CN102399767A - 一种宽pH范围纤维素酶Cel5A及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种宽pH范围纤维素酶Cel5A及其基因和应用。本发明提供了一种宽pH范围纤维素酶Cel5A，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述宽pH范围纤维素酶Cel5A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的宽pH范围纤维素酶Cel5A具有极好的耐热性，可应用于动物及鱼类的饲料、食品、医药等工业，同时还可以应用于造纸及纺织印染行业。

Description

一种宽pH范围纤维素酶Cel5A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种宽pH范围纤维素酶Cel5A及其基因和应用。

背景技术

纤维素是葡萄糖以β-1，4糖苷键连接成的多糖，是自然界中最主要的可再生资源之一。这些可再生资源要获得利用，对纤维素的降解是很重要的一部分。纤维素的降解需要三种酶协同作用，包括：内切纤维素酶(endo-1，4-β-d-glucanase，EC 3.2.1.4，简称EG)，这类酶优先作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；外切纤维素酶(exo-1，4-β-d-glucanase或cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91，简称CBH)，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子；β-葡糖苷酶(β-d-glucosidase，EC 3.2.1.21，简称BG)，这类酶作用于纤维二糖或纤维寡糖的非还原端，产生葡萄糖分子。

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，微生物是纤维素酶的重要来源，很多微生物包括细菌、放线菌、真菌等都产纤维素酶(张传富等，生物信息学，2006，1(5)：34-36)。微生物纤维素酶具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。按纤维素酶催化反应的最适pH值，可将其分为酸性纤维素酶(最适pH值为3.0-5.0)、中性纤维素酶(最适pH值为6.0-8.0)和碱性纤维素酶(最适pH值为8.0-11.0)(Zhang YHP et al.Biotechnol Adv 2006，24：62-481.)。

纤维素酶在造纸、酿造、纺织、饲料、生物能源等领域均具有广泛的应用前景(WongKK，et al.Microbiol Rev 1988，52：305-317.)。但是，不同的工业应用需求不同性质的纤维素酶，例如，饲料工业需要的纤维素酶需在酸性和中性条件下有高活性，而纺织工业需要中性耐碱的纤维素酶。目前工业上广泛应用的木霉所产纤维素酶最适pH在5.0左右，最适温度在50-60℃之间，不能满足棉织品水洗整理工业、造纸制浆业的工业要求。由于棉纤维耐碱不耐酸，强酸性处理后易损坏(许爱国等，中性纤维素酶在棉织物整理中的应用，印染，2006，21，11-12)。因此，获得新型具有耐碱高温的中性纤维素酶的研究具有重大意义。克隆和分离具有中性、热稳定性好的纤维素酶可以更好的应用于纺织等领域。

本发明得到了一个新的纤维素酶，在酸性及中性碱性条件下均具有高活性和稳定性，同时，该纤维素酶具有极好的耐热性，可应用于动物及鱼类的饲料生产，应用于食品、医药等工业，同时还可以应用于造纸及纺织印染行业。

发明内容

本发明的目的是提供一种宽pH范围纤维素酶Cel5A。

本发明的再一目的是提供编码上述宽pH范围纤维素酶的基因cel5A。

本发明的另一目的是提供包含上述宽pH范围纤维素酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述宽pH范围纤维素酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述宽pH范围纤维素酶的方法。

本发明的另一目的提供上述宽pH范围纤维素酶的应用。

本发明从Bispora antennata CBS 126.38中分离得到一种新的耐高温宽pH范围纤维素酶Cel5A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MRFSTPLLAT SLMASVFGSP VITTKRSNSS TFQFFGVNES GAEFGQTNIP

