CN102399293B

CN102399293B - 一种与纤维蛋白特异结合的重组蛋白及其应用

Info

Publication number: CN102399293B
Application number: CN2011103226576A
Authority: CN
Inventors: 戴建武; 赵文学
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2008-06-03
Filing date: 2008-06-03
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2028-06-03
Also published as: CN102399293A

Abstract

本发明公开了一种与纤维蛋白特异结合的重组蛋白及其应用。该蛋白是将如下a)或b)或c)或d)的多肽作为融合伙伴融合到目的蛋白的氨基末端得到的融合蛋白：a)由序列表中序列2自氨基末端第22-107位所示的氨基酸序列组成的多肽；b)由序列表中序列4自氨基末端第22-109位所示的氨基酸序列组成的多肽；c)将a)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与纤维蛋白特异结合的由a)衍生的多肽；d)将b)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与纤维蛋白特异结合的由b)衍生的多肽。本发明的与纤维蛋白特异结合的重组蛋白可用于创伤修复和活性组织诱导再生。

Description

一种与纤维蛋白特异结合的重组蛋白及其应用

本申请是申请号为200810114495.5、申请日为2008年06月03日、发明创造名称为“一种与纤维蛋白特异结合的重组蛋白及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种与纤维蛋白特异结合的重组蛋白及其应用。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一个很强的有丝***原，能促进多种中胚层来源的细胞包括成纤维细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖，因此有望用来进行治疗性血管再生和损伤修复。内源性的bFGF通常在损伤和缺血过程中往往不足以快速促进血管新生以及损伤修复。注射重组bFGF能改善损伤以及肢体和心肌缺血过程中血管新生和血液循环，然而目前重组bFGF的使用受限制的原因之一在于重组bFGF在体内快速扩散，导致治疗部位的重组bFGF积累低，药物难以持续作用(Rinsch，C.，et al.(2001).Delivery of FGF-2but not VEGF by encapsulated genetically engineered myoblasts improvessurvival and vascularization in a model of acute skin flap ischemia.Genetherapy 8：523-533.)。因此，采用以位点特异和可持续的方式应用bFGF的新方法就显得非常必要。定向治疗或者靶向治疗(targeted therapy)，是一种非常有效的给药方法，这种方法通过药物与治疗部位的分子靶标特异的相互作用提高治疗效果，降低副作用(Sawyers，C(2004)Targeted cancer therapy.Nature 432：294-297.Garrett，C(2005)Targeted therapy：the fast pace of progress.Cancer Control 12：71-72.)。靶向治疗很关键的一点就是寻找特异的分子靶标。大多数损伤都伴随着血管破裂、出血并随后形成血浆凝集物(plasma clot)，这种血浆凝集物的主要成分是纤维蛋白(fibrin)，也是血栓的主要成分(Wu，S.C.，Castellino，F.J.，and Wong，S.L.(2003).A fast-acting，modular-structuredstaphylokinase fusion with Kringle-1from human plasminogen as thefibrin-targeting domain offers improved clot lysis efficacy.The Journalof biological chemistry 278：18199-18206.)。这种凝集物的微观结构为一种多孔的三维结构，是损伤修复的天然支架(Wu，S.C.，et al(2002)Functionalproduction and characterization of a fibrin-specific single-chain antibodyfragment from Bacillus subtilis：effects of molecular chaperones and awall-bound protease on antibody fragment production.Applied andenvironmental microbiology 68：3261-3269.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种与纤维蛋白特异结合的重组蛋白及其应用。

本发明所提供与纤维蛋白特异结合的重组蛋白，是将如下a)或b)或c)或d)的多肽作为融合伙伴融合到目的蛋白的氨基末端得到的重组蛋白：

a)由序列表中序列2自氨基末端第22位-第107位所示的氨基酸序列组成的多肽；

b)由序列表中序列4自氨基末端第22位-第109位所示的氨基酸序列组成的多肽；

c)将a)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与纤维蛋白特异结合的由a)衍生的多肽。

d)将b)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与纤维蛋白特异结合的由b)衍生的多肽。

a)和b)的多肽分别是Kringle1和Kringle4结构域。

为了使本发明的重组蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)或d)中的重组蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)或d)中的重组蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第1-828位或序列3自5′末端第1-834位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

