CN102365372B - 预测和监控对于Aurora激酶B抑制剂疗法的应答的标记 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鉴定ABCB1基因、ABCB4基因或其组合中一种或多种拷贝数增益的存在或不存在，鉴定对于接受作为单一疗法或作为组合疗法的部分的Aurora激酶抑制剂疗法合格的患者，并且监控患者对于此种疗法的应答。
Description
相关申请信息
本申请要求于2009年1月31日提交的美国系列号61/148,957的利益，其内容引入本文作为参考。
序列表
本申请含有序列表，其已经由EFS-Web提交且整体引入本文作为参考。所述ASCII拷贝名称为9700.txt且大小于79kb。
技术领域
本发明涉及在关于选择用一种或多种Aurora激酶B抑制剂的癌症疗法的患者分类中有用的诊断测定。具体地，本发明涉及鉴定ABCB1基因、ABCB4基因或其组合中一种或多种拷贝数增益(gain)的存在或不存在，鉴定对于接受作为单一疗法或作为组合疗法的部分的Aurora激酶抑制剂疗法合格的患者，并且监控对于此种疗法的患者应答。
背景
Aurora激酶家族是一组高度相关的丝氨酸/苏氨酸激酶，其充当有丝***的关键调节剂。3种Aurora激酶在哺乳动物细胞中表达。这些Aurora激酶是Aurora A、Aurora B和Aurora C。这些Aurora激酶各自显示不同的亚细胞定位且发挥独特作用（参见，Carmena M.E.W.，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. ，4:842-854（2003）和（Ducat，D.Z.Y.，Exp. Cell Res. ，301:60-67（2004））。具体地，Aurora A定位于纺锤极且在两极纺锤体形成中具有关键作用（参见Marumoto，T.Z.D.，等人，Nat. Rev. Cancer，5:42-50（2005））。Aurora B，染色体过客蛋白质，定位于早期有丝***中的着丝粒，并且随后定位于后期中的纺锤体中间区。Aurora B是有丝***组蛋白H3磷酸化、染色体双向定向(biorientation)、纺锤体装配限制点和胞质***所需的（Andrews，P.D.，等人，Curr. Opin. Cell Biol. ，15:672-683（2003））。Aurora C也是染色体过客蛋白质，并且在正常细胞中，其表达局限于睾丸，在其中它主要在雄性配子发生中起作用。因为Aurora激酶在有丝***中发挥基本功能，所以相当大的注意力已给予靶向这个激酶家族用于癌症疗法。几种小分子抑制剂已得到开发，包括Hesperadin、ZM447439、VX-680/MK0457、AZD1152和MLN8054（参见，Ditchfield，C，J.V.，等人，J. Cell Biol. ，161:267-280（2003），Harrington，E.A.，等人，Nat. Med. ，10:262-267（2004），Hauf，S.，等人，J. Cell Biol. ，161:281-294（2003），Manfredi，M.G.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. ， USA，104:4106-4111（2007））。
AZD1152是新N-乙酰苯胺取代的吡唑-氨基喹唑啉前体药物，其在人血浆中快速转变为活性药物AZD1152 HQPA（参见，Mortlock，A.A.，等人，J. Med. Chem. ，50:2213-2224（2007））。与Aurora A相比较（Ki 1369 nM），AZD1152 HQPA是Aurora B的高度有效和有选择性的抑制剂（Ki 0.36 nM），并且针对50种其他激酶的实验对象组是无活性的。AZD1152有效抑制人结肠、肺和血液学肿瘤异种移植物在免疫缺陷小鼠中的生长。用AZD1152静脉内处理的荷有SW620结肠直肠肿瘤的无胸腺大鼠中的详细药物动力学分析揭示肿瘤中的表型事件的时间顺序：组蛋白H3磷酸化的瞬时抑制，具有4n DNA的细胞积累，随后为多倍体（>4n DNA）细胞比例中的增加。组织学分析已显示与AZD1152处理的肿瘤中细胞凋亡中的增加同时的异常细胞***，即，观察到骨髓的增殖抑制所继发的瞬时的骨髓抑制，尽管这种作用在AZD1152处理停止后是完全可逆的（参见，Wilkinson，R.W.，等人，Clin. Cancer Res. ，13:3683-3688（2007））。
在癌症化学疗法中面对的主要障碍是肿瘤对于细胞毒剂，甚至对于肿瘤细胞从未暴露于其的药物的交叉抗性的发展。这种表型称为多药耐性（MDR），在用抗癌药物治疗后频繁观察到。虽然关于MDR的分子基础经常是复杂的，但ATP结合盒（ABC）转运蛋白超家族成员的上调已作为由肿瘤细胞利用的核心、细胞自主性机制出现，以逃避在第一线和第二线治疗标准中普遍的化学治疗药物的活性。因为先前化学疗法已失败的个体是最可能接受更新的实验医学的那些，所以MDR易感性代表肿瘤学中的药物开发中的重大障碍。原型ABC转运蛋白，多药耐性1（MDR1；也称为P-糖蛋白或P-gp；由基因ABCB1编码）由2个跨膜结构域和2个核苷酸结合结构域组成，其通过ATP的水解转运溶质逆着浓度梯度进入细胞外间隙内。其他ABC转运蛋白例如乳腺癌抗性蛋白质（BRCP，其由基因ABCG2编码）作为半转运蛋白表达，并且二聚化以产生成熟的功能单位。尽管BRCP对于针对化学疗法的抗性的贡献仍不明了，但MDR1的上调已是具有急性髓细胞性白血病（AML）或骨髓异常增生综合征的个体中化学疗法失败和低存活的一致地预兆（Pallis，M.R.N.，Leukemia，18:1927-1930（2004）和van der Holt，B.L.B.，等人，Blood，106:2646-2654（2005））。此外，MDR1已与31个乳腺癌试验的元分析(meta-analysis)中对于化学疗法的应答减少相关（参见，Trock，B.J.，等人，J. Natl. Cancer Inst.，89:917-931（1997））。因此，在抑制或调节一种或多种ABC转运蛋白的物质开发中已投入相当大的努力。事实上，这类第二代和第三代抑制剂待作为化学致敏剂(chemosensitizer)在临床试验中评价（Bates，S.F.，等人，Novartis Found. Symp. ，83-96（2002））。
尽管AZD1152已显示希望的临床前功效且在AML和实体瘤中的I/II期临床试验中评价，但关于发展对于AZD1152的抗性的潜力仍未探究。因此，本领域需要鉴定对于用Aurora激酶B抑制剂治疗的受试者赋予肿瘤细胞抗性的基因，并且使用得自这些基因的信息，例如由这些基因围绕的蛋白质的上调或下调，以开发用于测定或分类患者对于用Aurora激酶B抑制剂的治疗是否合格的诊断方法，和用于就药物抗性的发展监控患有癌症且用一种或多种Aurora激酶B抑制剂治疗的患者的方法。
概述
在第一个方面，本发明涉及对于用Aurora激酶B抑制剂的治疗的合格性分类患者的方法。该方法包括步骤：
a）提供来自患者的测试样品；
b）测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在；和
c）基于关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在，将患者分类为对于接受用Aurora激酶B抑制剂的治疗是合格的。
在第二个方面，本发明涉及对于用Aurora激酶B抑制剂的治疗的合格性分类患者的方法。该方法包括步骤：
a）提供来自患者的测试样品；
b）测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在；和
c）基于关于在染色体基因座7q21.1的ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在，将患者分类为对于接受用Aurora激酶B抑制剂的治疗是合格的。
在上述2个方面各自中，Aurora激酶B抑制剂可以是AZD1152、ZM447439、VX-680/MK0457或Hersperadin。
在上述2个方面各自中，测试样品可以包括组织样品。具体地，组织样品包括外周血样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、骨髓样品、***样品、尿样品、腹水样品、灌洗样品、食管刷洗样品、膀胱或肺洗涤样品、脊髓液样品、脑液体样品、导管抽吸物样品、***排出物样品、胸膜积液样品、新鲜冷冻组织样品、石蜡包埋的组织样品，或由外周血样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、骨髓样品、尿样品、腹水样品、灌洗样品、食管刷洗样品、膀胱或肺洗涤样品、脊髓液样品、脑液体样品、导管抽吸物样品、***排出物样品、胸膜积液样品、新鲜冷冻组织样品或石蜡包埋的组织样品中的任何一种产生的提取物或加工的样品。
在上述2个方面各自中，测定步骤（b）可以通过原位杂交执行。具体地，原位杂交可以用荧光标记的核酸探针执行。更具体而言，原位杂交可以用至少2种核酸探针执行。可替代地，原位杂交用肽核酸探针执行。
可替代地，在上述2个方面各自中，测定步骤（b）可以通过聚合酶链反应执行。
再进一步可替代地，测定步骤（b）可以通过核酸微阵列测定执行。
在上述2个方面各自中，癌症可以是结肠直肠癌或胰癌。
在第一个方面，在ABCB1基因中拷贝数增益的存在与MDR1多肽表达中的增加相关。在第二个方面，在ABCB4基因中拷贝数增益的存在与MDR3多肽表达中的增加相关。
在上述2个方面各自中，患者用反义试剂治疗，所述反义试剂设计为与ABCB1基因、ABCB4基因或ABCB1基因和ABCB4基因的组合中的至少一种结合。
在上述2个方面各自中，患者还可以任选用化学疗法、放射或其组合进行治疗。
在第三个方面，本发明涉及监控患有癌症且用Aurora激酶B抑制剂治疗的患者的方法。该方法包括步骤：
a）提供来自患有癌症且目前用至少一种Aurora激酶B抑制剂治疗的患者的测试样品；
b）测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在；
c）针对基线水平或预定水平比较测试样品中ABCB1基因的拷贝数；和
d）基于步骤c）中的比较，决定患者是否应继续用Aurora激酶B抑制剂治疗。
在第四个方面，本发明涉及监控患有癌症且用Aurora激酶B抑制剂治疗的患者的方法。该方法包括步骤：
a）提供来自患有癌症且目前用至少一种Aurora激酶B抑制剂治疗的患者的测试样品；
b）测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在；
c）针对基线水平或预定水平比较测试样品中关于ABCB4基因的拷贝数增益或不存在；和
d）基于步骤c）中的比较，决定患者是否应继续用Aurora激酶B抑制剂治疗。
在上述2个方面各自中，Aurora激酶B抑制剂可以是AZD1152、ZM447439、VX-680/MK0457或Hersperadin。
在上述2个方面各自中，测试样品可以包括组织样品。具体地，组织样品包括外周血样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、骨髓样品、***样品、尿样品、腹水样品、灌洗样品、食管刷洗样品、膀胱或肺洗涤样品、脊髓液样品、脑液体样品、导管抽吸物样品、***排出物样品、胸膜积液样品、新鲜冷冻组织样品、石蜡包埋的组织样品，或由外周血样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、骨髓样品、尿样品、腹水样品、灌洗样品、食管刷洗样品、膀胱或肺洗涤样品、脊髓液样品、脑液体样品、导管抽吸物样品、***排出物样品、胸膜积液样品、新鲜冷冻组织样品或石蜡包埋的组织样品中的任何一种产生的提取物或加工的样品。
在上述2个方面各自中，测定步骤（b）可以通过原位杂交执行。具体地，原位杂交可以用荧光标记的核酸探针执行。更具体而言，原位杂交可以用至少2种核酸探针执行。可替代地，原位杂交用肽核酸探针执行。
可替代地，在上述2个方面各自中，测定步骤（b）可以通过聚合酶链反应执行。
再进一步可替代地，测定步骤（b）可以通过核酸微阵列测定执行。
在上述2个方面各自中，癌症可以是结肠直肠癌或胰癌。
在第三个方面，在ABCB1基因中拷贝数增益的存在与MDR1多肽表达中的增加相关。在第四个方面，在ABCB4基因中拷贝数增益的存在与MDR3多肽表达中的增加相关。
在上述2个方面各自中，患者用反义试剂治疗，所述反义试剂设计为与ABCB1基因、ABCB4基因或ABCB1基因和ABCB4基因的组合中的至少一种结合。
在上述2个方面各自中，患者还可以任选用化学疗法、放射或其组合进行治疗。
在第五个方面，本发明涉及分类具有对于用Aurora激酶B抑制剂治疗是抗性的癌症的患者的方法。该方法包括步骤：
a）提供来自患者的测试样品；
b）测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在；
c）针对基线水平或预定水平比较测试样品中关于ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在；和
d）基于（i）在染色体基因座7q21.1上ABCB1基因的拷贝数增益的存在；和（ii）测试样品中拷贝数增益是否高于基线水平或预定水平，将患者分类为具有对于Aurora激酶B抑制剂治疗是抗性的癌症。
