CN102406610B

CN102406610B - 一种具有长循环性能的微粒给药***及其制备方法

Info

Publication number: CN102406610B
Application number: CN 201110234982
Authority: CN
Inventors: 魏晓红; 刘金华; 张玲
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2011-08-17
Filing date: 2011-08-17
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2031-08-17
Also published as: CN102406610A

Abstract

本发明涉及一种难溶性药物的微粒给药***及其制备方法。目前临床应用的许多药物大多为难溶性药物，为解决在一定程度上改善难溶性药物的溶解度，提高生物利用度的问题，本发明提出了一种具有长循环性能的微粒给药***及其制备方法，长循环性能由PEG化壳聚糖提供，本发明的药物在体外漏槽条件下表现出缓慢释放特征，起到控释功能。以静脉注射液方式进入家兔体内时，该微粒给药***也表现出比单纯的药物溶液或壳聚糖修饰的微粒给药***更长的消除半衰期，生物利用度有显著提高。

Description

一种具有长循环性能的微粒给药***及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说是涉及一种难溶性药物的微粒给药***及其制备方法。

背景技术

临床应用的许多药物大多为难溶性药物。它们由于高亲脂性，在水溶性介质中溶解性能差，而自身又受到相对较大分子量、小肠透过率低、肝脏和胃肠道粘膜的首过效应等因素的限制，使生物利用度呈现极大的个体差异。因此，人们希望通过剂型改造，包括增溶、助溶和采用微粒给药***等制剂学技术，在一定程度上改善难溶性药物的溶解度，辅助不同的给药途径改善药物的转运、分布、吸收，提高药效。提高难溶性药物的生物利用度是实现安全高效难溶性药物新制剂需要解决的关键问题之一，是研究和开发具有自主知识产权医药产品的必经之路。

壳聚糖，是天然存在的、亲水的、阳离子的、可生物降解多糖，具有无毒、良好的生物相容性、低免疫排斥反应，适合作为药物的控缓释载体，被广泛用于制剂研究。然而，由于壳聚糖分子间、内氢键的存在，使得它不溶于一般的有机溶剂和水，只有在醋酸溶液中才能被溶解。这为其广泛应用造成了很大困难。为了改进其溶解性，人们对其糖苷上的羟基和氨基进行了许多改性工作，保留壳聚糖的优点，改进了其缺点，如对其甲苯磺酸化、氨基化、酯化、羧基化、醛基化、磺化等修饰手段，得到许多壳聚糖的水溶性衍生物。

聚乙二醇(PEG)是一种用途极为广泛的高分子化合物，能够溶解于水和许多溶剂中，具有优异的生物相容性，在体内能溶于组织液中，可被机体迅速排除体外而不产生任何毒副作用。研究表明在微粒表面接枝PEG后，交替重叠覆盖在微粒表面，形成致密的构象云。这种立***阻保护微粒不被血液中的调理素识别、摄取，使微粒消除速率减慢，血液中驻留时间延长，药物作用时间延长。通过氢键的作用，PEG化壳聚糖被吸附在磷脂载体表面，PEG长链在微粒表面形成的水化膜，减小微粒给药***被人体网状内皮***和血中的单核细胞吞噬的可能。而且，PEG化壳聚糖缠绕在微粒给药***表面，能够使微粒稳定地存在于介质中而不聚集，起到稳定的作用。

生物医学工程学杂志2007；24(4)∶941～945页马超、匡安仁的《长循环脂质体的研究进展及其在核医学中的应用》中公开了一种由聚乙二醇或与配体连接的聚乙二醇修饰的脂质体，即长循环脂质体，作为一种给药***，但是该给药***是由脂质体组成，脂质体主要是由卵磷脂和胆固醇组成骨架，PEG通过化学反应，形成PEG化磷脂或PEG化胆固醇。脂质体的稳定性较差，存储时间短，存储条件高。同时商用PEG化磷脂或PEG化胆固醇价格高。

申请号为200610099318.5的中国专利公开了一种新型的注射用长循环前列地尔脂质体给药***及其制备方法，该发明将药物包裹于形成的脂质双层膜中,制备成可供注射的***素E1脂质体给药***。该聚乙二醇长链由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺一聚乙二醇（PEG-DSPE）提供。形成脂质体后,其聚乙二醇长链可以分布于微粒的表面形成亲水性保护膜,一方面防止微粒之间的相互聚集,另一方面可以避免被体内网状内皮***识别、吞噬,延长微粒给药***在血液循环的保留时间,达到长循环的作用。该脂质体的pH为柠檬酸缓冲液，pH在4.0-5.0之间，该pH范围大大低于血液pH7.4，虽然加入了止痛剂——叔丁基羟基甲苯（BHT）, 该制剂注射后，病人还是可能产生不适和疼痛。另外，该冻干制剂中加入了大量的冻干保护剂——乳糖和止痛剂——叔丁基羟基甲苯（BHT）等辅料，带来毒性。