GTLGTDYTWP                                       60

STTAIGTLMD KGMNTFRIAF LMERLAQNSM TATLDATYLA DLRKVVEYIT

GRGGYAVLDP                                       120

HNFGRYAGSV ITSTADFGTF WANVASQFKD DEKVVFDCNN EFHDMPSNDL

VRGLNQACVD                                       180

GVRGAGATEQ WIFVEGTSYT GAWTWVSSGN GDALISLTDP SDKIVYEMHQ

YLDSDGSGTS                                       240

SECVSSTIGA ERIATATAWL KANNKRGILG EFAGGVNTQC QTAVMGLLDA

LVTDKAVWMG                                       300

ALWWGGGPWW GDYSFGMEAG SGVGAYEGYI DILTKYV         337

其中，该酶蛋白全长337个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列“MRFSTPLLAT SLMASVFG”。

因此，成熟的纤维素酶Cel5A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

SPVITTKRSN SSTFQFFGVN ESGAEFGQTN IPGTLGTDYT WPSTTAIGTL

MDKGMNTFRI                                       60

AFLMERLAQN SMTATLDATY LADLRKVVEY ITGRGGYAVL DPHNFGRYAG

SVITSTADFG                                       120

TFWANVASQF KDDEKVVFDC NNEFHDMPSN DLVRGLNQAC

VDGVRGAGAT EQWIFVEGTS       180

YTGAWTWVSS GNGDALISLT DPSDKIVYEM HQYLDSDGSG TSSECVSSTI

GAERIATATA                  240

WLKANNKRGI LGEFAGGVNT QCQTAVMGLL DALVTDKAVW

MGALWWGGGP WWGDYSFGME       300

AGSGVGAYEG YIDILTKYV        319

成熟蛋白由319个氨基酸和一个终止密码子组成，理论分子量为34.5kDa，该酶属于糖基水解酶第5家族。将纤维素酶氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，与来源于Sclerotinia sclerotiorum 1980的假定蛋白的序列一致性最高为63％，与Thermoascus aurantiacus的纤维素酶EGI的序列一致性最高为55.3％。说明纤维素酶Cel5A是一种新的纤维素酶。

