CN102369213A

CN102369213A - 纯化方法

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Publication number: CN102369213A
Application number: CN2010800144671A
Authority: CN
Inventors: L.E.布拉克威尔; J.卡梅伦; P.H.莫顿
Original assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 2009-02-06
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2012-03-07
Also published as: US20110294988A1; EP2393834A1; EP2393834B1; JP2012516878A; DK2393834T3; EP2617733A1; WO2010089385A1

Abstract

用于纯化转铁蛋白溶液的方法和纯化方法的产物。用于生产转铁蛋白的方法和生产方法的产物。转铁蛋白在细胞培养物中的用途，作为药物组分，作为药物产物的用途和在细胞培养基中的用途。

Description

纯化方法

对序列列表的引用

本发明包含计算机可读形式的序列列表。计算机可读形式通过提述并入本文。

发明领域

本发明涉及纯化转铁蛋白溶液的方法。本发明还涉及纯化方法的产物。术语“转铁蛋白”指转铁蛋白和转铁蛋白样(transferrin-like)蛋白。

发明背景

本说明中对在先发表文件的罗列或讨论不应视为承认该文件是本领域当前技术的一部分或者是普通常识。

转铁蛋白是已知可调节细胞对铁的生物可用性的蛋白，其支持关键的代谢过程如DNA合成和氧运输。人血清转铁蛋白(HST)是正常人血清中的主要铁结合蛋白，以约2-4g/l的浓度存在(van Campenhout等，2003，Free Radic.Res.，37，1069-1077)。血清转铁蛋白目前源自牛或人来源，并且是在商业规模哺乳动物细胞培养中使用的常用补充物。随着管理部门在生物制品生产中降低动物来源组分的压力不断增加，重组转铁蛋白对于无血清、大规模哺乳动物细胞培养工业是合意的。

更具体地，人血清转铁蛋白是678个氨基酸的单体糖蛋白，相对分子量为约80kDa。每分子转铁蛋白能够强烈地结合一个或两个铁离子。

已经描述了通过层析从血清纯化转铁蛋白，例如在Rivat等(1992)Journalof Chromatography，576：71-77，US 6,251,860；US 5,744,586和US 5,041,537中。在PCT/EP2008/060482和US 5,986,067中已经描述了从酵母纯化重组转铁蛋白。也可以在其它宿主中，如在植物中产生转铁蛋白。

无论何种来源的转铁蛋白，其为动物、人或重组的，理想的是在从所述来源纯化转铁蛋白的过程中回收最大量的转铁蛋白。然而，目前纯化转铁蛋白的方法不能获得足够高的纯化转铁蛋白产量。因此，需要改进的转铁蛋白纯化方法。

发明简述

本发明提供可获得增加的转铁蛋白产量的层析纯化方法。已经发现纯化方法的两个步骤特别有益。这两个步骤可以单独或一起使用。

因此，本发明提供从相对不纯的转铁蛋白溶液中纯化转铁蛋白的改进方法。方法可以包括阴离子层析步骤和阳离子层析步骤中的一个或两个。

本发明还提供通过纯化方法纯化的转铁蛋白和通过纯化方法纯化的转铁蛋白的用途。

附图简述

图1显示转铁蛋白溶液中含有(A)0和(B)824mol/摩尔(5.4mM)硼酸盐时Capto^TMQ层析的A254nm的迹线(trace)，所述溶液加载到层析柱上。

图2是宿主细胞蛋白清除率为至少275倍并且回收率至少60％的SP-FF低pH，高盐洗涤2设计空间的覆盖图(overlay plot)图示。

发明详述

本发明的第一个方面提供用于纯化转铁蛋白溶液(转铁蛋白溶液可以视为“初始材料”)的方法，所述方法包括：

a)向相对不纯的转铁蛋白溶液加入四硼酸盐，提供转铁蛋白和四硼酸盐的溶液；

b)使转铁蛋白和四硼酸盐的溶液经过转铁蛋白对其没有特异的结合活性的阴离子层析材料，使转铁蛋白与所述材料结合；

c)洗涤结合转铁蛋白的层析材料；

d)任选地，进一步洗涤结合转铁蛋白的层析材料；和

e)任选地，从所述阴离子层析材料回收转铁蛋白。

优选地，使用洗涤溶液(其浓度低于步骤(d)的洗涤中使用的洗涤溶液的浓度)进行步骤(c)的洗涤。例如，“低于”可以指低至少5、10、25、30或50％和/或至少5、10、20、30、40或50mM或者至少2、3、4、5或10倍。

更具体地，用于纯化转铁蛋白溶液的方法可以包含如下步骤：

a)向相对不纯的转铁蛋白溶液加入四硼酸盐，以至少1摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白，例如至少20摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白的比例提供转铁蛋白和四硼酸盐的溶液；

b)将转铁蛋白和四硼酸盐的溶液施于转铁蛋白对其没有特异的结合亲和性的阴离子层析材料，从而使转铁蛋白与所述材料结合；

c)用0.1至30mM，例如0.1-20mM的四硼酸盐溶液洗涤所述层析材料；

d)随后用5至60mM，例如30-60mM或至少30mM的四硼酸盐溶液洗涤层析材料；和

e)任选地，从所述阴离子层析材料回收转铁蛋白。

术语“没有特异的结合活性”指，优选地，转铁蛋白不以抗体-抗原结合方式与层析材料结合。

在将转铁蛋白溶液加载于阴离子层析材料上之前向转铁蛋白溶液加入四硼酸盐的令人惊异的优势是增加了材料对转铁蛋白的加载容量。加载容量可以增加2倍、3倍或者更多。因此可以在指定量的基质上加载更多的转铁蛋白，和/或可以降低穿透物(flow-through)中损失的转铁蛋白量。优选地，以1摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白至1000摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白的比例加入四硼酸盐，例如，以从或高达处于或大约1、10、15、20、30、50、100、200、300、400、450、500、600、700、800、900或1000mol/mol的比例加入。优选的比例是20-1000摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白。在将转铁蛋白加载于阴离子层析材料之前向转铁蛋白加入四硼酸盐的优势可以单独利用或者与上文公开的纯化方法的洗涤步骤组合。例如，可以使用四硼酸盐单独增加阴离子交换基质的转铁蛋白结合容量，或者与使用该基质的纯化方法组合来进行。

步骤(c)的洗涤中使用的四硼酸盐溶液的浓度可以为处于或大约0.1mM至处于或大约30mM。例如，步骤(c)中使用的四硼酸盐溶液的浓度可为处于或大约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM或25mM至处于或大约0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM。更特别地，(c)的四硼酸盐溶液的浓度可为处于或大约2.5至处于或大约7.5mM，最特别为处于或大约5mM。

步骤(d)的洗涤中使用的四硼酸盐溶液的浓度可为处于或大约5mM至处于或大约60mM。例如，(d)中使用的四硼酸盐溶液的浓度为处于或大约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或55mM至处于或大约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM或60mM。更具体地，(d)的四硼酸盐溶液的浓度可为处于或大约20至处于或大约40mM，最特别地为处于或大约30mM。

在更高浓度洗涤，如步骤(d)的洗涤之前，进行低浓度“预洗涤”，如步骤(c)的洗涤的令人惊异的优势，是这种方案可以降低高浓度洗涤过程中转铁蛋白的损失。优选地，“浓度”是“四硼酸盐浓度”。

四硼酸盐可以是I族金属的四硼酸盐，如四硼酸钾或四硼酸钠。优选的四硼酸盐是四硼酸钾。

可以通过洗脱从阴离子层析材料回收转铁蛋白，例如通过改变pH和/或增加导电性。洗脱溶液的pH可以低于或等于pH 5.2和/或导电性大于或等于2.5mS.cm^-1。可替换的洗脱液包含110mM四硼酸钾或四硼酸钠。

优选地，阴离子层析材料包含功能性配体，其为强阴离子交换剂或者弱阴离子交换剂。功能性配体可以是离子。强阴离子交换剂的实例包括季胺基团(”Q”)，即-N⁺(CH₃)₃如Q Sepharose Fast Flow(Q-FF)和Capto Q(均可从GEHealthcare，Little Chalfont，UK获得)、UNOsphere^TM Q(Bio-Rad，HemelHempstead，UK)、

SuperQ(TosoH Corporation，Tokyo，Japan)、QCeramic (Pall，Portsmouth，UK)和

50 HQ(AppliedBiosystems Inc.，Foster City，CA，USA)。弱阴离子交换剂的实例包括二乙基氨基烷基基团如二乙基氨基乙基基团(“DEAE”，也称作“DE”)，即-N⁺H(CH₂CH₃)₂如DEAE Sepharose Fast Flow(DE-FF；可从GE Healthcare获得)。在‘Liquid column chromatography：a survey of modern techniques andapplications’(1975，344-351页，编者：Zdeněk Deyl，Karel Macek，Jaroslav Janak，Publisher：Elsevier)和‘Protein liquid chromatography’(2000，18-21页，编者：Michael Kastener，Publisher：Elsevier)中描述了更多的强和弱阴离子交换剂，所述两篇文献均通过提述并入本文。

弱阴离子交换剂可以受益于步骤(c)和(d)中洗涤缓冲液的使用，其浓度低于强阴离子交换剂使用的洗涤缓冲液的浓度。

优选地，将转铁蛋白溶液以约0.01mg转铁蛋白每mL层析基质至约100mg.mL^-1加载于阴离子层析材料上，例如约从处于或大约0.01、0.1、1、10、20、30、40、50、60、70、80或90mg.mL^-1至处于或大约0.1、1、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg.mL^-1。优选的加载参数是处于或大约10至处于或大约100mg.mL^-1。特别优选的载入参数是处于或大约30mg.mL^-1。

优选地，加载于阴离子层析基质的转铁蛋白溶液的pH为约pH 8-10，如约pH 8.0-10.0，更优选约pH 9.0-9.4。

在将含转铁蛋白材料加载于阴离子层析材料之前，可以用例如一种或多种强度的四硼酸盐溶液平衡阴离子层析材料，例如110mM四硼酸钾和/或30mM四硼酸钾。四硼酸钾可以部分或全部由不同的四硼酸盐代替，如I族金属的四硼酸盐，如四硼酸钠。

本发明的第二方面提供用于纯化转铁蛋白溶液的方法(转铁蛋白溶液可以视为“初始材料”)，该方法包括阳离子层析步骤，其包含步骤：

a)将相对不纯的转铁蛋白溶液施于转铁蛋白对其没有特异的结合亲和性的阳离子层析材料，从而使转铁蛋白与所述材料相结合；

b)用pH为约4至约5和盐浓度为200mM或更低的洗涤缓冲液洗涤所述层析材料；

c)随后用pH为约4至约5和盐浓度为约50mM至约5M的洗涤缓冲液洗涤所述层析材料；和

d)任选地，从阳离子层析材料回收转铁蛋白。

优选地，阳离子层析步骤的步骤(b)的洗涤缓冲液的pH为处于或大约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8或4.9至处于或大约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0，最优选为处于或大约pH 4.5。

