CN102367424B - 红椿菌AUH-Julong21及其在甘草素转化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红椿菌AUH-Julong21及其在甘草素转化中的应用，红椿菌（Coriobacteriumsp.）AUH-Julong21，保藏号为CGMCCNo.5306。将菌株Julong21的种子液按10-15%接种量转接到液体培养基中培养，加入甘草素粗品,在厌氧工作站内培养2-3天；用乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上对产物进行分离制备。本发明的菌株能将甘草素粗品高效转化为达维荚蒾苷元，当浓度为0.4-1.6毫摩尔/升时,产物达维荚蒾苷元对二苯代苦味酰基自由基（DPPH）的体外清除率极显著高于底物甘草素（p<0.01）。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株及其应用，尤其是一种红椿菌AUH-Julong21及其在甘草素转化中的应用。
背景技术
甘草（Licorice roots）是一味古老的中药材，在我国古代医药典籍中多有记载，迄今已有几千年的使用史。甘草具有保肝、祛痰止咳、清热解毒、补脾益气、抗菌消炎、抗癌、降糖、免疫调节、神经保护等多种功效，临床上主要用于治疗呼吸***、消化***和免疫***等疾病。由于甘草对多种疾病均具良好的预防和治疗作用，尤其是甘草毒副作用低，对甘草中药理活性物质的研究和挖掘已成为国内外研究热点。
甘草中的黄酮和酚类是甘草中的标志性化合物，目前从甘草中已分离得到300多种三萜皂苷和甘草黄酮类化合物。甘草苷（Liquiritin，简称LQ）是甘草中含量较高的黄酮成分之一，有研究表明，LQ在酸性条件下或在人肠道微生物菌群产生的葡萄糖苷酶作用下，可被水解为甘草素（Liquiritigenin，简称LG）。已有研究表明，LG是Akt蛋白激酶抑制剂，也是有较高选择性的***受体激动剂，对肝细胞等具有保护作用。甘草不管是做成中成药还是作为汤药熬服，最终都要经口服进入体内，甘草中的众多药理活性成分具有被寄居在胃肠道的微生物菌群降解为不同代谢产物的可能性。1998年，Li 等（Biological and Pharmaceutical Bulletin, 1998, 12:1251-1257）在人尿液检测到了甘草代谢产物达维荚蒾苷元（Davidigenin，简称DG），而DG在天然甘草提取物物中未能检测到，故推测人体肠道微生物菌群可将LG转化为DG。此后，Zuo等的研究结果进一步证实LG可被人肠道微生物菌群代谢为DG（Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2002, 25:558-563），然而，迄今国内外尚未见任何利用单一微生物菌株将LG转化为DG的报道。目前虽在某些植物中，如Viburnum davidii Franch，Caprifoliaceae等，有分离得到天然DG的报道，但天然DG在植物细胞中的含量极低，试图从天然植物中去规模化提取DG几乎是不可能的。有关DG的化学合成方法已有报道，但大多是通过在无氧条件下提供昂贵的化学催化剂钯经化学加氢来完成（Biomed Chromatogr, 1997, 11:125-231），所需成本高，且易造成环境污染。由于DG资源匮乏，有关其生理活性方面研究报道较少，但从目前已有研究结果看，DG除具有与LG相似的生理功能，如止咳、降糖等外，还表现出不同于LG的一些生理功能，如抑制人肺细胞纤维化,抗过敏和抗痉挛等。随着DG生理功能研究的不断深入，这意味着DG今后极有可能开发为不同于目前甘草药效的其他新药。
发明内容
本发明解决了DG资源缺乏的问题，提供一种红椿菌AUH-Julong21及红椿菌AUH-Julong21将甘草素高效转化为DG的方法。
本发明采取的技术方案为：
一种红椿菌（Coriobacterium sp.）AUH-Julong21，保藏号为CGMCC No.5306。
红椿菌Coriobacterium sp.AUH-Julong21（EU919864）是从人粪便中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将中药甘草提取物的水解物粗品（即甘草素粗品）高效转化为DG。由于甘草素与甘草素异构体在适宜酸碱条件下可能会相互转化，经推测是甘草素粗品在菌株Coriobacterium sp.AUH-Julong21（为方便书写，在这里将菌株Coriobacterium sp.AUH-Julong21简称Julong21，以下均使用该转化菌株的简称形式，菌株Julong21与菌株Coriobacterium sp.AUH-Julong21为同一菌株）的培养物中首先自发转变为异甘草素，异甘草素再在菌株Julong21分泌的还原酶作用下被加氢还原成DG，有关DG微生物生物合成途径推测如下所示。
本发明中的红椿菌Coriobacterium sp.AUH-Julong21菌株（简称Julong21）已于2011年9月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为 CGMCC No.5306。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述红椿菌Coriobacterium sp.AUH-Julong21的分类学特征为：