其中，所述目的蛋白可为能诱导组织再生和创伤修复的因子。能诱导组织再生和创伤修复的因子包括FGF(成纤维细胞生长因子)、BMP3(骨形成蛋白3)、PDGF(血小板衍生生长因子)、EGF(表皮生长因子)、TGF(转化生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、NGF(神经生长因子)或NT3/4(神经营养因子3/4)。

本发明中所述目的蛋白具体为碱性成纤维细胞生长因子。

为了便于分离和纯化本发明的能与纤维蛋白特异结合的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基末端还加入了组氨酸标签；为了保证重组蛋白的正确折叠，Kringle1蛋白或Kringle4蛋白与目的蛋白间还加入了连接肽。

加入组氨酸标签和连接肽后的重组蛋白具体可为如下1)至4)中任一种蛋白：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与纤维蛋白特异结合的由1)衍生的蛋白质；

4)将2)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与纤维蛋白特异结合的由2)衍生的蛋白质。

上述将1)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与纤维蛋白特异结合的由1)衍生的蛋白质具体可为将组氨酸标签和组氨酸标签前的多肽缺失且能与纤维蛋白特异结合的由1)衍生的蛋白质，即氨基酸序列为自序列2的氨基末端第11-276位的蛋白质。

上述将2)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与纤维蛋白特异结合的由2)衍生的蛋白质具体可为将组氨酸标签和组氨酸标签前的多肽缺失且能与纤维蛋白特异结合的由2)衍生的蛋白质，即氨基酸序列为自序列4的氨基末端第11-278位的蛋白质。

其中，序列表中序列2由276个氨基酸组成，自氨基末端第5-第10位为组氨酸标签，自氨基末端第22-第107位为Kringle1蛋白，自氨基末端第123-第276位为bFGF蛋白，自氨基末端第108-第122位为连接肽；序列表中序列4由278个氨基酸组成，自氨基末端第5-第10位为组氨酸标签，自氨基末端第22-第109位为Kringle4蛋白，自氨基末端第125-第278位为bFGF蛋白，自氨基末端第110-第124位为连接肽。

所述重组蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

其中，所述重组蛋白的编码基因具体可为①至④中任一所述的基因；

①其核苷酸序列是序列表中序列1；

②其核苷酸序列是序列表中序列3；

③在严格条件下与①或②限定的DNA片段杂交且编码能与纤维蛋白特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的DNA分子；

④与①或②的基因具有90％以上的同源性，且编码能与纤维蛋白特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的DNA分子。

所述步骤④中的基因，与①或②的基因最好有95％以上的同源性。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中序列1由828个脱氧核糖核苷酸组成，自5′末端第14位-第30位为编码(His)₆短肽的核苷酸序列，自5′末端第64位-第321位Kringle1结构域，自5′末端第367位-第828位为编码碱性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列，自5′末端第322-第366位为连接序列；序列表中序列3由834个脱氧核糖核苷酸组成，自5′末端第14位-第30位为编码(His)₆短肽的核苷酸序列，自5′末端第64位-第327位Kringle4结构域，自5′末端第373位-第834位碱性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列，自5′末端第328-第372位为连接序列。

含有所述编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明所述的重组蛋白可用来制备促进血管新生药物，如可将所述的重组蛋白与纤维蛋白支架结合形成复合物，将该复合物应用到没有天然血浆凝集物的病例中促进血管新生。本发明所述的重组蛋白也可单独应用促进血管新生。