优选地，阳离子层析步骤的步骤(b)的洗涤缓冲液总盐浓度为约10mM至约200mM，更优选为约50mM。更优选地，可提供阳离子层析步骤的步骤(b)的洗涤缓冲液的缓冲活性的盐浓度为约10mM至约200mM，更优选为约50mM。优选地，步骤(b)的洗涤缓冲液除了提供缓冲效果的盐(即“缓冲盐”)基本不含盐，并且最优选不含除缓冲盐之外的盐。术语“基本不含”表示除缓冲盐之外的盐的水平不可检测，和或足够低以至于相对于完全不含除缓冲盐之外的盐的洗涤缓冲液，对洗涤缓冲液没有影响。例如，优选步骤(b)的洗涤缓冲液基本不含氯化钠。

优选的是，阳离子层析步骤的步骤(c)的洗涤缓冲液的pH为处于或大约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8或4.9至处于或大约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0，最优选为处于或大约pH 4.5。

优选地，阳离子层析步骤的步骤(c)的洗涤缓冲液的盐浓度为约40mM至约5M，例如从处于或大约50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、500mM、1M、1.25M、1.5M、1.75M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M或4.5M至处于或大约100mM、150mM、200mM、250mM、500mM、1M、1.25M、1.5M、1.75M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M或5M，更优选为处于或大约250mM至处于或大约2M，最优选为处于或大约2M。优选的是，步骤(c)的洗涤缓冲液的盐浓度高于步骤(b)的洗涤缓冲液。“高于”的实例包括高大于或等于5、10、20、30、40、50、100、150mM。

阳离子层析步骤的步骤(c)的优选洗涤缓冲液提供至少60、70、80、90、95或100％的回收率和至少200、225、250、275、300、325、350、375或400倍的宿主细胞蛋白(HCP)清除率(例如酵母抗原清除率)。特别优选的洗涤缓冲液提供至少60、70、80、90、95或100％的回收率和至少200、225、250、275、300、325、350、375或400倍的HCP(例如YA)清除率，并且通过其满足下述等式的一个或多个(优选两个)来定义：

回收率＝-940.50069+(441.61018×p)+(0.043309×s)-(47.57735×p²)-(0.010263×p×s)

HCP(例如YA)清除率＝16388.65744-(10512.30681×p)-(1.70101×s)+(2257.17601×p²)+(0.78628×p×s)-(159.06573×p³)-(0.090182×p²×s)

在上述公式中，p＝pH并且s＝以mM表示的盐浓度，回收率是％回收率(例如重量/重量)。

例如，洗涤缓冲液可以提供至少60％的回收率和至少275倍的HCP(例如YA)清除率。提供至少60％的回收率和至少275倍的HCP(例如YA)清除率的洗涤缓冲液的参数可以通过下式定义：

回收率(％)：60＝-940.50069+(441.61018×p)+(0.043309×s)-(47.57735×p²)-(0.010263×p×s)

HCP(例如YA)清除率(倍)：275＝16388.65744-(10512.30681×p)-(1.70101×s)+(2257.17601×p²)+(0.78628×p×s)-(159.06573×p³)-(0.090182×p²×s)

在上述公式中，p＝pH并且s＝以mM表示的盐浓度。

回收率(％)可以是重量/重量。术语“宿主细胞蛋白”是技术人员公知的。宿主细胞蛋白包括对于宿主细胞为天然的和由宿主细胞产生的蛋白，其可以蛋白质中污染物存在，如由宿主细胞产生的异源蛋白。理想的是降低或消除存在于由宿主细胞产生的产物中的宿主细胞蛋白的量。对于酵母宿主细胞，宿主细胞蛋白可称为“酵母抗原”。

可以在图中绘制pH、盐浓度、HCP(例如YA)清除率和回收率，例如覆盖图。图2显示了一张覆盖图的实例。此图给出了“设计空间”的视图。设计空间代表实现理想回收率(％)和HCP(例如YA)清除率(倍)的pH和盐浓度的组合。可以对理想回收率和HCP(YA)清除率的任何组合产生(“定义”)设计空间。

设计空间是提供理想回收率和HCP(例如YA)清除率的pH和盐浓度的组合的最精确定义。然而，也可以通过由一个或多个矩形区描述至少一部分，并且优选重要部分(significant part)的设计空间而近似描述所述组合。例如，通过60％或更多的回收率和275倍或更多的HCP(例如YA)清除率定义的设计空间可以用(i)pH 4.3-5.0，50-1100mM盐，(ii)pH 4.0-4.7，1100-5000mM盐，(iii)pH 4.7-5.0，1100-2270mM盐，(iv)pH 4.7-4.8，2270-3900mM盐，(v)pH4.8-4.9，2270-2990mM盐和(vi)pH 4.7-4.75，3900-4345mM盐中的一个或多个近似描述。优选地，通过(i)至(iv)，更优选通过(i)至(v)并且最优选通过(i)至(vi)来近似描述设计。合适的盐包括单价和二价金属和铵盐。对于阳离子层析步骤的一种优选盐是NaCl。

步骤(c)的洗涤缓冲液可以或可以不包含两种或多种盐。例如，步骤(c)的洗涤缓冲液可以或可以不包含乙酸钠和NaCl。乙酸钠可以处于或大约27mM存在。

低pH/高盐洗涤的令人惊异的优势，如上所述，是改善通过阳离子基质的HCP清除率，例如酵母抗原清除率，而不显著降低从基质回收转铁蛋白的回收率。这与使用高盐洗涤的预期正好相反，其会导致转铁蛋白从基质上不理想的高度损失。

可以通过洗脱从阳离子层析材料回收转铁蛋白，例如用pH和/或导电性的变化和/或加入特定洗脱剂。洗脱溶液可包含磷酸钠和或氯化钠。例如磷酸钠可以处于或大约50mM存在。氯化钠可以处于或大约150mM存在。洗脱溶液的pH可以为处于或大约pH 6，例如处于或大约pH 6.0。

阳离子层析步骤可以在回收转铁蛋白之前包含进一步的，例如第三次洗涤。优选地，在步骤(c)的洗涤步骤之后进行进一步的洗涤步骤。优选地，在步骤(c)的洗涤步骤之后立即进行进一步的洗涤步骤，例如没有***步骤。可以使用50mM乙酸钠pH 5.0-5.2(优选pH 5.1)的洗涤缓冲液进行进一步洗涤，所述缓冲液优选导电性为2.5-3.1mS.cm^-1。

优选地，以高达100mg转铁蛋白每mL层析材料，例如处于或大约10、20、30、40、50、60、70、80或90mg.mL^-1至处于或大约20、30、40、50、60、70、80、90或100mg.mL^-1，更优选以约30至约50mg.mL^-1将转铁蛋白溶液加载于阳离子层析材料。

优选地，阳离子层析材料包含其为强阳离子交换剂的功能性配体。强阳离子交换剂的实例包括含磺基基团，即-SO₃ ^-，例如SP Sepharose Fast Flow(SP-FF)和S-Spheradex；(均可从GE Healthcare获得)，SP-Spherosil，SE-Cellulose。特别优选的阳离子层析材料是SP Sepharose Fast Flow。阳离子层析材料可包含其为弱阳离子交换剂的功能性配体，这种材料包括，CM-Sepharose FF或CM-Cellulose。在‘Liquid column chromatography：a surveyof modern techniques and applications’(1975，344-351页，Editors：Zdeněk Deyl，Karel Macek，Jaroslav Janák，Publisher：Elsevier)和‘Protein liquidchromatography’(2000，18-21页，编者：Michael Kastener，Publisher：Elsevier)描述了更多的强和弱阳离子交换剂。

在加载(例如，步骤(a))之前，可以用例如50mM乙酸钠(处于或大约pH 4至pH6，如处于或大约pH 4.0至pH6.0，例如处于或大约pH 5.0至处于或大约5.2，优选处于或大约pH 5.1，并且导电率为处于或大约2.5至处于或大约3.1mS.cm^-1)平衡阳离子层析材料。

回收转铁蛋白后，可以在材料的保存和/或再使用之前净化阳离子和/或阴离子层析材料。用于净化层析材料的技术在本领域中已知。

本发明的第三方面提供用于纯化转铁蛋白溶液的方法，所述方法包括根据本发明的第二方面的阳离子步骤和根据本发明的第一方面的阴离子层析步骤。优选地，阳离子步骤之后是阴离子步骤。可替换地，阳离子步骤可以在阴离子步骤之后。优选地，阳离子之后立即进行阴离子步骤，例如没有***步骤。任选地，在阳离子和阴离子步骤之间可以进行其它步骤。阳离子步骤的洗脱液在进行阴离子步骤之前可以或可以不稀释。

优选地，进行本发明的纯化的转铁蛋白溶液基本上，或者完全，不含颗粒如细胞和细胞碎片。“基本上不含”表示溶液中存在的任何颗粒对纯化方法没有显著的负面影响。优选地，相对于完全不含颗粒的溶液，存在的任何颗粒不会将纯化方法的收率降低多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0.1％。

从本发明的第一、第二或第三方面的方法获得的最终的含转铁蛋白溶液可以或可以不进行一个或多个进一步的步骤如纯化步骤。这种进一步的步骤可以在本发明的第一、第二或第三方面的一个或多个步骤之前进行。例如，本发明的第一和第二方面可以由一个或多个进一步的步骤分开。

一个或多个进一步的纯化步骤可选自：阴离子交换层析、阳离子交换层析、缓冲液交换、浓缩、稀释、去除金属离子如铁离子、透析、渗滤、pH调节(例如用含四硼酸盐和碱的溶液，如四硼酸钾和氢氧化钠，特别是250mM四硼酸钾和0.5M氢氧化钠)、用还原剂处理、脱色处理(例如用木炭)，例如去除酵母来源和/或基质来源的着色剂、加热(包括灭菌)、冷却、调节、超滤、细胞分离技术、如离心，细胞破裂的过滤(例如错流过滤、膨胀床层析等)方法，包括珠磨、超声、酶处理等，硫酸铵沉淀，乙醇沉淀，酸提取，溶剂提取，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析，凝集素层析，金属亲和/螯合层析，高效液相层析(“HPLC”)，反相HPLC，导电率调整，将转铁蛋白碱沉淀至亲脂相等。特别优选超滤。“调节”包括调整pH和导电率中的一个或多个和/或加入固体和/或组分。超滤可使用10000的标称分子量截留值。从本发明的第一、第二或第三方面的方法回收的转铁蛋白可以调整pH至pH 6.7-7.3，例如通过加入乙酸进行。随后可将调整pH的转铁蛋白浓缩和/或针对NaCl溶液渗滤。在渗滤结束时，可进一步浓缩渗余物。

