CN102373195A - 油菜油体蛋白Oleosin5’UTR序列的克隆及其在油体靶向表达中的应用 - Google Patents
油菜油体蛋白Oleosin5’UTR序列的克隆及其在油体靶向表达中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了油菜油体蛋白oleosin基因的5’UTR序列，及其在基因靶向表达中的应用。oleosin基因的5’UTR序列是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。利用SEQ ID NO：1序列和其他元件构建了植物表达载体pGOT，包括4个完整的表达盒：P35S-codA-Tnos表达盒、1900bp油菜oleosin基因5’UTR-“芝麻oleosin+CT融合蛋白基因”-Pnos-NPTII-Tnos-油菜oleosin基因3’DNA序列表达盒和P35S-codA-Tnos表达盒。通过in planta法获得转基因油菜植株及株系。本发明可利用基因打靶技术将外源目标基因的定点***油体oleosin基因的3’端，极大的提高外源基因在植物体内的表达，为利用生物反应器大量生产药用蛋白建立一个崭新的平台。
Description
技术领域
本发明涉及综合利用植物油体特异表达技术和基因打靶技术进行染色体定点同源重组，特别是涉及来源于甘蓝型油菜油体蛋白Oleosin基因5’端UTR序列的克隆及其在基因打靶技术中的应用。
背景技术
基因打靶(gene targeting)产生于70年代末和80年代初，是指将携带有选择标记的外源目的基因采用一定的实验方法导入受体细胞，再通过外源DNA序列与受体细胞染色体上同源DNA序列间发生重组，最终将外源DNA定点整合入受体细胞基因组某一预定位点，改变细胞遗传特性，或对某一预先确定的受***点进行定点突变，导致受体细胞基因功能敲除或者点突变的技术。虽然基因打靶的原理和技术路线并不复杂，但是由于高等真核生物细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列发生同源重组的机率非常低，所以获得定点整合的转基因植株仍然是一件非常困难的工作。
植物种子中贮存的营养物质主要包括：蛋白、脂肪和碳水化合物。所有植物中的脂类物质均以三酰甘油(triacylglycerols，TAG)的形式存在，只有jojoba是唯一例外，它贮存蜡酯(wax esters)。种子中的TAG分子之间不是彼此聚合的，而是分散成许多小的稳定的亚细胞微滴，这些小的亚细胞微滴被称为油体(Huang HC，1992)。油体有其自身的结构和特征，为直径0.5～2.5μm的球体，其大小因植物种类的不同而不同，且受营养、环境影响。油体的成份包括：92～98％的中性脂类[主要为TAG及少量的二酰甘油(DAG)和自由脂肪酸]；1～4％的磷脂(PL)(主要为磷脂酰胆碱-占60％～70％及少量的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)、1～4％油体蛋白oleosin和少量的油体钙蛋白(CALEOSIN)、油体固醇蛋白(STEROLEOSIN)、细胞色素C还原酶。油体内部为液态TAG，外部是由单层磷脂分子及其镶嵌蛋白-oleosin组成的半单位膜。油体蛋白oleosin是小分子量(15～26kD)的碱性疏水蛋白，在种子中特异表达，为油体所特有，对维持油体的稳定极为重要，占油体总重量的1～4％。不同物种来源的Oleosin分子量不同，但都具有3个基本的结构域，即：N端40～60个氨基酸组成的两亲性区域(兼具亲水性和亲脂性)，这一区域分布于油体表面朝向胞浆的一面；中间68～74个氨基酸的保守区域，为伸入油体内部的反式平行β-折叠结构，这一区域的氨基酸序列在不同来源的Oleosin中高度保守；位于或靠近C端的33～40个氨基酸组成的α-螺旋结构域。该结构域兼具亲水和亲脂性，其带正电荷的基团朝向油体表面的磷脂层(PL)，带负电荷的部分位于油体表面朝向胞浆的一面。虽然所有的Oleosin均具有上述3个结构域(3个结构域加起来约15kD)，但oleosin分子量的差别却很大(15～26kD)，多出的1～11kD以C-端或N-端的延伸形式存在。通过对不同植物oleosin氨基酸序列的研究发现，不同Oleosin分子间除中部疏水区域高度保守外，N端和C端氨基酸序列差异很大。这使人们想到，外源蛋白***oleosin分子的N端或C端后，不会影响oleosin在植物油体上的定位。
植物油体表达体系正是以此为理论基础建立起来的，将目的蛋白插在油体蛋白基因的N端或C端，构成融合蛋白，在转基因植物种子的油体上特异表达，利用油体亲脂疏水的特性，将种子粉碎-离心-回收上层油相-去油，即可获得融合蛋白，具有提取工艺简单，目的蛋白易于分离纯化的优点。
基于以上理论，本发明可利用基因打靶技术将外源目标基因的定点***油体oleosin基因的3’端，极大的提高外源基因在植物体内的表达，为利用生物反应器大量生产药用蛋白建立一个崭新的平台。