在第六个方面，本发明涉及分类具有对于用Aurora激酶B抑制剂治疗是抗性的癌症的患者的方法。该方法包括步骤：
a）提供来自患者的测试样品；
b）测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在；
c）针对基线水平或预定水平比较测试样品中关于ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在；和
d）基于（i）在染色体基因座7q21.1上ABCB4基因的拷贝数增益的存在；和（ii）测试样品中拷贝数增益是否高于基线水平或预定水平，将患者分类为具有对于Aurora激酶B抑制剂治疗是抗性的癌症。
在上述2个方面各自中，Aurora激酶B抑制剂可以是AZD1152、ZM447439、VX-680/MK0457或Hersperadin。
在上述2个方面各自中，测试样品可以包括组织样品。具体地，组织样品包括外周血样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、骨髓样品、***样品、尿样品、腹水样品、灌洗样品、食管刷洗样品、膀胱或肺洗涤样品、脊髓液样品、脑液体样品、导管抽吸物样品、***排出物样品、胸膜积液样品、新鲜冷冻组织样品、石蜡包埋的组织样品，或由外周血样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、骨髓样品、尿样品、腹水样品、灌洗样品、食管刷洗样品、膀胱或肺洗涤样品、脊髓液样品、脑液体样品、导管抽吸物样品、***排出物样品、胸膜积液样品、新鲜冷冻组织样品或石蜡包埋的组织样品中的任何一种产生的提取物或加工的样品。
在上述2个方面各自中，测定步骤（b）可以通过原位杂交执行。具体地，原位杂交可以用荧光标记的核酸探针执行。更具体而言，原位杂交可以用至少2种核酸探针执行。可替代地，原位杂交用肽核酸探针执行。
可替代地，在上述2个方面各自中，测定步骤（b）可以通过聚合酶链反应执行。
再进一步可替代地，测定步骤（b）可以通过核酸微阵列测定执行。
在上述2个方面各自中，癌症可以是结肠直肠癌或胰癌。
在第五个方面，在ABCB1基因中拷贝数增益的存在与MDR1多肽表达中的增加相关。在第六个方面，在ABCB4基因中拷贝数增益的存在与MDR3多肽表达中的增加相关。
在上述2个方面各自中，患者用反义试剂治疗，所述反义试剂设计为与ABCB1基因、ABCB4基因或ABCB1基因和ABCB4基因的组合中的至少一种结合。
在上述2个方面各自中，患者还可以任选用化学疗法、放射或其组合进行治疗。
在第七个方面，本发明涉及包括下述的试剂盒：
（a）用于测定关于ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在的试剂；
（b）用于执行测试的说明书。
在上述试剂盒中，测定拷贝数增益的存在或不存在的试剂包括与ABCB1基因的至少部分杂交的可检测标记的多核苷酸。
在第八个实施方案中，本发明涉及包括下述的试剂盒：
（a）用于测定关于ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在的试剂；
（b）用于执行测试的说明书。
在上述试剂盒中，测定拷贝数增益的存在或不存在的试剂包括与ABCB4基因的至少部分杂交的可检测标记的多核苷酸。
附图简述
图1显示如实施例中所述，ABCB1和ABCB4鉴定为SW620衍生物中扩增且超表达的基因，所述SW620衍生物对于针对AZD1152 HQPA的抗性进行选择。具体地，图1A显示在亲本SW620细胞、SW620ABCB1/3细胞和在无药物培养基中培养3个月后的SW620ABCB1/3细胞中，使用Affymetrix 100K SNP芯片通过CGH测定的ABCB1和ABCB4拷贝数。垂直线指示ABCB1基因座的位置，并且水平线指示正常DNA拷贝数（2个拷贝）。图1B显示与其他溶质转运蛋白相比较，关于ABCB1和ABCB4的mRNA表达值。SW620ABCB1/3中ABCB1（编码MDR1）和ABCB4（编码MDR3）的表达水平由箭标指示。图1C显示使用Affymetrix HG-U133A
GeneChips测定的，关于超过14,000种基因加上ESTs（~22,000探针组）的mRNA表达值。数据呈现为与其表达增加10倍或更大的所有基因相比较，与亲本SW620细胞相比较，关于SW620ABCB1/3细胞的基因表达中的倍数变化。图1D显示通过免疫印迹分析测定的MDR1蛋白质的相对表达。β-肌动蛋白用作装载对照。
图2显示ABCB1的抑制逆转SW620ABCB1/3衍生物中对于AZD1152 HQPA的抗性。图2A显示在剂量应答中用AZD1152 HQPA处理90分钟的SW620、SW620ABCB1/3和在无药物培养基中培养3个月后的SW620ABCB1/3细胞。通过免疫印迹分析测定组蛋白H3在Ser10上的磷酸化。图2B显示用1 µM AZD1152 HQPA处理4小时的SW620或SW620ABCB1/3细胞。使细胞分级分离，并且在分别的样品级分中通过LC-MS分析测定AZD1152 HQPA浓度。图2C显示在剂量应答中AZD1152 HQPA 90分钟前，用DMSO或1 μM PSC-833处理2小时的SW620ABCB1/3细胞。随后通过免疫印迹测定组蛋白H3的磷酸化。图2D显示通过转染萤光素酶（siLuciferase）或ABCB1（siABCB1）siRNAs，随后用AZD1152 HQPA处理转染的细胞90分钟，评估SW620ABCB1/3衍生物中ABCB1击倒的作用。ABCB1的免疫印迹分析指示与siLuciferase相比较，蛋白质水平由siABCB1减少约75％。
图3显示在SW620与SW620ABCB1/3异种移植物比较中，AZD1152 HQPA的药物代谢动力学、药物动力学和功效的关系。图3A（上图）显示通过计算在组蛋白H3磷酸化的测定中AZD1152 HQPA的固有效力和当在50％（vv-1）小鼠血浆的存在下测定时AZD1152 HQPA的效力中的倍数减少的积估计的抑制异种移植物组蛋白H3磷酸化所需的计划阈值瘤内浓度。下图显示在100 mg kg-1的单次腹膜内（i.p.）注射后，在给药后0、2、8和24小时时测定的AZD1152 HQPA瘤内药物代谢动力学。图3B显示给予单剂AZD1152 HQPA的荷有确立的SW620和SW620ABCB1/3肿瘤异种移植物的小鼠（100 mg kg-1，i.p.），并且每个时间点收获3个肿瘤。取出肿瘤，并且在用AZD1152处理后通过SW620肿瘤（浅蓝色）和SW620ABCB1/3肿瘤（深蓝色）中的免疫印迹测定磷酸-组蛋白H3水平。定量免疫印迹，并且数据表示为曲线下面积。呈现来自个别时间点的平均值±s.e.m。图3C和图3D显示如实施例1中所述，皮下注射到scid-bg小鼠内的SW620和SW620ABCB1/3细胞。肿瘤在约500 mm3进行大小匹配，并且用AZD1152的处理在接种后第7天起始。AZD1152以q2d时间表以50或100 mg/kg/天的剂量通过i.p.注射施用2周。每个点代表10个肿瘤的平均值± s.d.。
图4显示超表达ABCB1的细胞系在体外对于AZD1152 HQPA和VX-680/MK0457是抗性的。图4A呈现在显示ABCB1的相对表达的异种移植物研究中使用的细胞系的免疫印迹。图4B显示在7天集落形成（贴壁系：SW620、SW620ABCB1/3、HCT-15、AsPC1）或生存力（非贴壁系：RS；411和DoHH-2）中对于针对AZD1152 HQPA、VX-680/MK0457、MLN8054和紫杉醇的相对敏感性评价的细胞系实验对象组。细胞在剂量应答中处理，以测定IC50s。图4C显示在添加所示浓度的AZD1152 HQPA另外1小时前，用DMSO或1 μM PSC-833处理1小时的HCT-15细胞。通过免疫印迹测定总和磷酸-（Ser10）-组蛋白H3。图4D显示如图4C中所述，用DMSO或10 μM 烟曲霉毒素C处理1小时随后为AZD1152 HQPA的AsPC1细胞。
详述
本发明提供了关于对于Aurora激酶B抑制剂疗法的抗性监控癌症和肿瘤细胞的方法和组合物。本发明人发现关于（i）在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因；（ii）在染色体基因座7q21.1的ABCB4基因；或（iii）在染色体基因座7q21.1上的ABCB1基因和ABCB4基因各自的拷贝数增益的存在与对于用Aurora激酶B抑制剂的疗法的抗性相关。
本发明人发现使用基于微阵列的比较基因组杂交技术的上述拷贝数增益，以检测在全基因组规模上的基因拷贝数异常（例如拷贝数增益和拷贝数丧失），从而提供了伴随DNA拷贝数中的变化的染色体畸变的全基因组视图。这种方法在METHODS FOR ASSEMBLING
PANELS OF CANCER CELL LINES FOR USE IN TESTING THE EFFICACY OF ONE OR MORE
PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS中完全公开，其于2008年10月31日提交，并且指定美国系列号61/110,281，其内容整体引入本文。
本发明提供了用于鉴定、分类且监控癌症患者的诊断测定，这包括就关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因各自的拷贝数增益的存在或不存在评估测试样品。本发明的测定包括用于鉴定对于接受Aurora激酶B疗法（作为单一疗法或作为组合疗法（例如连同化学疗法、放射或其组合）的部分）合格的患者和用于监控对于此种疗法的患者应答的测定方法。本发明包括例如通过荧光原位杂交测定关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因各自的拷贝数增益的存在或不存在。分类为具有关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因各自的拷贝数增益中的增加的患者对于接受至少作为单一疗法的Aurora激酶B疗法是不合格的，因为他们不太可能响应这种疗法。此外，具有这种扩增的患者可以对其他癌症疗法是抗性的。因此，关于癌症和肿瘤细胞中（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因各自的拷贝数增益的存在的测定作为一般疗法分层标记是有用的。
在一个实施方案中，本发明包括用于将患者鉴定或分类为对于用Aurora激酶B抑制剂的治疗（作为单一疗法或组合疗法的部分）合格的方法，该方法包括步骤：
（a）提供来自患者的组织样品；
（b）测定关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在；和
（c）基于关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的不存在，将患者分类为对于用Aurora激酶B抑制剂的治疗是合格的。在上述方法中，基于关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的存在，患者对于用Aurora激酶B抑制剂的治疗（至少作为单一疗法）将是不合格的。由其获得测试样品的患者可以是怀疑或诊断有癌症的患者。此外，本发明人发现ABCB1基因中的拷贝数增益与MDR1多肽表达中的增加相关，并且ABCB4基因中的拷贝数增益与MDR3多肽表达中的增加相关。
在这个实施方案中，癌症可以是任何类型的癌症，例如结肠直肠癌或胰癌。此外，在这个实施方案中，基因扩增可以通过多彩色荧光原位杂交（FISH）测定进行测定，例如对肺癌肿瘤活组织检查样品执行。在其他实施方案中，使用定量聚合酶链反应（Q-PCR）方法。
在另外一个实施方案中，本发明包括用于鉴定或分类具有对于用Aurora激酶B抑制剂治疗是抗性的癌症的患者的方法，该方法包括步骤：
（a）提供来自患者的测试样品（例如组织样品）；
（b）测定关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在；和
（c）基于关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的存在，将患者分类为具有对于Aurora激酶B抑制剂是抗性的癌症。
在这个实施方案中，癌症可以是任何类型的癌症，例如结肠直肠癌或胰癌。此外，在这个实施方案中，基因扩增可以通过多彩色荧光原位杂交（FISH）测定进行测定，例如对肺癌肿瘤活组织检查样品执行。在其他实施方案中，使用聚合酶链反应（PCR）。
在另外一个实施方案中，本发明涉及用于监控用Aurora激酶B抑制剂治疗的患者的方法，该方法包括步骤：
（a）提供来自用至少一种Aurora激酶抑制剂治疗的癌症患者的测试样品（任选地，可以鉴定或提取得自组织样品的肿瘤或癌细胞）；
（b）测定测试样品中（例如肿瘤或癌细胞中）关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在；和
（c）针对基线水平或预定水平比较来自测试样品（例如肿瘤或癌细胞）的关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益；和