上述技术中的任何一个或多个可以或可以不用于进一步将分离的蛋白质分离至商业或工业可接受的纯度水平。通过商业或工业可接受的纯度水平，我们包括转铁蛋白供应产物，其中其它材料(例如，一种或多种污染物)存在的水平低于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％或0.000001％和，最优选0％的水平。

通过相对粗糙的纯化方法可以获得商业或工业可接受的纯度水平，通过所述方法，将所选的蛋白质产物制成适合其预定用途的形式。已经纯化成商业或工业可接受的纯度水平的蛋白制备物可以，除了所选的蛋白产物，还包含，例如，细胞培养组分如宿主细胞或来源于其的碎片。可替换地，可以或可以不去除(如通过过滤或离心)高分子量成分(如宿主细胞或来源于其的碎片)以获得组合物，所述组合物包含所选的蛋白产物和，任选地，来自细胞培养过程的功能上可接受水平的低分子量污染物。

可以或可以不纯化蛋白以实现药物可接受的纯度水平。如果基本上不含热原质，那么蛋白具有药物可接受的纯度水平，并且能用于预定目的，并因此可以以药物有效量施用而不引起与蛋白活性无关的药物作用。

可以至少10^-4g.L^-1、10^-3g.L^-1、0.01g.L^-1、0.02g.L^-1、0.03g.L^-1、0.04g.L^-1、0.05g.L^-1、0.06g.L^-1、0.07g.L^-1、0.08g.L^-1、0.09g.L^-1、0.1g.L^-1、0.2g.L^-1、0.3g.L^-1、0.4g.L^-1、0.5g.L^-1、0.6g.L^-1、0.7g.L^-1、0.8g.L^-1、0.9g.L^-1、1g.L^-1、2g.L^-1、3g.L^-1、4g.L^-1、5g.L^-1、6g.L^-1、7g.L^-1、8g.L^-1、9g.L^-1、10g.L^-1、15g.L^-1、20g.L^-1、25g.L^-1、30g.L^-1、40g.L^-1、50g.L^-1、60g.L^-1、70g.L^-1、80g.L^-1、90g.L^-1、100g.L^-1、150g.L^-1、200g.L^-1、250g.L^-1、300g.L^-1、350g.L^-1、400g.L^-1、500g.L^-1、600g.L^-1、700g.L^-1、800g.L^-1、900g.L^-1、1000g.L^-1的浓度提供转铁蛋白产物。

通过本发明的第一、第二或第三方面的方法获得的含转铁蛋白溶液可以进一步纯化和/或配制用于人类静脉内施用和/或提供作为细胞培养物组成和/或灭菌和/或放在最终容器中。

优选的是，将通过本发明的第一、第二或第三方面获得的含转铁蛋白溶液悬浮在液体中，例如缓冲液溶液，其适合转铁蛋白的最终用途。这种溶液包括氯化钠溶液，例如145mM NaCl。

本发明的第一、第二或第三方面的方法之后可以进行一个或多个下述步骤：发酵、初步分离、浓缩物调节、亲和分离、金属螯合分离、疏水分离、液/液提取、沉淀、超滤、尺度排阻分离和/或混合模式分离。

在本发明的第一、第二或第三方面的阳离子层析步骤和/或阴离子层析步骤之前和/或之后可以或可以不将转铁蛋白饱和化(holoize)。在本发明的第一、第二或第三方面的阳离子层析步骤和/或阴离子层析步骤之前和/或之后可以或可以不将转铁蛋白脱辅基化(apoize)。即，进行纯化过程的转铁蛋白可以是脱辅基-转铁蛋白，部分铁饱和转铁蛋白或饱和-转铁蛋白。

本领域已知饱和和脱辅基技术。可以通过加入碳酸氢钠和铁(例如柠檬酸铵铁的形式)至2摩尔Fe³⁺每摩尔转铁蛋白并在环境温度(例如20至25℃)温育至少一个小时，可以将转铁蛋白饱和化。可以在存在螯合剂的情况下在低pH将转铁蛋白脱辅基。例如可以通过加入1份转铁蛋白溶液比9份脱辅基溶液并将获得的混合物在4℃过夜搅拌温育，从而将转铁蛋白脱辅基。脱辅基溶液可以包含100mM乙酸钠、100mM柠檬酸钠、10mM EDTA于pH 4.5。

可以从血液来源或重组来源如原核(例如细菌)或真核(例如真菌、动物、昆虫或植物)获得相对不纯的转铁蛋白。相对不纯的转铁蛋白溶液的优选来源是微生物细胞，如真菌细胞(优选酵母细胞如酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)))或细菌细胞(例如芽孢杆菌属(Bacillus)或大肠杆菌(Escherichia coli))，哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)或幼仓鼠肾(BHK)细胞)，或者来自血液或血液级分如血清。血液或血液级分可以是人或动物来源(如牛来源)。

本发明的“转铁蛋白”可以是具有铁结合能力的任何蛋白，其属于转铁蛋白家族，如Lambert等，Comparative Biochemistry and Physiology，Part B，142(2005)，129-141和Testa，Proteins of iron metabolism，CRC Press，2002；Harris & Aisen，Ironcarriers and iron proteins，Vol.5，Physical Bioinorganic Chemistry，VCH，1991所述。

转铁蛋白家族蛋白质的实例是血清转铁蛋白、卵转铁蛋白/黑素转铁蛋白和乳铁蛋白及其衍生物和变体，如突变转铁蛋白(Mason等，(1993)Biochemistry，32，5472；Mason等，(1998)，Biochem.J.，330，35)、截短转铁蛋白、转铁蛋白lobe(Mason等，(1996)Protein Expr.Purif.，8，119；Mason等，(1991)Protein Expr.Purif.，2，214)、突变乳铁蛋白、截短乳铁蛋白、乳铁蛋白叶、突变卵转铁蛋白、截短卵转铁蛋白、黑素转铁蛋白叶、截短黑素转铁蛋白或任何上述蛋白与其它肽、多肽或蛋白的融合体(Shin等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，2820；Ali等，(1999)J.Biol.Chem.，274，24066；Mason等，(2002)Biochemistry，41，9448)。优选血清转铁蛋白，特别是人血清转铁蛋白(HST)，其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，有679个氨基酸，也称作C1变体(登录号NP_001054)。优选乳铁蛋白，特别是人乳铁蛋白，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，有691个氨基酸。优选黑素转铁蛋白，特别是人黑素转铁蛋白，其具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列残基20-738。

术语“转铁蛋白”还包括转铁蛋白的天然和工程化变体，例如转铁蛋白的融合体和结合体和能进行结合的转铁蛋白，如“硫代转铁蛋白(thio-transferrins)”。在WO2008/152140和PCT/EP2008/060482中描述了实例，所述文献均通过提述并入本文。转铁蛋白的结合体，例如“硫代转铁蛋白“可以根据PCT/EP2008/060482和“Protein Formulation and Delivery”，E.J.McNally(编)，由Marcel Dekker Inc.New York 2000出版和“Rational Design ofStable Protein Formulations-Theory and Practice”；J.F.Carpenter和M.C.Manning(编)Pharmaceutical Biotechnology Vol 13.Kluwer Academic/PlenumPublishers，New York 2002，Yazdi和Murphy，(1994)Cancer Research 54，6387-6394，Widera等，(2003)Pharmaceutical Research 20，1231-1238；Lee等，(2005)Arch.Pharm.Res.28，722-729制备。要求保护的本发明转铁蛋白或通过本发明的方法纯化的转铁蛋白可以或可以不是如本文所述的转铁蛋白的天然或工程化变体。例如，转铁蛋白可以或可以不具有一个或多个可与其它分子缀合的硫醇基团。

[SEQ ID No.1]

VPDKTVRWCA VSEHEATKCQ SFRDHMKSVI PSDGPSVACV KKASYLDCIR AIAANEADAV 60

TLDAGLVYDA YLAPNNLKPV VAEFYGSKED PQTFYYAVAV VKKDSGFQMN QLRGKKSCHT 120

GLGRSAGWNI PIGLLYCDLP EPRKPLEKAV ANFFSGSCAP CADGTDFPQL CQLCPGCGCS 180

TLNQYFGYSG AFKCLKDGAG DVAFVKHSTI FENLANKADR DQYELLCLDN TRKPVDEYKD 240

CHLAQVPSHT VVARSMGGKE DLIWELLNQA QEHFGKDKSK EFQLFSSPHG KDLLFKDSAH 300

GFLKVPPRMD AKMYLGYEYV TAIRNLREGT CPEAPTDECK PVKWCALSHH ERLKCDEWSV 360

NSVGKIECVS AETTEDCIAK IMNGEADAMS LDGGFVYIAG KCGLVPVLAE NYNKSDNCED 420

TPEAGYFAVA VVKKSASDLT WDNLKGKKSC HTAVGRTAGW NIPMGLLYNK INHCRFDEFF 480

SEGCAPGSKK DSSLCKLCMG SGLNLCEPNN KEGYYGYTGA FRCLVEKGDV AFVKHQTVPQ 540

NTGGKNPDPW AKNLNEKDYE LLCLDGTRKP VEEYANCHLA RAPNHAVVTR KDKEACVHKI 600

LRQQQHLFGS NVTDCSGNFC LFRSETKDLL FRDDTVCLAK LHDRNTYEKY LGEEYVKAVG 660

NLRKCSTSSL LEACTFRRP 679

[SEQ ID No.2]

GRRRSVQWCA VSQPEATKCF QWQRNMRKVR GPPVSCIKRD SPIQCIQAIA ENRADAVTLD 60

GGFIYEAGLA PYKLRPVAAE VYGTERQPRT HYYAVAVVKK GGSFQLNELQ GLKSCHTGLR 120

RTAGWNVPIG TLRPFLNWAG PPEPIEAAVA RFFSASCVPG ADKGQFPNLC RLCAGTGENK 180

CAFSSQEPYF SYSGAFKCLR DGAGDVAFIR ESTVFEDLSD EAERDEYELL CPDNTRKPVD 240

KFKDCHLARV PSHAVVARSV NGKEDAIWNL LRQAQEKFGK DKSPKFQLFG SPSGQKDLLF 300

KDSAIGFSRV PPRIDSGLYL GSGYFTAIQN LRKSEEEVAA RRARVVWCAV GEQELRKCNQ 360

WSGLSEGSVT CSSASTTEDC IALVLKGEAD AMSLDGGYVY TAGKCGLVPV LAENYKSQQS 420

SDPDPNCVDR PVEGYLAVAV VRRSDTSLTW NSVKGKKSCH TAVDRTAGWN IPMGLLFNQA 480

GSCKFDEYFS QSCAPGSDPR SNLCALCIGD EQGENKCVPN SNERYYGYTG AFRCLAENAG 540

DVAFVKDVTV LQNTDGNNNE AWAKDLKLAD FALLCLDGKR KPVTEARSCH LAMAPNHAVV 600

SRMDKVERLK QVLLHQQAKF GRNGADCPDK FCLFQSETKN LLFNDNTECL ARLHGKTTYE 660

KYLGPQYVAG ITNLKKCSTS PLLEACEFLR K 691

[SEQ ID No.3]

