CN102373258B

CN102373258B - 一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法

Info

Publication number: CN102373258B
Application number: CN2011103434136A
Authority: CN
Inventors: 沈玉江; 孙彦达; 李国军; 王柱; 张丽茹; 段宝颜
Original assignee: DAQING HUALI ENERGY BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Daqing Huali Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2011-11-03
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2031-11-03
Also published as: CN102373258A

Abstract

本发明的一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法涉及一种生物表面活性剂的生产方法，是由枯草芽孢杆菌ACCC01430经发酵培养制得，其具体步骤如下：将斜面固体枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶培养，温度为35±2℃、120转/分震荡培养12～16小时，得到摇瓶菌种；将制得的摇瓶菌种转接入装有培养基的一级发酵罐中，制得一级发酵菌种；将一级发酵菌种转接入装有培养基的二级发酵罐中，制得二级发酵菌种；将二级发酵菌种转接入装有培养基的三级发酵罐中，发酵培养24～26小时，即制得脂肽生物表面活性剂。本发明的一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法，其脂肽含量达到7～10%g/L，并取得了工业化生产实验的成功，发酵周期缩短到48小时，大大降低了生产成本；本发明首次将工业化生产的脂肽发酵液应用现场，将其注入地下油层，使原来难以注水的区块水顺利注入，并且使原油采收率提高了5～12％；效率高。

Description

一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物表面活性剂的生产方法，尤其是涉及一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法。

背景技术

脂肽又名脂酰肽，属于含氨基酸类脂。脂肽类生物表面活性剂一般是革兰氏阳性的芽孢杆菌的代谢物。脂肽分子由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域有重要的应用前景。脂肽类表面活性剂一般由革兰氏阳性的芽孢杆菌代谢产生，能产生脂肽类表面活性剂的菌株有很多，如枯草芽孢杆菌（Bacillussu btilis）、地衣芽孢杆菌（Bacilluslic heniformis）等。除了细菌可以产生脂肽类表面活性剂外，酵母、真菌也可以产生。

脂肽类生物表面活性剂按其结构分类可以分为环状脂肽和线形脂肽两大类。

环状脂肽。环状脂肽是指分子中具有环状结构的一类脂肽，肽链的 C-端氨基酸的羧基与肽或脂肪酸中的氨基或羟基相连构成环状结构。根据形成环的成分的差异，又可将环状脂肽分为脂肪酸成环的环状脂肽、脂肪酸接环的环状脂肽及脂肪酸离环的环状脂肽。含氨基酸类脂是以低缩氨基酸为亲水基团的生物表面活性剂。典型产物有脂肽、脂蛋白、脂氨基酸。这是一类表面性能优良的表面活性剂，其乳化性能好，去污能力强，与其他各种表面活性剂的相容性也很好，同时具有很好的抗菌性能。

许多生物分子具有亲水和亲油基团，他们在性能上和化学合成的表面活性剂非常相似。通常把那些具有两亲性，表现出很高表面活性由微生物、动植物或植物产生的天然表面活性剂称为生物表面活性剂(Biosurfactant,简称BS)。其中由微生物产生的生物表面活性剂活性较高，具有很好的亲水、亲油性能和界面优先分配能力，较为适合于工业化大规模生产。但现有的表面活性剂，由于产量低、周期长、装料系数低、工艺复杂等缺陷，能大规模生产的还不多。

发明内容

本发明旨在于克服现有技术的不足，提供了一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法，这种生产工艺具有产量高、效率高、装料系数高、发酵周期短、工艺简单，使产品综合成本降低，完全适合工业化生产，对脂肽生物表面活性剂的推广及大规模应用起到了重要的作用。

本发明的一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法，是由枯草芽孢杆菌ACCC01430经发酵培养制得，其具体步骤如下：

A、将斜面固体枯草芽孢杆菌（ACCC01430）菌种接入摇瓶培养，摇瓶中每500ml培养基接入1环菌种,温度为35±2℃、120转/分震荡培养12～16小时，得到摇瓶菌种；

