CN102382187A - Fbxl15蛋白片段及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了FBXL15蛋白片段及其编码基因和应用。本发明公开的蛋白片段，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。所述蛋白片段或其编码基因可用于抑制成骨细胞的分化，对于石骨症的治疗具有潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及FBXL15蛋白片段及其编码基因和应用。
背景技术
蛋白质是构成生命体内细胞和组织的基本物质，几乎所有的蛋白质都处在不断合成与降解的动态平衡之中。与蛋白质的合成相比，蛋白质的降解同样重要，机体内短寿命的、错误折叠的以及机体自身不需要的蛋白都需要通过降解途径来清除。其中泛素-蛋白酶体***(Ubiquitin-Proteasome System，UPS)就是真核生物体内普遍存在的具有高度选择性的蛋白质降解***，主要由蛋白质泛素化和蛋白酶体降解两个过程组成。该***的生物学功能非常广泛，参与调控细胞内几乎各个方面的生命活动，其异常与炎症、癌症及神经退行性疾病等密切相关。
泛素化修饰通过由泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme，E2)和泛素连接酶(ubiquitin-protein ligase，E3)参与介导的酶促级联反应完成，最后经蛋白酶体降解。其中E3决定底物识别的特异性，是蛋白质泛素化领域的研究热点。E3可以分为两大类：含有RING(reallyinteresting new gene)锌指结构和HECT(homologous to E6AP C-terminus)结构域的E3。
RING类E3中的大多数是基于Cullins蛋白的多亚基复合体，其中基于Cullin1所形成的SCF(Skp1-Cullin1-F-box)复合体是研究最多、最深入的RING类E3复合体。它以支架蛋白Cullin1为中心，C端结合RING锌指蛋白Roc1，N端结合接头蛋白Skp1，Skp1又进一步募集不同的F-box蛋白，F-box蛋白担当底物识别亚基的角色，这样SCF复合体就利用不同的F-box蛋白形成不同复合体，从而结合不同的底物，在细胞周期调控、细胞生长及肿瘤发生等多种生物学过程中发挥着重要作用。F-box蛋白是一个大的蛋白家族，其家族成员数量在不同的物种中差别很大，酵母中约有20种，果蝇中有27种，而在人中则有69个成员。人中的F-box蛋白家族根据其C端所含结构域的不同，可以分为三类：含有WD40结构域的FBXW亚家族，含有LRR区的FBXL亚家族，以及含有其它结构域的统称为FBXO亚家族，它们分别通过WD40、LRR及其它结构域与底物蛋白发生相互作用，介导SCF复合体的结合。
发明内容
本发明的目的是提供FBXL15蛋白片段(FBXL15-ΔF)及其编码基因和应用。
本发明提供的FBXL15蛋白片段，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质(序列表的序列3所示的FBXL15蛋白自N末端第71至300位氨基酸残基)；
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述蛋白片段的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述蛋白的编码基因可为如下(1)或(2)或(3)所述的DNA分子：
(1)序列表中序列2所示的DNA分子(即序列表的序列4自5’末端第211至903位核苷酸)；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
含有所述编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因。
所述重组载体具体可为在pFlag-CMV-2表达载体的多克隆位点***序列表的序列2所示的DNA片段得到的重组质粒。
所述蛋白片段、所述编码基因或所述重组载体可用于抑制成骨细胞的分化。
所述蛋白片段、所述编码基因或所述重组载体可用于制备抑制成骨细胞分化的产品。
本发明还保护一种抑制成骨细胞分化的产品，它的活性成分为所述蛋白片段、所述编码基因或所述重组载体。
以上任一所述成骨细胞可为UMR106细胞。
骨硬化症，又称石骨症，骨密度升高伴随骨形态变化，由于失去了中空髓腔反而使骨头脆性增加，更容易骨折。本发明提供的FBXL15蛋白片段(FBXL15-ΔF)在一定程度上抑制成骨细胞的分化，即抑制骨形成，可用于作为石骨症的候选药物。
附图说明
图1为各组细胞的碱性磷酸酶ALP染色后照片。
图2为各组细胞的ALP活性分析结果，*表示P＜0.05。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
BMP-2即大鼠骨成型蛋白2：购自PEPROTECH公司，目录号120-02。UMR106细胞(大鼠成骨样细胞系)：购自美国标准菌种保藏中心(ATCC)，目录号为CRL-1661。HEK293T细胞：北京协和细胞资源中心，编号为3111C0001CCC000091；为人胚肾细胞(SV40T基因修饰)。pFlag-CMV-2表达载体：Sigma，目录号为E7398。
实施例1、重组质粒的制备
一、重组质粒Flag-FBXL15的制备
1、根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站查到人FBXL15基因(NM_024326.3)的编码区序列，设计扩增该基因的引物对如下：
正向引物：5’-cgg aat tca atg gag cca ccg atg gag(斜体为EcoR I酶切位点)；
反向引物：5’-cg gga tcc tca gac ctg cag gtt gac aaa(斜体为BamH I酶切位点)。
2、提取HEK293T细胞的总RNA，反转录为cDNA。
3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