发明内容
本发明的目的是克隆油菜油体蛋白oleosin基因的5’UTR序列及其在基因定点同源重组中的应用。
本发明利用染色体步移技术，克隆得到来源于甘蓝属油菜(Brassica napus)oleosin基因5’UTR，是下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；
2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO：1由2031个碱基组成。
本发明所提供的外源基因定点同源重组是将所述oleosin基因的5’UTR序列及外源基因拼接在同一个表达盒中，再导入植物组织或细胞，得到同源重组的转基因的植株。
所述含有oleosin基因的5’UTR序列表达盒可通过含有所述oleosin基因的5’UTR序列表达盒的植物表达载体导入植物组织或细胞。
使用本发明的基因构建植物表达载体转化油菜时，为提高发生同源重组的机率可使用RAD54基因(编码蛋白具有ATP酶/解旋酶的保守序列，属于SWI2/SNF2超家族)。RAD54可促进供体DNA向DSB位点的整合在拟南芥中表达RAD54蛋白，基因靶向整合的几率提高27倍，达到10-2到10-1。
具体来讲，用于构建所述植物表达载体的出发载体可为pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300等，优选为pCAMBIA2300。
以pCAMBIA2300为出发载体，构建的植物表达载体为pGTO。
为了便于转基因植物的鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。此外，为确保获得的转基因油菜是同源重组型转基因油菜而非随机***，可引入CodA基因作为负筛选***。在含有5-氟胞嘧啶的筛选培养基中，CodA可将无毒的5-氟胞嘧啶转化成有毒的5-氟脲嘧啶从而将非同源重组的转基因油菜杀死。
携带有本发明oleosin基因的5’UTR序列表达盒的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导，inplanta等常规生物学方法转化油菜的细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
本发明中为实现油菜基因打靶在转基因油菜籽中特异、超高量表达外源蛋白，构建包括4个完整的基因表达盒的植物表达载体。其中4个表达盒分别是P35S-codA-Tnos表达盒、油菜oleosin基因5’UTR-芝麻oleosin+外源基因-Pnos-NPTII-Tnos表达盒、油菜oleosin基因3’DNA序列表达盒和P35S-codA-Tnos表达盒。我们可以根据需要将外源基因，例如降钙素、胰岛素、载脂蛋白A1等目标蛋白***“油菜oleosin基因5’UTR-芝麻oleosin+外源基因-Pnos-NPTII-Tnos”表达盒即可构建为基因打靶植物表达载体。利用该方法目的蛋白表达量可达到种子总蛋白的10％，远远高于现有的外源基因在转基因植物中0.2-1％的表达量。该方法具有目的蛋白表达量高，表达的蛋白易于储存和纯化的显著优点。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为构建oleosin基因5’上游序列步移文库的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果
图2为pOPF的限制性内切酶HindIII/EcoRI酶切鉴定结果
图3为油体蛋白oleosin基因PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果
图4为pOPS的SpeI酶切鉴定结果
图5为CodA基因PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果
图6为pCodA BamHI/SacI双酶切鉴定结果
图7为NPTII表达盒PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果
图8为pBluA BamHI/EcoRI双酶切鉴定结果
图9为中间载体pCodA121BamHI/SacI双酶切鉴定结果
图10为中间载体p2300/ka-codA-E EcoRI单酶切鉴定结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物均由上海生工合成，测序工作均由中国农业科学院重大工程楼实验室协助完成。
实施例1、油菜oleosin基因5’上游序列的克隆
植物材料：油菜品种中双4号，苗龄4周时。
一、oleosin基因5’上游序列染色体步移引物的设计
同源序列的大小是影响基因打靶效率的重要因素，构建基因打靶载体时，一般要求需要有2kb左右的DNA同源序列，但Genbank上已登录的oleosin基因(序列号为M63985)5’上游序列大小仅为944bp，为此，需用染色体步移进一步克隆oleosin上游序列。