发明内容

目前临床应用的许多药物大多为难溶性药物，为解决改善难溶性药物的溶解度，提高生物利用度所存在的问题，本发明提出了一种具有长循环性能的微粒给药***及其制备方法，本发明的药物在体外漏槽条件下表现出缓慢释放特征，起到控释功能。以静脉注射液方式进入家兔体内时，该微粒给药***也表现出比单纯的脂质体或壳聚糖修饰的微粒给药***更长的消除半衰期，生物利用度有显著提高。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种具有长循环性能的微粒给药***，所述的具有长循环性能的微粒给药***为负载阿霉素，PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***，长循环性能由PEG化壳聚糖提供，PEG化壳聚糖具有代表性的结构通式为：

其中n为聚合度；壳聚糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70-100%；壳聚糖链上的部分自由氨基被聚乙二醇（PEG）取代，氨基取代度为1～80％。

我们通过条件温和的合成反应将亲水的聚乙二醇5000链段引入壳聚糖氨基葡萄糖单元，合成PEG化壳聚糖，并用它来修饰负载有难溶性药物的微粒给药***。同时对该微粒给药***在体内、外的性能进行表征。

一种具有长循环性能的微粒给药***制备方法，所述的具有长循环性能的微粒给药***的制备方法为以下步骤：

（1）油相：称取阿霉素、卵磷脂，用二氯甲烷和丙酮混合液溶解，混合液的量为使溶质完全溶解的溶剂量；

（2）水相：称取PEG化壳聚糖、Poloxmer（泊洛沙姆），用水溶解，水的量为使溶质完全溶解的溶剂量；

（3）将油相注入水相时，边搅拌边注入，加水定容至阿霉素的终浓度为0.5~10mg/ml，2~8℃超声分散，室温蒸发（室温为18~32℃），除去二氯甲烷后再用水洗涤，离心速度6000~16000g、2~8℃离心15~50分钟，弃去上清液，将得到离心后的沉淀物用水重悬, 过0.3~0.6μm的膜去除大的微球和集结物后定容，干燥，即为负载阿霉素，PEG化壳聚糖修饰的长循环性能的微粒给药***；作为优选，用水洗涤两次或两次以上。

其中阿霉素：卵磷脂：PEG化壳聚糖：Poloxmer的质量比为1：0.5~2.0：0.1~1：0.3~2，二氯甲烷与丙酮的体积比为0.1~5：1。

本发明所得到的具有长循环性能的微粒给药***的微粒是5～1000nm、zeta电位为-30mV～+30mV的微粒。通过乳化-溶剂挥发法制备的微粒给药***，PEG化壳聚糖吸附在磷脂载体表面，利用PEG柔软长链在微粒表面形成水化膜，从而减小药物微粒被人体网状内皮***和血中的单核细胞吞噬的可能。同时PEG化壳聚糖缠绕在微粒给药***表面，使微粒稳定地存在于介质中而不聚集，起到稳定的作用。

本发明所得到的微粒给药***，包封率在30%-100%之间，载药量在1%-50%之间。在体外释放表现出缓释特征，起到控缓释功能。在动物体内也表现出比单纯的脂质体和壳聚糖修饰的微粒给药***更长的半衰期，生物利用度有显著提高。

本发明所涉及的微粒给药***，因微粒表面的PEG链的舒展性和柔软性，能在表面形成严密不可渗透的形态云，明显增加微粒的空间位阻，使微粒具有隐秘性，减少了血浆蛋白和微粒表面的相互作用，降低了被单核巨噬细胞的识别和吞噬，延长了在循环***的滞留时间，大大提高了生物利用度。又因为PEG亲水，所以此水化层能减少蛋白的吸附，降低内皮网状吞噬***的摄取，从而达到长循环的目的。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明中的PEG化壳聚糖，结合了PEG和壳聚糖二者的优点，其中PEG具有优异的亲水性和柔软长链产生的“隐秘性”；壳聚糖具有阳离子、生物相容性和生物降解性。因此，PEG化壳聚糖缠绕在微粒给药***表面，能够使微粒稳定地存在于介质中而不聚集，起到稳定的作用。

（2）本发明所述的PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***，制备方法简单。

附图说明

图1为PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***的TEM图(Bar，50nm)；

图2为PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***的zeta电位图；

图3为在体外释放条件下药物从PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***中释放图；

图4为PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***以静脉给药后，不同时间点在家兔体内的血药浓度。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