MRGPSGALWL LLALRTVLGG MEVRWCATSD PEQHKCGNMS EAFREAGIQP SLLCVRGTSA 60

DHCVQLIAAQ EADAITLDGG AIYEAGKEHG LKPVVGEVYD QEVGTSYYAV AVVRRSSHVT 120

IDTLKGVKSC HTGINRTVGW NVPVGYLVES GRLSVMGCDV LKAVSDYFGG SCVPGAGETS 180

YSESLCRLCR GDSSGEGVCD KSPLERYYDY SGAFRCLAEG AGDVAFVKHS TVLENTDGKT 240

LPSWGQALLS QDFELLCRDG SRADVTEWRQ CHLARVPAHA VVVRADTDGG LIFRLLNEGQ 300

RLFSHEGSSF QMFSSEAYGQ KDLLFKDSTS ELVPIATQTY EAWLGHEYLH AMKGLLCDPN 360

RLPPYLRWCV LSTPEIQKCG DMAVAFRRQR LKPEIQCVSA KSPQHCMERI QAEQVDAVTL 420

SGEDIYTAGK TYGLVPAAGE HYAPEDSSNS YYVVAVVRRD SSHAFTLDEL RGKRSCHAGF 480

GSPAGWDVPV GALIQRGFIR PKDCDVLTAV SEFFNASCVP VNNPKNYPSS LCALCVGDEQ 540

GRNKCVGNSQ ERYYGYRGAF RCLVENAGDV AFVRHTTVFD NTNGHNSEPW AAELRSEDYE 600

LLCPNGARAE VSQFAACNLA QIPPHAVMVR PDTNIFTVYG LLDKAQDLFG DDHNKNGFKM 660

FDSSNYHGQD LLFKDATVRA VPVGEKTTYR GWLGLDYVAA LEGMSSQQCS GAAAPAPGAP 720

LLPLLLPALA ARLLPPAL 738

特别优选的转铁蛋白由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成或包含该序列。

[SEQ ID No.4]

VPDKTVRWCA VSEHEATKCQ SFRDHMKSVI PSDGPSVACV KKASYLDCIR AIAANEADAV 60

TLDAGLVYDA YLAPNNLKPV VAEFYGSKED PQTFYYAVAV VKKDSGFQMN QLRGKKSCHT 120

GLGRSAGWNI PIGLLYCDLP EPRKPLEKAV ANFFSGSCAP CADGTDFPQL CQLCPGCGCS 180

TLNQYFGYSG AFKCLKDGAG DVAFVKHSTI FENLANKADR DQYELLCLDN TRKPVDEYKD 240

CHLAQVPSHT VVARSMGGKE DLIWELLNQA QEHFGKDKSK EFQLFSSPHG KDLLFKDSAH 300

GFLKVPPRMD AKMYLGYEYV TAIRNLREGT CPEAPTDECK PVKWCALSHH ERLKCDEWSV 360

NSVGKIECVS AETTEDCIAK IMNGEADAMS LDGGFVYIAG KCGLVPVLAE NYNKADNCED 420

TPEAGYFAVA VVKKSASDLT WDNLKGKKSC HTAVGRTAGW NIPMGLLYNK INHCRFDEFF 480

SEGCAPGSKK DSSLCKLCMG SGLNLCEPNN KEGYYGYTGA FRCLVEKGDV AFVKHQTVPQ 540

NTGGKNPDPW AKNLNEKDYE LLCLDGTRKP VEEYANCHLA RAPNHAVVTR KDKEACVHKI 600

LRQQQHLFGS NVADCSGNFC LFRSETKDLL FRDDTVCLAK LHDRNTYEKY LGEEYVKAVG 660

NLRKCSTSSL LEACTFRRP 679

优选地，进行纯化的转铁蛋白不包含前导序列。例如，可以产生包含前导序列的转铁蛋白，并且在纯化前可以或可以不去除前导序列。可替换地，可以产生不包含前导序列的转铁蛋白。不含前导序列的转铁蛋白序列的实例在SEQ ID No.1和SEQ ID No.4中给出。

可以相对于天然存在的转铁蛋白或者转铁蛋白的已知工程化变体对转铁蛋白进行修饰。例如，转铁蛋白可以由与SEQ ID NO：1、SEQ ID No.2或SEQID No.3或SEQ ID No.4具有至少25％同一性的氨基酸序列组成，或包含所述序列，特别是至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。更特别地，可以与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或者最特别地与SEQ ID No.4具有100％同一性。

转铁蛋白家族蛋白的氨基酸序列长度可以为至少167个氨基酸，特别是至少300个氨基酸，630个氨基酸，691个氨基酸，694个氨基酸或695个氨基酸。长度通常最多为1274个氨基酸，特别是最多819个氨基酸，最多722个氨基酸，最多717个氨基酸或者最多706个氨基酸。特别地长度可以为679个氨基酸。可以是长度为691-717个氨基酸的脊椎动物转铁蛋白，或者是长度为695-706个氨基酸的哺乳动物转铁蛋白。

转铁蛋白家族蛋白，特别是长度为694-706个氨基酸的蛋白，通常包含两个域(称作N-和C-叶)，每个具有约331-341个残基并且各自结合一个Fe(III)和一个碳酸根阴离子，通过约7个残基的叶间接头连接。通常，每个铁与四个保守氨基酸残基配位：一个Asp、两个Tyr和一个His，并且碳酸根阴离子与Arg和Thr结合。

优选地，本发明中纯化的转铁蛋白家族蛋白与全长HST(SEQ ID NO：1的残基1-679)或HST的C-叶(SEQ ID NO：1的残基339-679)具有至少40％或至少60％同一性。HST主要的TfR受体识别位点在C-叶，并且通过蛋白分解而分离的HST C-叶能将铁离子传递给细胞。

人血清转铁蛋白可以是命名为TfC₁、TfC₂或TfC₃的变体。

已知转铁蛋白家族中存在很多蛋白，并且下面给出了非专一性列表。列表说明序列的全长，包括成熟蛋白和前导序列。这些转铁蛋白和其变体中的每一个都可以或可以不通过本发明的方法纯化。

表1：转铁蛋白的实例

转铁蛋白可以或可以不与蛋白或其它分子如生物活性化合物融合和/或结合。蛋白或其它分子，如生物活性化合物，可以或可以不具有治疗和/或诊断用途。在本上下文中，“融合体”包括蛋白，其中转铁蛋白和其它蛋白由相同的DNA序列编码，而“缀合体”包括蛋白，其中转铁蛋白包含通过任何其它方法与其结合的蛋白或其它分子，例如通过化学缀合。US 20030221201和20040023334描述了包含与治疗用蛋白融合的转铁蛋白的融合蛋白。转铁蛋白可以或可以不同时是融合和缀合的转铁蛋白。

转铁蛋白可以或可以不是治疗性或诊断性转铁蛋白。“治疗性转铁蛋白”是适用于预防性疗法或治愈性疗法的转铁蛋白，例如治疗贫血。“诊断性转铁蛋白”是适用于诊断的转铁蛋白，例如转铁蛋白可以与抗体或标签融合或缀合，所述标签如适用于成像的标签或造影剂。诊断性转铁蛋白可以体内或体外使用。

治疗性转铁蛋白可以包含用于癌症化疗的化疗药物。它可以是细胞抑制性的或细胞毒性的；可以是肿瘤抑制剂。

生物活性化合物可以是多肽(蛋白)，特别是重组蛋白药物。它可以是用于治疗癌症和/或其它相关疾病的化疗或放疗药物。

生物活性化合物可以与转铁蛋白的游离硫醇相缀合。生物活性化合物包括但不限于，肽、多肽或蛋白(天然、重组或合成)。游离硫醇可以位于半胱氨酸残基上。

本发明的第四方面包含产生转铁蛋白的方法，所述方法包括在例如细胞中表达转铁蛋白，特别是在真菌细胞如酵母细胞中表达，并且根据本发明的第一、第二或第三方面纯化获得的转铁蛋白。

本发明的第五方面包含将根据本发明的第一、第二、第三或第四方面纯化的转铁蛋白冻干的步骤。

本发明的第六方面提供通过根据本发明的第一、第二、第三、第四或第五方面的方法获得的或可获得的纯化的转铁蛋白。

本发明的第七方面涉及根据本发明的第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的转铁蛋白在治疗(预防性和/或治愈性)或诊断中的用途。例如，转铁蛋白可以用于白血病治疗中以预防患者体内未结合转铁蛋白的铁的有害影响。转铁蛋白，例如融合或缀合的转铁蛋白，可以用于靶向，例如肿瘤的诊断、成像、定位和/或治疗中。

本发明的第八方面涉及根据本发明的第一、第二、第三、第四、第五或第六方面，转铁蛋白在细胞培养物如哺乳动物细胞培养物中，特别是人细胞培养物中的用途。细胞培养物可以是实验室或工业规模。本发明还涉及包含根据本发明的第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的转铁蛋白的细胞培养基。本发明还包括这种细胞培养基的制造。

本发明的第九方面提供药物组合物，其包含根据本发明的第一、第二、第三、第四或第五方面纯化的转铁蛋白和药物可接受的载体和/或稀释剂。因此，纯化的转铁蛋白可以与载体或稀释剂一起调配。由此调配得到的转铁蛋白可以任选地以单位剂量形式呈现。载体或稀释剂必须在与期望的蛋白相容的意义上来讲是“可接受的”。通常，载体或稀释剂是无菌并且不含热原的水或盐水。本发明还包括提供根据本发明的转铁蛋白用作药物成分。转铁蛋白可以或可以不与另一个分子融合或结合，所述分子可以或可以不是生物活性分子。

对于“起始材料”(即相对不纯的转铁蛋白溶液，通过本发明的方法可以由其纯化转铁蛋白)，可以通过本领域已知的方法制备转铁蛋白或转铁蛋白与另一个蛋白或另外多个蛋白的融合体(Sanker，(2004)，Genetic Eng.News，24，22-28，Schmidt，(2004)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，65，363-372)。所述方法包括但不限于在来自细胞系如CHO(及其变体)、NS0、BHK、HEK293、Vero或PERC6细胞的哺乳动物细胞培养中通过转化或瞬时表达而表达(Mason等，(2004)，ProteinExpr.Purif.，36，318-326；Mason等，(2002)，Biochemistry，41，9448-9454)；在昆虫细胞培养(Lim等，(2004)Biotechnol.Prog.，20，1192-1197)、来自如浮萍属(Lemna)植物的植物细胞培养、转基因动物(Dyck等，(2003)Trends in Biotechnology，21，394-399)、转基因植物(Ma等，(2003)Nature Reviews Genetics，4，794-805)、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌如芽孢杆菌属和大肠杆菌(Steinlein和Ikeda，(1993)，Enzyme Microb.Technol.，15，193-199)、丝状真菌包括但不限于曲霉属(Aspergillus)菌种(EP 238023，US 5,364,770，US 5,578,463，EP184438，EP284603，WO2000/056900，WO9614413)、木霉属(Trichoderma)菌种和镰孢属(Fusarium)菌种(Navalainen等，(2005)，Trends in Biotechnology，23，468-473)中表达。

