中发现，预给药5天，中剂量和大剂量蛇毒在6h和24h能明显的改善急性期炎症，减轻足肿胀程度，提高机械性痛阈，并且优于雷公藤治疗组和不加热蛇毒中剂量组。结果见表2和表3。表2为中华眼镜蛇蛇毒对完全弗氏佐剂致大鼠原发性关节炎足肿胀的影响 n＝8)；表3为中华眼镜蛇蛇毒对完全弗氏佐剂致大鼠原发性关节炎机械性痛阈的影响， 

n＝8)。 

表2中华眼镜蛇蛇毒对完全弗氏佐剂致大鼠原发性关节炎足肿胀的影响 

与正常组相比###P＜0.001；与模型组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01。 

表3中华眼镜蛇蛇毒对完全弗氏佐剂致大鼠原发性关节炎机械性痛阈的影响 

n＝8)

与正常组相比###P＜0.001；与模型组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01。 

原发性佐剂性关节炎病变持续3天后逐渐减轻，继发性病变由迟发型超敏反应引起，于造模后第10天出现新一轮的肿胀。佐剂造模后第10天，与正常对照组相比，大鼠踝关节周长差明显升高。灌胃给药十天，观察到中剂量和大剂量蛇毒都明显减少关节周长差，减轻足肿胀，提高机械性痛阈，优于雷公藤治疗组和不加热的中剂量组。结果见表4、表5和表6。 

表4中华眼镜蛇蛇毒对完全弗氏佐剂致大鼠继发性关节炎踝关节周长差的影响 n＝8) 

与正常组相比###P＜0.001；与模型组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01。 

表5中华眼镜蛇蛇毒对完全弗氏佐剂致大鼠继发性关节炎足体积差值的影响 

n＝8) 

与正常组相比###P＜0.001；与模型组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01。 

表6中华眼镜蛇蛇毒对完全弗氏佐剂致大鼠继发性关节炎机械性痛阈的影响 

n＝8) 

与正常组相比###P＜0.001；与模型组相比^＊P＜0.05，^＊＊＊P＜0.001。 

原发性佐剂关节炎病变持续3天后逐渐减轻，继发性病变由迟发型超敏反应引起，致炎后第10天后出现新一轮的肿胀。与空白对照组相比，模型组炎症因子肿瘤坏死因子-α明显升高，而抗炎因子白细胞介素-10明显降低。中剂量和大剂量蛇毒能明显减少炎症因子肿瘤坏死因子-α的释放，增加抗炎因子白细胞介素-10的水平。结果见表7。 

表7中华眼镜蛇蛇毒对完全弗氏佐剂致大鼠继发性关节炎血清中细胞因子的影响 

n＝6) 

与正常组相比###P＜0.001；与模型组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01， ^＊＊＊P＜0.001。 

如图3和图4所示，病理切片结果提示：与正常组相比，模型组大鼠(图3和图4中B)在注射完全弗氏佐剂后的第33天，大鼠踝关节软骨明显增生 (图3)，有明显的炎症细胞渗入，甚至炎症细胞浸润整个关节(图4)，骨关节明显被破坏。中华眼镜蛇蛇毒(90，270μg/kg)(图3和图4E和F)均能明显降低抑制关节软骨增生(图3)，抑制炎症细胞渗入(图4)，降低骨破坏。雷公藤(15mg/kg)(图3和图4C)能抑制炎症细胞渗入和关节软骨增生，但剂量比中华眼镜蛇蛇毒组(90，270μg/kg)高。 

综上所述，可知： 

1.物理改性后的中华眼镜蛇毒口服给药抑制甲醛引起的疼痛发应。 

2.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能改善鸡蛋清所致的足肿胀，减轻7％的甲醛浸润的纸片诱发的肉芽肿重量。 

3.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒不仅能改善原发性关节炎足肿胀症状，还能提高机械性痛的阈值。 

4.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能降低继发性佐剂性关节炎大鼠踝关节周长，提高大鼠机械性痛的阈值。 

5.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能降低继发性佐剂性关节炎大鼠足肿胀体积。 

6.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能降低佐剂性关节炎大鼠血清中肿瘤坏死因子-α的水平，提高抗炎因子白细胞介素-10的水平。 

7.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能改善继发性佐剂性关节炎大鼠关节病理改变。 

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 

Claims (6)

1. 一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗关节炎药物中的应用。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒是将眼镜蛇蛇毒用去离子水溶解后加热变性，加热温度在50～100℃之间，加热时间为1min～30min后得到的。

3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒选自物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒或物理改性后的泰国眼镜蛇蛇毒。

4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述关节炎包括具有炎性增生或关节损伤的疾病。

5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒的给药剂型选自口腔速溶药膜、口服液、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂。

6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒与其他药物活性成分组成复方制剂或物理改性后的眼镜蛇蛇毒与药用辅料形成单方制剂。

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