（a）油相：称取阿霉素0.1g，卵磷脂0.12g，用体积比为3：1二氯甲烷和丙酮混合液6ml溶解，

（b）水相：称取0.05g PEG化壳聚糖、0.08g Poloxmer，用20ml水溶解；

（c）将油相缓慢注入磁力搅拌的水相中，加水定容至阿霉素的终浓度为1mg/ml，4℃超声分散，室温旋转蒸发，除去二氯甲烷后再用20ml水洗涤两次，离心速度12，000g、4℃离心30分钟，弃去上清液，将得到离心后的沉淀物用水重悬，过0.45μm的膜去除大的微球和集结物后定容，冷冻干燥，即为长循环性能的微粒给药***。

实施例2

（a）油相：称取阿霉素0.1g，卵磷脂0.05g，用体积比为0.5：1二氯甲烷和丙酮混合液6ml溶解，

（b）水相：称取0.01g PEG化壳聚糖、0.03g Poloxmer，用10ml水溶解；

（c）将油相缓慢注入磁力搅拌的水相中，加水定容至阿霉素的终浓度为1mg/ml，4℃超声分散，室温旋转蒸发，除去二氯甲烷后再用10ml水洗涤三次，离心速度16，000g、4℃离心30分钟，弃去上清液，将得到离心后的沉淀物用水重悬，过0.30μm的膜去除大的微球和集结物后定容，冷冻干燥，即为长循环性能的微粒给药***。

实施例3

（a）油相：称取阿霉素0.1g，卵磷脂0.2g，用体积比为5：1二氯甲烷和丙酮混合液6ml溶解，

（b）水相：称取0.1g PEG化壳聚糖、0.2g Poloxmer,用50ml水溶解；

（c）将油相缓慢注入用磁力搅拌的水相中，加水定容至阿霉素的终浓度为1mg/ml，4℃超声分散，室温旋转蒸发，除去二氯甲烷后再用50ml水洗涤三次，离心速度8，000g、4℃离心30分钟，弃去上清液，将得到离心后的沉淀物用水重悬，过0.6μm的膜去除大的微球和集结物后定容，冷冻干燥，即为长循环性能的微粒给药***。

实施例4

（a）油相：称取阿霉素0.1g，卵磷脂0.15g，用体积比为1：1二氯甲烷和丙酮混合液6ml溶解，

（b）水相：称取0.02g PEG化壳聚糖、0.1g Poloxmer，用20ml水溶解；

（c）将油相缓慢注入用磁力搅拌的水相中，加水定容至阿霉素的终浓度为3mg/ml，5℃超声分散，室温旋转蒸发，除去二氯甲烷后再用20ml水洗涤两次，离心速度10，000g、5℃离心40分钟，弃去上清液，将得到离心后的沉淀物用水重悬，过0.4μm的膜去除大的微球和集结物后定容，冷冻干燥，即为长循环性能的微粒给药***。

实施例5

（a）油相：称取阿霉素0.1g，卵磷脂0.18g，用体积比为4：1二氯甲烷和丙酮混合液6ml溶解，

（b）水相：称取0.08g PEG化壳聚糖、0.15g Poloxmer，用20ml水溶解；

（c）将油相缓慢注入用磁力搅拌的水相中，加水定容至阿霉素的终浓度为7mg/ml，3℃超声分散，室温旋转蒸发，除去二氯甲烷后再用20ml水洗涤两次，离心速度15，000g、3℃离心20分钟，弃去上清液，将得到离心后的沉淀物用水重悬，过0.5μm的膜去除大的微球和集结物后定容，冷冻干燥，即为长循环性能的微粒给药***。

实施例评定

（1）包封产率和载药量的测定

精密称取实施例1中制备的的微粒冷冻干燥品，用高效液相流动相溶解，滤纸过滤除去不溶物，取续滤液稀释到标准曲线的检测浓度范围后，用HPLC测定浓度，计算药物含量。

包封产率＝测得的药物量/处方投药量×100％。

载药量=药物量/处方投药量×100%

经HPLC测定，PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***的药物包封率为69.22％，载药量为37.04％。

2）给药微粒形态和粒径测定

定量将PEG化壳聚糖修饰的给药微粒冷冻干燥品分散于定量的生理盐水中,得到混悬液，加水稀释至2.5%,用专用铜网蘸取后，用1％磷钨酸染色片刻,置于透射电镜下观察其形态和大致粒径。将定量PEG化壳聚糖修饰的药物微粒给药***干燥品溶于水,ZETASIZE 3000 HSa下测量粒径和ζ电位。