本发明提供了编码上述纤维素酶的基因，该酶基因全长1168bp，序列如SEQ IDNO.3所示：

atgcgcttct caacccccct cctcgccaca agcctcatgg cttcagtctt tggatcacca      60

gtcataacca ccaaacgctc aaactcaagt accttccaat ttttcggcgt caacgaatca     120

ggcgctgaat tcggacaaac caacatcccc ggtactctag gaacagacta cacatggccc     180

tccacaaccg ccatcggaac tttgatggat aaagggatga acaccttccg aatcgccttc     240

ctcatggaac ggctcgctca gaatagcatg acggctaccc ttgacgcaac atacctcgcc     300

gatctccgca aggttgtgga atacatcact gggaggggag gctatgcggt tttagatcca     360

cataactttg ggaggtatgc tgggagtgtg attacttcca ccgcggattt tgggactttt     420

tgggcgaatg ttgcaagcca gtttaaggat gatgagaagg tggtgtttga ttgtaataat     480

gagtttcatg atatgccgtc gaatgatttg gttagggggt tgaatcaggc ttgtgttgat     540

ggggtgaggg gtgctggtgc gacggagcag tggatttttg ttgaaggaac tgtttgttcc     600

cctccccata tccccctata aactcgctaa cgcaaaacag tcttacacgg gagcatggac     660

atgggtatct tccggaaatg gcgacgccct tatttcactt accgatccat ctgataaaat     720

cgtttatgag atgcatcaat atctcgactc tgatggctca ggcacttctt ccgaatgtgt     780

ttcttccacc attggtgccg aaagaatcgc taccgcaact gcttggttga aggcgaataa     840

caaacgaggg attctgggcg agttcgcggg gggtgtgaat acgcagtgtc agactgctgt     900

gatgggtttg cttgatgctt tggtcacgga taaggcggtt tggatggggg ctttgtggtg     960

gggtggtgga ccggtatgtt tattctgctc tgttttccat tcatgatgtt gcgagatttt    1020

atatgttgtc tcctgagagg ggttccgaat ggtaaatgct gacttgtttt tcttctagtg    1080

gtggggagat tacagttttg ggatggaggc tgggagtggg gttggggctt atgagggata    1140

cattgatatt ttaacaaagt atgtgtag                                       1168

本发明还提供了编码上述纤维素酶的cDNA序列，全长1014bp，如SEQ ID NO.4所示：

atgcgcttct caacccccct cctcgccaca agcctcatgg cttcagtctt tggatcacca      60

gtcataacca ccaaacgctc aaactcaagt accttccaat ttttcggcgt caacgaatca     120

ggcgctgaat tcggacaaac caacatcccc ggtactctag gaacagacta cacatggccc     180

tccacaaccg ccatcggaac tttgatggat aaagggatga acaccttccg aatcgccttc     240

ctcatggaac ggctcgctca gaatagcatg acggctaccc ttgacgcaac atacctcgcc     300

gatctccgca aggttgtgga atacatcact gggaggggag gctatgcggt tttagatcca     360

cataactttg ggaggtatgc tgggagtgtg attacttcca ccgcggattt tgggactttt     420

tgggcgaatg ttgcaagcca gtttaaggat gatgagaagg tggtgtttga ttgtaataat     480

gagtttcatg atatgccgtc gaatgatttg gttagggggt tgaatcaggc ttgtgttgat     540

ggggtgaggg gtgctggtgc gacggagcag tggatttttg ttgaaggaac ttcttacacg     600

ggagcatgga catgggtatc ttccggaaat ggcgacgccc ttatttcact taccgatcca     660

tctgataaaa tcgtttatga gatgcatcaa tatctcgact ctgatggctc aggcacttct     720

tccgaatgtg tttcttccac cattggtgcc gaaagaatcg ctaccgcaac tgcttggttg     780

aaggcgaata acaaacgagg gattctgggc gagttcgcgg ggggtgtgaa tacgcagtgt     840

cagactgctg tgatgggttt gcttgatgct ttggtcacgg ataaggcggt ttggatgggg     900

gctttgtggt ggggtggtgg accgtggtgg ggagattaca gttttgggat ggaggctggg     960

agtggggttg gggcttatga gggatacatt gatattttaa caaagtatgt gtag          1014

其中，信号肽的碱基序列为：“ATGCGCTTCT CAACCCCCCT CCTCGCCACAAGCCTCATGG CTTCAGTCTT TGGA”。因此，编码成熟纤维素酶的基因序列如SEQID NO.5所示：

tcaccagtca taaccaccaa acgctcaaac tcaagtacct tccaattttt cggcgtcaac      60

gaatcaggcg ctgaattcgg acaaaccaac atccccggta ctctaggaac agactacaca     120

tggccctcca caaccgccat cggaactttg atggataaag ggatgaacac cttccgaatc     180

gccttcctca tggaacggct cgctcagaat agcatgacgg ctacccttga cgcaacatac     240

ctcgccgatc tccgcaaggt tgtggaatac atcactggga ggggaggcta tgcggtttta     300

gatccacata actttgggag gtatgctggg agtgtgatta cttccaccgc ggattttggg     360

actttttggg cgaatgttgc aagccagttt aaggatgatg agaaggtggt gtttgattgt     420

aataatgagt ttcatgatat gccgtcgaat gatttggtta gggggttgaa tcaggcttgt     480

gttgatgggg tgaggggtgc tggtgcgacg gagcagtgga tttttgttga aggaacttct     540

tacacgggag catggacatg ggtatcttcc ggaaatggcg acgcccttat ttcacttacc     600

gatccatctg ataaaatcgt ttatgagatg catcaatatc tcgactctga tggctcaggc     660

acttcttccg aatgtgtttc ttccaccatt ggtgccgaaa gaatcgctac cgcaactgct     720

tggttgaagg cgaataacaa acgagggatt ctgggcgagt tcgcgggggg tgtgaatacg     780

cagtgtcaga ctgctgtgat gggtttgctt gatgctttgg tcacggataa ggcggtttgg     840

atgggggctt tgtggtgggg tggtggaccg tggtggggag attacagttt tgggatggag     900

gctgggagtg gggttggggc ttatgaggga tacattgata ttttaacaaa gtatgtgtag     960

DNA序列与cDNA序列比对分析结果表明：纤维素酶Cel5A的结构基因cel5A全长1,168bp，含有2个内含子，其序列分别为：592-640bp和974-1,078bp，cDNA长1041bp。