本发明把纤维蛋白作为能诱导组织再生和创伤修复的因子的靶标，纤维蛋白不仅在细胞结构和信号传递中起重要作用，同时也在某些疾病中特异表达。为使能诱导组织再生和创伤修复的因子特异结合到纤维蛋白，本发明把它们与纤维蛋白结合区(Kringle1和Kringle4结构域)融合，得到的重组蛋白(K1bFGF和K4bFG)能与纤维蛋白特异结合。与细胞基质中的纤维蛋白特异结合的重组蛋白能更持久地停留在治疗部位，并以持续释放的方式起作用。这种方法避免了单独使用能诱导组织再生和创伤修复的因子的低靶标特异性，以及多次-高剂量的给药方式等缺点，从而显著增强治疗性血管化的效果。重组蛋白K1bFGF和K4bFG与外源的纤维蛋白结合后还适合于没有天然纤维蛋白基质的病例。外源的纤维蛋白也能特异结合K1bFGF和K4bFG形成多功能的修复体系，一方面可以以定点、持续的方式提供再生信号分子，同时外源的支架材料也为细胞增殖和组织再生提供了三维空间。构建的纤维蛋白/重组K1bFGF和K4bFG在动物模型中能显著增强血管新生，促进细胞增殖和组织再生，并改善修复质量。因此重组蛋白K1bFGF和K4bFG结合相应的细胞基质有望改善多种缺血疾病的治疗，如大面积溃疡、肢体缺血和心肌缺血。本发明的与纤维蛋白特异结合的重组蛋白可以用于创伤修复和利用纤维蛋白作为支架的活性组织诱导再生；且为将来的治疗性血管新生在临床上的实践提供了新的方法。

附图说明

图1为重组蛋白的结构示意图。(His)₆是用于纯化的亲和标签；Kringle，代表K1和K4，是纤维蛋白结合区；bFGF是有丝***原和促血管发生效应等的功能区

图2为重组蛋白表达、纯化和鉴定

A和C中，1：分子量标记，2：天然bFGF总蛋白；3：天然bFG培养液上清；4：天然bFG纯化后的蛋白；5：K1bFGF总蛋白；6：K1bFGF培养液上清；7：K1bFGF纯化后的蛋白；8，转空白载体的对照。

B和D中，1：分子量标记，2：天然bFGF总蛋白；3：天然bFG培养液上清；4：天然bFG纯化后的蛋白；5：K4bFGF总蛋白；6：K4bFGF培养液上清；7：K4bFGF纯化后的蛋白；8，转空白载体的对照。

图3为K1bFGF、K4bFGF和bFGF分别对人成纤维细胞的促增殖曲线

图4为ELISA方法测试K1bFGF、K4bFGF和bFGF与血浆凝集物和纤维蛋白的结合能力

图5为手术后第5天K1bFGF和K4bFG促进皮下血管新生

(A)PBS；(B)bFGF；(C)K1bFGF；(D)K4bFGF。

图6为H&E染色法评价皮肤切口愈合速度和质量

图7为重组蛋白结合纤维蛋白促进血管新生

具体实施方式

实施例1、制备重组K1bFGF和K4bFGF蛋白

1)Kringle1和Kringle4的获得

通过引物K1-1、K1-2、K1-3、K1-4和K1-5的互补序列互补结合扩增Kringle1片段。

引物的加入顺序为：第一次扩增使用K1-1、K1-2，第二次使用K1-3、K1-4，第三次使用K1-1、K1-5。

引物K1-1、K1-2、K1-3、K1-4和K1-5的序列如下：

K1-1：5’-AGA GGG ACG ATG TCC AAA ACA AAA AAT GGC ATC ACC TGT CAA AAATGG AGT TCC ACT TCT CCC CAC AGA CCT AGA TTC TCA CCT-3’；

K1-2：5’-CCT GCG GAT CGT TGT CTG GAT TCC TGC AGT AGT TCT CCT CCA GTCCCT CTG AGG GGT GTG TAG CAG GTG AGA ATC TAG GTC TGT-3’；