（d）基于步骤（c）中的比较，决定患者是否应继续用Aurora激酶B抑制剂治疗。具体地，如果具有关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的测试样品（例如肿瘤或癌细胞）与基线水平或预定水平相同或高于基线水平或预定水平，那么用Aurora激酶B抑制剂的治疗可以中断、停止或终止（如果它作为单一疗法单独使用的话）。可替代地，治疗医生可以决定组合Aurora激酶B抑制剂与至少第二种疗法（例如用第二种小分子的治疗）作为组合疗法。然而，如果得自测试样品（例如肿瘤或癌细胞）的关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益小于基线水平或预定水平，或如果未检测到关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益，那么用Aurora激酶B抑制剂的治疗可继续。再次，取决于用所述治疗获得的结果，治疗医生可以决定组合Aurora激酶B抑制剂与至少第二种疗法（例如用第二种小分子的治疗）作为组合疗法。
再次，FISH和PCR方法可以用于检测得自患者的测试样品中关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在。
本发明还涉及包装例如工程改造为作为PCR引物、FISH探针等使用的寡核苷酸或多核苷酸的试剂盒。
本发明具有提供用于癌症疗法且具体用于Aurora激酶B抑制剂疗法的改善的患者分层的显著能力。这些生物标记由本发明的评估还允许跟踪对于疗法的个别患者应答。
A. 定义
如本文这个章节和整个公开内容中使用的章节标题不预期是限制性的。
如本文使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。对于本文数字范围的叙述，明确预期了具有相同精确度的两者之间的每个间插数字。例如，对于范围6-9，除6和9外，还预期了数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确预期了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
a）Aurora激酶B抑制剂
“Aurora激酶B抑制剂”指任何类型（例如非选择性或选择性）的治疗化合物，包括基于小分子、抗体、反义、小干扰RNA或微小RNA的化合物，其与Aurora激酶B或Aurora B中的至少一种结合，并且拮抗Aurora激酶B或Aurora B相关核酸或蛋白质的活性。例如，已知许多Aurora激酶B抑制剂抑制组蛋白H3磷酸化或细胞***中的至少一种。此外，已知许多Aurora激酶B抑制剂在至少一种细胞***（例如急性髓性白血病细胞系、原代急性髓性白血病培养物等）中诱导细胞凋亡。本发明的方法对于任何已知或将来开发的Aurora激酶B抑制剂都是有用的。Aurora激酶B抑制剂的例子是AZD1152、ZM447439、VX-680/MK0457和Hesperadin。
AZD1152也称为2-[[3-（{4-[（5-{2-[（3-氟苯基）氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-3-基）氨基]-喹唑啉-7-基}氧）丙基]（乙基）氨基]乙基二氢磷酸酯是吡唑并喹唑啉Aurora激酶抑制剂（AZD1152-N-羟基喹唑啉吡唑酰苯胺（HQPA））的药物前体，并且在血浆中快速转变为活性AZD1152-HQPA（参见，Mortlock，AA，等人，J. Med. Chem. ，50:2213-24（2007））。AZD1152-HQPA是Aurora B的高度有效和有选择性的抑制剂。
ZM447439也称为4-（4-（N-苯甲酰氨基）苯胺基）-6-甲氧基-7-（3-（1-吗啉代）丙氧基）喹唑啉，是喹唑啉衍生物，抑制Aurora A和Aurora B。ZM447439的化学结构在Ditchfield，C.，等人，J. Cell Bio. ，161（2）:267-280（2003）和Montembault，E.，等人，Drugs of the Future，30（1）:1-9（2005）中提供。
VX-680/MK0457是{4-[4-（4-甲基-哌嗪-1-基）-6-（5-甲基-2H-吡唑-3-基氨基）-嘧啶-2-基硫烷基]-苯基}-酰胺的环丙烷羧酸，并且抑制Aurora A、Aurora B和Aurora C。VX-680/MK0457的化学结构在Montembault，E.，等人，Drugs of the Future，30（1）:1-9（2005）中提供。
Hesperadin，吲哚满酮，抑制Aurora B。Hesperadin的化学结构在Hauf，S.，等人，J. Cell Bio. ，161（2）:281-294（2003）和Montembault，E.，等人，Drugs of the Future，30（1）:1-9（2005）中提供。
b）基本上由具有％序列同一性的多核苷酸组成
“基本上由具有％序列同一性的多核苷酸组成”意指多核苷酸在长度中没有相当大不同，但在序列中可能相当大地不同。因此，基本上由与100个核苷酸的已知序列“B”具有至少80％序列同一性的多核苷酸组成的多核苷酸“A”意指多核苷酸“A”约100个核苷酸（nts）长，但最高达20个nts可以与“B”序列不同。正被讨论的多核苷酸序列可以更长或更短，这是由于末端的修饰，例如1-15个核苷酸的添加，以产生特定类型的探针、引物和其他分子工具等，例如当添加基本上非等同的序列以产生预期二级结构时的情况。当序列通过“基本上由……组成”修饰时，此种非等同核苷酸在序列同一性计算中不予以考虑。
c）表达、反义抑制和共抑制
“表达”指功能终产物的产生。基因的表达涉及基因的转录和mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。“反义抑制”指能够抑制靶蛋白质表达的反义RNA转录物的产生。“共抑制”指能够抑制等同或基本上相似的外来或内源基因表达的有义RNA转录物的产生（美国专利号5,231,020）。
d）分离的
如本文使用的，在核酸分子或多核苷酸的背景中的术语“分离的”指这样的核酸分子或多核苷酸，其与核酸分子或多核苷酸的天然来源中存在的其他核酸分子或多核苷酸分离。此外，当通过重组技术产生时，“分离的”核酸分子或多核苷酸例如cDNA分子可以基本上不含其他细胞材料或培养基，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学试剂。在一个方面，核酸分子或多核苷酸是分离的。
e）基因
“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在编码序列前（5'非编码序列）和后（3'非编码序列）的调节序列。
f）天然基因和嵌合构建体
“天然基因”指如在自然界中与其自身调节序列一起发现的基因。相比之下，“嵌合构建体”指在自然界中正常未一起发现的核酸片段的组合。因此，嵌合构建体可以包括衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或衍生自相同来源但以与自然界中正常发现的那种不同的方式排列的调节序列和编码序列。
g）百分比（％）核酸序列同一性
就核酸序列而言的“百分比（％）核酸序列同一性”定义为，在比对序列和若需要则引入缺口，以达到最大限度的百分比序列同一性后候选序列中与目的序列中的核苷酸等同的核苷酸百分比。为了测定％核酸序列同一性目的的比对可以以在本领域技术内的各种方式达到，例如使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括达到在被比较的序列全长上的最大限度比对所需的任何算法。
当比对核苷酸序列时，对于、关于或针对给定核酸序列D的给定核酸序列C的％核酸序列同一性（其可以可替代地用短语表示为具有或包括对于、关于或针对给定核酸序列D的特定％核酸序列同一性的给定核酸序列C）可以如下计算：
％核酸序列同一性 = W/Z*100
其中
W是通过序列比对程序或算法的C和D比对评分为等同匹配的核苷酸数目
和
Z是D中的核苷酸总数目。
当核酸序列C的长度不等同于核酸序列D的长度时，C与D的％核酸序列同一性将不等同于D与C的％核酸序列同一性。
h）聚合酶链反应或PCR
“聚合酶链反应”或“PCR”是用于合成大量特定DNA区段的技术，由一系列重复的循环组成（Perkin Elmer Cetus
Instruments，Norwalk，CT）。一般地，使双链DNA热变性，与靶区段的3'边界互补的2个引物在低温退火，并且随后在中间温度延伸。一组这3个连续步骤被称为循环。
PCR是通过模板的反复复制，在短时间段内用于将DNA扩增数百万倍的强大技术。（（Mullis，K.，等人，Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 51 Pt 1:263-73（1986））；欧洲专利申请号50,424；欧洲专利申请号84,796；欧洲专利申请号258,017，欧洲专利申请号237,362；欧洲专利申请号201,184，美国专利号4,683,202；美国专利号4,582,788；和美国专利号4,683,194）。该方法使用特定体外合成的寡核苷酸组以引发DNA合成。引物的设计取决于待分析的DNA序列。该技术通过在高温使模板解链、允许引物与模板内的互补序列退火，并且随后用DNA聚合酶复制模板的许多循环（通常20-50个）执行。
PCR反应的产物可以通过在琼脂糖凝胶中分离随后为溴化乙锭染色和用UV透照显现进行分析。可替代地，放射性dNTPs可以添加到PCR中，以将标记掺入产物内。在这种情况下，PCR的产物通过使凝胶暴露于x射线片进行显现。放射性标记PCR产物的添加的优点是可以定量个别扩增产物的水平。
i）多核苷酸
“多核苷酸”是核糖核酸（RNA）、脱氧核糖核酸（DNA）、修饰的RNA或DNA、或RNA或DNA模拟物（例如PNAs）及其衍生物和其同源物的核酸聚合物。因此，多核苷酸包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间（主链）键组成的聚合物，以及相似作用的具有非天然存在部分的聚合物。此种修饰或取代的核酸聚合物是本领域众所周知的，并且被称为“类似物”。寡核苷酸一般是约10到最高达约160或200个核苷酸的短多核苷酸。
多核苷酸还包括与靶序列特异性杂交的引物，包括核酸序列的类似物和/或衍生物及其同源物。
多核苷酸可以通过常规技术进行制备，例如使用商购可得设备的固相合成，例如可从Applied Biosystems USA
Inc.（Foster City，CA；USA）、DuPont（Wilmington，DE；USA）或Milligen（Bedford，MA；USA）获得的那种。修饰的多核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物还可以通过本领域已知的相似方法容易地制备（参见美国专利号4,948,882、5,464,746和5,424,414）。
j）多核苷酸类似物
如本文使用的，术语“多核苷酸类似物”指具有修饰的主链或非天然核苷间键的聚合物。修饰的主链包括保留主链中的磷原子的那些，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，以及不再具有磷原子的那些，例如通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。修饰的核酸聚合物（类似物）可以包含一种或多种修饰的糖部分。
其中核苷酸单位的糖和核苷间键由新基团替换的作为RNA或DNA模拟物的类似物也是有用的。在这些模拟物中，维持碱基单位用于与靶序列杂交。已显示具有极佳杂交性质的此种模拟物的例子是肽核酸（PNA）（参见Buchardt，O.，P. Nielsen，和R. Berg. 1992. Peptide
Nucleic Acids）。
k）预定水平
如本文使用的，术语“预定水平”一般指测定截止值，其用于通过针对预定水平比较测定结果来评估诊断结果，并且其中预定水平已经与各种临床参数关联或相关（例如评估危险、疾病严重性、进展/非进展/改善，测定测试样品的时期（age），测定测试样品（例如血清或血浆）是否发生溶血等）。本发明提供了示例性预定水平，并且描述了此种水平与关于如本文描述的示例性测定的临床参数的初始关联或联系。然而，众所周知截止值可以依赖于测定的性质而改变。进一步完全在本领域技术人员普通技术内的是使本文的本发明适合于其他测定，以基于这个说明书获得关于那些其他测定的测定特异性截止值。
l）引物或探针
如本文使用的，“探针”或“引物”是长度至少8个核苷酸且与靶序列形成杂交体结构的多核苷酸，这是由于探针或引物中的至少一个序列与靶区域中的序列的互补性。探针的多核苷酸区可以由DNA和/或RNA和/或合成核苷酸类似物组成。优选地，探针不包含与在聚合酶链反应过程中用于引发靶序列的一个或多个序列互补的序列。
m）重组体
“重组体”指2个否则分离的序列区段的人工组合，例如通过化学合成或通过经由基因工程技术操作核酸的分离的区段。
n）特异性杂交
“特异性杂交”指核酸与第二种核酸可检测且特异性结合的能力。在使通过非特异性核酸的可检测结合的可估计量降到最低的杂交和洗涤条件下，多核苷酸与靶核酸链特异性杂交。
o）严格性或严格条件
单链DNA与互补片段杂交的特异性由反应条件的严格性决定。杂交严格性随着形成DNA双链体的倾向降低而增加。在核酸杂交反应中，可以选择严格性以支持特异性杂交（高严格性）。较不特异的杂交（低严格性）可以用于鉴定相关但并非确切的DNA分子（同源但并非等同）或区段。
