CN102365933B

CN102365933B - 一种间充质干细胞保存液及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102365933B
Application number: CN201110325314.5A
Authority: CN
Inventors: 万桦; 魏伟
Original assignee: GUANGZHOU TIANHE NUOYA BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU TIANHE NUOYA BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2011-10-24
Filing date: 2011-10-24
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2031-10-24
Also published as: CN102365933A

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种间充质干细胞保存液及其制备方法与应用，该间充质干细胞保存液含有占保存液体积5-15％的人AB型脐带血血浆和70-80AXaIU/ml的低分子肝素钙；所述的人AB型脐带血血浆与间充质干细胞来自同一提供者。本发明的间充质干细胞保存液能延长间充质干细胞的活性维持时间(4-15℃下保持90％以上的活性72小时)，间充质干细胞在本发明的保存液中保存72小时后，细胞形态正常、不影响其增殖扩增能力、不影响间充质干细胞表型特征。本发明的间充质干细胞保存液其临床应用安全可靠，AB型脐带血血浆和脐带间充质干细胞来源于同一个胎盘，属于自体血浆，这就减少了外源病毒污染的可能性。

Description

一种间充质干细胞保存液及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种间充质干细胞保存液及其制备方法与应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是中胚层来源的一类具有多向分化能力的干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化成心肌细胞、神经细胞及脂肪细胞等。

随着国内外学者对间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，目前已经可以从多种组织中分离出间充质干细胞。间充质干细胞具有支持造血和调节免疫等作用，在造血重建、组织修复、免疫治疗等方面具有广阔的临床应用前景。间充质干细胞不表达MHCII类分子及共刺激因子B7-1、B7-2、CD40、CD40L等，极少表达MHCI类分子，因此免疫原性弱。由于以上间充质干细胞的作用及特性，近年来，间充质干细胞被用于临床多种疾病的临床试验及治疗中，并且表现出良好的应用前景。

目前国内有资质开展大规模分离、扩增、培养人间充质干细胞的机构很少，而间充质干细胞的临床应用范围却非常广泛，因此急需研究一种间充质干细胞保护液，使间充质干细胞在此种保护液中活性维持时间较长，可以满足运输到国内大多数地区及周边国家的要求，并且可以直接应用于人体，安全无毒。

目前国内可以大量提供人间充质干细胞的机构通常是采用生理盐水或者细胞培养基作为临床间充质干细胞应用时的溶液介质。如果将人间充质干细胞分离、培养、扩增后，立即给病人应用，生理盐水是方便安全的，但是间充质干细胞在生理盐水中活力下降的速度非常快，单纯用生理盐水保存间充质干细胞，2小时后细胞活力就会降低10％左右，因此只适用于间充质干细胞的即时使用。

现有的另外一种细胞保护液是将细胞培养基作为成份之一，细胞培养基中含有细胞生长代谢所需的糖类、氨基酸、无机盐、维生素等物质，对于维持细胞渗透压及活力有较好的作用，但是目前国内大部分细胞培养基均是仅供科研使用，不作为临床应用的常规试剂，因此临床应用人间充质干细胞的同时直接应用细胞培养基的安全性及可靠性不确定，并且细胞培养基由于生产厂家、生产方法的不同，质量、纯度、价格也不等，纯度、质量都比较好的进口培养基价格更贵。

现有技术是用TC199无血清培养基、人血白蛋白和低分子肝素钙配置的溶液作为人间充质干细胞的保存液。该技术将人间充质干细胞分离、培养、收集后分别用含有1％人血清白蛋白的TC199和含有1％人血清白蛋白的生理盐水保存，细胞浓度为5×10⁵/ml，4℃保存8小时后，生理盐水组的细胞活力明显低于TC199组；调整人血白蛋白的浓度，分别使TC199中含有0.5％、1％、2％、5％的人血白蛋白，1％、2％、5％的人血白蛋白对于保持间充质干细胞的活力都是有益的；用含1％人血白蛋白的TC199分别配制含0.01％EDTA、75AXaIU/ml低分子肝素钠、75AXaIU/ml低分子肝素钙的溶液保存人间充质干细胞，发现低分子肝素钙可以有效防止间充质干细胞聚集。总之现有技术是将TC199培养基、人血白蛋白、低分子肝素钙作为保存液保存人间充质干细胞，干细胞可以保持90％以上的活力24小时，细胞活力随时间延长逐渐递减，并且可以防止干细胞与容器内壁的粘附。