根据Genbank上登录的oleosin基因5’UTR序列和GenomeWalkerTM Universal Kit的要求，设计2个特异引物，引物序列如下
GSP1：5’-TAATCTCCGCCGCGTCTCTCTCTAAAC-3’
GSP2：5’-CCAAAGCTGCACTCTCTCTATCCAAAAG-3’
二、oleosin基因5’上游序列的克隆
用下述方法进行oleosin基因5’上游序列的克隆，具体过程包括以下步骤：
1)油菜基因组DNA提取
取25～100mg新鲜油菜叶片，加液氮碾成粉末，转入1.5mL离心管中。加450μL提取缓冲液(100mmol·L-1Tris-Cl，pH 8.0，500mmol·L-1NaCl，10mmol·L-1β-巯基乙醇，50mmol·L-1EDTA，pH 8.0)及100μL10％SDS，剧烈振荡。65℃水浴30min，加160μL 3mol·L-1NaAc(pH 5.2)，置冰上20min。12000g 4℃离心10min，取上清。加2倍体积的预冷的无水乙醇，颠倒混匀以利于DNA析出。用玻棒挑出丝状DNA，置于1.5mL小离心管中，70％乙醇漂洗数次后晾干备用。
2)基因组DNA步移文库的构建
参照GenomeWalkerTM Universal Kit中的说明书进行。具体步骤如下：
①基因组DNA的酶切消化。将基因组DNA分别以DraI、EcoRV、PvuI和StuI平末端酶酶切消化，37℃，18h～20h，以0.6％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测酶切是否完全。
②DNA的纯化。在上一步酶切完全的EP管中加入等体积的苯酚，混匀，离心，12000rpm，5min；取上清到新的EP管中，加入等体积的氯仿，混匀，离心，12000rpm，5min；将上清吸到新的EP管中，每管加2倍体积冰预冷的95％的乙醇，1/10体积3mol·L-1NaAc，轻轻混匀，4℃，14000rpm离心15min；去上清，加入100μL冰预冷的80％的乙醇洗DNA，重复几次，4℃，14000rpm离心10min；去掉液体，空气干燥；用20μL无菌水溶解。
③纯化后的DNA与GenomeWalkerTM接头的连接。将上一步回收的4管DNA分别与GenomeWalkerTM接头连接，16℃过夜，之后70℃，5min终止反应，构建得4个基因组步移文库(DL1、DL2、DL3和DL4)。
3)oleosin基因5’上游序列的克隆
oleosin基因5’上游序列的克隆通过两轮PCR完成。
①第一轮PCR反应：在4个0.5mL的EP管(C1～C4)中分别以构建好的DNA文库(DL1、DL2、DL3和DL4)为模板，以基因特异引物GSP1和接头引物(GenomeWalkerTM Universal Kit提供)AP1(5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)在热循环仪(BIO-RAD)上进行PCR反应。反应程序为：95℃预变性5min；随后紧接着7个循环为94℃25s，72℃3min；然后接着32个循环，94℃25s，67℃3min；最后67℃延伸7min。反应完成后，将上述4管PCR产物稀释50倍(D1～D4)用作第二轮PCR扩增的模板。
②第二轮PCR反应：以基因特异引物GSP2和接头引物AP2(5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’)进行PCR扩增，反应程序为：首先94℃25s，72℃3min扩增5个循环；紧接着94℃25s，67℃3min扩增20个循环，最后67℃延伸7min。
③PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图1所示1：λDNA EcoRI/HindIII Marker2：DarI酶切文库3：StuI酶切文库4：EcoRV酶切文库5：PvuII酶切文库6：阴性对照7：试剂盒阳性对照8：试剂盒阴性对照9：试剂盒中提供构建好的文库)。
4)PCR克隆重组子的筛选
PCR产物经纯化后与pMD19-T Vector连接，转化E.coli DH5α，筛选重组子，酶切鉴定，测序验证。
转化方法如下：
1)取10μL过夜连接产物加到一管感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30min；
2)将离心管置于42℃水浴中热激90s，不要晃动离心管；
3)迅速将离心管置于冰上，冷却2min；
4)加入800μL LB液体培养基，37℃，150rpm摇床培养45min；挑取单菌落碱裂解法提取质粒DNA筛选不同的重组子，首先HindIII/EcoRI双酶切鉴定，然后挑选一部分重组子进行测序检测(如图3)。
5)oleosin基因5’上游序列的分析