本发明还提供了包含上述纤维素酶基因cel5A的重组载体，优选为pPIC9-cel5A。将本发明的纤维素酶编码基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将去除信号肽的纤维素酶基因***到质粒pPIC9上的SnaB I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-cel5A。

本发明还提供了包含上述纤维素酶基因的重组菌株，优选为重组毕赤酵母菌株GS115/cel5A。

本发明还提供了一种制备上述宽pH范围纤维素酶Cel5A的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶Cel5A的表达；以及

3)回收并纯化所表达的纤维素酶Cel5A。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞、大肠杆菌细胞或丝状真菌细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GSll5/cel5A。

本发明还提供了上述宽pH范围纤维素酶Cel5A的应用，优选其在水解纤维素及该酶在饲料、食品、医药、造纸及纺织行业的应用。

本发明提供了一个新的纤维素酶基因，其编码的纤维素酶具有宽的pH适性范围，该纤维素酶具有极好的耐热性，可应用于动物及鱼类的饲料工业，应用于食品、医药等工业，同时还可以应用于造纸及纺织印染行业。

附图说明

图1重组纤维素酶的SDS-PAGE分析；M.Marker；1.发酵液上清；2.纯化纤维素酶Cel5A；3.去糖基化纤维素酶Cel5A。

图2纤维素酶Cel5A的最适pH曲线。

图3纤维素酶Cel5A的pH稳定性曲线。

图4纤维素酶Cel5A最适温度曲线。

图5纤维素酶Cel5A在50℃和60℃条件下的热稳定性曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。

以下实施例采用的实验材料如下：

1、菌株及载体：大肠杆菌(Escherichia coli)Trans1感受态细胞购自北京全式金公司，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，pPIC9载体菌均购自Invitrogen公司，BisporaantennataCBS 126.38购自皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Centraalbureauvoor Schimmelcultures，Netherlands)。

2、试剂盒、工具酶和生化试剂：DNA回收试剂盒为TakaRa公司产品，蛋白分子量Marker购自Fermentas公司，实验所用的各种限制性内切酶和Taq酶均购自TakaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，纤维素酶底物为Sigma公司产品，其它化学试剂均为国产分析纯试剂。

3、培养基：

大肠杆菌培养基为LB培养基：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0；

YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

MD固体培养基：YNB 13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4×10^-4g/L，琼脂粉20g/L；

BMGY培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，酵母氮源(YNB)13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甘油10mL/L；

BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油外，其余成份与BMGY相同。

实施例1真菌Bispora antennata CBS 126.38的产酶特性试验

将Bispora antennata CBS 126.38经麦芽提取物培养基培养后，接种于诱导培养基中(0.2％ MgSO₄·7H₂O，0.1％ KH₂PO₄，0.1％ CuSO₄·5H₂O，0.1％ CaCl₂，0.5％蛋白胨，1％玉米芯粉，1％麸皮，pH 5.0)，30℃培养3～4d，测定其产纤维素酶和半纤维素酶的活性。经测定该菌为高产纤维素酶菌株。