作为全长HST的变体的多肽可以由幼仓鼠肾(BHK)细胞(Mason等，(2004)，Protein Expr.Purif.，36，318-326，Mason等，(2002)，Biochemistry，41，9448-9454)、D.melanogaster S2细胞(Lim等，(2004)，Biotechnol Prog.，20，1192-1197)、BHK细胞的非N连接糖基化突变体(Mason等，(2001)，Protein Expr.Purif.，23，142-150，Mason等，(1993)，Biochemistry，32，5472-5479)和酿酒酵母(Sargent等，(2006)，Biometals 19，513-519)重组表达。作为HST的C-叶变体的多肽可以由BHK细胞(Mason等，(1997)，Biochem.J.，326(Pt 1)，77-85)表达。在一个实施方案中，宿主细胞是酵母细胞，如酵母属、克鲁维酵母属或毕赤酵母属的成员，如优选酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(Mason等，(1996)，Protein Expr.Purif.，8，119-125，Steinlein等，1995 Protein Expr.Purif.，6，619-624)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)(Mayson等，(2003)Biotechnol.Bioeng.，81，291-298)和膜蹼毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)或鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)(原来分类为二孢接合酵母(Zygosaccharomyces bisporus))、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、发酵接合酵母(Zygosaccharomyces fermentati)、多态汉逊酵母(Hansenula polymorpha，也称作安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))或果蝇克鲁维酵母(Kluyveromyces drosophilarum)。

宿主细胞可以是任何类型的细胞。宿主细胞可以或可以不是动物(如哺乳动物、鸟、昆虫等)、植物、真菌或细菌细胞。细菌和真菌，如酵母，宿主细胞可以或可以不是优选的。

典型的原核细胞载体质粒是：可从BioRad Laboratories(Richmond，CA，USA)获得的pUC18、pUC19、pBR322和pBR329；可从Pharmacia(Piscataway，NJ，USA)获得的pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5；可从Stratagene Cloning Systems(La Jolla，CA 92037，USA)获得的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A。

典型的哺乳动物细胞载体质粒是可从Pharmacia(Piscataway，NJ，USA)获得的pSVL。这个载体使用SV40晚期启动子启动克隆基因的表达，T-抗原产生细胞如COS-1细胞中发现最高的表达水平。可诱导哺乳动物表达载体的一个实例是pMSG，也可从Pharmacia(Piscataway，NJ，USA)获得。这个载体使用小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复片段的糖皮质激素诱导启动子以驱动克隆基因的表达。

可以使用本领域技术人员公知的方法构建表达载体，所述载体包含期望蛋白的编码序列和，例如适当的转录或翻译对照。一种这样的方法包括通过粘性末端连接。可以通过适当的限制性酶的作用在DNA片段和载体上产生相容的粘性末端。这些末端将在互补碱基配对过程中快速退火并且其余的缺口通过DNA连接酶的作用而闭合。

进一步的方法使用合成的双链寡核苷酸接头和衔接头。通过细菌噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I产生具有平末端的DNA片段，所述酶可去除突出的3’末端并补平凹陷的3′末端。合成的连接头和平末端双链DNA，其包含限定的限制性酶的识别序列，可以通过T4DNA连接酶连接至平末端DNA片段。随后用合适的限制性酶消化所述片段，产生粘性末端并连接至具有相容末端的表达载体。接头也可以是化学合成的DNA片段，其包含一个用于连接的平末端但是其还具有一个预制的粘性末端。可替换地，DNA片段可以通过DNA连接酶的作用，在存在或不存在一个或多个合成双链寡核苷酸的情况下连接在一起，所述寡核苷酸任选地包含粘性末端。

包含各种限制性内切酶位点的合成连接头可从多种来源购得，包括Sigma-Genosys Ltd，London Road，Pampisford，Cambridge，United Kingdom。

将由核苷酸序列表达转铁蛋白或转铁蛋白和其它蛋白的融合体，所述序列可以或可以不包含一个或多个内含子。此外，所述核苷酸序列可以或可以不通过本领域已知的方法针对宿主进行密码子优化。

转铁蛋白或者转铁蛋白和另外一种或多种蛋白的融合体可以表达为具有减少的N-连接糖基化的变体。因此，对于人血清转铁蛋白(HST)，可以将N413变化为任何氨基酸，优选地，Q、D、E或A；S415可以变化为S或T之外的任何氨基酸，优选为A；T613可以变化为S或T之外的任何氨基酸，优选为A；N611可以变化为任何氨基酸；或上述的组合。当转铁蛋白不是HST时，可以通过对蛋白一级序列的类似修饰而实现N-糖基化的减少。为了清楚起见，转铁蛋白或转铁蛋白与另一种或多种蛋白的融合体可以既是本发明的变体，同时N-连接糖基化减少。

特别有利地是使用一种或多种与蛋白的O-糖基化有关的蛋白甘露糖转移酶缺陷的宿主，例如酵母，所述缺陷通过例如阻断基因编码序列获得。重组表达的蛋白质可能由生产宿主细胞进行不理想的后翻译修饰。甘露糖化的转铁蛋白能结合凝集素伴刀豆球蛋白A。酵母产生的甘露糖化转铁蛋白的数量可以通过使用一种或多种PMT基因的缺陷而降低(WO 94/04687)。实现这一效果的最便利的方法是产生基因组有缺陷的酵母，所述缺陷使其产生一种Pmt蛋白的水平降低。例如，在编码序列或调节区(或调节一种PMT基因表达的另一个基因)中可以或可以不存在缺失、***或转座，使宿主产生极少或不产生Pmt蛋白。可替换地，可以转换酵母产生抗-Pmt剂，如抗-Pmt抗体。可替换地，酵母可以在存在可抑制一种PMT基因化合物的存在下培养(Duffy等，“Inhibition of protein mannosyltransferase 1(PMT1)activity in the pathogenicyeast Candida albicans”，International Conference on Molecular Mechanisms ofFungal Cell Wall Biogenesis，26-31 August 2001，Monte Verita，Switzerland，Poster Abstract P38；可以在http://www.micro.biol.ethz.ch/cellwall/浏览墙报摘要)。如果使用了酿酒酵母之外的酵母，阻断相当于酿酒酵母的PMT基因的一个或多个基因也是有益的，例如在巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母中。可以使用分离自酿酒酵母的PMT1(或任何其它PMT基因)的序列用于鉴定或阻断其它真菌中编码相似酶活性的基因。WO 94/04687中描述了乳酸克鲁维酵母的PMT1相似基因的克隆。

酵母还可以或可以不具有如WO 95/33833和WO 95/23857中所分别教导的HSP150和/或YAP3基因的缺失。

可以通过重组表达和分泌产生转铁蛋白。当表达***(即宿主细胞)是酵母时，如酿酒酵母，对于酿酒酵母的合适的启动子包括那些与下述基因相关的启动子：PGK1基因、GAL1或GAL10基因、TEF1、TEF2、PYK1、PMA1、CYC1、PHO5、TRP1、ADH1、ADH2，甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、葡糖激酶的基因，α-交配因子信息素、α-交配因子信息素、PRB1启动子、PRA1启动子、GPD1启动子和包含与部分5’调节区和其它启动子的部分5’调节区或者和上游活化位点组成的杂合体有关的杂合启动子(例如EP-A-258 067的启动子)。

本领域公知合适的转录终止信号。当宿主细胞是真核生物时，转录终止信号优选来自真核基因的3’侧翼序列，所述序列包含转录终止和聚腺苷化的正确信号。合适的3’侧翼序列可以是，例如，与使用的表达调控序列天然相连接的基因，即与启动子相对应的基因。可替换地，它们可以不同。在这种情况下，并且当宿主细胞是酵母时，优选酿酒酵母，此时优选酿酒酵母ADH1、ADH2、CYC1或PGK1基因的终止信号。

有益的是，启动子和编码重组蛋白的开放阅读框的侧翼为转录终止序列，所述重组蛋白包含转铁蛋白变体的序列，以使转录终止序列同时位于启动子和开放阅读框的上游和下游，从而防止在邻近基因出现转录通读，如2μm基因，反之亦然。

在一个实施方案中，酵母如酿酒酵母中优选的调节序列包括：酵母启动子(例如酿酒酵母PRB1启动子)，如EP 431 880所教导的；和转录终止子，优选来自酿酒酵母ADH1的终止子，如EP 60 057所教导的。

对于非编码区，有益的是，合并多于一个编码翻译终止密码子的DNA序列，如UAA、UAG或UGA，以将翻译通读降至最低，并由此防止产生延长的、非天然融合蛋白。优选翻译终止密码子UAA。

优选分泌包含转铁蛋白变体序列的重组蛋白。在这种情况下，开放阅读框中可以包括编码分泌前导序列的序列。因此，根据本发明的多核苷酸可以包含编码重组蛋白的序列，所述蛋白包含与编码分泌前导序列的多核苷酸序列可操作连接的转铁蛋白变体的序列。前导序列通常，尽管不是必需的，位于ORF的一级翻译产物的N-末端并且通常，尽管不是必需的，在分泌过程中切开蛋白，获得“成熟”蛋白。因此，在一个实施方案中，术语“可操作连接”在前导序列的上下文中包括下述含义：表示编码重组蛋白的序列，所述蛋白包含在其5’末端，并且在框内，与编码分泌前导序列的多核苷酸序列的3’末端相连的转铁蛋白变体的序列。可替换地，编码分泌前导序列的多核苷酸序列可以，在框内，位于重组蛋白的编码序列中或者位于重组蛋白的编码序列的3’末端，所述蛋白包含转铁蛋白变体的序列。

已经使用或开发了多种从宿主细胞分泌蛋白的天然或人工的多肽前导序列(也称作分泌前区和前/原区)。前导序列将初期蛋白指向细胞将蛋白从细胞输出到周围培养基的机制，或者，在某些情况下，输出到周质空间的机制。