DNA双链体通过下述得到稳定：（1）互补碱基对数目，（2）碱基对类型，（3）反应混合物的盐浓度（离子强度），（4）反应温度，和（5）降低DNA双链体稳定性的特定有机溶剂例如甲酰胺的存在。通常方法是改变温度：更高的相对温度导致更严格的反应条件（参见Ausubel，F.M.，R. Brent，R.E. Kingston，等人1987. Current Protocols
in Molecular Biology. John Wiley & Sons，New York），提供杂交反应的严格性的极佳解释。
在“严格条件”下的杂交意指其中彼此至少60％同源的核苷酸序列保持杂交的杂交规程。
多核苷酸可以包括其他附加基团，例如肽（例如用于在体内靶向宿主细胞受体），或促进跨越细胞膜的转运的试剂。此外，寡核苷酸可以用杂交触发的切割试剂（参见van der Krol 等人，Biotechniques. 6:958-76（1988）或嵌入剂（intercalculating agents）（Zon，G.，Pharm Res. 5:539-49（1988））进行修饰。寡核苷酸可以与另一种分子缀合，例如肽、杂交触发的交联剂、转运试剂、杂交触发的切割试剂等。
p）受试者或患者
如本文使用的，术语“受试者”和“患者”互换使用，不管受试者是否具有或目前经历任何形式的治疗。如本文使用的，术语“受试者”指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物（例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、犬、大鼠和小鼠、非人灵长类动物（例如猴，例如食蟹猴、黑猩猩等）和人）。优选地，受试者是人。受试者或患者可以是活的或死亡的。
q）靶序列或靶核酸序列
“靶序列”或“靶核酸序列”意指包含例如基因或其互补体或片段的核酸序列，其使用多核苷酸引物或探针扩增、检测或两者。另外，虽然术语靶序列有时指双链核酸序列；但靶序列还可以是单链的。在其中靶是双链的情况下，多核苷酸引物序列优选扩增靶序列的2条链。可以选择对于特定生物或多或少特异的靶序列。例如，靶序列可以对于生物的整个属、超过一个属、物种或亚种、血清群(serogroup)、营养型、血清型、品系、分离物或其他亚型是特异的。
r）测试样品
“测试样品”意指得自受试者的样品或生物学流体，其中样品可以包含靶序列。测试样品可以得自任何来源，例如组织、血液、唾液、痰、粘液、汗、尿、尿道拭子、子宫颈拭子、泌尿生殖或***拭子、结膜拭子、眼睛晶状体流体、脑脊髓液等。测试样品可以（i）如得自来源那样直接使用；或（ii）在预处理后使用，以修饰样品的特征。因此，测试样品可以在使用前进行预处理，通过例如由血液制备血浆或血清，破裂细胞或病毒颗粒，由固体材料制备液体，稀释粘性流体，过滤液体，添加试剂，纯化核酸等。
s）治疗
如本文使用的，术语“治疗”指在（i）防止病理学状况发生（例如预防）；（ii）抑制病理学状况或阻止其发展；（iii）减轻病理学状况和/或防止或减少与此种病理学状况相关的一种或多种症状的严重性的努力中，给受试者施用一种或多种活性剂或化合物，不管项目（i）到（iii）中的任何一项在受试者中是否是成功的。
t）变体多核苷酸或变体核酸序列
“变体多核苷酸”或“变体核酸序列”意指与给定核酸序列具有至少约60％核酸序列同一性，更优选至少约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％核酸序列同一性，且更加优选至少约99％核酸序列同一性的多核苷酸。变体不包含天然核苷酸序列。
一般地，变体多核苷酸长度至少约8个核苷酸，经常长度至少约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 30、35、40、45、50、55、60个核苷酸，或甚至长度约75-200个核苷酸或更多。
核苷酸的范畴包括其中核酸分子已通过取代、化学、酶促或其他合适方法用除天然存在的核苷酸外的部分共价修饰的衍生物。
B. 多核苷酸测定
在本发明中有用的核酸测定法包括通过下述检测拷贝数增益的存在或不存在：（i）对于完整组织或细胞样品的原位杂交测定，（ii）对于从组织样品中提取的染色体DNA的微阵列杂交测定，和（iii）对于从组织样品中提取的染色体DNA的聚合酶链反应（PCR）或其他扩增测定。还可以使用在这些形式中的任何一种中使用核酸的合成类似物例如肽核酸的测定。
本发明的测定用于鉴定关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益用于在预测治疗应答和用于监控对于Aurora激酶B抑制剂疗法的患者应答中使用。对于应答预测的测定可以在疗法开始前运行，并且未显示或展示显示关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的患者对于接受Aurora激酶B抑制剂疗法是合格的。关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益还可以指示对于其他癌症疗法的抗性，例如化学疗法或放射疗法。对于监控患者应答，测定可以在疗法起始时运行，以确立组织样品中的生物标记的基线水平，例如显示样品中的拷贝数增益的总细胞百分比或细胞数目。随后取样且测定相同组织，并且使生物标记的水平与基线比较。当水平保持相同或降低时，疗法可能是有效的且可以继续。当发生超过基线水平的显著增加时，患者可能不响应或可能已发展对于继续的Aurora激酶B抑制剂疗法的抗性。
本发明的测定可以与靶向的癌症疗法一起使用，例如对于实体瘤（例如肉瘤或癌）或血液学恶性肿瘤（例如影响血液、骨髓和***的癌症）的靶向疗法。本发明的测定可以对于实体瘤使用，所述实体瘤例如结肠直肠癌、胰癌、甲状腺癌、***癌、膀胱癌、肝癌、胆管癌、口癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌或乳腺癌。本发明的测定可以对于血液学恶性肿瘤使用，所述血液学恶性肿瘤例如急性淋巴细胞性白血病（ALL）、急性髓性白血病（AML）、慢性髓细胞性白血病（CML）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、费城染色体阳性的急性成淋巴细胞性白血病（Ph+ALL）和慢性淋巴细胞性白血病（CLL）。测定可以关于其中涉及Aurora激酶B扩增或超表达的任何癌症类型进行。本发明的测定对任何类型的测试样品执行，例如任何类型的患者组织样品或其衍生物，包括外周血，肿瘤或可疑肿瘤组织（包括新鲜冷冻和固定的石蜡包埋的组织），细胞分离物例如在血液样品、***组织、骨髓和细针抽吸物中分离或鉴定的循环上皮细胞。
本发明包括通过杂交测定检测基因组生物标记，其中使用基于可检测标记的核酸的探针，例如脱氧核糖核酸（DNA）探针或蛋白质核酸（PNA）探针，或设计/选择为与特定染色体靶杂交的未标记的引物。未标记的引物在扩增测定中使用，例如通过聚合酶链反应（PCR），其中在引物结合后，聚合酶扩增靶核酸序列用于后续检测。在PCR或其他扩增测定中使用的检测探针优选是荧光的，并且更加优选地，在“实时PCR”中有用的检测探针。荧光标记对于在原位杂交中的使用也是优选的，但还可以使用在杂交技术中常用的其他可检测标记，例如酶促、生色和同位素标记。有用的探针标记技术在文献中描述（Fan，Y.-S. 2002. Molecular
cytogenetics：protocols and applications.
Humana Press，Totowa，N.J. xiv，第411页，其内容引入本文作为参考）。在通过微阵列分析检测基因组生物标记中，应用这些探针标记技术，以标记从患者样品中提取的染色体DNA，其随后与微阵列杂交。
关于人ABCB1基因的多核苷酸序列（SEQ ID NO:1；GenBank登记号NM_000927）显示于表1中。
关于人ABCB4基因的多核苷酸序列（SEQ ID NO:2；GenBank登记号NM_018849）显示于表1中。
优选地，原位杂交用于检测关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的染色体拷贝数增加的存在。引物和探针可以通过本领域技术人员使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列进行制备。
用于在本发明的原位杂交法中使用的探针归入2个广泛组：染色体列举探针，即与染色体区域通常为重复序列区域杂交，并且指示整个染色体的存在或不存在的探针；和基因座特异性探针，即与在染色体上的特异性基因座杂交且检测特异性基因座的存在或不存在的探针。还可以使用染色体臂探针，即与染色体区域杂交且指示特异性染色体的臂的存在或不存在的探针。优选使用可以检测在询问的基因座例如ABCB1和ABCB4基因座上的独特染色体DNA序列的改变的基因座特异性探针。关于使用独特序列探针用于原位杂交的方法在美国专利号5,447,841中描述，其内容引入本文作为参考。
染色体列举探针可以与重复序列杂交，所述重复序列位于着丝粒附近或从着丝粒中去除，或可以与位于染色体上的任何位置的独特序列杂交。例如，染色体列举探针可以与和染色体的着丝粒结合的重复DNA杂交。灵长类动物染色体的着丝粒包含含约171个碱基对的单体重复长度的DNA的长串联重复的复杂家族，其被称为α-卫星DNA。针对染色体14和18各自的着丝粒荧光原位杂交探针从Abbott Molecular（Des Plaines，IL）商购可得。
特别有用的原位杂交探针是直接标记的荧光探针，例如引入本文作为参考的美国专利号5,491,224中描述的。美国专利号5,491,224还描述了使用超过一种荧光标记的探针的同时FISH测定。
有用的基因座特异性探针可以以任何方式产生，并且一般包含与长约10,000 – 约1,000,000个碱基的染色体DNA靶序列杂交的序列。优选地，探针与在长至少100,000个碱基 – 长约500,000个碱基的靶基因座上的染色体DNA的靶序列段杂交，并且还包括在探针混合物中未标记的封闭核酸，如其内容引入本文作为参考的美国专利号5,756,696中公开的，以避免探针的非特异性结合。还可能使用未标记的、合成的寡聚核酸或肽核酸作为封闭核酸。对于靶向特定基因基因座，优选探针包括这样的核酸序列，其跨越基因且从而与基因的整个基因组编码基因座的两侧杂交。探针可以从含人DNA的克隆例如细菌人工染色体（BAC’s）等开始产生。用于人基因组的BAC文库可从Invitrogen（Carlsbad，CA）获得，并且可以被进行研究用于有用克隆的鉴定。优选使用University of California
Santa Cruz Genome Browser，以鉴定在靶基因座中的DNA序列。这些DNA序列随后可以用于合成PCR引物用于筛选BAC文库，以鉴定有用克隆。克隆随后可以通过常规切口平移法进行标记，并且作为原位杂交探针进行测试。
可以在本文描述的原位杂交方法中使用的荧光团的例子是：7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸（AMCA）；Texas RedMolecular Probes，Inc.，Eugene，OR）；5-（和-6）-羧基-X-罗丹明；丽丝胺罗丹明B；5-（和-6）-羧基荧光素；荧光素-5-异硫氰酸酯（FITC）；7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸，四甲基-罗丹明-5-（和-6）-异硫氰酸酯；5-（和-6）-羧基四甲基罗丹明；7-羟基-香豆素-3-羧酸；6-[荧光素 5-（和-6）-羧酰胺]己酸；N-（4,4-二氟-5,7-二甲基-4-bora-3a，4a 二氮杂-3-indacene丙酸；伊红-5-异硫氰酸酯；赤藓红-5-异硫氰酸酯；5-（和–6）-羧基罗丹明6G；和Cascade 蓝色乙酰叠氮化物（aectylazide）（Molecular Probes；Invitrogen品牌）。
探针可以用荧光显微镜和关于每种荧光团的合适滤光片观察，或通过使用双重或三重带通滤光片组以观察多重荧光团。参见例如，美国专利号5,776,688，其内容引入本文作为参考。任何合适的显微成像法都可以用于显现杂交的探针，包括自动化数字图像***。可替代地，技术例如流式细胞术可以用于检查染色体探针的杂交模式。
尽管由原位杂交产生的逐细胞（cell-by-cell）的基因扩增分析是优选的，但基因组生物标记还可以通过定量PCR进行检测。在这个实施方案中，从组织样品中提取染色体DNA，并且随后通过PCR扩增，其中使用对于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因中的至少一种特异性的一对引物，或通过多重PCR扩增，其中使用多对引物。可以使用用于生物标记的任何引物序列。可以使用的引物的例子在表3中显示。组织的拷贝数随后通过与参考扩增标准比较进行测定。
表3
还可以使用基于微阵列的拷贝数分析。在这个实施方案中，在提取后的染色体DNA进行标记，用于与包括底物的微阵列杂交，所述底物具有以最高达几百万探针/平方厘米的底物表面的探针密度排列的多重固定的未标记的核酸探针。存在多重微阵列形式，并且在本发明中可以使用这些中的任何一种。可以使用的微阵列的例子是Affymetrix GeneChip®
Mapping 100K Set SNP Array（参见Matsuzaki，H.，等人，“Genotyping over 100,000
SNPs on a pair of oligonucleotide arrays,” Nat Methods.