实施例2真菌Bispora antennata CBS 126.38纤维素酶编码基因cel5A的克隆

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据糖苷水解酶第基因保守序列(YEM/FHQYLD和WWAG/AGPW)设计合成了兼并引物P1(5′-TAYGARWTBCAYCARTAYCTNGA-3′)，P2(5′-CCATGGNCCNCCNGCCCACCA-3′)(其中：Y＝C/T，R＝A/G，B＝C/G/T，W＝A/T，N＝A/T/G/C)。以Bisporaantennata CBS 126.38总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃ 5min；94℃ 30sec，55-45℃ 30sec(其中每个循环后复性温度下降1℃)，72℃ 1min，10个循环，然后进入第二个循环程序：94℃ 30sec，45℃ 30sec，72℃ 1min，25个循环后；72℃ 10min，琼脂糖电泳检测。得到一约250bp片段，将该片段回收后与pEASY-T₃载体相连并测序。

根据测定序列结果，在NCBI的GenBank中利用BLASTX[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]进行序列比对，初步判断该基因片段是纤维素酶基因片段，并进行该片段的相似性研究。该片段长与Aspergillus aculeatus来源的纤维素酶FII-CMCase的序列一致性最高为73％。

根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物：

U1(5′-CATCCAAACCGCCTTATCCGTGACCAAAGC-3′)，

U2(5′-GCAAACCCATCACAGCAGTCTGACACTGC-3′)，

U3(5′-CACATTCGGAAGAAGTGCCTGAGCCATCAG-3′)；

D1(5′-GCATCAATACCTGGACTCTGATGGCTCAGG-3′)，

D2(5′-CCGAATGTGTTTCTTCCACCATTGGTGCCG-3′)，

D3(5′-GGGTTTGCTTGATGCTTTGGTCACGGATAAGG-3′)。

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列进行拼接得到cel5A全长基因。经序列分析表明，该基因DNA全长为一个长1168bp的基因片段(SEQ ID NO.3)。

实施例3纤维素酶基因的cDNA序列的获得

提取Bispora antennata CBS 126.38的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物Cel5AF(5′-ATGCGCTTCTCAACCCCCCTCCTCGC-3′)和Cel5AR(5′-CTACACATACTTTGTTAAAATATCAATGTATCCCTCATAAGCCC-3′)扩增该单链cDNA，获得纤维素酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

通过比较纤维素酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因纤维素酶的基因组DNA序列和cDNA序列分析结果表明，纤维素酶Cel5A的结构基因全长1,168bp，含有2个内含子，其序列分别为：592-640bp和974-1,078bp，cDNA长1041bp。N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列。纤维素酶Cel5A cDNA序列编码蛋白与GeneBank上的序列进行同源比较发现，其与来源于Sclerotinia sclerotiorum 1980的假定蛋白的序列一致性最高为63％，与Thermoascus aurantiacus的纤维素酶EGI的序列一致性最高为55.3％。

实施例4重组表达载体的构建

根据cDNA序列设计表达引物：

F：5′-GGGTACGTATCACCAGTCATAACCACCAA-3′；

R：5′-GGGGCGGCCGCCTACACATACTTTGTTAAAA-3′；

在表达引物的末端分别引入内切酶SnaBI和NotI酶切位点，以纤维素酶的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到纤维素酶Cel5A成熟蛋白的编码序列。将表达载体pPIC9进行双酶切(SnaBI+NotI)，同时将纤维素酶成熟蛋白的编码的基因cel5A双酶切(SnaBI+NotI)，并与表达载体pPIC9连接，转化大肠杆菌Trans1感受态细胞，经PCR验证阳性克隆送测序，从而得到含有Bispora antennata CBS 126.38纤维素酶基因的重组质粒pPIC9-cel5A。同样，将包含有信号肽序列的纤维素酶Cel5A的cDNA通过酶切、连接方法***已去除α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9中，获得含信号肽序列的编码纤维素酶的基因cel5A的重组质粒pPIC-cel5A-1。