K1-3：5’-TAT CTC TCA GAG TGC AAG ACT GGG AAT GGA AAG AAC TAC AGAGGGACG ATG TCC AAA AC-3’：

K1-4：5’-CAT ATC TCT TTT CTG GAT CAG TAG TAT AGC ACC AGG GCC CCT GCGGAT CGT TGT CTG GA-3’；

K1-5：5’-TTC CTC TTC ACA CTC AAG AAT GTC GCA GTA GTC ATA TCT CTT TTCTGG ATC A-3’。

通过引物K4-1、K4-2、K4-3、K4-4和K4-5的互补序列互补结合扩增Kringle4片段。

引物的加入顺序为：第一次扩增使用K4-1、K4-2，第二次使用K4-3、K4-4，第三次使用K4-1、K4-5。

引物K4-1、K4-2、K4-3、K4-4和K4-5的序列如下：

K4-1：5’-GGC ACA TCC TCC ACC ACC ACC ACA GGA AAG AAG TGT CAG TCT TGGTCA TCT ATG ACA CCA CAC CGG CAC CAG AAG ACC CCA GAA-3’；

K4-2：5’-AGG GGC CTT TAT CGG CAT CTG GAT TCC TGC AGT AGT TCA TTG TCAGGC CAG CAT TTG GGT AGT TTT CTG GGG TCT TCT GGT GCC-3’；

K4-3：5’-GTC CAG GAC TGC TAC CAT GGT GAT GGA CAG AGC TAC CGA GGC ACATCC TCC ACC ACC AC-3’；

K4-4：5’-AGT ACT CCC ACC TGA CGC TGG GGT CTG TGG TAA AAC ACC AGG GGCCTT TAT CGG CAT CT-3’；

K4-5：5’-AAC ACT CGC TTC TGT TCC TGA GCA TTT TTT CAG GTT GCA GTA CTCCCA CCT GAC GCT G-3’。

回收并纯化260bp左右的Kringle1和Kringle4的DNA片段。

2)构建pET28a-6His-K1bFGF和pET28a-6His-K4bFGF表达载体

用NdeI和KpnI分别双酶切Kringle1和Kringle4片段，回收纯化后，分别***到pET28a-(His)₆-bFGF表达载体(Novagen)的NdeI和KpnI酶切位点，获得重组表达载体pET28a-6Hi s-K1bFGF和pET28a-6Hi s-K4bFGF。

用NdeI和KpnI分别双酶切pET28a-6His-K1bFGF和pET28a-6His-K4bFGF，获得6His-K1bFGF和6His-K4bFGF片段，回收后分别连入pMD18-T载体中，获得pMD18-T-6His-K1bFGF和pMD18-T-6His-K4bFGF载体，分别进行测序，测序结果表明6His-K1bFGF的DNA片段具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，由828个脱氧核糖核苷酸组成，自5′末端第14位-第30位为编码(His)₆短肽的核苷酸序列，自5′末端第64位-第321位Kringle 1结构域，自5′末端第367位-第828位为编码碱性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列，自5′末端第322-第366位为连接序列。序列表中序列1自5′末端第1-828位为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白。序列表中序列2由276个氨基酸组成，自氨基末端第5-第10位为组氨酸标签，自氨基末端第22-第107位为Kringle1蛋白，自氨基末端第123-第276位为bFGF蛋白，自氨基末端第108-第122位为连接肽。

按照上述方法将6His-K4bFGF的DNA片段进行测序，测序结果表明，His-K4bFGF的DNA片段具有序列表中序列3所示的核苷酸序列，由834个脱氧核糖核苷酸组成，自5′末端第14位-第30位为编码(His)₆短肽的核苷酸序列，自5′末端第64位-第327位Kringle4结构域，自5′末端第373位-第834位碱性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列，自5′末端第328-第372位为连接序列。序列表中序列3自5′末端第1-834位为编码序列，编码序列表中序列4所示的蛋白。序列表中序列4由278个氨基酸组成，自氨基末端第5-第10位为组氨酸标签，自氨基末端第22-第109位为Kringle4蛋白，自氨基末端第125-第278位为bFGF蛋白，自氨基末端第110-第124位为连接肽。