B、一级发酵培养：将A步骤制得的摇瓶菌种转接入装有培养基的一级发酵罐中，摇瓶菌种与培养基的体积比为1：19～20,在温度为35±2℃、pH6～7.5、通风比1: 0.3～0.5及搅拌速度为100～150转/分的条件下发酵培养10～14小时，得到一级发酵菌种；

C、二级发酵培养：将B步骤制得的一级发酵菌种转接入装有培养基的二级发酵罐中，一级发酵菌种与培养基的体积比为1:10，在温度为35±2℃、pH 6～7.5、通风比1: 0.3～0.5及搅拌速度为100～110转/分的条件下发酵培养10～14小时，得到二级发酵菌种；

D、发酵培养：将C步骤制得的二级发酵菌种转接入装有培养基的三级发酵罐中，二级发酵菌种与培养基的体积比为1：10，在温度为35±2℃、pH 6～7.5、通风比1: 0.3～0.5、搅拌速度为80～100转/分，在菌体处于衰落期进行补料，发酵培养24～26小时，得到脂肽生物表面活性剂。

作为本发明的进一步改进，摇瓶及各级发酵罐培养基配方是：米糠油2～5%、尿素0.2～1.5%、糖蜜10～15%、KCl 0.05～1.0%、KH₂PO₄ 0.05～1.2%、K₂HPO₄ 0.05～1.5%、酵母膏0.005～0.1%、复合微量元素0.005～0.01%，余量为水，pH为6.0 -7.5；

所述的复合微量元素为硫酸锌1.1 g/L、氧化锡 1.3 g/L、氯化锰 1.0 g/L、硫酸铜 1.0 g/L、氧化钴 1.0g/L及溶剂水复配而成。

作为本发明的进一步改进，所述的补料是米糠油，每次补料量按发酵液总体积量的3%～5%补加。

作为本发明的进一步改进，各级发酵罐的装料系数是60～80%。

一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法，整个生产制备过程是逐级扩大发酵纯培养的过程。得到的脂肽生物表面活性剂发酵液经过杀菌和离心分离后，根据各种用途的需要纯化成不同等级的产品，广泛应用于三次采油、日化、农药、食品、土壤修复等行业。

本发明的一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法，具有产量高、周期短、装料系数高、工艺简单等特点，实现了脂肽生物表面活性剂的工业化生产。

本发明的一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法，其脂肽含量达到7～10%g/L，并取得了工业化生产实验的成功，发酵周期缩短到48小时，大大降低了生产成本；本发明首次将工业化生产的脂肽发酵液应用现场，将其注入地下油层，使原来难以注水的区块水顺利注入，并且使原油采收率提高了5～12％；效率高。

附图说明

图1为表面张力；

图2 生物脂肽表面活性剂在不同浓度时的界面张力值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

本发明采用的菌的名称及菌种来源如下：

枯草芽孢杆菌（ACCC01430），中国农业微生物菌种保藏中心。

本发明实施例1～4中菌体的衰落期的标准，见高等教育出版社2002年5月第二版《微生物学教程》周德庆编著。在下述实施例中，进入三级发酵后，每小时检测一次。

实施例1

摇瓶及发酵罐培养基配方为：米糠油2%、尿素1%、糖蜜11%、KCl 0.1%、KH2PO4 0.05%、K2HPO4 0.3%、酵母膏0.005%、复合微量元素0.008%，其余为水，pH为7.0, 所述的复合微量元素为硫酸锌1.1 g/L、氧化锡 1.3 g/L、氯化锰 1.0 g/L、硫酸铜 1.0 g/L、氧化钴 1.0g/L及溶剂水复配而成。

摇瓶及发酵罐培养：

将斜面枯草芽孢杆菌（ACCC01430）接入到7个3L摇瓶中，摇瓶装入1L的培养基，每个摇瓶接入2环菌种，温度为35±2℃、120 rpm培养14 h，血球计数板检测菌数达到2亿以上，即为得到摇瓶菌种；再转接入200升的一级发酵罐，装料系数为70%，接种量5%、温度为35±2℃、通风比为1：0.5、pH为 7.0、搅拌转速为110 rpm培养12 h，得到一级发酵菌种；再转接入2吨二级发酵罐,装料系数为70%，接种量10%、温度为35±2℃、通风比为1：0.5、pH为 7.0、搅拌转速为100 rpm培养12 h，得到二级发酵菌种，再转接入20吨三级发酵罐，装料量为14吨，三级发酵罐的工艺参数为：温度35±2℃、灭菌前用0.1吨固体NaOH将pH调到7.0，通风比为1：0.5、搅拌转速为80 rpm，期间累计补加米糠油0.5吨，发酵培养24小时后用临界胶束浓度反推法检测脂肽含量为7.5g/L。