为了在真核物种如酵母酿酒酵母、接合酵母菌种、乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母中产生蛋白，可以使用分泌前导序列。这可以包含信号(前)序列或前原前导(prepro leader)序列。已知信号序列的氨基酸序列为异源(Nothwehr和Gordon 1990，Bioessays 12，479-484，或Gierasch 1989，Biochemistry 28，p923-930)。在本质上，信号序列通常位于N-末端，具有基本的n-区、疏水的h-区和极性的c-区。只要保留这种结构，信号序列就会工作，无论何种氨基酸组成。它们工作的效果如何，即分泌多少成熟蛋白，依赖于氨基酸序列。因此，术语“信号肽”理解为表示原序列，所述序列的本质主要为疏水的，并且以在酵母中表达的胞外蛋白的前体形式的N-末端序列而出现。信号肽的功能是允许表达的蛋白分泌进入周质空间。信号肽通常在这个过程中切割。信号肽对于产生蛋白的酵母生物体可以是异源或同源的。已知的前导序列包括来自酿酒酵母酸性磷酸酶蛋白(Pho5p)(参见EP 366 400)、反转酶蛋白(Suc2p)(参见Smith等(1985)Science，229，1219-1224)和热激蛋白150(Hsp150p)(参见WO 95/33833)的前导序列。此外，已经使用了来自酿酒酵母交配因子α-1蛋白(MFα-1)和来自人溶菌酶和人血清白蛋白(HSA)蛋白的前导序列，后者已经专门，尽管不是绝对专一的，用于分泌人白蛋白。WO 90/01063公开了MFα-1和HSA前导序列的融合体。此外，可以或可以不使用天然转铁蛋白前导序列指导包含转铁蛋白变体的重组蛋白的分泌。

技术人员应了解的是可以使用任何合适的质粒，如着丝粒质粒。实施例提供合适的质粒(基于着丝粒Ycplac33的载体)用于转化本发明的酵母宿主细胞。可替换地，可以使用任何其它合适的质粒，如酵母相容的基于2μm的质粒。

获得自一种酵母类型的质粒可以在其它酵母类型中保持(Irie等，1991，Gene，108(1)，139-144；Irie等，1991，Mol.Gen.Genet.，225(2)，257-265)。例如，来自鲁氏接合酵母的pSR1可以在酿酒酵母中保持。在一个实施方案中，质粒可以或可以不是2μm家族质粒并且宿主细胞与使用的2μm家族质粒相容(参见下文对于下述质粒的完整描述)。例如，当质粒基于pSR1、pSB3或pSB4时，合适的酵母细胞是鲁氏接合酵母；当质粒基于pSB1或pSB2时，合适的酵母细胞是拜耳接合酵母；当质粒基于pSM1时，合适的酵母细胞是发酵接合酵母；当质粒基于pKD1时，合适的酵母细胞是果蝇克鲁维酵母；当质粒基于pPM1时，合适的酵母细胞是膜蹼毕赤酵母；当质粒基于2μm质粒时，合适的酵母细胞是酿酒酵母或卡尔酵母。因此，质粒可以基于2μm质粒并且酵母细胞可以是酿酒酵母。如果2μm质粒包含具有其来源的天然发生质粒的序列的FLP、REP1和REP2基因中的一个、两个或者优选三个，可以说2μm家族质粒“基于”天然存在的质粒。

有用的酵母附加型质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，并且通常可从Stratagene Cloning Systems(La Jolla，CA 92037，USA)获得，Yep24(Botstein，D.等.(1979)Gene 8，17-24)，和Yeplac122、Yeplac195和Yeplac181(Gietz，R.D.和ugino.A.(1988)Gene 74，527-534)。在WO 90/01063和EP 424 117，以及EP-A-286 424的“分解载体和WO2005061719中描述了其它酵母质粒。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合质粒(Ylps)，并且并入酵母选择性标记HIS3、TRP1、LEU2和URA3，称为Ylplac204、Ylplac211和Ylplac128(Gietz，R.D.和Sugino.A.(1988)Gene 74，527-534)。质粒pRS413-416和酵母着丝粒质粒(Ycps)作为Ycplac22、Ycplac33和Ycplac111(Gietz，R.D.和Sugino.A.(1988)Gene 74，527-534)。

本发明的方法可以用于从来自多个来源如血液产物和原核或真核细胞培养物的相对不纯的转铁蛋白溶液获得高度纯化的转铁蛋白。然而，方法特别适用于从酵母如酿酒酵母纯化重组转铁蛋白(rTf)。根据本发明产生的转铁蛋白可以是任何哺乳动物转铁蛋白如牛转铁蛋白，但是优选为人转铁蛋白或其衍生物。

本文引用了多篇参考文献，所述文献的公开通过提述全部并入本文。

参照本文的权利要求，本发明还提供：

i.根据权利要求1至27中任一项的方法，其中由此获得的包含转铁蛋白的终溶液随后进行或者不进行一个或多个进一步的纯化步骤。

ii.根据权利要求1至27中任一项和/或(i)的方法，其中一个或多个进一步的纯化步骤选自：硫酸铵沉淀、乙醇沉淀、酸提取、溶剂提取、阴离子交换层析、阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析、凝集素层析、金属亲和/螯合层析、浓缩、稀释、pH调节、渗滤、超滤、高效液相层析(“HPLC″)、反相HPLC、导电性调整、基质来源染料的去除、酵母来源着色剂的去除和将转铁蛋白碱性沉淀至亲脂相。

iii.根据权利要求1至27中任一项或(i)至(ii)中任一项的方法，其中由此获得的含转铁蛋白的溶液随后进行或者不进行通过超滤的进一步纯化。

iv.根据权利要求1至27中任一项或(i)至(iii)中任一项的方法，其中由此获得的含转铁蛋白的溶液进行或者不进行进一步纯化和/或配制用于对人静脉内施用和/或用作细胞培养基组分和/或灭菌和/或放置在最终的容器中。

v.根据权利要求1至27中任一项或(i)至(iv)中任一项的方法，其中由此获得的含转铁蛋白的溶液悬浮或者不悬浮在适于转铁蛋白最终用途的液体中。

vi.根据权利要求1至27中任一项或(i)至(v)中任一项的方法，其中在阴离子层析步骤和/或阳离子层析步骤之前和/或之后将或不将转铁蛋白饱和化。

vii.根据权利要求1至27中任一项或(i)至(vi)中任一项的方法，其中在阴离子层析步骤和/或阳离子层析步骤之前和/或之后将或不将转铁蛋白脱辅基。

viii.根据权利要求1至27中任一项或(i)至(vii)中任一项的方法，其中相对不纯的转铁蛋白溶液是或不是自微生物细胞，如真菌细胞(优选酵母细胞如酵母属、毕赤酵母属或克鲁维酵母属)或细菌细胞、哺乳动物细胞或者来自血液或血液级分如血清获得的。

ix.根据权利要求1至27中任一项或(i)至(viii)中任一项的方法，其中转铁蛋白是或者不是天然存在的转铁蛋白。

x.根据权利要求1至27中任一项或(i)至(ix)中任一项的方法，其中转铁蛋白相对于天然存在的转铁蛋白进行或者未进行修饰。

xi.根据(x)的方法，其中转铁蛋白包含或者不包含SEQ ID No.4。

xii.根据权利要求1至27中任一项或(i)至(xi)中任一项的方法，其中转铁蛋白是或者不是治疗性转铁蛋白。

xiii.通过根据权利要求1至27中任一项或(i)至(xii)中任一项的方法获得或可获得的纯化转铁蛋白。

xiv.包含根据(xiii)的转铁蛋白的细胞培养基。

xv.根据(xiv)的转铁蛋白在制造细胞培养基中的用途。

参照附图和下述非限定性实施例，仅通过举例的方式描述本发明：

实施例

实施例1：阳离子交换低pH/高盐洗涤

用九种不同的洗涤缓冲液(pH/氯化钠浓度组合)洗涤Sepharose FastFlow(SP-FF)获得的回收率数据

(a)低pH/高盐洗涤

初始优化：用8.6mL柱在AKTA^TM Explorer 100 Air层析***(GE Healthcare)上运行十二次。使用pH和盐浓度的不同组合进行洗涤。特别地，使用pH 4.0、4.5和5.1和氯化钠浓度0.25、1.0和2.0M。将初始材料(即约3.7mg/ml转铁蛋白溶液)解冻并通过加入乙酸调节至pH 5.1；3.5mS.cm^-1。将柱平衡在pH 5.0-5.2和2.5-3.1mS.cm^-1，将已调节的材料以25mg转铁蛋白/mL基质加载，并首先用适当pH(即与洗涤2中使用的缓冲液相同的pH)且不含氯化钠的缓冲液洗涤(洗涤1)。随后用低pH/高盐缓冲液洗涤(洗涤2)并用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，25mM氯化钠，pH 7.0)洗脱结合的转铁蛋白。收集加载液、穿透物、洗涤和洗脱组分，使用面积校准法通过GP.HPLC测定它们的转铁蛋白含量。使用这个数据计算质量平衡和回收率数值。加载液、洗涤2和洗脱组分还进行酵母抗原(HCP)ELISA分析，并且计算酵母抗原(HCP)清除率数值。

表2：洗涤条件对于洗脱液中转铁蛋白回收率的影响

这些数据(表2)显示，在测试的条件，在任一个氯化钠浓度，pH 4.5都可以获得最好的回收率，并且在pH 4.5，2.0M氯化钠最优。

表3：用三种不同pH/氯化钠浓度组合洗涤SP-FF的平均回收率和酵母抗原(HCP)清除率数据

数据是每种氯化钠浓度两次运行的平均值。洗脱回收率数据来自表2。这显示出pH 4.5时含有2M氯化钠的洗涤缓冲液给出最好的洗脱回收率/酵母抗原(HCP)清除率组合。

(b)进一步优化

本实施例给出低pH/高盐洗涤对于酵母抗原(HCP)清除率和洗脱液的转铁蛋白浓度的影响。

用8.6mL柱在AKTA Explorer 100 Air上运行SP-FF，使用上述详细给出的pH 4.5、2M氯化钠洗涤2条件，但是加入使用平衡缓冲液的第三次洗涤步骤。另外进行三次运行，比较下述三种洗涤方案：

A：洗涤1(50mM乙酸钠pH 5.1)

B：洗涤1(50mM乙酸钠pH 4.5)；洗涤2(27mM乙酸钠，2M氯化钠pH 4.5)

C：洗涤1(50mM乙酸钠pH 4.5)；洗涤2(27mM乙酸钠，2M氯化钠pH 4.5)；洗涤3(50mM乙酸钠pH 5.1)

纯化过程中的所有样品如上所述进行GP.HPLC和ELISA分析，并且使用数据计算转铁蛋白回收率和酵母抗原(HCP)清除率数据。

表4：比较三种不同SP-FF洗涤方案的回收率和酵母抗原(HCP)清除率数据

这些数据(表4)显示，两次洗涤方案(B)的酵母抗原(HCP)清除率显著高于单次洗涤方案(A)，并且三次洗涤方案(C)进一步提高了酵母抗原清除率，仅在洗脱回收率上有相对较小的下降。