菌落直径2.5-4.5毫米，边缘有浅锯齿，中部有凸起，初期呈黄白色，后期边缘锯齿加深，菌落黄色加深；在BHI培养基中菌体为中短杆状或中丝状；该菌株革兰氏染色呈阳性；
本发明还提供了红椿菌AUH-Julong21在甘草素转化中的应用，其特征在于包括下述步骤：
（1）菌株Julong21的培养
将低温冷冻保存的红椿菌Julong21融化并按20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37oC下培养24小时，再以10%接种量将试管中菌株Julong21重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液；
（2）底物甘草素粗品与菌株Julong21共培养与代谢产物的分离纯化
①底物甘草素粗品与菌株Julong21共培养
将菌株Julong21的种子液按10-15%接种量转接到液体培养基中培养，根据甘草素粗品母液中底物甘草素浓度（40-60毫摩尔/升）及三角瓶中培养基体积，确定母液加入量，使得甘草素在培养基中的浓度为0.8毫摩尔/升, 在厌氧工作站内培养2-3天，即可将底物甘草素粗品高效转化为达维荚蒾苷元；
②代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备代谢产物。
其中，所述红椿菌AUH-Julong21的分离培养包括下述步骤：
（1）人粪样的采集与培养
用已灭菌的棉签挑取新鲜粪便，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37℃温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；
（2）分离培养红椿菌AUH-Julong21
①单一菌落式分离培养
用新鲜BHI液体培养基将事先在厌氧工作站内培养24小时的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10–1，10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7、10–8，再分别将100微升浓度分别为10–5、10–6、10–7、10–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；
②单菌落的混合培养及转化活性鉴定
将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入0.1毫摩尔/升甘草素纯品，在厌氧工作站内培养2天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；
③特定功能微生物菌落的分离筛选
一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入0.1毫摩尔/升的底物甘草素10微升，共同培养24小时后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中具有转化底物甘草素功能的单菌落；
甘草素纯品通过以下方法分离制备：
（1）甘草苷（LQ）粗品的提取方法
从药店购买中药甘草（产地：中国甘肃），将甘草充分晾干后用粉碎机粉粹。称取粉碎后的甘草粉10 克加到250毫升三角瓶中，同时加入100毫升的70%的乙醇水溶液（固液比为1：10），浸泡1小时后用超声波常温萃取30分钟，甘草中的大部分甘草苷即被提取到乙醇水溶液中了，提取效果可用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）进行检测（见附图1中实线图）。HPLC检测条件为：色谱柱为Kromasil C18反相色谱柱（4.6毫米×250毫米）；流动相为乙腈和水，具体为A液为10%乙腈水溶液加入0.1%乙酸，B液为90%乙腈水溶液同时加入0.1%乙酸；检测方法为：A:B = 40:60（v/v）流速为1毫升/分钟，检测波长为270纳米。
（2）甘草素粗品的制备方法
将上述溶解在乙醇水溶液中的粗提物用滤纸过滤后在旋转蒸发仪中蒸干，加入与提取液等体积的1N 盐酸，在80oC水浴锅中保温2小时进行酸水解。水解结束后取出水浴锅中的三角瓶，等三角瓶内液体温度降至室温后用1N氢氧化钠进行中和，再加入等体积的***进行萃取。***被蒸干后所得物即为甘草素粗品。甘草的乙醇水溶液提取物的酸水解的效果可用HPLC进行检测（见附图1中虚线图），HPLC检测条件同上所述。
（3）甘草素纯品的制备方法
甘草的乙醇水溶液提取物的酸水解产物分别在276纳米和313纳米处有最大紫外吸收（见附图1中紫外吸收图谱），这与文献中报道的甘草素的紫外图谱正好相吻合。为了对甘草乙醇水溶液提取物的酸水解产物做准确结构鉴定，我们将水解后产物用制备柱（8.0毫米×250毫米）在HPLC上进行分离制备，对水解产物峰进行收集，收集液用旋转蒸发仪蒸干后分别进行核磁共振氢谱（1H-NMR）和碳谱（13C-NMR）测定，通过谱图解析并与文献报道中的甘草素的核磁共振谱（Tetrahedron, 2006,62:841-846）进行对比分析，确定该水解后产物确为甘草素（LG）。水解产物的1H-NMR和13C-NMR具体结果如下：