实施例2

摇瓶及发酵罐培养基配方为：米糠油3%、尿素1.5%、糖蜜17%、KCl 1.0%、KH₂PO₄0.2%、K₂HPO₄1.5%、酵母膏0.02%、复合微量元素0.01%，其余为水，pH为7.0, 所述的复合微量元素为硫酸锌1.1 g/L、氧化锡 1.3 g/L、氯化锰 1.0 g/L、硫酸铜 1.0 g/L、氧化钴 1.0g/L及溶剂水复配而成。

摇瓶及发酵罐培养：

将斜面固体枯草芽孢杆菌（ACCC01430）菌种，转接入4个3L摇瓶（各装入1L培养基），每500ml培养基接入1环菌种，在温度为35±2℃、120 rpm培养13.5 h，血球计数板检测菌数达到2亿以上后，转接入200升的一级发酵罐,装料系数为67%，接种量3%、温度为35±2℃、通风比为1：0.4、pH为 7.0、搅拌转速为120 rpm培养12 h，转接入2吨二级发酵罐,装料系数为67%，接种量10%、温度为35±2℃、通风比为1：0.4、pH为 7.0、搅拌转速为100 rpm培养12 h，转接入20吨三级发酵罐，装料量为14吨，三级发酵罐的工艺参数为：温度35±2℃、灭菌前用0.10吨NaOH将pH控制在7.0，通风比为1：0.4、搅拌转速为80 rpm，期间累计补加米糠油0.6吨，发酵培养25小时后用临界胶束浓度反推法检测脂肽含量为8.8g/L。

实施例3

摇瓶及发酵罐培养基配方为：米糠油5%、尿素0.2%、糖蜜20%、KCl 0.05%、KH₂PO₄ 1.2%、K₂HPO₄ 0.05%、酵母膏0.1%、复合微量元素0.005%，其余为水，pH为7.5, 所述的复合微量元素为硫酸锌1.1 g/L、氧化锡 1.3 g/L、氯化锰 1.0 g/L、硫酸铜 1.0 g/L、氧化钴 1.0g/L及溶剂水复配而成。

摇瓶及发酵罐培养：

将斜面固体枯草芽孢杆菌（ACCC01430）菌种，转接入6个3L摇瓶（装入1L培养基），35±2℃、120 rpm培养12h，血球计数板检测菌数达到2亿以上，转接入200升的一级发酵罐,装料系数为60%，接种量5%、温度为35±2℃、通风比为1：1、pH为7.5、搅拌转速为120rpm培养12 h，转接入2吨二级发酵罐,装料系数为60%，接种量10%、温度为35±2℃、通风比为1：1、pH为7.5、搅拌转速为100rpm培养12 h，转接入20吨三级发酵罐，装料量为16吨，三级发酵罐的工艺参数为：温度35±2℃、灭菌前pH调到7.5左右，后期用0.12吨NaOH将pH控制在7.0，通风比为1： 1、搅拌转速为100 rpm，期间累计补加米糠油0.7吨，发酵培养24小时后用临界胶束浓度反推法检测脂肽含量为10.4g/L。

实施例4

摇瓶及发酵罐培养基配方为：米糠油3%、尿素1%、糖蜜20%、KCl 0.5%、KH₂PO₄ 0.5%、K₂HPO₄ 0.5%、酵母膏0.05%及复合微量元素0.005%，其余为水，pH为6.5, 所述的复合微量元素为硫酸锌1.1 g/L、氧化锡 1.3 g/L、氯化锰 1.0 g/L、硫酸铜 1.0 g/L、氧化钴 1.0g/L及溶剂水复配而成。