1:109-11（2004））；Affymetrix GeneChip®
Mapping 250K Assay Kits（例如GeneChip® Human Mapping 250K Nsp Array或GeneChip® Human Mapping
250K Sty Array）或Affymetrix GeneChip®
Mapping 500K Array Set，其各自从Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA商购可得）、Agilent Human Genome aCGH
Microarray 44B（可从Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA获得）、Illumina 微阵列（Illumina，Inc.，San Diego，CA）、Nimblegen aCGH 微阵列（Nimblegen，Inc.，Madison，WI）等。当使用寡核苷酸微阵列检测扩增时，优选使用具有针对靶向的区域中的超过3个分开位置的探针序列的微阵列。可以在微阵列中使用的探针的例子显示于下表4和SEQ ID NOS：23-321中。关于下表4中列出的探针的侧翼序列显示于下表5中。
表4
表5
C. 检测表达：mRNA
关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的基因表达水平可以通过评估测试样品中的一种或多种mRNAs的量进行测定。测量样品中的mRNA的方法是本领域已知的。为了测量mRNA水平，可以裂解测试样品中的细胞，并且通过本领域技术人员熟悉的任何多种方法可以测量裂解物中的mRNA水平或从裂解物中纯化或半纯化的RNA中的mRNA水平。此种方法包括使用可检测标记的DNA或RNA探针的杂交测定（即RNA印迹），或使用合适的寡核苷酸引物的定量或半定量RT-PCR方法。可替代地，使用例如组织切片或未裂解的细胞悬浮液和可检测标记的（例如荧光或酶标记的）DNA或RNA探针，可以执行定量或半定量原位杂交测定。用于定量mRNA的另外方法包括RNA保护测定（RPA）、cDNA和寡核苷酸微阵列、代表性差别分析（RDA）、差别展示、EST序列分析和基因表达的系列分析（SAGE）。
在合适的实施方案中，PCR扩增用于检测测试样品中的（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因。简言之，在PCR中，制备2种引物序列，其与标记序列的相反互补链上的区域互补，例如包含关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的序列。将过量脱氧核苷酸三磷酸连同DNA聚合酶例如Taq聚合酶一起添加到反应混合物中。如果靶序列存在于样品中，那么引物将与序列结合，并且聚合酶将通过添加核苷酸引起引物沿着标记序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度，延伸的引物将与标记解离，以形成反应产物，过量引物将与标记和反应产物结合，并且重复该过程，从而生成扩增产物。可以执行逆转录酶PCR扩增程序，以定量扩增的mRNA量。
可以扩增且检测（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的任何合适片段。设计用于PCR的有效引物在本领域普通技术内。可以使用的引物的例子显示于表3中。一般地，用于检测的扩增片段长度约50 – 300个核苷酸。
扩增产物可以以几种方式进行检测。扩增产物可以通过样品在凝胶中的电泳，并且随后用DNA结合染料例如溴化乙锭染色进行显现。可替代地，扩增产物可以用放射性或荧光核苷酸进行整合地标记，并且随后使用x射线片或在合适的刺激谱下显现。
扩增还可以使用“实时”法进行监控。实时PCR允许检测和定量核酸靶。一般地，定量PCR的这种方法利用荧光染料，其可以是双链特异性染料，例如SYBR GREEN®。可替代地，其他荧光染料（例如FAM或HEX）可以与寡核苷酸探针或引物缀合。能够执行实时PCR的各种仪器是本领域已知的，并且包括例如ABI PRISM® 7900（Applied Biosystems）和LIGHTCYCLER®***（Roche）。在PCR的每个循环生成的荧光信号与PCR产物的量成比例。荧光与循环数目比较的图用于描述扩增的动力学，并且荧光阈值水平用于限定与初始模板浓度相关的分数循环数目。当在能够在热循环过程中阅读荧光的仪器上执行且检测扩增时，预期PCR产物可以使用解链分析与非特异性PCR产物加以区分。通过在扩增和信号生成后测量荧光中的变化同时逐渐增加反应的温度，可能测定一种或多种预期产物的Tm以及非特异性产物的那种。
该方法可以包括扩增样品中的多种核酸，也称为“多重检测”或“多重化（multiplexing）”。“多重PCR”指涉及将超过一组PCR引物添加到反应中的PCR，以检测且定量多重核酸，包括来自一种或多种靶基因标记的核酸。此外，用内部对照（例如18S rRNA、GADPH或肌动蛋白）的多重化提供了无需反应用于PCR的对照。
D. 样品处理和测定性能
如本文先前讨论的，本发明的测试样品可以是组织样品。待通过本发明的方法测定的组织样品可以包括任何类型，包括外周血样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、骨髓样品、***样品、尿样品、腹水样品、灌洗样品、食管刷洗样品、膀胱或肺洗涤样品、脊髓液样品、脑液体样品、导管抽吸物样品、***排出物样品、胸膜积液样品、新鲜冷冻组织样品、石蜡包埋的组织样品，或由外周血样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、骨髓样品、***样品、尿样品、腹水样品、灌洗样品、食管刷洗样品、膀胱或肺洗涤样品、脊髓液样品、脑液体样品、导管抽吸物样品、***排出物样品、胸膜积液样品、新鲜冷冻组织样品或石蜡包埋的组织样品中的任何一种产生的提取物或加工的样品。例如，患者外周血样品可以最初进行处理，以提取上皮细胞群体，并且这种提取物随后可以进行测定。还可以使用组织样品的显微解剖，以获得富含可疑肿瘤细胞的细胞样品。用于在本文中使用的优选组织样品是外周血，肿瘤组织或可疑肿瘤组织，包括细针抽吸物、新鲜冷冻组织和石蜡包埋的组织，和骨髓。
组织样品可以通过用于执行原位杂交或其他核酸测定的任何所需方法进行处理。对于优选的原位杂交测定，使石蜡包埋的肿瘤组织样品或骨髓样品固定在玻璃显微镜载玻片上，并且用溶剂一般为二甲苯脱蜡。用于组织脱蜡和原位杂交的有用规程可从Abbott Molecular Inc.（Des Plaines，Illinois）获得。任何合适的使用仪器或自动化可以用于本发明测定的执行中。基于PCR的测定可以在m2000仪器***（Abbott Molecular，Des Plaines，IL）上执行。自动化成像可以用于优选的荧光原位杂交测定。
在一个实施方案中，样品包括来自患者的外周血样品，其进行处理以产生循环肿瘤或癌细胞的提取物，对所述提取物要检查关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在。循环肿瘤细胞可以通过免疫磁性分离技术例如可从Immunicon（Huntingdon Valley，Pennsylvania）获得的那种进行分离。对于循环肿瘤细胞测定的拷贝数随后与具有在先前时间点例如在治疗开始时测定的拷贝数的循环肿瘤细胞的基线水平或预定水平比较。与基线水平或预定水平相比较在拷贝数中的增加可以指示治疗失败。
测试样品可以包括对于临床诊断足够的许多细胞，并且一般包含至少约100个细胞。在一般的FISH测定中，杂交模式在约25-1,000个细胞中进行评估。当发现在足够比例的样品中包含基因扩增时，测试样品一般被视为“测试阳性的”。一般而言，关于染色体拷贝数鉴定的且用于将特定样品分类为阳性的细胞数目随着样品中的细胞数目而改变。用于阳性分类的细胞数目也称为截止值。可以在测定中使用的截止值的例子包括约5、25、50、100和250个细胞，或样品群体中的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％和60％细胞。低至一个细胞可以足以将样品分类为阳性的。在一般的石蜡包埋的组织样品中，对于具有染色体拷贝数增益，优选将至少30个细胞鉴定为阳性的，并且更优选将至少20个细胞鉴定为阳性的。例如，在一般的石蜡包埋的结肠直肠癌中30个细胞的检测将足以将组织分类为阳性的并且对于治疗是合格的。
E. 试剂盒
本发明还预期了用于检测测试样品中关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在的试剂盒。此种试剂盒可以包括用于测定上述拷贝数增益的存在或不存在的一种或多种试剂。例如，所述试剂盒可以包含一种或多种核酸探针。可替代地或除探针外，试剂盒可以包含一种或多种核酸引物。
因此，本公开内容进一步提供了诊断和质量控制试剂盒，其包括本文描述的一种或多种核酸引物、核酸探针或核酸引物和探针。任选地，本发明的测定、试剂盒和试剂盒组分可以对于在商业平台（例如在Abbott Laboratories，Abbott Park，IL的Prism®、AxSYM®、ARCHITECT®和EIA（珠）平台上的免疫测定，以及其他商业和/或体外诊断测定）上的使用进行最佳化。此外，测定、试剂盒和试剂盒组分可以以其他形式采用，例如在电化学或其他手提式或及时现场护理(point-of-care)测定***上。本公开内容例如可应用于商业Abbott Point of Care（i-STAT®，Abbott Laboratories，Abbott Park，IL）电化学免疫测定***，其执行关于几种心脏标记包括TnI、CKMB和BNP的夹心免疫测定。在单用途(single-use)的测试设备中操作其的免疫传感器和方法例如在美国专利申请公开号2003/0170881、2004/0018577、2005/0054078和2006/0160164中描述，其引入本文作为参考。关于电化学和其他类型的免疫传感器的制造的另外背景在美国专利号5,063,081中发现，在其关于这点的教导方面其也引入作为参考。
任选地，试剂盒包括质量控制试剂（例如灵敏度实验对象组、校准物(calibrator)和阳性对照）。质量控制试剂的制备是本领域众所周知的，并且例如在多种免疫诊断产物插页中描述。
试剂盒可以掺入可检测标记，例如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标记、生色团、化学发光标记等，或试剂盒可以包括用于标记核酸引物、核酸探针或核酸引物和核酸探针的试剂，用于如本文描述的检测拷贝数增益的存在或不存在。引物和/或探针、校准物和/或对照可以在分开容器中提供，或预分配到合适的测定形式例如微量滴定板内。
试剂盒可以任选包括执行诊断测定或促进质量控制评价所需的其他试剂，例如缓冲剂、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等。用于测试样品分离和/或处理的其他组分例如缓冲剂和溶液（例如预处理试剂）也可以包括在试剂盒中。试剂盒可以另外包括一种或多种其他对照。试剂盒的一种或多种组分可以是冻干的，并且试剂盒可以进一步包括适合于重构冻干组分的试剂。
试剂盒的各种组分任选在合适容器中提供。如上所述，一种或多种容器可以是微量滴定板。试剂盒进一步可以包括用于容纳或贮存样品的容器（例如用于血液或尿样品的容器或药液筒）。在合适时，试剂盒还可以任选包含反应容器、混合容器和促进试剂或测试样品制备的其他组分。试剂盒还可以包括用于帮助获得测试样品的一种或多种其他仪器，例如注射器、移液管、镊子、量匙等。
试剂盒进一步可以任选包括使用说明书，其可以以纸张形式或计算机可读形式例如磁盘、CD、DVD等提供。
F. 试剂盒的适应
使用本文描述的组分和方法的测定关于（i）ABCB1基因；（ii）ABCB4基因；或（iii）ABCB1基因和ABCB4基因的拷贝数增益的存在或不存在的试剂盒（或其组分）以及方法，可以适合于在多种自动化和半自动化***（包括其中固相包括微粒的那些）中使用，如例如美国专利号5,089,424和5,006,309中所述，并且如例如通过Abbott Laboratories（Abbott Park，IL）作为ARCHITECT®商业销售的。
与非自动化***（例如ELISA）相比较，在自动化或半自动化***中的一些差异包括第一种特异性结合配偶体（例如捕获抗体）与之附着的底物（这可以影响夹心形成和分析物反应性），以及捕获的时间和时机选择，检测和/或任何任选的洗涤步骤。尽管非自动化形式例如ELISA对于样品和捕获试剂可能需要相对更长的温育时间（例如约2小时），但自动化或半自动化形式（例如ARCHITECT®，Abbott Laboratories）可以具有相对更短的温育时间（例如对于ARCHITECT®约18分钟）。类似地，尽管非自动化形式例如ELISA可以使检测抗体例如缀合试剂温育相对更长的温育时间（例如约2小时），但自动化或半自动化形式（例如ARCHITECT®）可以具有相对更短的温育时间（例如对于ARCHITECT®约4分钟）。
可从Abbott Laboratories获得的其他平台包括但不限于AxSYM®、IMx®（参见例如，美国专利号5,294,404，其在此整体引入作为参考）、PRISM®、EIA（珠）和Quantum II，以及其他平台。另外，测定、试剂盒和试剂盒组分可以以其他形式采用，例如在电化学或其他手提式或及时现场护理测定***上。本公开内容例如可应用于商业Abbott Point of Care（i-STAT®，Abbott Laboratories）电化学免疫测定***，其执行夹心免疫测定。免疫传感器及其在单用途的测试设备中的制造和操作方法例如在美国专利号5,063,081、美国专利申请公开号2003/0170881、2004/0018577、2005/0054078和2006/0160164中描述，在其关于这点的教导方面其整体引入作为参考。
进一步不言而喻的是如本文描述的方法和试剂盒必定包含用于执行测定的其他试剂和方法。例如，包含的是如本领域已知的和/或可以容易制备或对于采用最佳化的各种缓冲剂。
例如和非限制性地，现在给予本公开内容的例子。
实施例
试剂
抗体购自如下所示供应商：MDR1/P-糖蛋白（目录号517310）来自Calbiochem（San Diego，CA），抗-BRCP抗体（目录号sc-58222）来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（Santa Cruz，CA），抗磷酸-组蛋白H3（Ser10）（目录号9701）和抗组蛋白H3（目录号9715）来自Cell Signaling Technology（Danvers，MA），藻红蛋白（PE）缀合的山羊抗小鼠IgG（目录号550589）和PE缀合的抗人CD44（目录号555479）来自BD Biosciences（Franklin Lakes，NJ），肌动蛋白来自Sigma Aldrich（St. Louis，MO），Alexa Fluor 680缀合的山羊抗兔IgG（目录号A21109）来自Invitrogen（Carlsbad，CA），并且IRDye 800缀合的驴抗小鼠（目录号610-732-124）来自Rockland Immunochemicals，Inc.（Gilbertsville，PA）。紫杉醇购自Sigma Aldrich（St. Louis，MO），PSC-833购自Wenger Chemtech（Riehen，瑞士），并且烟曲霉毒素（Fumetrimorgin） C购自Alexis Biochemicals
Corporation（San Diego，CA）。
MLN8054（4-{[9-氯-7-（2,6-二氟苯基）-5H-嘧啶并[5,4-D][2] 苯并氮杂-2-基]氨基}-苯甲酸）（参见Manfriedi，MG，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:4106-4111（2007））；MLN8075 抑制Aurora A），AZD1152（2-[[3-（{4-[（5-{2-[（3-氟苯基）氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-3-基）氨基]-喹唑啉-7-基}氧）丙基]（乙基）氨基]乙基二氢磷酸酯），和VX-680/MK-0457（环丙烷羧酸{ 4-[4-（4-甲基-哌嗪-1-基）-6-（5-甲基-2H-吡唑-3-基氨基）-嘧啶-2-基硫烷基]-苯基}-酰胺）的化学结构已得到公开，并且是本领域技术人员已知的。
细胞培养和
AZD1152 HQPA
抗性细胞系的生成
SW620、HCT-15和AsPC1细胞系得自美国典型培养物保藏中心（ATCC；Manassas，VA），并且根据ATCC建议进行繁殖。
多克隆SW620ABCB1/3细胞通过在3个月时间段期间在1μM AZD1152 HQPA（每周更换培养基2次）的存在下培养进行选择。在12周后，评估对于AZD1152 HQPA的敏感性。每个亲本/药物抗性对的倍增时间在药物选择后并无显著不同。所有细胞维持在37℃在5％CO2中。
流式细胞术
BCRP或人CD44的细胞表面表达的测定通过流式细胞术执行，其中使用Cytofix/Cytoperm试剂盒（目录号554714，BD Biosciences（Franklin Lakes，NJ）。样品在BD LSR II流式细胞仪上运行，并且使用BD FACSDiva软件（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）进行分析。
集落形成测定
洗涤SW620ABCB1/3和分别的亲本细胞系，并且将500个细胞/孔接种到无药物培养基中的6孔板内。随后，24小时后，化合物在DMEM或RPMI中稀释，添加到在37℃培养7-10天的细胞中。细胞随后固定且用0.2％结晶紫染色，以显现且计数集落。
微阵列分析
分离总RNA，并且5 µg用于微阵列分析，其中使用由Affymetrix，Inc.（Santa Clara，CA）提供的标准规程。使用IVT标记试剂盒合成断裂的、标记的cRNA，并且与高密度Affymetrix微阵列（Affymetrix人基因组U133A版本2.0）在45℃过夜杂交。将扫描的图像和强度文件输入Rosetta Resolver基因表达分析软件版本6.0（Rosetta Inpharmatics，Kirkland，WA）内。应用Resolver's Affymetrix误差模型，并且组合重复。表达概况衍生自来自关于每个细胞系的3个独立样品的mRNA。
免疫印迹分析
洗涤SW620和SW620ABCB1/3细胞，并且允许在无药物培养基中生长过夜。为了监控组蛋白H3的磷酸化，细胞用AZD1152 HQPA处理90分钟，随后立即在来自Biosource（Camarillo，CA）的细胞提取缓冲液（目录号FNN0011）中提取，所述细胞提取缓冲液补加有磷酸酶抑制剂混合物1和2以及蛋白酶抑制剂混合物（Sigma Aldrich（St. Louis，MO））。裂解物随后探针超声处理10秒，随后通过在15,000g在4℃离心15分钟得到澄清。在用SDS-样品缓冲液处理后，在NuPAGE Bis-Tris 4-12％凝胶（Invitrogen（Carlsbad，CA））上分离蛋白质提取物。将样品电转移至PVDF膜（Invitrogen（Carlsbad，CA）），与第一抗体温育过夜，并且使用Pierce Dura-Signal化学发光试剂（Pierce，Rockford，IL）或来自LI-COR Biosciences（Lincoln，NE）的Odyssey红外成像***显色。
细胞内和细胞外药物浓度的测量
洗涤SW620和SW620ABCB1/3细胞，并且允许在无药物培养基中生长过夜。细胞随后用1 µM AZD1152 HQPA处理4小时。通过LC-MS分析测定胞质药物累积。简言之，细胞用PBS漂洗1次，并且在细胞裂解缓冲液中提取。培养基、PBS洗涤和细胞裂解物用2体积的酸化MeOH处理。粗全细胞裂解物随后通过在15000g在4℃离心15分钟得到澄清，从而获得不溶性细胞沉淀和细胞溶胶。不溶性细胞沉淀用50％乙腈稀释1:10，并且在11,000g离心5分钟。相对于由使用纯化合物生成的标准曲线，测定在每种级分中的AZD1152 HQPA浓度。
siRNA-
介导的
ABCB1
和
ABCB4
沉默
4种个别siRNAs（ABCB1，目录号LQ-003868，ABCB4；目录号LQ-007302-00）的去褶合ON-TARGETplus SMARTpool和萤光素酶siRNA阴性对照（5’-AACGUACGCGGAAUACUUCGA-3’（SEQ ID NO:3）购自Dharmacon，Inc.（Lafayette，CO）。洗涤SW620和SW620ABCB1/3细胞，并且以30,000个细胞/孔接种在24孔板中，并且允许贴壁过夜。第二天，细胞用siRNA寡核苷酸以25 nM/寡核苷酸的终浓度转染，其中使用Lipofectamine2000（Invitrogen，Carlsbad，CA），根据制造商的说明书。转染后48小时收获细胞。
RNA
分离和
RT-PCR
用于
DNA
序列分析