将重组表达载体pET28a-6His-K1bFGF和pET28a-6His-K4bFGF分别转入大肠杆菌BL21(D3)中，得到重组菌BL21(D3)-K1bFGF和BL21(D3)-K4bFGF。

3)表达纯化重组蛋白K1bFGF和K4bFGF

重组菌BL21(D3)-K1bFGF和BL21(D3)-K4bFGF分别接种于10ml新鲜的LB培养基，在37℃，200rpm培养12小时左右，然后按2％(体积百分比)的比例将培养的重组菌BL21(D3)-K1bFGF和BL21(D3)-K4bFGF分别接种到150ml新鲜LB培养基，在37℃，200rpm培养3小时左右，当OD₆₀₀达到0.6-0.8，加入诱导物IPTG(IPTG终浓度1mM)诱导。8000g离心10min收集沉淀。用15mlPBS(含0.5M NaCl)溶解上述收集的沉淀，超声破碎，13000g离心30分钟，分离上清，0.45um滤膜过滤上清；用琼脂糖-Ni²⁺柱(购买于Amersham Biosciences公司)纯化。然后进行SDS-PAGE和Western blot，检测蛋白纯度。

Western blot使用anti-his(Sigma)抗体。

实验结果如图2所示，图2A为K1bFGF的SDS-PAGE检测结果，图2C为K1bFGF的Western blot检测结果，表明重组蛋白K1bFGF在大肠杆菌中表达，并经分离和纯化获得重组蛋白K1bFGF；图2B为K4bFGF的SDS-PAGE检测结果，图2D为K4bFGF的Western blot检测结果，表明重组蛋白K4bFGF在大肠杆菌中表达，并经分离和纯化获得重组蛋白K4bFGF。

实施例2、体外验证K1bFGF和K4bFGF的生物学活性

1)重组蛋白有丝***原活性鉴定

用人成纤维细胞测试重组蛋白K1bFGF和K4bFGF的有丝***原活性。

人成纤维细胞按3000个/孔接种到48孔板，用含有10％(体积比)胎牛血清(FBS)、1％(质量比)谷氨酰氨、1％(质量比)非必需氨基酸、100U青霉素/ml和100μg链霉素/ml高糖DMEM培养基(H-DMEM)，在37℃，5％CO₂及饱和湿度下培养24小时。24小时后将培养基的FBS浓度更换成2％(体积比)，其它条件不变。然后向每个培养孔中依次加入终浓度为0、30、120、600、1500和3000pmol/L的K1bFGF或K4bFGF，每个浓度设4个平行样，继续培养3天，向各培养孔中加入终浓度为1mg/ml MTT(methylthiazoletetrazolium，Sigma公司)，37℃继续培养，4小时后弃掉上清，向其中加入400μl二甲亚枫(dimethl sulfoxid)，待充分溶解后，在492nm酶标仪下读取OD值。图3中，纵坐标为OD值的绝对增加值，代表细胞密度的增加量；横坐标为培养基中添加的重组蛋白K1bFGF或K4bFGF的终浓度(μM)，数值以平均值±标准差表示。

实验结果表明，重组蛋白K1bFGF和K4bFGF的活性和天然形式的bFGF没有显著差别。

2)重组蛋白的结合能力的测试

用ELISA方法检测重组蛋白与纯化的人纤维蛋白和兔血浆的结合能力。

a)生长因子与血浆凝集物(plasma clot)的结合实验

(1)分离兔血浆：从健康兔耳中央动脉采血20ml，预先在注射器吸入1/10体积的3.8％(质量百分含量)柠檬酸钠作为抗凝剂。取10ml抗凝兔血100g离心15min，收集上层浑浊液作为富含血小板血浆(PRP)；另取10ml抗凝兔血1500g离心15min，收集上清液作为不含血小板血浆(PPP)，-80℃冻存；