摇瓶及发酵罐培养：

将斜面固体枯草芽孢杆菌（ACCC01430）菌种，转接入7个3L摇瓶（装入1L培养基），接种量5%、35±2℃、120 rpm培养12h，转接入200升的一级发酵罐,装料系数为65%，接种量5%、35±2℃、通风比为1：0.3、pH为 6.5，搅拌转速为120 rpm培养12 h，转接入2吨二级发酵罐,装料系数为65%，接种量10%、温度为35±2℃、通风比为1：0.3、pH为 6.5、搅拌转速为120 rpm培养12 h，转接入20吨三级发酵罐，装料量为15吨，三级发酵罐的工艺参数为：温度35±2℃、灭菌前pH调到6左右，后期用0.23吨NaOH将pH控制在7.0，通风比为1：0.3、搅拌转速为120 rpm，期间累计补加米糠油0.6吨，发酵培养25小时后用临界胶束浓度反推法检测脂肽含量为9.7g/L。

由上述几个实例可以看出采用此生产工艺发酵脂肽含量可达到7－10 g/L。

将经实施例1-4制得的脂肽表面活性剂，测定脂肽含量、发酵液表面张力及驱油效果，结果如下：

(1)、发酵液中脂肽表面活性剂的临界胶束浓度反推法检测含量：如图1所示；

(2)、生物表面活性的界面张力检测:如图2所示。

A. 实验仪器: JJ2000B型旋转滴界面张力测量仪、全自动表面张力仪、万分之一电子天平、电子秤、烧杯、吸管等。

B. 实验材料:生物表面活性剂：枯草芽孢杆菌（ACCC01430）的发酵液浓度为1～5％、水：大庆油田地层水、原油：大庆原油，密度为0.8806g/m³、氢氧化钠：固体片状；

C. 检测方法参见中华人民共和国石油天然气行业标准SY/T 5370-1999。

D. 检测结果:

生物表面活性剂浓度为1.0%时与大庆原油之间的界面张力值，见图2。

总结：将枯草芽孢杆菌ACCC01430其经发酵后脂肽含量可达到5～10%g/L，35℃、0.5～1％浓度的脂肽发酵液在PH为8-9时，能使原油与地层水界面张力降低至0.07～0.2mN/m，在水相有效渗透率50－400md、残余油饱和度30～50％、注入量为0.1pv脂肽发酵液浓度为1-5%、50℃的条件下，原油采收率比水驱提高了5-10％左右。

Claims

1.一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法，其特征在于：该脂肽生物表面活性剂是由枯草芽孢杆菌ACCC01430经发酵培养制得，其具体步骤如下：

A、将斜面固体枯草芽孢杆菌ACCC01430菌种接入摇瓶培养，摇瓶中每500ml培养基接入1环菌种,温度为35±2℃、120转/分震荡培养12～16小时，得到摇瓶菌种；

D、发酵培养：将C步骤制得的二级发酵菌种转接入装有培养基的三级发酵罐中，二级发酵菌种与培养基的体积比为1：10，在温度为35±2℃、pH 6～7.5、通风比1: 0.3～0.5、搅拌速度为80～100转/分，在菌体处于衰落期进行补料，发酵培养24～26小时，得到脂肽生物表面活性剂；

其中，所述的摇瓶及各级发酵罐培养基配方是：米糠油2～5%、尿素0.2～1.5%、糖蜜10～15%、KCl 0.05～1.0%、KH₂PO₄ 0.05～1.2%、K₂HPO₄ 0.05～1.5%、酵母膏0.005～0.1%、复合微量元素0.005～0.01%，余量为水，pH为6.0 -7.5；

所述的复合微量元素为硫酸锌1.1 g/L、氧化锡 1.3 g/L、氯化锰 1.0 g/L、硫酸铜 1.0 g/L、氧化钴 1.0g/L及溶剂水复配而成；

步骤D中所述的补料是米糠油，每次补料量按发酵液总体积量的3%～5%补加。

2.根据权利要求1所述的一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法，其特征在于：各级发酵罐的装料系数是60～80%。