实施例5高效表达的重组菌株的获得

分别将重组载体pPIC9-cel5A和pPIC-cel5A-1经BglII线型化后转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板，3天后待菌落长出，用灭过菌的牙签分别从长有两种转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MM上，再点到相应编号的MD平板上30℃培养1～2天，至菌落长出。将MD平板上能正常生长的两种转化子分别接种于装有5mL BMGY培养基的离心管中，30℃、260rpm摇床培养48h后离心去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、260rpm诱导培养48h后，离心取上清用于酶活性检测，从中分别筛选出具有纤维素酶活性的两种转化子。获得重组毕赤酵母菌株GS115/cel5A和GS115/cel5A-1。分别筛选出有酶活的经两种载体转化的菌株，共挑取100个克隆，其中33个测到纤维素酶活，阳性率为33％。

实施例6重组纤维素酶的活性分析

采用DNS比色法测还原糖含量。取4支试管，其中一支作为对照，对照只加入900ul 1％羧甲基纤维素钠(CMCNa)底物，另外三支平行样品要加入100uL酶液和900uL 1％ CMC底物，将其置于50℃水浴10min，之后在样品和对照中均加入1.5mL DNS，沸水浴5min，在540nm测定其OD值。

纤维素酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解羧甲基纤维素钠生成1μmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(IU)。

实施例7重组纤维素酶Cel5A的制备及纯化

重组纤维素酶Cel5A的制备：将筛选到的经上述两种载体各自转化的高表达菌株分别接种于装有200mL BMGY培养基的1000mL三角瓶，30℃，250-280rpm摇床培养2天，培养液3250rpm离心5min，取沉淀(尽量将上清除尽)，加入100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，重新在30℃，250-280rpm诱导培养。为补偿甲醇的挥发损失，菌液中每隔12h补加甲醇溶液，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，直至48h，将菌体离心，取上清发酵液。测定纤维素酶的活力。重组菌株GS115/cel5A的重组纤维素酶的表达量约为20U/mL，相比之下，重组菌株GSll5/cel5A-1的重组纤维素酶的表达量低于前者。

毕赤酵母诱导产生的纤维素酶Cel5A过分子筛纯化，取活性峰经SDS-PAGE检测得到单一条带，分子量约为21.7kDa与预测分子量相当(见图1)。

实施例8纤维素酶Cel5A的酶学性质测定

1、重组纤维素酶Cel5A的最适pH和pH稳定性的测定

经纯化的纤维素酶Cel5A在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 3.0-8.0的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和pH 9.0-11.0的0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。纯化的纤维素酶Cel5A在不同pH值的缓冲体系，37℃下测定的pH适性结果(见图2)表明：Cel5A的最适作用pH为5.0，在pH 4.0-7.0保持50％以上的酶活性。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于常温下处理1h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性，结果(见图3)表明：Cel5A在pH范围为4.0-10.0间都很稳定，保持80％以上的酶活。

2、重组纤维素酶Cel5A的最适温度和热稳定性的测定

在pH 5.0的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液体系及不同的温度(0-70℃)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(见图4)表明，Cel5A的最适作用温度50℃，温度高于60℃时仍有40％左右的酶活。

测定纤维素酶在不同温度(50℃，60℃)下分别保温10、20、30、40、50、60分钟时的相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。结果在50℃下处理60min后仍有90％以上的酶活，热稳定性好(见图5)。

Claims (9)

1.一种宽pH范围纤维素酶Cel5A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。

2.一种宽pH范围纤维素酶基因cel5A，其特征在于，编码权利要求1所述的宽pH范围纤维素酶Cel5A。

3.根据权利要求2所述的宽pH范围纤维素酶基因cel5A，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示。

4.包含权利要求2或3所述宽pH范围纤维素酶基因cel5A的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-cel5A。

6.包含权利要求2或3所述宽pH范围纤维素酶基因cel5A的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。

8.一种制备宽pH范围纤维素酶Cel5A的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶Cel5A的表达；以及

3)回收并纯化所表达的纤维素酶Cel5A。

9.权利要求1所述宽pH范围纤维素酶Cel5A的应用。

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