实施例2：阴离子交换层析加载缓冲液中是否存在硼酸盐对Q-FF阴离子交换层析上转铁蛋白回收率的影响

Q-FF基质由GE Healthcare获得。向来自实施例1(表4，洗涤方案C)的SP-FF洗脱液加入四硼酸盐，浓度相当于100摩尔硼酸盐每摩尔rTf(相当于加载液中的0.7mM硼酸盐)，并且不加硼酸盐作为对照。使用0.66cmx15cm床高(5.13mL)柱，使用Q-FF，以30mg.mL^-1基质的基质容量，如上所述进行层析。用15.7mM四硼酸钾进行洗涤。用150mM四硼酸钾进行洗脱。在加载、洗涤、洗脱和NaCl清除过程中收集组分并通过RP-HPLC和列表分析回收率而估计rTf浓度(表5)。也分析并将穿透物数据制成表格(表5)。

表5：阴离子交换层析加载缓冲液中不存在(A)和存在(B)硼酸盐对于由Q-FF阴离子交换层析回收转铁蛋白的影响

在加载液中使用硼酸盐可以在洗脱液中得到更高的总体转铁蛋白回收率(存在硼酸盐时为75.3％回收率，不存在硼酸盐时为49.8％回收率)。而且，在加载液包括硼酸盐时，穿透物(FT)中存在的转铁蛋白较少(存在硼酸盐时为1.1％，不存在硼酸盐时为28.4％)。

实施例3：阴离子交换层析加载缓冲液中存在硼酸盐对于由Capto^TMQ阴离子交换层析回收转铁蛋白的影响

Capto^TMQ基质由GE Healthcare获得。如下向Capto^TMQ加入四硼酸钾，用15.7mM四硼酸盐用水1∶1稀释的溶液将来自实施例1的SP-FF洗脱液(表4，洗涤方案C)稀释5.7倍。最后，加入足量的水和27％(w/v)NaOH，实现导电率为3.5mS.cm^-1和pH 8.8(相当于加载液中为824mol.mol^-1，5.4mM硼酸盐)。作为对照(无硼酸盐)，用水、27％(w/v)NaOH和5M NaCl调节SP-FF洗脱液，实现pH 8.8和导电率3.5mS.cm^-1。将足够的加载液以0.7mL.min^-1的流速经过0.66cmx2cm床高(0.68mL)柱，得到40mg.mL^-1基质。用15.7mM四硼酸钾进行洗涤。用150mM四硼酸钾进行洗脱。在加载、洗涤、洗脱和NaCl净化过程中收集组分并通过RP-HPLC和列表分析回收率估计rTf浓度(表6)。也分析并列出了穿透物的结果(表6)。

表6：阴离子交换层析加载液缓冲液中不存在(A)和存在(B)硼酸盐对于由Capto^TMQ阴离子交换层析回收转铁蛋白的影响

在加载液中使用硼酸盐可以在洗脱液中得到更高的总体转铁蛋白回收率(存在硼酸盐时为80.6％回收率，不存在硼酸盐时为53.6％回收率)。而且，在加载液包括硼酸盐时，穿透物(FT)中存在的转铁蛋白较少(存在硼酸盐时为11.4％，不存在硼酸盐时为31.3％)。

数据也如图1所示。图1显示在加载液中包括硼酸盐可以改善转铁蛋白与柱的结合。图1A是在向柱加载之前未向转铁蛋白加入四硼酸盐时Capto^TMQ柱的曲线。图1B是在向柱加载之前向转铁蛋白加入824mol.mol^-1四硼酸盐时Capto^TMQ柱的曲线。

峰(a)与洗涤柱之后洗涤液中存在的转铁蛋白有关。峰(b)与洗脱液中存在的转铁蛋白有关。峰(c)与用NaOH洗涤后从柱回收的转铁蛋白有关。

图1B中不存在峰(a)，表明在加载液中包括四硼酸盐可以改善转铁蛋白与柱的结合。图1A中存在峰(a)，表明在不存在四硼酸盐的情况下将转铁蛋白向柱加载导致在洗涤步骤中部分转铁蛋白不理想地从柱上洗脱。

实施例4：阴离子交换基质的低浓度洗涤

使用用15.7mM四硼酸钾平衡的0.66x15cm(5.13mL)柱进行Capto^TMQ层析。使用来自实施例1的SP-FF洗脱液(表4，洗涤方案C)作为加载液材料。调节Capto^TMQ层析的加载液，通过加入27％(w/v)NaOH使pH为9.0-9.2，加入水使导电率为～2.6mS.cm^-1。最后，加入固体四硼酸钾使终浓度为5mM四硼酸盐(725mol.mol^-1)，使加载液导电率增加至～3.4mS.cm^-1。使用30mg.mL^-1基质的柱容量。加载后，用5mM四硼酸钾(10CV)、15.7mM四硼酸钾(11CV)洗涤柱，并用150mM四硼酸钾pH 9.4洗脱，然后用1MNaCl、0.5M NaOH再生柱，并用1M NaOH清洗1小时。

表7：使用用加载液中的5mM四硼酸盐调节后的SP-FF洗脱液经过Capto^TMQ层析回收转铁蛋白

数据(表7)表明，在存在四硼酸盐的情况下将转铁蛋白加载，之后进行低浓度洗涤和高浓度洗涤，可以在每个洗涤步骤中都实现转铁蛋白的低水平损失，从而在洗脱液中得到非常高水平的转铁蛋白(93.2％回收率)。

实施例5：低pH和盐浓度相对于酵母抗原(HCP)去除率和回收率的数学建模

进一步研究了使用低pH、高盐浓度洗涤方案去除酵母抗原(YA)(即宿主细胞蛋白(HCP))并保持SP-FF上的洗脱液回收率。使用Design of Experiments(DoE)方法构建数学模型，研究两个因素，pH和盐浓度，对于两个响应值，洗脱液回收率和YA清除率的影响。研究了pH 3.66-5.34和0-6000mM氯化钠之间的多个pH和盐浓度。通过使用冰醋酸和水调节培养物上清的pH和导电率至5.11和3.57mS.cm^-1而制备加载材料。用50mM乙酸钠pH 5.1平衡十五个包含50μL SP-FF基质(GE Healthcare)的Atoll 5mm直径x2.5mm床高的

MiniColumn(Atoll GmbH，Weingarten，Germany)。将这个加载材料以50μL.min^-1实现40mg.mL^-1基质载入。每个柱首先用适当的不含NaCl的低pH乙酸钠缓冲液洗涤(洗涤1)，然后用pH相当但含有合适浓度的NaCl的第二乙酸钠缓冲液洗涤(洗涤2)(表8)。然后将每个柱用50mM磷酸钠、150mM氯化钠pH 6.0洗脱并用1M NaCl、0.5％(w/w)聚山梨醇酯80净化。收集所有层析级分并通过反相高效液相层析(RP.HPLC)估计每个组分中的转铁蛋白浓度。通过酶联免疫吸收测试(ELISA)估计YA水平。将回收率和YA清除率列表，示于表8中。

表8：洗涤2中低pH和高盐浓度的各种组合对于SP-FF洗脱液组分中转铁蛋白回收率和YA清除率的影响。

将15种洗涤条件(“运行”)中每种条件下的回收率和YA清除率输入DoE软件(Design Expert 6.0.10，Stat-Ease，Inc.，Minneapolis，MN，USA)，产生设计空间的数学模型。计算机使用“设计点”(即实验数据点)产生设计空间的数学模型。模型如下拟合各个响应值。

(i)回收率：

●不需要转化并使用二次拟合。

●ANOVA(变异性分析)数据表明拟合显著但不需要盐²项。

●因此从模型去除盐²项并重新拟合数据产生下述公式：

回收率＝

-940.50069+(441.61018×p)+(0.043309×s)-(47.57735×p²)-(0.010263×p×s)

其中：“p”＝pH，”s“＝以mM表示的盐浓度，并且回收率为％回收率。

(ii)HCP(YA)清除率：

●无需转化并且使用二次拟合。

●ANOVA数据表明二次拟合不显著；因此三次方拟合中包括所有项。

●ANOVA数据表明拟合现在显著但不需要盐³项。

●因此从模型去除盐³项并重新拟合数据。

●ANOVA数据表明拟合显著单不需要盐²项。

●因此从模型去除盐²项并重新拟合数据。

●ANOVA数据表明拟合显著单不需要pH x盐²项，因为其与pH和pH³项相混叠(aliased)。

●因此去除pH x盐²项，并重新拟合数据，产生下述公式：

HCP(YA)清除率＝

16388.65744-(10512.30681×p)-(1.70101×s)+(2257.17601×p²)+(0.78628×p×s)-(159.06573×p³)-(0.090182×p²×s)

其中：“p”＝pH，“s以mM表示的盐浓度”且清除率为“倍-清除率”。

对于回收率和HCP(YA)清除率的可接受表现，分别使用大于或等于60％和大于或等于275-倍的界限(“≥”表示“大于或等于”)，绘制出设计空间的示意图(覆盖图)(图2)。灰色阴影区(即I、III和IV)代表回收率和/或HCP(YA)清除率落到可接受表现界限之外的pH和盐浓度组合；而用白色显示的区(即II)代表pH和盐浓度都落在可接受表现界限内(即大于或等于60％回收率和大于或等于275-倍HCP(YA)清除率)的组合。

实施例6：向Capto Q加载液加入四硼酸钾

研究了向Capto Q加载材料加入1-1000mol.mol四硼酸钾。通过使用0.5M NaOH和水将SP-FF洗脱液(来自实施例1)的pH和导电率调整至9.3和3.53mS.cm^-1而制备加载材料。向30mL该溶液中加入足量的0.5M四硼酸钾，获得摩尔比例为1000mol硼酸盐∶1mol转铁蛋白的加载样品。通过用上述制备的已调pH、稀释溶液将1000mol.mol溶液连续稀释至500、100、50、10、5、2.5和1mol.mol而制备各个加载样品。测量每个加载样品的导电率并用水重新调整至3.5mS.cm^-1。首先用110mM四硼酸钾平衡八个包含50μL Capto Q基质(GE Healthcare)的5mm直径x2.5mm床高的

MiniColumn，然后用30mM四硼酸钾平衡。将足够体积的每个加载样品以50μL.min^-1施加，获得40mg.mL^-1的基质加载量。首先用5mM四硼酸钾洗涤每个柱(洗涤1)，随后用30mM四硼酸钾洗涤(洗涤2)，之后用110mM四硼酸钾洗脱并用1MNaCl、0.5％(w/w)聚山梨醇酯80净化。收集所有层析级分并通过反相高效液相层析(RP.HPLC)估计转铁蛋白浓度。将回收率数据制成表格并示于表9中。

表9：Capto Q加载材料中1-1000mol.mol的四硼酸钾对于穿透物和洗脱液组分中转铁蛋白回收率的影响。

数据表明向加载液加入50-1000mol.mol的四硼酸钾具有理想的有益效果并降低在穿透物组分中损失的转铁蛋白的量，使洗脱液中回收量增加。10和50mol.mol可显著增加穿透物中损失的转铁蛋白量，导致洗脱液中的回收量降低。为了更好地确定加入四硼酸钾的影响的分界点，进行了第二次实验，基本与上述一致，但是加载为10、20、30、40和50mol.mol。第二次实验的结果示于表10中。