1H NMR (MeOD, 400 MHz,): δ 7.74 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-5 ), 7.34 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′,6′), 6.84 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′,5′), 6.51 (1H,dd, J = 8.7, 2.0 Hz, H-6), 6.37 (1H,d, J = 2.0 Hz, H-8), 5.39(1H,dd, J = 13.0, 2.6 Hz, H-2), 3.06 (1H, dd, J = 16.8, 13.0 Hz, H-3 trans), 2.71 (1H, dd, J = 16.8, 2.6 Hz, H-3 cis); 13C NMR(MeOD, 100MHz): δ192.1 (C-4), 165.5(C-7), 164.2 (C-9), 157.6 (C-4′), 130.0 (C-1′), 128.4 (C-5), 127.6 (C-2′, 6′), 114.9 (C-3′, 5′), 113.5 (C-10), 110.4 (C-6), 102.4 (C-8), 79.6 (C-2), 43.6 (C-3)。
有益效果：
1. 本发明提供的人肠道分离菌株红椿菌Julong21能在厌氧工作站内将中药甘草水解物甘草素（LG）粗品高效转化为达维荚蒾苷元（DG）；当底物浓度超过0.4毫摩尔/升时，产物DG对DPPH的清除率均极显著高于底物LG（p<0.01）。
2. 本发明的红椿菌Julong21解决了达维荚蒾苷元（DG）资源缺乏的问题，对甘草中药理活性物质的研究具有极大的推动作用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1 为本发明中甘草提取物（图中实线部分）和甘草提取物水解产物（图中虚线部分）的高效液相色谱图；
图2为本发明实施例1中厌氧菌株Julong21转化底物甘草素的高效液相色谱图；
图3 为本发明实施例1中甘草素代谢产物的质谱图；
图4 为本发明实施例1中厌氧菌株Julong21对底物甘草素的转化动态曲线；
图5为本发明实施例1中厌氧菌株Julong21对不同浓度底物甘草素转化能力比较；
图6 为本发明实施例1中不同浓度底物甘草素及其代谢产物达维荚蒾苷元体外清除DPPH自由基能力比较。
具体实施方式
实施例1
1.菌株Julong21的分离培养
（1）人粪样的采集与培养
用已灭菌的棉签挑取新鲜粪便，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37℃温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；
（2）分离培养红椿菌AUH-Julong21
①单一菌落式分离培养
用新鲜BHI液体培养基将事先在厌氧工作站内培养24小时的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10–1，10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7、10–8，再分别将100微升浓度分别为10–5、10–6、10–7、10–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；
②单菌落的混合培养及转化活性鉴定
将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入0.1毫摩尔/升甘草素纯品，在厌氧工作站内培养2天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；
③特定功能微生物菌落的分离筛选
一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入0.1毫摩尔/升的底物甘草素10微升，共同培养24小时后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中具有转化底物甘草素功能的单菌落；
2.菌株Julong21的纯化培养、菌种鉴定与保藏
（1）单菌落的纯化培养
将筛选出的单一功能微生物菌落在BHI固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到1毫升BHI液体培养基中，培养24小时取菌液100微升，加入到盛有500微升事先已灭菌的50％甘油水溶液的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在-70oC的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。
（2）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定