4、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切pFlag-CMV-2表达载体，回收载体骨架(约4.7kb)。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒Flag-FBXL15。根据测序结果，对重组质粒Flag-FBXL15进行结构描述如下：在pFlag-CMV-2表达载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间***了序列表的序列4所示的人FBXL15基因(序列表的序列4所示的人FBXL15基因编码序列表的序列3所示的人FBXL15蛋白)。
二、重组质粒Flag-FBXL15-ΔF的制备
1、设计引物对如下：
正向引物5’-cgg aat tca ggt ccg cag atc ccg(斜体为EcoR I酶切位点)；
反向引物5’-cg gga tcc tca gac ctg cag gtt gac aaa(斜体为BamH I酶切位点)。
2、以重组质粒Flag-FBXL15为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切pFlag-CMV-2表达载体，回收载体骨架(约4.7kb)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒Flag-FBXL15-ΔF。根据测序结果，对重组质粒Flag-FBXL15-ΔF进行结构描述如下：在pFlag-CMV-2表达载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间***了序列表的序列2所示的人FBXL15-ΔF基因(序列表的序列2所示的人FBXL15-ΔF基因编码序列表的序列1所示的人FBXL15-ΔF蛋白)。序列表的序列2所示的人FBXL15-ΔF基因即序列表的序列4自5’末端第211至903位核苷酸所示的基因。
实施例2、FBXL15-ΔF蛋白抑制成骨细胞的分化
1、在24孔板中加入含10％胎牛血清(GIBCO)的α-MEM培养基(Hyclone)，每孔500微升，然后每孔接种0.5×105个UMR106细胞。
2、待细胞生长至汇合度约70％时，设置以下三组处理(每组设置三个复孔)：
第一组(Flag-FBXL15-ΔF组；第1组)：利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)将实施例1制备的重组质粒Flag-FBXL15-ΔF转染细胞，细胞数与质粒比例为：1×105个细胞：1μg质粒；
第二组(Flag-FBXL15组；第2组)：利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)将实施例1制备的重组质粒Flag-FBXL15转染细胞，细胞数与质粒比例为：1×105个细胞：1μg质粒；
第三组(pFlag-CMV-2组；第3组)：利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)将pFlag-CMV-2表达载体转染细胞，细胞数与质粒比例为：1×105个细胞：1μg质粒。
3、转染48h后，吸弃上清，每孔加入500微升诱导培养基(含100μg/ml维生素C、5mM β-甘油磷酸钠、100ng/ml BMP-2的α-MEM培养基)进行诱导。
4、诱导72h后，用4％多聚甲醛固定细胞，然后用ALP染色试剂盒(Sigma，产品目录号为86-C)染色并用ALP活性测定试剂盒(Wako，LabAssayTM ALP)进行活性测定(ALP染色和活性检测方法均按试剂盒说明书进行)。
空白空不接种细胞且不转染质粒，其它同上。
ALP染色后的细胞照片见图1。可见与第三组(pFlag-CMV-2组)相比，第一组(Flag-FBXL15-ΔF组)成骨细胞的数量显著降低，第二组(Flag-FBXL15组)成骨细胞的数量显著升高，即FBXL15蛋白促进成骨细胞分化，FBXL15-ΔF蛋白抑制成骨细胞分化。
ALP活性检测试剂盒利用对硝基苯酚磷酸盐(p-Nitrophenylphosphate)在pH9.8缓冲液中可被碱性磷酸酶(ALP)水解为对硝基苯酚(p-Nitrophenol)和磷酸盐，释放的对硝基苯酚在溶液中呈现黄色的特性，通过测定黄色溶液的吸光度来反映对硝基苯酚的浓度从而表征ALP的活性。因此ALP活性测定试剂盒得到的原始结果为405nm波长下溶液的吸光值(A)。用对硝基苯酚制作标准曲线，函数式为：y(吸光值)＝1.2×x(对硝基苯酚浓度)。
ALP的相对活性通过下面公式换算得到：
ALP活性(nmol p-NP/min/mg protein)＝C*a/t*c；
C：样品中对硝基苯酚的浓度，A样品-A空白(nmol/uL)；
a：样品的稀释倍数；
t：反应时间(min)；
c：样品中蛋白含量(mg/uL)；
pFlag-CMV-2组的ALP活性为105.5±10.3，Flag-FBXL15-ΔF组的ALP活性为94.7±14.7，Flag-FBXL15组的ALP活性为170.7±18.5。
各组的ALP活性比较见图2。结果显示，FBXL15表达能明显增强成骨细胞的分化，FBXL15-ΔF则表现出显性负效应，一定程度上抑制成骨细胞的分化。
Claims (10)
1.一种蛋白片段，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白片段的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因是如下(1)或(2)或(3)所述的DNA分子：
(1)序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pFlag-CMV-2表达载体的多克隆位点***序列表的序列2所示的DNA片段得到的重组质粒。
6.如下(I)或(II)或(III)在抑制成骨细胞的分化中的应用：
(I)权利要求1所述蛋白片段；
(II)权利要求2或3所述编码基因；
(III)权利要求4或5所述重组载体。
7.如下(i)或(ii)或(iii)在制备抑制成骨细胞分化的产品中的应用：
(i)权利要求1所述蛋白片段；
(ii)权利要求2或3所述编码基因；
(iii)权利要求4或5所述重组载体。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述成骨细胞为UMR106细胞。
9.抑制成骨细胞分化的产品，它的活性成分为如下①或②或③：
①权利要求1所述蛋白片段；
②权利要求2或3所述编码基因；
③权利要求4或5所述重组载体。
10.如权利要求9所述的产品，其特征在于：所述成骨细胞为UMR106细胞。
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