使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA）从细胞系中分离总细胞RNA，并且通过UV吸光度光谱学进行定量。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）使用来自Qiagen的（OneStep RT-PCR试剂盒）执行。Aurora B引物（正向引物：5’-GGAGAGTAGCAGTGCCTTGGACC-3’（SEQ ID NO:4），和反向引物：5’-AGGAGGAGGTAGAAAACAGATAAGGGAAC-3’（SEQ ID NO:5））用于PCR扩增。Aurora B嵌套引物（正向引物：5’-AGTGCCTTGGACCCCAGCTCTC-3’（SEQ ID NO:6）和反向引物：5’-GAAAACAGATAAGGGAACAGTTAGGGATC-3’（SEQ ID NO:7））用于直接测序，其中使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA）。通过在Abbott Laboratories的DNA测序实验室执行DNA测序。简言之，按照制造商的建议规程（P/N 4337035），使用Applied Biosystems Big Dye
Terminator版本3.1循环测序试剂执行RT-PCR产物的直接测序。测序引物通过10和11个碱基分别对于5引发和3'引发扩增引物内部嵌套。荧光标记的测序产物的电泳在3130xl Genetic Analyzer上执行，其中使用50 cm阵列和POP-7Sequence Analysis版本5.2用KB碱基判定器（basecaller）执行碱基判定。
比较基因组杂交
使用DNAeasy试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）分离基因组DNA，并且在100K SNP基因型分型阵列组（Affymetrix，Santa Clara，CA）上运行。阵列根据制造商的规程运行。原始微阵列数据文件已装载到Gene Expression Omnibus（登记号GSE7068）（Gene Expression Omnibus是支持MIAME顺应数据提交的基因表达/分子多度储库(repository)，和专业的（curated）在线来源用于基因表达数据浏览、查询和检索）和Array Express（登记号E-MEXP-1008）内（ArrayExpress是关于转录组学数据的公共储库，其旨在贮存依照MGED建议的MIAME-和MINSEQE-顺应数据。ArrayExpress Warehouse贮存来自储库中的专业实验亚群的基因索引表达概况）。数据使用GTYPE软件（Affymetrix，Santa Clara，CA）进行处理，以产生包含关于每个探针组（SNP）的推断的拷贝数的信息的拷贝数（.cnt）文件。.cnt文件包含来自组中的2个阵列的组合信息。文件使用内部开发的基于UNIX的软件包GeneWalker（参见Olejniczak 等人，Mol. Can. Res.,.5（4）:331-339（2007））进行分析。
体内研究
C.B.-17 scid-bg（scid-bg）或C.B.-17 scid（scid）小鼠以5-6周龄得自Charles River Laboratories（Wilmington，MA，USA），并且当超过8周龄和/或大小约20克时用于研究。所有动物研究在无特定病原体环境中进行，依照Internal Institutional
Animal Care and Use Committee（IACUC），由American Association of
Laboratory Animal Care授权，在满足或超过由United States Department of Agriculture Animal Welfare Act，Public Health Service关于动物人道护理和使用的政策和NIH关于实验室动物福利的指导设定的标准的条件下。脱水、缺乏梳理、昏睡、超过15％重量减轻以及超过20％体重的肿瘤体积的明显体征用于确定肿瘤终点。
SW620细胞系得自ATCC（Manassas，VA），并且根据其建议无抗生素培养，并且对于枝原体属（Mycoplasma）进行常规测试，并且在体内接种前通过传染性微生物PCR扩增测试（IMPACT；Missouri Research Animal
Diagnostic Laboratory，Columbia，MO）证实无微生物。SW620细胞在补加有1mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco氏极限必需培养基（DMEM）中生长，维持在37℃在由5％CO2 95％空气平衡的湿润气氛中，并且在传代3-7之间当处于用于肿瘤细胞接种的对数期中时使用。细胞（1-2 x 106）与基质胶(matrigel)（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）1:1混合，并且皮下注射（0.2 ml）到雌性小鼠的刮毛胁腹内。肿瘤是大小匹配的（408-605 mm3），并且在给药起始前分配到处理组内。用测径器测量2个二等分直径，并且由公式估计肿瘤体积：（长度 x 宽度2）/2。通过测定通过下述计算的96T/C天评估对肿瘤生长速率的治疗作用：[（在第X天时治疗组的平均肿瘤体积/在第X天时对照载体组的平均肿瘤体积）x 100]。通过计算的100-％T/C天来计算％TGI。腹膜内施用在包含10％Solutol（BASF，Florham Park，NJ）和90％酒石酸（Sigma Aldrich，St. Louis，MO）的载体中的VX-680（i.p.，50 mg/kg/天，每天2次（b.i.d.）到结束；17-21天，取决于何时达到终点，并且终止研究）。腹膜内施用在包含2％乙醇、5％Tween 20、20％PEG-400和73％HPMC（Sigma Aldrich，St. Louis，MO）的载体中的AZD1152（100 mg/kg/天，b.i.d. x 3，4天开启，3天关闭，1-2个循环）。
结果
为了揭露癌细胞可能细胞自主地利用以破坏Aurora激酶抑制剂的活性的潜在机制，做出生成对于AZD1152的活性醇，AZD1152 HQPA固有抗性的细胞系的尝试。SW620结肠癌细胞在1 μM AZD1152 HQPA（~50倍IC50）的存在下繁殖3个月的时间段。小于0.01％的细胞在5次传代后经受住这个处理（数据未显示）。经受住初始选择期的细胞在1 μM AZD1152 HQPA的存在下维持另外3个月，或在不存在药物的情况下繁殖相同时间段。接下来，执行亲本和药物抗性细胞的全基因组微阵列分析，以鉴定可能与对于AZD1152 HQPA的抗性相关的基因表达变化。在药物抗性SW620衍生物（下文被称为SW620ABCB1/3）中，编码MDR1的ABCB1是在阵列上最高度超表达的基因，并且通过2个不同探针组鉴定（图1A，插图）。还观察到第二种基因编码MDR3的ABCB4在SW620ABCB1/3中也是上调的，尽管未到ABCB1的程度。在编码已知小分子转运蛋白的基因集合中，ABCB1和ABCB4是显示高度差异表达的仅有的2种（图1A）。ABCB1和ABCB4的明显共同上调是不寻常的，已知这些基因在染色体7长臂上的共同基因组基因座（7q21.1）内并列存在的话。这暗示包括ABCB1和ABCB4的基因组区域可以在AZD1152 HQPA中的选择过程中扩增，从而导致这些转运蛋白基因的串联超表达。通过比较基因组杂交（CGH）分析，相对于亲本SW620，观察到在SW620ABCB1/3中关于ABCB1（5个拷贝）和ABCB4（3个拷贝）的DNA拷贝数中的增加（图1B）。在SW620ABCB1/3中，关于2种基因的拷贝数改变在AZD1152 HQPA从培养基中撤出后维持3个月（图1B），从而指示抗性表型涉及与基因扩增一致的持续遗传事件。MDR1在AZD1152 HQPA的存在下繁殖的细胞中在蛋白质水平是高度上调的，并且即使在选择压力去除后也持续（图1C）。
SW620ABCB1/3衍生物需要比亲本系多约100倍的AZD1152 HQPA，以抑制Aurora B底物组蛋白H3的磷酸化（图2A）。因为MDR1是ATP依赖性生物异源转运蛋白，所以AZD1152 HQPA可以在SW620ABCB1/3中通过从细胞内区室流出得到消除是合理的，从而省去组蛋白H3磷酸化。通过LC-MS分析，与亲本SW620细胞相比较，在抗性系的细胞溶胶中测量到明显更少的药物（图2B）。PSC-833，MDR1（参见，Girdler，F.，等人，Chem. Biol. ，15:552-562（2008），Twentyman PR，Eur. J. Cancer，27:1639-1642（1991））和MDR3（参见，Boesch，D.，Cancer Res.，51:4226-4233（1991））的小分子抑制剂，在逆转SW620ABCB1/3细胞对于AZD1152 HQPA的抗性中是有效的（图2C）。ABCB1由siRNA的部分击倒（~75％）部分恢复SW620ABCB1/3中通过AZD1152 HQPA的组蛋白H3磷酸化的抑制（图2D），从而暗示ABCB1是这个模型中对于AZD1152 HQPA的完全抗性所需的。
通过计算AZD1152 HQPA在SW620或SW620ABCB1/3中的固有效力（分别为0.02或2 μM）和当在50％（v/v）小鼠血浆的存在下测定时AZD1152 HQPA的效力中的倍数减少的积，估计Aurora B抑制所需的AZD1152 HQPA的最低限度瘤内浓度（效力中的丧失推测是由于血浆蛋白质结合；数据未显示）。基于这个预测，在SW620或SW620ABCB1/3异种移植物中必须分别达到0.1或10 μM的AZD1152 HQPA的最低限度阈值浓度，以产生组蛋白H3磷酸化的抑制（图3A，上图）。在AZD1152 HQPA的单次IP施用后在给药后24小时时间段期间评估肿瘤药物代谢动力学。这个分析证实与亲本群组（cohort）相比较，在SW620ABCB1/3异种移植物中总体肿瘤AUC中的减少。基于上述预测，SW620ABCB1/3肿瘤中的AZD1152 HQPA浓度超过最低限度阈值浓度仅短暂时间段（~6小时），而在SW620肿瘤中，超过阈值的浓度达到至少24小时（图3A，下图）。相应地，与亲本肿瘤相比较，在SW620ABCB1/3中仅观察到组蛋白H3磷酸化的瞬时抑制。因为多倍体化是在有丝***过程中抑制Aurora B的表现，所以人们可以预测AZD1152必须以最低限度阈值浓度存在足够久，以允许肿瘤中的增殖细胞尝试单个有丝***，或大致等价于一个细胞周期的时间段（15-20小时）。在亲本SW620异种移植物中Aurora B的持续抑制是在这个模型中观察到的高度有效活性的伴随物，而在SW620ABCB1/3肿瘤中观察到的瞬时抑制在任一剂量都获得很少的抗肿瘤作用或无抗肿瘤作用（参照图3B与图3C-D比较）。
已知在这些模型中基因ABCB1和ABCB4的上调在体外和体内赋予对于AZD1152的抗癌性质的抗性，下一个步骤是确定这些推定的Aurora抑制剂抗性基因的存在是否真正预测固有肿瘤抗性。查询来自人异种移植物实验对象组的内部基因表达数据（数据未显示），以鉴定展示ABCB1（MDR1）上调的肿瘤模型。在这些模型中，HCT-15和AsPC1被证实分别在蛋白质水平表达升高水平的MDR1（图4A）。在集落形成和细胞增殖测定中在掺入HCT-15和AsPC1的细胞系实验对象组中评价3种代表性Aurora激酶抑制剂以及紫杉醇，MDR1的已知底物（参见，Smith AJ.，J. Biol. Chem. ，275:23530-23539（2000））。一般而言，大多数细胞系对于AZD1152 HQPA是相当敏感的，展示在低纳摩尔范围内的IC50s（4-15 nM；图4B）。相比之下，SW620ABCB1/3、HCT-15和AsPC1对于这种化合物是显著抗性的（分别地，2、1.4和2.2、.63 μM的IC50s）。不寻常地，泛Aurora激酶抑制剂VX-680在细胞系实验对象组中显示出相似活性概况，尽管对于SW620ABCB1/3、HCT-15和AsPC1的抗性程度更低。如预期的，SW620ABCB1/3和HCT-15而不是AsPC1对于天然产物紫杉醇是相对不敏感的。对于Aurora A选择性化合物MLN8054，未观察到效力中的明显丧失。重要的是，对于AZD1152 HQPA相对敏感的SW620细胞系通过免疫印迹分析不表达可检测的ABCB4（MDR3）（图4A并且数据未显示）。分别使用PSC-833和烟曲霉毒素C，证实BRCP是在HCT-15和AsPC1中对于AZD1152 HQPA的抗性所需的（图4C-D）。
HCT-15结肠癌异种移植物的生长通过用AZD1152或VX-680处理是不减弱的，而2种疗法在可替代结肠癌模型HCT116中（图4D），以及在DoHH-2 B细胞淋巴瘤异种移植物中（图4C）诱导显著的肿瘤生长抑制。
本领域技术人员将容易认识到本公开内容充分适合于执行所述目的且获得结果和优点，以及其中固有的那些。本文描述的分子复合物以及方法、程序、处理、分子、特异性化合物是优选实施方案的目前代表，是示例性的，并且不预期作为对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本发明的范围和精神的情况下对本文公开的本发明做出不同取代和修饰。
说明书中提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术水平。所有专利和出版物都引入本文作为参考，其程度与每个个别出版物特别且个别指出引入作为参考相同。
本文举例说明性描述的本发明可以适当地在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元素、一种或多种限制的情况下实践。因此，例如在本文的每种情况下，术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一种都可以由其他2个术语中的任一替换。已采用的术语和表达作为描述性而不是限制性术语使用，并且在此种术语和表达的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本公开内容已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和变化，并且此种修改和变化视为在如由附加权利要求限定的本发明的范围内。
序列表
<110>
SEMIZAROV, DIMITRI
SHAH, JAMEEL
GUO, JUN
ANDERSON, MARK
<120> 预测和监控对于Aurora激酶B抑制剂疗法的应答的标记
<130>
D-24625
<140>
<141>
<160>
321
<170>
PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>
4872
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
tattcagata
ttctccagat tcctaaagat tagagatcat ttctcattct cctaggagta 60
ctcacttcag
gaagcaacca gataaaagag aggtgcaacg gaagccagaa cattcctcct 120
ggaaattcaa
cctgtttcgc agtttctcga ggaatcagca ttcagtcaat ccgggccggg 180
agcagtcatc
tgtggtgagg ctgattggct gggcaggaac agcgccgggg cgtgggctga 240
gcacagccgc
ttcgctctct ttgccacagg aagcctgagc tcattcgagt agcggctctt 300
ccaagctcaa
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agtatcttct
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ggggaccgca atggaggagc aaagaagaag aactttttta aactgaacaa 480
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gttaaagggg ctataggttc caggcttgct gtaattaccc agaatatagc 2940
aaatcttggg
acaggaataa ttatatcctt catctatggt tggcaactaa cactgttact 3000
cttagcaatt
gtacccatca ttgcaatagc aggagttgtt gaaatgaaaa tgttgtctgg 3060
acaagcactg
aaagataaga aagaactaga aggttctggg aagatcgcta ctgaagcaat 3120
agaaaacttc
cgaaccgttg tttctttgac tcaggagcag aagtttgaac atatgtatgc 3180
tcagagtttg
caggtaccat acagaaactc tttgaggaaa gcacacatct ttggaattac 3240
attttccttc
acccaggcaa tgatgtattt ttcctatgct ggatgtttcc ggtttggagc 3300
ctacttggtg
gcacataaac tcatgagctt tgaggatgtt ctgttagtat tttcagctgt 3360
tgtctttggt
gccatggccg tggggcaagt cagttcattt gctcctgact atgccaaagc 3420
caaaatatca
gcagcccaca tcatcatgat cattgaaaaa acccctttga ttgacagcta 3480
cagcacggaa
ggcctaatgc cgaacacatt ggaaggaaat gtcacatttg gtgaagttgt 3540
attcaactat
cccacccgac cggacatccc agtgcttcag ggactgagcc tggaggtgaa 3600
gaagggccag
acgctggctc tggtgggcag cagtggctgt gggaagagca cagtggtcca 3660
gctcctggag
cggttctacg accccttggc agggaaagtg ctgcttgatg gcaaagaaat 3720
aaagcgactg
aatgttcagt ggctccgagc acacctgggc atcgtgtccc aggagcccat 3780
cctgtttgac
tgcagcattg ctgagaacat tgcctatgga gacaacagcc gggtggtgtc 3840
acaggaagag
attgtgaggg cagcaaagga ggccaacata catgccttca tcgagtcact 3900
gcctaataaa
tatagcacta aagtaggaga caaaggaact cagctctctg gtggccagaa 3960
acaacgcatt
gccatagctc gtgcccttgt tagacagcct catattttgc ttttggatga 4020
agccacgtca
gctctggata cagaaagtga aaaggttgtc caagaagccc tggacaaagc 4080
cagagaaggc
cgcacctgca ttgtgattgc tcaccgcctg tccaccatcc agaatgcaga 4140
cttaatagtg
gtgtttcaga atggcagagt caaggagcat ggcacgcatc agcagctgct 4200
ggcacagaaa
ggcatctatt tttcaatggt cagtgtccag gctggaacaa agcgccagtg 4260
aactctgact
gtatgagatg ttaaatactt tttaatattt gtttagatat gacatttatt 4320
caaagttaaa
agcaaacact tacagaatta tgaagaggta tctgtttaac atttcctcag 4380
tcaagttcag
agtcttcaga gacttcgtaa ttaaaggaac agagtgagag acatcatcaa 4440
gtggagagaa
atcatagttt aaactgcatt ataaatttta taacagaatt aaagtagatt 4500
ttaaaagata
aaatgtgtaa ttttgtttat attttcccat ttggactgta actgactgcc 4560
ttgctaaaag
attatagaag tagcaaaaag tattgaaatg tttgcataaa gtgtctataa 4620
taaaactaaa
ctttcatgtg actggagtca tcttgtccaa actgcctgtg aatatatctt 4680
ctctcaattg
gaatattgta gataacttct gctttaaaaa agttttcttt aaatatacct 4740
actcattttt gtgggaatgg
ttaagcagtt taaataattc ctgttgtata tgtctattca
4800
cattgggtct
tacagaacca tctggcttca ttcttcttgg acttgatcct gctgattctt 4860
gcatttccac
at
4872
<210> 2
<211>
3988