将重组子测序结果利用DNAMAN软件进行分析，筛选获得oleosin基因5’上游序列，将该阳性克隆命名为pOPF。
实施例2、基因打靶载体元件的克隆
实验材料：油菜中双4号，大肠杆菌JM109。
一、油菜油体蛋白Oleosin全基因的克隆
本发明中使用oleosin基因全长(包括exon1+intron1+exon2+intron2+polyA)作为基因打靶的另一段同源重组序列。根据Genbank上已登录的oleosin基因(序列号为M63985)设计引物，从油菜基因组中PCR扩增oleosin基因。具体步骤如下：
1)油菜基因组DNA提取
取25～100mg新鲜油菜叶片，加液氮碾成粉末，转入1.5mL离心管中。加450μL提取缓冲液(100mmol·L-1Tris-Cl，pH 8.0，500mmol·L-1NaCl，10mmol·L-1β-巯基乙醇，50mmol·L-1EDTA，pH 8.0)及100μL10％SDS，剧烈振荡。65℃水浴30min，加160μL 3mol·L-1NaAc(pH 5.2)，置冰上20min。12000g 4℃离心10min，取上清。加2倍体积的预冷的无水乙醇，颠倒混匀以利于DNA析出。用玻棒挑出丝状DNA，置于1.5mL小离心管中，70％乙醇漂洗数次后晾干备用。
2)PCR引物的设计及扩增
根据Genbank上已登录的oleosin基因(序列号为M63985)，设计特异引物，序列如下：
Ole5：ACTAGTCACAAGAAGCAAAATGACGG
Ole3：actagtGGTACCTTCATTCAAACTCCC
以油菜基因组为模板，Ole5和Ole3为引物，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，共35个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示。
3)PCR产物的克隆
使用载体pMD18-T(TaKaRa，Cat.No.D504A)试剂盒进行PCR产物的克隆。具体方法为：取步骤2)获得PCR回收产物2μL，依次加入0.5μL载体pMD18-T、2.5μL Ligase Solution I，然后16℃连接8h。将连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性重组克隆，将阳性克隆质粒命名为pOPS，用限制性内切酶SpeI进行酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，表明1672bp的目的片段已正确连接入载体pMD18-T中，对pOPS做进一步的测序鉴定，测序结果表明***片段具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
二、大肠杆菌CodA基因的克隆
1)大肠杆菌基因组DNA的提取
①挑取E.coli单菌落，接种到5ml带有相应抗生素的液体LB培养基中，200rpm、37℃培养过夜。
②将2ml菌液加入2ml Eppendorf管中，12000rpm离心1min，弃上清。
③向管中加人200μl Solution I(50mM蔗糖，10mM EDTA pH8.0，25mM Tris-Cl pH8.0)混匀。
④加入400μl SolutionII(1％SDS，0.2M NaOH)，上下颠倒混匀2次。
⑤迅速加入300μl SolutionIII(每100ml含5M KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，蒸馏水28.5ml)，轻轻混匀，室温放置10min。
⑥12000rpm离心10min，吸上清于另一EP管中。
⑦分别用苯酚和氯仿各抽提一次，抽提条件是：12000rpm离心10min。
⑧小心取上清，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置10min，12000rpm离心10min，DNA沉淀用70％乙醇洗2次，晾干备用。
2)克隆CodA基因的引物设计
根据GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的大肠杆菌CodA基因(序列号为AY552602)，设计5’引物codA5，3’引物codA3，引物序列如下：
CodA5：5’-GGATCCATGTCGAATAACGCTTTAC-3’
CodA3：5’-GAGCTCTCAACGTTTGTAATCGATG-3’
3)CodA基因的克隆
以大肠杆菌JM109基因组为模板，以引物codA5和codA3进行PCR扩增，程序为：95℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，共32个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示，在1290bp处有一明显的扩增条带。