(2)制备血浆凝集物：4℃解冻PPP和PRP；先向96孔板(NUNC公司)每孔加3μl浓缩CaCl₂和thrombin(凝血酶，Roche公司)混合物(CaCl₂终浓度为30mM，thrombin终浓度为1.0NIH unit/ml)，每孔加入50μl PPP或PRP，室温凝固2-3小时，用前PBS洗2次；

(3)向上述制备的血浆凝集物加入不同梯度的K1bFGF、bFGF(0、0.1、1、2、3、4和5uM)100μl/每孔，37℃，60rpm离心2hr；

(4)用PBS洗(3)中的沉淀4次，加封闭液(含有质量百分数为2.5％BSA+体积百分数为0.1％Tween20的PBS溶液)，100μl/每孔，37℃，60rpm离心1.5hr；

(5)用PBS洗(4)中的沉淀4次，加一抗(anti-hi s，用PBS按体积比为1∶2000稀释，Sigma公司)，100μl/每孔，37℃，60rpm离心100分钟；

(6)用PBS洗(5)中的沉淀4次，加二抗(anti-mouse IgG，用PBS按体积比为1∶10000稀释，Sigma公司)，100μl/每孔，37℃，60rpm离心1hr；

(7)用PBS洗(6)中沉淀4次，加AP显色底物溶液对-硝基苯磷酸(P-NPP，Amersham)(2mg/ml)，80μl/每孔，避光反应8.5分钟，加等体积0.2M NaOH终止反应。

8)取100μl(7)中终止反应后的溶液，用酶标仪测定405nm下的OD值。

b)生长因子与纤维蛋白(fibrin)的结合实验

1)实验所用干粉人纤维蛋白原从华兰生物工程股份有限公司购买(商品名康普欣)，每毫克该样品含0.125IU凝血因子XIII。用PBS配成100μg/ml的溶液，按100μl/每孔加入96孔酶标板，4℃过夜吸附；

2)次日将过夜包被的酶标板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3％(质量百分比)BSA(用PBS配制不含Tween20，)封闭，100μl/每孔，37℃，60rpm离心1.5小时；

3)用PBS彻底洗2)中的沉淀4次后加入凝血酶溶液1NIH unit/ml(无菌双蒸水配制，含30mM CaCl₂)，100μl/每孔，37℃，60rpm离心2小时；

4)用PBS彻底洗3)中的沉淀4次后加入不同浓度的bFGF、K1bFGF或K4bFGF(0、0.2、0.5、1、2、3、4、5μM)，100μl/每孔，37℃，60rpm离心2.5小时；

5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加一抗(anti-hi s，用PBS按体积比为1∶2000稀释)。100μl/每孔，37℃，60rpm离心1.5小时；

6)用PBS洗5)中的沉淀4次，加二抗(anti-mouse IgG，用PBS按体积比为1∶10000稀释)，100μl/每孔，37℃，60rpm离心1hr；

7)用PBS洗6)中的沉淀4次，加AP显色液P-NPP(2mg/ml)，80μl/每孔，避光反应8.5分钟，加等体积0.2M NaOH终止反应。

8)取100μl(7)中终止反应后的溶液100μl，用酶标仪测定405nm下的OD值。

实验结果如图4所示，表明K1bFGF和K4bFGF的纤维蛋白结合能力要显著高于天然形式的bFGF(Sigma，106096-93-9)。

图4中，A为K1bFGF、K4bFGF和bFGF分别与纤维蛋白的结合曲线，B为K1bFGF、K4bFGF和bFGF分别与血浆凝集物的结合曲线。横坐标代表重组蛋白的浓度，纵坐标表示结合在纤维蛋白或血浆凝集物上的重组蛋白的相对量；“**”代表p＜0.005；“***”，p＜0.001；数据表示为平均值±标准差。