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
caaagtccag
gcccctctgc tgcagcgccc gcgcgtccag aggccctgcc agacacgcgc 60
gaggttcgag
gctgagatgg atcttgaggc ggcaaagaac ggaacagcct ggcgccccac 120
gagcgcggag
ggcgactttg aactgggcat cagcagcaaa caaaaaagga aaaaaacgaa 180
gacagtgaaa
atgattggag tattaacatt gtttcgatac tccgattggc aggataaatt 240
gtttatgtcg
ctgggtacca tcatggccat agctcacgga tcaggtctcc ccctcatgat 300
gatagtattt
ggagagatga ctgacaaatt tgttgatact gcaggaaact tctcctttcc 360
agtgaacttt
tccttgtcgc tgctaaatcc aggcaaaatt ctggaagaag aaatgactag 420
atatgcatat
tactactcag gattgggtgc tggagttctt gttgctgcct atatacaagt 480
ttcattttgg
actttggcag ctggtcgaca gatcaggaaa attaggcaga agttttttca 540
tgctattcta
cgacaggaaa taggatggtt tgacatcaac gacaccactg aactcaatac 600
gcggctaaca gatgacatct
ccaaaatcag tgaaggaatt ggtgacaagg ttggaatgtt
660
ctttcaagca
gtagccacgt tttttgcagg attcatagtg ggattcatca gaggatggaa 720
gctcaccctt
gtgataatgg ccatcagccc tattctagga ctctctgcag ccgtttgggc 780
aaagatactc
tcggcattta gtgacaaaga actagctgct tatgcaaaag caggcgccgt 840
ggcagaagag
gctctggggg ccatcaggac tgtgatagct ttcgggggcc agaacaaaga 900
gctggaaagg
tatcagaaac atttagaaaa tgccaaagag attggaatta aaaaagctat 960
ttcagcaaac
atttccatgg gtattgcctt cctgttaata tatgcatcat atgcactggc 1020
cttctggtat
ggatccactc tagtcatatc aaaagaatat actattggaa atgcaatgac 1080
agtttttttt
tcaatcctaa ttggagcttt cagtgttggc caggctgccc catgtattga 1140
tgcttttgcc
aatgcaagag gagcagcata tgtgatcttt gatattattg ataataatcc 1200
taaaattgac
agtttttcag agagaggaca caaaccagac agcatcaaag ggaatttgga 1260
gttcaatgat
gttcactttt cttacccttc tcgagctaac gtcaagatct tgaagggcct 1320
caacctgaag
gtgcagagtg ggcagacggt ggccctggtt ggaagtagtg gctgtgggaa 1380
gagcacaacg
gtccagctga tacagaggct ctatgaccct gatgagggca caattaacat 1440
tgatgggcag
gatattagga actttaatgt aaactatctg agggaaatca ttggtgtggt 1500
gagtcaggag
ccggtgctgt tttccaccac aattgctgaa aatatttgtt atggccgtgg 1560
aaatgtaacc
atggatgaga taaagaaagc tgtcaaagag gccaacgcct atgagtttat 1620
catgaaatta
ccacagaaat ttgacaccct ggttggagag agaggggccc agctgagtgg 1680
tgggcagaag
cagaggatcg ccattgcacg tgccctggtt cgcaacccca agatccttct 1740
gctggatgag
gccacgtcag cattggacac agaaagtgaa gctgaggtac aggcagctct 1800
ggataaggcc
agagaaggcc ggaccaccat tgtgatagca caccgactgt ctacggtccg 1860
aaatgcagat
gtcatcgctg ggtttgagga tggagtaatt gtggagcaag gaagccacag 1920
cgaactgatg
aagaaggaag gggtgtactt caaacttgtc aacatgcaga catcaggaag 1980
ccagatccag
tcagaagaat ttgaactaaa tgatgaaaag gctgccacta gaatggcccc 2040
aaatggctgg
aaatctcgcc tatttaggca ttctactcag aaaaacctta aaaattcaca 2100
aatgtgtcag
aagagccttg atgtggaaac cgatggactt gaagcaaatg tgccaccagt 2160
gtcctttctg
aaggtcctga aactgaataa aacagaatgg ccctactttg tcgtgggaac 2220
agtatgtgcc
attgccaatg gggggcttca gccggcattt tcagtcatat tctcagagat 2280
catagcgatt
tttggaccag gcgatgatgc agtgaagcag cagaagtgca acatattctc 2340
tttgattttc
ttatttctgg gaattatttc tttttttact ttcttccttc agggtttcac 2400
gtttgggaaa
gctggcgaga tcctcaccag aagactgcgg tcaatggctt ttaaagcaat 2460
gctaagacag
gacatgagct ggtttgatga ccataaaaac agtactggtg cactttctac 2520
aagacttgcc
acagatgctg cccaagtcca aggagccaca ggaaccaggt tggctttaat 2580
tgcacagaat
atagctaacc ttggaactgg tattatcata tcatttatct acggttggca 2640
gttaacccta
ttgctattag cagttgttcc aattattgct gtgtcaggaa ttgttgaaat 2700
gaaattgttg
gctggaaatg ccaaaagaga taaaaaagaa ctggaagctg ctggaaagat 2760
tgcaacagag
gcaatagaaa atattaggac agttgtgtct ttgacccagg aaagaaaatt 2820
tgaatcaatg
tatgttgaaa aattgtatgg accttacagg aattctgtgc agaaggcaca 2880
catctatgga
attactttta gtatctcaca agcatttatg tatttttcct atgccggttg 2940
ttttcgattt
ggtgcatatc tcattgtgaa tggacatatg cgcttcagag atgttattct 3000
ggtgttttct
gcaattgtat ttggtgcagt ggctctagga catgccagtt catttgctcc 3060
agactatgct
aaagctaagc tgtctgcagc ccacttattc atgctgtttg aaagacaacc 3120
tctgattgac
agctacagtg aagaggggct gaagcctgat aaatttgaag gaaatataac 3180
atttaatgaa
gtcgtgttca actatcccac ccgagcaaac gtgccagtgc ttcaggggct 3240
gagcctggag
gtgaagaaag gccagacact agccctggtg ggcagcagtg gctgtgggaa 3300
gagcacggtg
gtccagctcc tggagcggtt ctacgacccc ttggcgggga cagtgtttgt 3360
ggactttggt
tttcagcttc tcgatggtca agaagcaaag aaactcaatg tccagtggct 3420
cagagctcaa
ctcggaatcg tgtctcagga gcctatccta tttgactgca gcattgccga 3480
gaatattgcc
tatggagaca acagccgggt tgtatcacag gatgaaattg tgagtgcagc 3540
caaagctgcc
aacatacatc ctttcatcga gacgttaccc cacaaatatg aaacaagagt 3600
gggagataag
gggactcagc tctcaggagg tcaaaaacag aggattgcta ttgcccgagc 3660
cctcatcaga
caacctcaaa tcctcctgtt ggatgaagct acatcagctc tggatactga 3720
aagtgaaaag
gttgtccaag aagccctgga caaagccaga gaaggccgca cctgcattgt 3780
gattgctcac
cgcctgtcca ccatccagaa tgcagactta atagtggtgt ttcagaatgg 3840
gagagtcaag
gagcatggca cgcatcagca gctgctggca cagaaaggca tctatttttc 3900
aatggtcagt
gtccaggctg ggacacagaa cttatgaact tttgctacag tatattttaa 3960
aaataaattc
aaattattct accatttt 3988
<210> 3
<211> 21
<212>
RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的寡核苷酸
<400> 3
aacguacgcg
gaauacuucg a 21
<210> 4
<211> 23
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 4
ggagagtagc
agtgccttgg acc 23
<210> 5
<211> 29
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 5
aggaggaggt
agaaaacaga taagggaac 29
<210> 6
<211> 22
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 6
agtgccttgg
accccagctc tc
22
<210> 7
<211> 29
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 7
gaaaacagat
aagggaacag ttagggatc 29
<210> 8
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
ccatgttgaa
aaacattgac ctgaartggt ggttctaaag cttcggtgaa t 51
<210> 9
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
tgccctacaa
ttcattatag cacaaycttt aacacaccac ttaataactg t 51
<210> 10
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
aaccatcagg
ctactgagat agtgayagca attttttttc atacttcttc t 51
<210> 11
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
ccaaaatatt
agttatgctg taatayatcc attaagctat ttaagaaaac a 51
<210> 12
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
ctttccctac
atagttatag tagctsaagt cccttagtct ctccacattc c 51
<210> 13
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
agtcctgtaa
cttcttcctc tataartctc ataagtattt gctttctttt c 51
<210> 14
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
tacaataaac
ataggatcta attagwcagc tctaaaacct tcttcagtaa g 51
<210> 15
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
tcttagaaac
tagagcaaca aatacyatat tatataccat taaatacttt t 51
<210> 16
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
taaatattat
gtgttgtgga ttaaayttgt gcgcttaaat aaatttcagt t 51
<210> 17
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
aaaattacaa
tttatcttac tgctaycatt tgtgttttca atcttcatct t 51
<210> 18
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
taaggaaaaa
tatagtacac tttacrgatt tgcaggtttt gctatttata a 51
<210> 19
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
caagaccctt
tctttaatgg gtacawaatg tcaaaaatat ttttatataa t 51
<210> 20
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
gacaccttga
tgcaggcttc tttaaygcag agtaggacac agatggctgg a 51
<210> 21
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
atttcagtat
ctcctaaact cttgcyatgc aggaaaaatt attttatgtg a 51
<210> 22
<211> 51
<212>
DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
taagagggaa
gattaacatt cggacyaacc atgtttccac taaaccaatt a 51
<210> 23
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 23
agctttagaa
ccaccacttc aggtc 25
<210> 24
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 24
agctttagaa
ccaccatttc aggtc 25
<210> 25
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 25
gacctgaagt
ggtggttcta aagct 25
<210> 26
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 26
tagaaccacc
atttcaggtc aatgt 25
<210> 27
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 27
tagaaccacc
acttcaggtc aatgt 25
<210> 28
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 28
gacctgaaat
ggtggttcta aagct 25
<210> 29
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 29
ttgacctgaa
gtggtggttc taaag 25
<210> 30
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 30
ttgacctgaa
atggtggttc taaag 25
<210> 31
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 31
acattgacct
gaaatggtgg ttcta 25
<210> 32
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 32
acattgacct
gaagtggtgg ttcta 25
<210> 33
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 33
cattgacctg
aagtggtggt tctaa 25
<210> 34
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 34
cattgacctg
aaatggtggt tctaa 25
<210> 35
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 35
aaccaccact
tcaggtcaat gtttt 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 36
aaccaccatt
tcaggtcaat gtttt 25
<210> 37
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 37
aaaacattga
cctgaaatgg tggtt
25
<210> 38
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 38
aaaacattga
cctgaagtgg tggtt 25
<210> 39
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 39
aaacattgac ctgaaatggt
ggttc
25
<210> 40
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 40
aaacattgac
ctgaagtggt ggttc 25
<210> 41
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 41
tttagaacca
ccacttcagg tcaat 25
<210> 42
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 42
tttagaacca
ccatttcagg tcaat 25
<210> 43
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 43
tgttaaaggt
tgtgctataa tgaat 25
<210> 44
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 44
tcattatagc
acaaccttta acaca 25
<210> 45
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 45
gtgtgttaaa
gattgtgcta taatg 25