以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R（27F:
5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物对16S rDNA基因序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生工生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析，该单一功能微生物菌株的16S rDNA序列与红椿属菌株Coriobacterium sp.的相似性高达99%，将该功能微生物菌株初步确定为红椿属菌株。将该功能微生物菌株菌株命名为AUH-Julong21，并将其16S rDNA序列上交NCBI基因库，得到该菌株注册号（Accession Number）EU919864。
3.菌株Julong21在甘草转化中的应用
（1）菌株Julong21的培养
将–70oC低温保存的人肠道分离菌株Julong21冻融后，按20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37oC下培养24小时后试管中菌液呈絮状混浊。再以10%接种量将试管中已长混浊的菌株Julong21重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的塑料离心管中，继续在厌氧工作站内培养24小时作为种子液；
（2）底物甘草素粗品与菌株Julong21共培养
在厌氧工作站将上述事先培养好的菌株Julong21的种子液按10-15%接种量转接到盛有液体培养基的三角瓶内培养，同时加入40-60毫摩尔/升的甘草素粗品, 使得培养基中甘草素浓度为0.2-0.8毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2-3天，菌株Julong21可将底物甘草素粗品转化为达维荚蒾苷元。
（3）用HPLC检测底物甘草素粗品被菌株Julong21的转化情况
从上述三角瓶中培养物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入800微升100%甲醇溶液。
（4）代谢产物的分离纯化与结构鉴定
经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集代谢产物峰。将收集的代谢产物峰蒸干后，在分析型高效液相色谱仪上测定其纯度，再分别测定代谢产物的紫外吸收谱、质谱、核磁共振氢谱和碳谱。结果表明，该代谢产物分别在278纳米和317纳米处有最大紫外吸收（见附图2中的紫外吸收图谱），这与文献中报道的达维荚蒾苷元（DG）的紫外吸收图谱相吻合；质谱测定结果表明，该代谢产物分子量为258（见附图3），这恰好与DG分子式C15H14O4相吻合。根据产物的紫外吸收图谱和分子量可将其初步鉴定为DG。为进一步准确解析该代谢产物的化学结构，我们对纯化后的代谢产物的核磁共振氢谱（1H-NMR）和碳谱（13C-NMR）分别进行了测定。通过谱图解析并与文献报道中的DG的核磁共振谱进行对比分析，最终将该代谢产物准确鉴定为DG。代谢产物的1H-NMR和13C-NMR结果如下：
1H NMR (MeOD, 400 MHz,): δ7.69 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6′), 7.06 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2,6), 6.70 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3,5), 6.34 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5′), 6.26 (1H, s, H-3′), 3.17 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-β), 2.90 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-α); 13C NMR(MeOD, 100MHz): δ 204.1 (C=O), 165 (C-2′), 164.9 (C-4′), 155.3 (C-4), 132.3 (C-6′), 131.8 (C-1), 129.0 (C-2, 6), 114.8 (C-3, 5), 112.6 (C-1′), 107.7 (C-5′), 102.3 (C-3′), 39.5 (C-β), 29.6 (C-α)。
（5）菌株Julong21对底物甘草素粗品的转化动态
为了解菌株Julong21转化底物甘草素的速度，以便确定最佳转化时间，我们对菌株Julong21转化底物甘草素粗品的转化动态进行了测定，具体方法如下：