但现有技术的缺点之一在于间充质干细胞保存液中的TC199是一种细胞培养基，细胞培养基通常被用来进行细胞及组织培养，并非国家批准可以临床应用于人体的试剂，成份复杂，不同生产厂家的培养基质量不一，进口试剂价格昂贵，而且近年来随着生物试剂领域的不断发展，TC199已经逐渐退出培养基市场，被其它培养基所替代，因此其来源有限。

总之，尽管现有技术用TC199作为间充质干细胞保存液的有效成份可以保持细胞活力24小时，从试剂来源、临床应用的合法性、试剂成本方面考虑都是不利于间充质干细胞临床推广使用的。

现有技术的另一个不足之处在于其保持间充质干细胞活力的时间较短，间充质干细胞在现有技术的细胞保存液中可以保持90％以上活力仅24个小时，并且随着时间延长，细胞活力下降，那么就意味着超过24小时，细胞活力将下降到90％以下，然而干细胞治疗及临床试验已经在国内多数城市及国外多个国家开展，利用现有的交通工具，24小时的活力维持时间明显限制了间充质干细胞的应用范围。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种间充质干细胞保存液，该保存液能延长间充质干细胞的活性维持时间，降低保存液的制备成本，且临床应用安全可靠。

本发明的另一目的在于提供上述间充质干细胞保存液的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述间充质干细胞保存液的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种间充质干细胞保存液，含有占保存液体积5-15％的人AB型脐带血血浆和70-80AXaIU/ml的低分子肝素钙，余量为生理盐水或质量分数为5％的葡萄糖水溶液；

所述的低分子肝素钙的浓度优选75AXaIU/ml；

所述的人AB型脐带血血浆与间充质干细胞来自同一提供者。

上述的间充质干细胞保存液的制备方法，是将人AB型脐带血血浆、低分子肝素钙与生理盐水或质量分数为5％的葡萄糖水溶液混合均匀即可。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的间充质干细胞保存液能延长间充质干细胞的活性维持时间(4-15℃下保持90％以上的活性72小时)，使得间充质干细胞的长途远距离运输成为可能，大大增加了间充质干细胞的应用范围。

(2)本发明的间充质干细胞保存液的制备方法简单，降低了保存液的制备成本。

(3)本发明的间充质干细胞保存液其临床应用安全可靠。脐带血血浆比一般人血浆中含有更多的生长因子，对于细胞的保存来说具有比人血白蛋白以及普通人血清更好的效果，同时由于是AB型的脐带血血浆，输注于任何血型的人体时都不会引起溶血反应。该AB型脐带血血浆和脐带间充质干细胞来源于同一个胎盘，属于自体血浆，这就减少了外源病毒污染的可能性。

(4)间充质干细胞在本发明的保存液中保存72小时后，细胞形态正常、不影响其增殖扩增能力、不影响间充质干细胞表型特征。

附图说明

图1是脐带间充质干细胞流式细胞术细胞表型分析结果图。

图2是脐带间充质干细胞在本发明的保存液A中保存72h后的细胞表型分析结果图。

图3是脐带间充质干细胞在本发明的保存液B中保存72h后的细胞表型分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

1、脐带间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定

(1)将脐带在含100IU/L青霉素、100mg/L链霉素的注射用生理盐水中浸泡10-15分钟。

(2)用注射用生理盐水充分冲洗脐带，然后将脐带组织块剪碎成1mm³的小块。

(3)加入LONZA培养基悬浮组织块，将全部组织块接种到细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂的饱和湿度培养箱(Thermo公司，美国)中培养。

(4)组织块培养1周后全量换LONZA培养基，弃去组织块及非贴壁细胞。

(5)以后每3天半量换LONZA培养基，每日观察细胞生长状态，观察细胞至80％融合时，用体积分数为0.25％的胰酶(GIBCO公司，美国)消化细胞，按1∶3传代。

(6)收集细胞以FITC标记的CD45、CD90(BD公司，美国)，PE标记的CD105、CD34、CD73(BD公司)进行流式细胞仪(Fascalibur，BD公司，美国)检测。