使用载体pMD18-T(TaKaRa，Cat.No.D504A)试剂盒进行PCR产物的克隆。具体方法为：取上一步获得的PCR产物2μL，依次加入0.5μL载体pMD18-T、2.5μL Ligase Solution I，然后16℃连接8h。将连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选得到阳性重组克隆，将阳性克隆质粒命名为pCodA，用限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明1290bp的目的片段已正确连接入载体pMD18-T中(如图6)，对pCodA做进一步的测序鉴定，测序结果表明***片段是序列表中的核苷酸序列。
三、NptII基因的克隆
根据已知序列，设计引物从质粒pBI121中将PCR扩增NptII表达盒序列出来，序列长度为1783bp(如图7)，引物序列如下：
Npt5：5’-GGATCCAACGACAATCTGATC-3’
Npt3：5’-GAATTCGCCCGATCTAGTAAC-3’
将扩增出来的序列连到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，酶切验证正确的送测序，将测序结果正确的质粒以BamHI和EcoRI双酶切，将得到的1783bp片段，与相同酶切的载体Bluescript II KS+/-连接，得到中间载体，命名为pBluA(如图8)。
实施例2、基因打靶载体pGOT的构建
一、中间载体pCodA2300/ka-的构建
1)中间载体pCodA121的构建及表达盒酶切位点的改变
①中间载体pCodA121的构建
本实施例所构建的基因pCodA121的表达盒中包括以下基因表达调控元件：5’端的35S启动子、基因CodA和3’端的NOS终止子。首先将质粒pCodA以限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切，回收1290bp片段，将其与相同酶切的载体pBI121连接，构成中间载体，命名为pCodA121。以BamHI和SacI双酶切进行验证，酶切鉴定结果如图8所示，结果证明CodA片段已经连在pBI121上(如图9)。
②中间载体pCodA121表达盒酶切位点的改变
受可用限制性内切酶位点的限制，本发明中将pCodA121表达盒两端的酶切位点分别改变为I：两端都是HindIII，命名为pCodA121H；II：两端都是EcoRI，命名为pCodA121E。
2)中间载体pCodA2300/ka-的构建
①将pCAMBIA2300用限制性内切酶XhoI酶切消化，将nptII基因切下，再用T4连接酶连接，得到不含nptII基因的pCAMBIA2300，命名为pCAMBIA2300/ka-。
②将质粒pCodA121E用限制性内切酶EcoRI酶切消化，回收2400bp片段，与相同酶切的pCAMBIA2300/ka-连接，得到中间载体，命名为pCodAE2300/ka-。以EcoRI单酶切验证，证明2400bp片段已经连在pCodAE2300/ka-上，酶切鉴定结果如图10所示。以限制性内切酶PstI单酶切，验证CodA表达盒的方向。
③将质粒pCodA121H用限制性内切酶HindIII酶切消化，回收2400bp片段，与相同酶切的pCodAE2300/ka-连接，得到中间载体，命名为pCodA2300/ka-。以HindIII单酶切验证2400bp片段是否连上，以限制性内切酶BamHI单酶切验证方向，此步连上的CodA表达盒的方向需与上步的方向相反。
二、基因打靶载体pGTO的构建
基因打靶载体pGTO所用的内源序列I(OPF)为实施例3获得的油菜oleosin基因5’上游序列，内源序列II(OPS)为油菜oleosin基因全长(包括exon1+intron1+exon2+intron2+polyA)，目的基因为鲑鱼降钙素(sCT，本实验室构建好的)，正筛选标记为NptII(具有卡那霉素抗性)，负筛选标记为CodA。构建过程如下所示：
根据实施例1得到的序列设计引物，从油菜基因组中PCR得到1800bp产物，将其连在pMD19-T载体上，测序，正确的克隆命名为pOPF(内源序列1)。将OPF以限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切，将得到的片段与相同酶切的中间载体pBluA连接，得到中间产物，命名为pBluB。
根据实验室已有的质粒pBOSC(载体为pTΩ4A，基因为油菜promoter-His6-芝麻oleosin-EK-sCT)设计引物，将His6-芝麻oleosin-EK-sCT-NOS ter这一段基因PCR扩增出来，改变酶切位点为两端都是EcoRI，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，测序，将测序结果正确的质粒以限制性内切酶EcoRI单酶切，回收780bp片段，与相同酶切的中间载体pBluB连接，得到中间载体，命名为pBluC。