将事先培养好的种子液（培养方法同上所述）按10%接种量接种到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入40 毫摩尔/升的甘草素粗品0.5 毫升，在厌氧工作站内培养0小时、12小时、24小时、48小时、72小时和96小时后分别取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入100微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况，根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态（见图4），由图4可知，底物加入1天后即有52.8%左右产物达维荚蒾苷元被生成，继续培养1天后，所加入的底物甘草素有84.7%被转化为达维荚蒾苷元；第3天产物达维荚蒾苷元稍有上升，第4天产物量基本不再上升，转化率为90%以上。
4.菌株Julong21对不同浓度底物甘草素粗品最大转化能力测定
将菌株Julong21分别与不同浓度的甘草素粗品在厌氧工作站内共同培养3天，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物甘草素粗品被转化情况。结果表明，菌株Julong21对浓度分别为0.2毫摩尔/升、0.4毫摩尔/升和0.8毫摩尔/升的甘草素粗品的转化能力相似，平均转化率（转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）分别为93.2%、94.0%和91.3%；当所加入的底物浓度为1.2毫摩尔/升时，菌株Julong21对底物甘草素粗品转化能力急剧下降，平均转化率为68.3%（见附图5）。
5.代谢产物达维荚蒾苷元与底物甘草素纯品对DPPH自由基体外清除能力比较
分别将底物甘草素纯品与产物达维荚蒾苷元纯品配制为5毫摩尔/升的母液，然后依次稀释为以下浓度：0.2毫摩尔/升、0.4毫摩尔/升、0.8毫摩尔/升、1.2毫摩尔/升和1.6毫摩尔/升，对比测定不同浓度下底物和产物对二苯代苦味酰基自由基（1,1-Diphenyl- 2-Picrylhydrazyl，即DPPH）的体外清除能力。结果表明，当浓度为0.2毫摩尔/升下，产物DG对DPPH自由基清除能力显著高于底物LG（p<0.05）；当浓度为0.4毫摩尔/升、0.8毫摩尔/升、1.2毫摩尔/升和1.6毫摩尔/升时，产物DG对DPPH自由基的清除能力均极显著高于底物LG（p<0.01），结果见附图6。
实施例2
菌株Julong21的分离方法同实施例1。
在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株Julong21的种子液按10%接种量转接到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入40毫摩尔/升的甘草素粗品0.5 毫升（甘草素粗品浓度依据甘草素粗品中甘草素峰面积值及甘草素纯品的标准曲线进行计算）, 在厌氧工作站内培养2天。用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，得到达维荚蒾苷元的转化率为93.8%。
实施例3
菌株Julong21的分离方法同实施例1。
在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株Julong21的种子液按10%接种量转接到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入60毫摩尔/升的甘草素粗品1.3 毫升（甘草素粗品浓度依据甘草素粗品中甘草素峰面积值及甘草素纯品的标准曲线进行计算）, 在厌氧工作站内培养3天。用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，得到达维荚蒾苷元的转化率为91.5%。
Claims (2)
1.一种红椿菌（Coriobacterium sp.）AUH-Julong21，保藏号为CGMCC No.5306。
2.如权利要求1所述的红椿菌AUH-Julong21在甘草素转化中的应用，其特征在于包括下述步骤：
（1）菌株AUH-Julong21的培养
将低温冷冻保存的红椿菌AUH-Julong21融化并按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37℃下培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-Julong21重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液；
（2）底物甘草素粗品与菌株AUH-Julong21共培养与代谢产物的分离纯化
①底物甘草素粗品与菌株AUH-Julong21共培养
将菌株AUH-Julong21的种子液按10-15%接种量转接到液体培养基中培养，根据甘草素粗品母液中底物甘草素浓度40-60毫摩尔/升及三角瓶中培养基体积，确定母液加入量，使得甘草素在培养基中的浓度为0.2-0.8毫摩尔/升, 在厌氧工作站内培养2-3天，即可将底物甘草素粗品高效转化为达维荚蒾苷元；
②代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备达维荚蒾苷元。
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