脐带间充质干细胞流式细胞术细胞表型分析结果表明：间充质干细胞高表达CD90、CD105、CD73，不表达CD45、CD34。如图1所示。

2、人AB型脐带血血浆的浓度选择

以下所述低分子肝素钙购自江苏万邦生化医药股份有限公司。

配制保存液1：占保存液体积1％的人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的生理盐水注射液

配制保存液2：占保存液体积5％的人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的生理盐水注射液

配制保存液3：占保存液体积10％的人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的生理盐水注射液

配制保存液4：占保存液体积15％的人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的生理盐水注射液

配制保存液6：占保存液体积1％的人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5％(质量比)葡萄糖注射液

配制保存液7：占保存液体积5％的人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5％(质量比)葡萄糖注射液

配制保存液8：占保存液体积10％的人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5％(质量比)葡萄糖注射液

配制保存液9：占保存液体积15％的人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5％(质量比)葡萄糖注射液

制备脐带间充质干细胞悬液，密度为5×10⁵个/ml。分装24管(每种保存液3支平行管)，3ml/管；分别加入3ml配制好的保存液，将细胞混匀后置于4℃保存72小时，期间分别于第12、24、36、48、72小时时用台盼兰染色计数细胞存活率。

结果判断：死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深蓝色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

结果：人脐带间充质干细胞保存于含有不同体积分数的人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5％葡萄糖注射液(或生理盐水)的保存液中，人AB型脐带血血浆浓度分别为1％、5％、10％、15％，结果表明5-15％浓度的人AB型脐带血血浆对于细胞活力及形态的维持较适宜。结果如表1和2所示。

表1

表2

3、含1％人血白蛋白(购自广东双林制药有限公司)和10％人AB型脐带血浆的两种保存液的效果对比

配制保存液1：含1％(体积比)人血白蛋白+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5％(质量比)葡萄糖注射液注射液；

配制保存液2：含10％(体积比)人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5％(质量比)葡萄糖注射液注射液；

制备脐带间充质干细胞悬液，密度为5×10⁵个/ml。分装6管(每种保存液3支平行管)，3ml/管。分别加入3ml配制好的保存液。置于4℃，保存72小时，期间分别于12、24、36、48、72小时时用台盼兰染色计数细胞存活率。

结果：人脐带间充质干细胞在10％人AB型脐带血血浆中4℃保存72小时后，细胞活力仍然在90％以上，细胞形态不变，细胞膜光滑，细胞轮廓清晰，细胞大小均匀，细胞分散度好，折光度好：而保存于1％人血白蛋白在同样的条件下保存72小后细胞活力即下降到90％以下，而且细胞形态变得大小不等，细胞轮廓模糊，细胞体积变大。结果见表3。

表3

细胞存活率＝(细胞总数着色细胞数)/细胞总数×100％

4、人脐带间充质干细胞在本发明的保存液中保存72小时后的表型鉴定

人脐带间充质干细胞在本发明的保存液A(含10％(体积比)人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5％(质量比)葡萄糖水溶液)和保存液B(含10％(体积比)人AB型脐带血血浆+75AXaIU/ml低分子肝素钙的生理盐水)中保存72小时后其细胞表型鉴定结果分别如图2和图3所示。

图2中，CD90为99.21％、CD105为98.98％、CD73为99.46％、CD34为0.17％、CD45为0.10％；图3中，CD90为99.43％、CD105为99.30％、CD73为99..9％、CD34为0.10％、CD45为0.03％；与图1所示的未经过保存液保存的细胞表型鉴定结果(CD90为99.82％、CD105为99.77％、CD73为99.86％、CD34为0.07％、CD45为0.06％)相比并无太大差距，人脐带间充质干细胞在本发明的保存液中保存72小时后，细胞表型不变。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种脐带间充质干细胞保存液，其特征在于：含有占保存液体积5-15%的人AB型脐带血血浆和70-80AXaIU/ml的低分子肝素钙；

所述的人AB型脐带血血浆与间充质干细胞来自同一提供者。

2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞保存液，其特征在于：所述的低分子肝素钙的浓度为75AXaIU/ml。

3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞保存液，其特征在于：余量为生理盐水或质量分数为5%的葡萄糖水溶液。

4.权利要求1-3任一项所述的脐带间充质干细胞保存液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将人AB型脐带血血浆、低分子肝素钙与生理盐水或质量分数为5%的葡萄糖水溶液混合均匀即可。

5.权利要求1-3任一项所述的脐带间充质干细胞保存液在间充质干细胞保存液中的应用。