将实施列2得到的含有全长oleosin基因的pOPS质粒以限制性内切酶SpeI单酶切，回收1672片段，与相同酶切的中间载体pBluC连接，得到中间产物，命名为pBluD。
将中间载体pBluD以限制性内切酶KpnI单酶切，回收片段，与载体p2300/ka-codA连接，得到基因打靶载体，命名为pGTO。
实施例3、转基因油菜的获得
植物材料：油菜中双4号
一、植物表达载体pRAD3301和pGTO
将构建好的通过热激法转化根癌农杆菌LBA4404。具体方法如下：
1)采用Promega公司的WizardTM plus minipreps DNA purification system，提取质粒DNA加入到100μLLBA4404感受态细胞中，混匀，冰浴5min。
2)将离心管置液氮中冷冻5min，迅速转至37℃水浴中温浴5min。
3)加入1mL YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm复苏4-5h。
4)取适量菌液涂布到含利福平50mg/L和Kan(卡那霉素)100mg/L的YEB固体培养基上，置28℃培养24-48h。
挑取单菌落碱裂解法提取质粒DNA筛选不同的重组子，转化E.coli JM109，(具体方法同上)，酶切验证将pRAD3301、pGTO转化到根癌农杆菌LBA4404中。
二、in planta方法转化油菜
从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5mLYEB液体培养基中(Kan 100mg/L+Rif 50mg/L)，振荡培养过夜，取1mL菌液接种到50mL YEB液体培养基(Kan 100mg/L+Rif 50mg/L)中，剧烈振荡培养至OD600为0.4-0.5(约3-4h)，2100g离心5min，菌体MS0培养基洗一次，重悬，使OD660＝1～1.5。
将上述的农杆菌悬浮液在5000×g下离心10min，沉淀后的农杆菌用1L新鲜的LB培养基重新悬浮。为提高侵染的转化效率，添加了0.5％的表面活性物质有机硅和5％的蔗糖。用农杆菌悬浮液直接浸染油菜花序。选择花即将开放且没有露水和泥土的的分枝，剪去分枝上已经开放的花。将枝条弯曲，使整个花序浸泡在盛有菌液的烧杯中，上下摇动1min左右。在确保所有花都已被浸染后，用杂交袋将处理过的花序套住。整个过程自第一次浸染后每天进行一次，共5-10次。每次浸染选择清晨和傍晚进行，以避免太阳紫外线过强使农杆菌活性降低。雨天暂停浸染。
待种子成熟时，将经过in planta处理过的分枝剪下单独收获种子，晒干后脱粒储藏。
三、基因打靶转基因油菜的筛选
将in planta处理获得种子灭菌后均匀播撒于含有270mg·L-1卡那霉素和500mg·L-15-氟胞嘧啶的MS固体培养基上。四到五天后，in planta方法获得的种子在含卡那霉素和5-氟胞嘧啶的MS培养基上萌发出幼苗。萌发的幼苗中转入外源基因者具有卡那霉素抗性，可以正常存活；未转入外源基因的幼苗不具有卡那霉素抗性，子叶叶片边缘褐化，在子叶及第一片真叶表面出现白斑，叶柄变紫变红，最终死掉。CodA蛋白可将无毒5-氟胞嘧啶转化为有毒的5-氟脲嘧啶。转基因油菜中非同源重组的转基因油菜由于CodA蛋白而将非同源重组的转基因油菜杀死。将存活下来的幼苗移栽至营养钵，经DNA检测确信外源基因的存在后移至土壤中。
Claims (7)
1.油菜oleosin基因5’UTR序列，是下列序列之一：
1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；
2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO：1由1900个碱基组成。利用染色体步移技术，克隆得到1900bp油菜oleosin基因5’UTR；
2.含有权利要求1所述核苷酸序列构建的表达载体，转基因细胞系和宿主菌。
3.利用权利要求2构建的植物表达载体在甘蓝型油菜中基实现油菜染色体替换，在转基因油菜籽油体中特异、超高量表达鲑鱼降钙素蛋白的方法。
4.根据权利要求3所述的方法，该方法通过使编码芝麻oleosin+sCT融合蛋白的目的基因通过同源重组的方式，靶向整合到油菜基因组中，并在油菜油体中特异地、超高量地表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其中的目的蛋白包括但不限于芝麻oleosin+sCT融合蛋白、sCT、突变型sCT、高胰血糖素类似肽GLP-1等医用或工业用蛋白。
6.根据权利要求3、4所述的方法所获得的表达目的蛋白的转基因植物包括根、茎、叶、花、果、种子等所有植物体部分和细胞、组织等。
7.根据权力要求6获得的油菜作为亲本杂交或转育所产生的植物。
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