给药微粒的TEM图和ζ-电位，如图1和图2。

从上可见，PEG化壳聚糖修饰给药微粒粒径在100nm左右，微粒相互间不粘连，粒径分布均匀。

从PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***的ζ-电位图可知，ζ-电位为-8.5mv。用同法制备的壳聚糖修饰的微粒给药***的ζ-电位为+15.2 mv，而单纯的磷脂给药体表面的ζ-电位为-17.5mv。这些数据表明了壳聚糖作为正电荷给予体，而卵磷脂为带负电荷的物质，它们都能使微粒表面电荷发生改变，同时，可能由于在这微粒处方中，卵磷脂的量比PEG化壳聚糖的量大，因此，PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***表面电荷略微为负，接近中性。这也从另一侧面表明，PEG化壳聚糖确实已被包裹在微粒表面。

室温下，将一定量的PEG化壳聚糖修饰的给药微粒冷冻干燥品混悬于100mLPBS(pH7.4)释放介质，置于棕色瓶中做体外释放，使符合漏槽条件。间隔一定时间定量取样，同时补充等量的新鲜释放介质。在不同时间点取的样品在12，000g、4℃离心30分钟,取上清液，以HPLC法测定上清样品中的药物的浓度，计算累积释放量。

含有PEG化壳聚糖的给药微粒体外释放见图3。从释放图可见，微粒的释放没有突释现象，在48小时内，从微粒中释放了药物约30%。

用定量无菌生理盐水稀释准确称量的PEG化壳聚糖修饰微粒给药***冻干品，得到该给药微粒的注射液。

取2公斤左右的家兔，实验前12小时禁食，但不禁水。先从家兔耳缘静脉取空白血，按家兔每公斤体重含药物5mg的PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***注射液、，分别在2min、5min、10min、20min、40min、1h、2h、4h、8h、12h、24h时间点取血样，用有机溶剂提取药物，经HPLC分析，得到各时间点的血药浓度，将血药浓度数据输入药动软件，计算药动参数。

由HPLC测定得到各时间点的血药浓度见图4。

将血药浓度数据输入药动软件，计算药动参数。从药动参数可知，壳聚糖修饰的给药微粒的消除半衰期、AUC是单纯药物溶液的13倍、1.38倍；PEG 化壳聚糖修饰的给药微粒的消除半衰期、AUC是单纯药物溶液的21倍、25.8倍。因此，PEG 化壳聚糖修饰的微粒消除半衰期比壳聚糖修饰的微粒略长，而生物利用度是壳聚糖修饰的微粒的18.6倍，有显著性差异。综上所述，PEG化壳聚糖修饰的给药微粒溶液和壳聚糖修饰的给药微粒溶液、单纯药物溶液相比，消除半衰期t_1/2beta延长；AUC增加。

以上结果说明，PEG化壳聚糖修饰的给药微粒具有长循环性能，药物及载体的药代动力学特征发生了明显的变化。主要表现为药物代谢及消除减慢，生物利用度大大提高。这些作用都是由于PEG接枝到壳聚糖骨架链上形成的PEG化微粒，表面的PEG链舒展性和柔软性，能在微粒表面形成严密不可渗透的形态云(conformational cloud)，明显增加微粒的空间位阻，使微粒具有隐秘性，减少了血浆蛋白和微粒表面的相互作用，降低了被单核巨噬细胞的识别和吞噬，延长了在循环***的滞留时间，大大提高了生物利用度。又因为PEG亲水，所以此水化层能减少蛋白的吸附，降低内皮网状吞噬***的摄取，从而达到长循环的目的。

Claims

1.一种具有长循环性能的微粒给药***，其特征在于，所述的具有长循环性能的微粒给药***为负载阿霉素，PEG化壳聚糖修饰的微粒给药***，长循环性能由PEG化壳聚糖提供，PEG化壳聚糖的结构通式为：

其中n为聚合度；壳聚糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70～100%；壳聚糖链上的部分自由氨基被聚乙二醇（PEG）取代，氨基取代度为1～80％；

微粒给药***微粒是5～1000nm、zeta电位为-30mV～+30mV的微粒，所形成具有长循环性能的微粒给药***包封率在30%～100%之间，载药量在1%～50%之间；

所述的具有长循环性能的微粒给药***的制备方法为以下步骤：

（2）水相：称取PEG化壳聚糖、泊洛沙姆，用水溶解，水的量为使溶质完全溶解的溶剂量；

（3）将油相注入水相时，边搅拌边注入，加水定容至阿霉素的终浓度为0.5～10mg/ml，2～8℃超声分散，室温蒸发，除去二氯甲烷后再用水洗涤，离心速度6000～16000g、2～8℃离心15～50分钟，弃去上清液，将得到离心后的沉淀物用水重悬，过0.3～0.6μm的膜去除大的微球和集结物后定容，干燥，得到长循环性能的微粒给药***；

其中阿霉素：卵磷脂：PEG化壳聚糖：泊洛沙姆的质量比为1：0.5～2.0：0.1～1：0.3～2，二氯甲烷与丙酮的体积比为0.1～5：1。