实施例3、重组蛋白在动物体内的功能评价

1)K1bFGF和K4bFG在大鼠皮肤随机缺血模型中的效应评价

大鼠皮肤随机缺血模型(the model of random skin flap)可用来检测血管的新生。由于该模型中有血浆凝集物(plasma clot)形成，可把重组蛋白直接应用到该模型中然后观察血管新生的状况。

重组蛋白应用到大鼠皮肤随机缺血模型的方法如下：

1)动物模型：大鼠“随机皮肤盖”(random pattern skin flap)，雄性Wistar大鼠，180g左右，按40mg/kg体重的剂量从腹腔注射(i.p.)戊巴比妥钠进行麻醉；去除背毛，酒精消毒；在背部剪4个15*15mm²的以两侧为基础的皮肤盖；

2)分别将580pmol(约相当于10μg天然bFGF)量的K1bFGF和bFGF涂布到创面。每个样品的位置在不同大鼠中不同，以消除位置的影响；

3)缝合伤口，每个开口侧面缝一针；

4)术后大鼠在清洁级动物房喂养；

5)术后5天，给大鼠注射过量麻醉剂处死，将整个皮肤背部皮肤从背脊线向两边解剖开，观察记录血管新生的表观状况。

实验分四组：对照组、K1bFGF组、K4bFG组和bFGF组。

对照组用PBS处理大鼠5天；K1bFGF组用K1bFGF处理大鼠5天；K4bFGF组用K4bFGF处理大鼠5天；bFGF组用bFGF处理大鼠5天。每组5处理5只大鼠，实验重复3次。

实验结果如图5所示，表明手术后第5天，重组蛋白K1bFGF和K4bFG能显著增强血管的新生，说明重组蛋白能特异结合在创伤位点的血浆凝集物上，增加了局部因子的浓度，从而促进血管的新生。

2)K1bFGF和K4bFGF在大鼠全皮肤切口模型中的效应评价

全皮肤切口模型(full-skin incision model)是用来评价损伤愈合的经典模型，把重组蛋白K1bFGF和K4bFGF直接应用到该模型中，可评价重组蛋白K1bFGF和K4bFGF对损伤愈合的影响。

重组蛋白应用到全皮肤切口模型中的方法如下：

1)动物模型：全皮肤切口(full skin incision)，雄性Wistar大鼠，200g左右，按40mg/kg体重的剂量从腹腔注射(i.p.)戊巴比妥钠进行麻醉；去除背毛，酒精消毒；在裸露区用手术剪剪开4个2cm长的全皮肤切口；

2)分别用300pmol(约相当5μg天然形式bFGF)的K1bFGF、K4bFGF和bFGF以及PBS处理切口，不缝合；

3)术后大鼠在清洁级动物房喂养；

4)在手术后1、3、6周，给动物注射过量麻醉剂处死，以切口为中线将两侧1.5cm以内的全皮肤剪下，再从与切口垂直的方向将样品一分为二。其中一份用4％甲醛固定用于组织学分析，另一份用预冷的PBS保存并及时进行撕裂强度测试。

撕裂强度测试方法如下：

1)仪器：数字力学测量仪(Instron 5848microtester，Japan)，测量范围和精度为1000±0.01N；

2)将样品两端分别用测量仪的移动臂和固定臂上的夹具固定，移动臂以10mm/s的恒定速度牵拉皮肤样品。样品从切口中线拉断所需最大力由电脑记录；

3)每组有5个样本，每个样本的最大力即代表撕裂强度，用于统计学分析。

实验分四组：对照组、K1bFGF组、K4bFGF组和bFGF组。

对照组用PBS处理大鼠一周；K1bFGF组用K1bFGF处理大鼠一周；K4bFGF组用K4bFGF处理大鼠一周；bFGF组用bFGF处理大鼠一周。每组5处理5只大鼠，实验重复3次。

实验结果如图6所示，处理1周后使用重组蛋白K1bFGF或K4bFGF的切口，其表皮再生和肉芽组织形成的速度要高于对照组和使用bFGF组，统计结果显示有显著差异。处理6周后，重组蛋白K1bFGF或K4bFGF处理组的皮肤撕裂强度要显著高于对照组和bFGF处理组，表明重组蛋白K1bFGF或K4bFGF处理组修复质量要高于对照组和bFGF处理组。