表10：Capto Q加载材料中10-50mol.mol的四硼酸钾对于穿透物和洗脱液组分中转铁蛋白回收率的影响。

这第二组数据表明加入20-50mol.mol的四硼酸钾具有理想的有益效果并降低穿透物组分中损失的转铁蛋白量，使洗脱液中的回收量增加。低于10mol.mol可显著增加穿透物中损失的转铁蛋白量，使洗脱液中的回收量降低。

总之，向Capto Q加载液加入20-1000mol.mol的四硼酸钾具有有益的效果，降低穿透物中转铁蛋白的损失，从而增加洗脱液中回收的转铁蛋白量。

实施例7：向Capto Q洗涤1中加入四硼酸钾

研究了向Capto Q洗涤1加入0-30mol.mol范围的四硼酸钾。通过使用0.5M NaOH和水将SP-FF洗脱液(来自实施例1)的pH和导电率调整至9.3和3.53mS.cm^-1而制备加载材料。向50mL该溶液中加入足量的0.5M四硼酸钾，获得摩尔比例为270mol硼酸盐∶1mol转铁蛋白的加载样品。测量加载样品的导电率并用水重新调整至3.5mS.cm^-1。首先用110mM四硼酸钾，然后用30mM四硼酸钾平衡九个包含50μL Capto Q基质(GE Healthcare)的5mm直径x2.5mm床高的

MiniColumn。将足够体积的每个加载样品以50μL.min^-1施加，获得40mg.mL^-1的基质加载量。首先用0、0.1、0.5、1、2、5、10、20或30mM的四硼酸钾洗涤每个柱(洗涤1)，随后用30mM四硼酸钾洗涤(洗涤2)，之后用110mM四硼酸钾洗脱并用1M NaCl、0.5％(w/w)聚山梨醇酯80净化。收集所有层析级分并通过RP.HPLC估计转铁蛋白浓度。将回收率数据制成表格并示于表11中。

表11：Capto Q洗涤1中0-30mM的四硼酸钾对洗涤1和洗涤2组分中转铁蛋白回收率的影响。

数据表明洗涤1中的四硼酸钾浓度为0.5-20mM时具有理想的有益效果，即降低洗涤2中损失的转铁蛋白的量。大于20mM可显著增加洗涤1中损失的转铁蛋白量，而0-0.1mM时产生的洗涤2中损失的转铁蛋白量增加则不可接受。

实施例8：向Capto Q加载液中加入四硼酸钠

研究了向Capto Q加载材料加入四硼酸钠。通过使用0.5M NaOH和水将SP-FF洗脱液的pH和导电率调整至9.4和3.66mS.cm^-1而制备加载材料。向一半该溶液中加入足量的110mM四硼酸钠，获得摩尔比例为270mol硼酸盐∶1mol转铁蛋白的加载样品。测量加载样品的导电率并用水重新调整至3.61mS.cm^-1。首先用110mM四硼酸钠，然后用30mM四硼酸钠平衡两个包含50μL Capto Q基质(GE Healthcare)的5mm直径x2.5mm床高的

MiniColumn。将足够的270mol.mol加载样品和不含四硼酸钠的已调pH的稀释材料作为对照以50μL.min^-1施加，获得40mg.mL^-1的基质加载量。首先用5mM的四硼酸钠洗涤每个柱(洗涤1)，随后用30mM四硼酸钠洗涤(洗涤2)，之后用110mM四硼酸钠洗脱并用1M NaCl、0.5％(w/w)聚山梨醇酯80净化。收集所有层析级分并通过反相高效液相层析(RP.HPLC)估计转铁蛋白浓度。将回收率数据制成表格并示于表12中。

表12：Capto Q加载液中270mol.mol的四硼酸钠对于穿透物和洗脱液组分中转铁蛋白回收率的影响。

数据表明向加载液加入270mol.mol的四硼酸钠具有理想的有益效果，即降低穿透物组分中损失的转铁蛋白的量，从而增加洗脱液中的回收量。

Claims

1.用于纯化转铁蛋白溶液的方法，所述方法包括：

a)向相对不纯的转铁蛋白溶液中加入四硼酸盐，提供转铁蛋白和四硼酸盐的溶液；

b)将所述转铁蛋白和四硼酸盐的溶液施于转铁蛋白对其没有特异的结合活性的阴离子层析材料，从而使转铁蛋白与所述材料结合；

c)洗涤结合转铁蛋白的层析材料；

d)任选地，进一步洗涤结合转铁蛋白的层析材料；和

e)任选地，从阴离子层析材料回收所述转铁蛋白。

2.根据权利要求1的方法，其中：在步骤(a)中，所述转铁蛋白和四硼酸盐的溶液比例为至少约20摩尔四硼酸盐对约1摩尔转铁蛋白。

3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤(c)的洗涤使用洗涤溶液进行，所述洗涤溶液的四硼酸盐浓度低于步骤(d)的洗涤所使用的洗涤溶液的四硼酸盐浓度。

4.根据任一项前述权利要求的方法，其中步骤(c)的洗涤使用约0.1mM至约20mM的四硼酸盐溶液进行。

5.根据任一项前述权利要求的方法，其中步骤(d)的洗涤使用约5mM至约60mM的四硼酸盐溶液进行。

6.根据任前一项述权利要求的方法，其包括：

a)向相对不纯的转铁蛋白溶液中加入四硼酸盐，以至少20摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白的比例提供转铁蛋白和四硼酸盐的溶液；

b)将所述转铁蛋白和四硼酸盐的溶液施于转铁蛋白对其没有特异的结合亲和性的阴离子层析材料，从而使转铁蛋白与所述材料结合；

c)用0.1mM至约20mM的四硼酸盐溶液洗涤所述层析材料；

d)随后用至少30mM的四硼酸盐溶液洗涤所述层析材料；和

e)任选地，从所述阴离子层析材料回收转铁蛋白。

7.用于纯化转铁蛋白溶液的方法，所述方法包括阴离子层析步骤和阳离子层析步骤，其中：

阳离子层析步骤包括：

a)将相对不纯的转铁蛋白溶液施于转铁蛋白对其没有特异的亲和性的阳离子层析材料，从而使转铁蛋白与所述材料结合；

b)用pH为约4至约5的洗涤缓冲液洗涤阳离子层析材料，所述缓冲液基本上不含提供缓冲效果的盐之外的盐；

c)随后用pH为约4至约5，盐浓度为约50mM至约5M的洗涤缓冲液洗涤所述阳离子层析材料；和

d)从所述阳离子层析材料回收转铁蛋白；和

阴离子层析步骤包括：

a)向由阳离子层析步骤的步骤(d)获得的转铁蛋白加入四硼酸盐，提供转铁蛋白和四硼酸盐的溶液；

b)将转铁蛋白和四硼酸盐的溶液施于转铁蛋白对其没有特异的活性的阴离子层析材料，从而使转铁蛋白与所述材料结合；

c)洗涤结合转铁蛋白的层析材料；

d)任选地，进一步洗涤结合转铁蛋白的层析材料；和

e)任选地，从所述阴离子层析材料回收转铁蛋白。

8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中阴离子层析步骤的步骤(c)的洗涤中使用的四硼酸盐溶液为约2.5mM至约7.5mM。

9.根据权利要求8的方法，其中阴离子层析步骤的步骤(c)的洗涤中使用的四硼酸盐溶液为约5mM。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中阴离子层析步骤的步骤(d)的洗涤中使用的四硼酸盐溶液为约20mM至约40mM。

11.根据权利要求10的方法，其中阴离子层析步骤的步骤(d)的洗涤中使用的四硼酸盐溶液为约30mM。

12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述四硼酸盐是四硼酸钾或四硼酸钠。

13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中所述阴离子层析材料包含选自下组的功能性配体：二乙基氨基乙基(DEAE)基团和季胺基团。

14.用于纯化转铁蛋白溶液的方法，所述方法包括阳离子层析步骤，其包含如下步骤：

b)用pH为约4至约5并且盐浓度低于200mM的洗涤缓冲液洗涤层析材料；

c)随后用洗涤缓冲液洗涤所述层析材料，所述缓冲液：

i)位于由下述公式限定的设计空间中：

(I)回收率＝-940.50069+(441.61018×p)+(0.043309×s)-(47.57735×p²)-(0.010263×p×s)

(II)宿主细胞蛋白清除率＝16388.65744-(10512.30681×p)-(1.70101×s)+(2257.17601×p²)+(0.78628×p×s)-(159.06573×p³)-(0.090182×p²×s)

其中p＝pH，s＝以mM表示的盐浓度，回收率大于或等于60％，并且YA清除率大于或等于275倍；和

ii)pH为4至5，并且盐浓度为50-5000mM；和

iii)盐浓度比步骤(b)的洗涤缓冲液高；

和

d)任选地，从所述阳离子层析材料回收转铁蛋白。

15.根据权利要求7-14中任一项的方法，其中阳离子层析步骤的步骤(b)的洗涤缓冲液的pH为约4.3至约4.7。

16.根据权利要求16的方法，其中步骤(b)的洗涤缓冲液的pH为约4.5。

17.根据权利要求7-16中任一项的方法，其中阳离子层析步骤的步骤(b)的洗涤缓冲液的盐浓度小于50mM。

18.根据权利要求17的方法，其中步骤(b)的洗涤缓冲液不包含提供缓冲效果的盐之外的盐。

19.根据权利要求7-18中任一项的方法，其中阳离子层析步骤的步骤(c)的洗涤：

(i)位于由下述两个公式限定的设计空间中：

(ii)pH为4至5，并且盐浓度为50-5000mM。

20.根据权利要求7-19中任一项的方法，其中阳离子层析步骤的步骤(c)的洗涤缓冲液的pH为约4.3至约4.7。

21.根据权利要求20的方法，其中步骤(c)的洗涤缓冲液的pH为约4.5。

22.根据权利要求7-21中任一项的方法，其中阳离子层析步骤的步骤(c)的洗涤缓冲液的盐浓度为约250mM至约2.5M。

23.根据权利要求22的方法，其中步骤(c)的洗涤缓冲液的盐浓度为约2M。

24.根据权利要求7-23中任一项的方法，其中阳离子层析步骤的步骤(b)和/或步骤(c)的盐是NaCl。

25.根据权利要求7-24中任一项的方法，其中阳离子层析材料包含含有磺丙基的功能配体。

26.根据权利要求7-25中任一项的方法，其中阳离子层析步骤进一步包含在回收转铁蛋白之前的第三次洗涤。

27.根据权利要求26的方法，其中所述第三次洗涤使用包含约50mM乙酸钠并处于约pH 5.1的洗涤缓冲液进行。