图6中，A-D为组织学方法评价表皮新生(箭头)和肉芽(GT)形成，A：PBS处理1周表皮新生(箭头)和肉芽(GT)形成；B：bFGF处理1周表皮新生(箭头)和肉芽(GT)形成；C：K1bFGF处理1周表皮新生(箭头)和肉芽(GT)形成；D：K4bFGF处理1周表皮新生(箭头)和肉芽(GT)形成。虚线表示切口原始边界，标尺，100μm。E-H为H&E染色分析胶原沉积和瘢痕形成，E：PBS处理6周；F：bFGF处理6周；G：K1bFGF处理6周；H：K4bFGF处理6周。虚线表示瘢痕边线，标尺，100μm。I：量化分析1周肉芽组织形成。J：量化分析6周瘢痕面积，数值以平均值±标准误表示(n＝5)。K：撕裂强度随时间的变化，数值以平均值±标准误表示(n＝5)，“*”代表p＜0.05。

上述实验结果表明重组蛋白K1bFGF和K4bFGF能显著加速损伤愈合，改善修复质量。说明重组K1bFGF和K4bFGF能与创伤处的天然纤维蛋白特异结合达到促进血管新生的目的。

3)K1bFGF和K4bFGF与纤维蛋白支架结合对血管再生的效应

纤维蛋白是一种优良和成熟的生物材料，将重组蛋白和生物材料结合再移植到大鼠皮下来评价对血管再生的影响。

重组蛋白与纤维蛋白支架结合对血管再生影响的测试方法如下：

人纤维蛋白原(fibrinogen，FN)从华兰生物公司(河南，新乡)购买，其中含有凝血因子XIII，0.125U/mg人纤维蛋白原；

2)用PBS溶解人纤维蛋白原(溶解前先将PBS和FN在水浴锅中预热到37℃再将二者混合)。纤维蛋白凝胶有FN溶液、凝血酶和CaCl₂混合凝聚而成，三者的终浓度依次为：50mg/ml、20IU/ml、40mM。操作时先将浓缩的凝血酶和CaCl₂溶液按比例加入48孔板的孔中，然后取200μl FN溶液(含870pmol生长因子，约15μg天然形式的bFGF)加入孔中并迅速混匀，37℃恒温箱中放置1小时。

实验分四组：对照组、纤维蛋白支架/K1bFGF组、纤维蛋白支架/K4bFGF组和纤维蛋白支架/bFGF组。

对照组：将纤维蛋白支架/PBS移植大鼠皮下5天；纤维蛋白支架/K1bFGF组：将纤维蛋白支架/K1bFGF移植大鼠皮下5天；纤维蛋白支架/K4bFGF组：将纤维蛋白支架/K4bFGF移植大鼠皮下5天；纤维蛋白支架/bFGF组：将纤维蛋白支架/bFGF移植大鼠皮下5天。每组5处理5只大鼠，实验重复3次。

实验结果如图7所示，表明重组蛋白K1bFGF和K4bFGF处理组中能观察到大量新形成的血管，而对照组中则极少，bFGF处理组中也有新形成的血管，但比重组蛋白K1bFGF和K4bFGF处理组少，统计结果有显著差异。

图7中，A：纤维蛋白支架/PBS；B：纤维蛋白支架/bFGF；C：纤维蛋白支架/K1bFGF；D：纤维蛋白支架/K4bFGF；标尺3mm。

上述结果说明重组蛋白能特异结合纤维蛋白支架从而有效改善血管的再生。

Claims

1.一种重组蛋白，是由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述重组蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述重组蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列3。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。

7.权利要求1所述的重组蛋白在制备促进血管新生药物中的应用。

8.权利要求1所述的重组蛋白与纤维蛋白支架结合形成的复合物。