<210> 46
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 46
atagcacaat
ctttaacaca ccact 25
<210> 47
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 47
tcattatagc
acaatcttta acaca 25
<210> 48
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 48
tagcacaacc
tttaacacac cactt 25
<210> 49
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 49
gtgtgttaaa
ggttgtgcta taatg 25
<210> 50
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 50
attatagcac
aacctttaac acacc 25
<210> 51
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 51
attatagcac
aatctttaac acacc 25
<210> 52
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 52
attcattata
gcacaatctt taaca 25
<210> 53
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 53
atagcacaac
ctttaacaca ccact 25
<210> 54
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 54
ttatagcaca
acctttaaca cacca 25
<210> 55
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 55
ttatagcaca
atctttaaca cacca 25
<210> 56
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 56
tgttaaagat
tgtgctataa tgaat 25
<210> 57
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 57
tggtgtgtta
aaggttgtgc tataa 25
<210> 58
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 58
tggtgtgtta
aagattgtgc tataa 25
<210> 59
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 59
aagtggtgtg
ttaaagattg tgcta 25
<210> 60
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 60
attcattata
gcacaacctt taaca 25
<210> 61
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 61
aagtggtgtg
ttaaaggttg tgcta 25
<210> 62
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 62
tagcacaatc
tttaacacac cactt 25
<210> 63
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 63
actgagatag
tgatagcaat ttttt 25
<210> 64
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 64
aaaaaattgc
tatcactatc tcagt 25
<210> 65
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 65
aaaaaaaatt
gctgtcacta tctca 25
<210> 66
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 66
aaaaaattgc
tgtcactatc tcagt
25
<210> 67
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 67
gctactgaga
tagtgatagc aattt 25
<210> 68
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 68
gctactgaga tagtgacagc
aattt
25
<210> 69
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 69
atgaaaaaaa
attgctatca ctatc 25
<210> 70
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 70
atgaaaaaaa
attgctgtca ctatc 25
<210> 71
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 71
aaattgctgt
cactatctca gtagc 25
<210> 72
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 72
aaattgctat
cactatctca gtagc 25
<210> 73
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 73
aaaaaaaatt
gctatcacta tctca 25
<210> 74
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 74
agatagtgac
agcaattttt tttca 25
<210> 75
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 75
agatagtgat
agcaattttt tttca 25
<210> 76
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 76
actgagatag
tgacagcaat ttttt 25
<210> 77
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 77
tactgagata
gtgatagcaa ttttt 25
<210> 78
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 78
tactgagata
gtgacagcaa ttttt 25
<210> 79
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 79
ctgagatagt
gatagcaatt ttttt 25
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<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 80
ctgagatagt
gacagcaatt ttttt 25
<210> 81
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 81
aaaaattgct
atcactatct cagta 25
<210> 82
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 82
aaaaattgct
gtcactatct cagta 25
<210> 83
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 83
ttatgctgta
atacatccat taagc 25
<210> 84
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 84
ttatgctgta
atatatccat taagc 25
<210> 85
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 85
agttatgctg
taatatatcc attaa 25
<210> 86
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 86
agttatgctg
taatacatcc attaa 25
<210> 87
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 87
tgctgtaata
tatccattaa gctat 25
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<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 88
tgctgtaata
catccattaa gctat 25
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<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 89
atgctgtaat
atatccatta agcta 25
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<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 90
atgctgtaat
acatccatta agcta 25
<210> 91
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 91
agcttaatgg
atgtattaca gcata 25
<210> 92
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 92
agcttaatgg
atatattaca gcata 25
<210> 93
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 93
tagttatgct
gtaatacatc catta 25
<210> 94
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 94
tagttatgct
gtaatatatc catta 25
<210> 95
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 95
ctgtaatata
tccattaagc tattt
25
<210> 96
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 96
ttaatggatg
tattacagca taact 25
<210> 97
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 97
ctgtaataca
tccattaagc tattt 25
<210> 98
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 98
ttaatggata
tattacagca taact 25
<210> 99
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 99
tatgctgtaa
tatatccatt aagct 25
<210>
100
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
100
tatgctgtaa
tacatccatt aagct 25
<210>
101
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
101
atagcttaat
ggatatatta cagca 25
<210>
102
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
102
tatagtagct
caagtccctt agtct 25
<210>
103
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
103
tatagtagct
gaagtccctt agtct 25
<210>
104
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
104
tagtagctca
agtcccttag tctct 25
<210>
105
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
105
tagtagctga
agtcccttag tctct 25
<210>
106
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
106
catagttata
gtagctgaag tccct 25
<210>
107
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
107
catagttata
gtagctcaag tccct 25
<210>
108
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
108
actaagggac
ttcagctact ataac 25
<210>
109
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
109
actaagggac
ttgagctact ataac 25
<210>
110
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
110
gttatagtag
ctcaagtccc ttagt 25
<210>
111
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
111
gttatagtag
ctgaagtccc ttagt 25
<210>
112
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
112
ttatagtagc
tcaagtccct tagtc 25
<210>
113
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
113
ttatagtagc
tgaagtccct tagtc 25
<210>
114
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 114
agactaaggg
acttcagcta ctata 25
<210>
115
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
115
agactaaggg
acttgagcta ctata 25
<210>
116
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
116
gactaaggga
cttcagctac tataa 25
<210>
117
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
117
gactaaggga
cttgagctac tataa 25
<210>
118
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
118
agttatagta
gctgaagtcc cttag 25
<210>
119
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
119
agttatagta
gctcaagtcc cttag 25
<210>
120
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
120
aagggacttc
agctactata actat 25
<210>
121
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
121
aagggacttg
agctactata actat 25
<210>
122
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
122
aatacttatg
agatttatag aggaa
25
<210>
123
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
123
cttatgagat
ttatagagga agaag 25
<210>
124
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
124
cttatgagac ttatagagga
agaag
25
<210>
125
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
125
atacttatga
gacttataga ggaag 25
<210>
126
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
126
atacttatga
gatttataga ggaag 25
<210>
127
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
127
acttcttcct
ctataagtct cataa 25
<210>
128
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
128
acttcttcct
ctataaatct cataa 25
<210>
129
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
129
aatacttatg
agacttatag aggaa 25
<210>
130
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
130
tacttatgag
atttatagag gaaga 25
<210>
131
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
131
tacttatgag
acttatagag gaaga 25
<210>
132
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
132
ttcctctata
aatctcataa gtatt 25
<210>
133
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
133
tcttcctcta
taagtctcat aagta 25
<210>
134
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
134
tcttcctcta
taaatctcat aagta 25
<210>
135
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
135
ctctataagt
ctcataagta tttgc 25
<210>
136
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
136
ctctataaat
ctcataagta tttgc 25
<210>
137
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
137
ttatgagatt
tatagaggaa gaagt 25
<210>
138
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
138
ttatgagact
tatagaggaa gaagt 25
<210>
139
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
139
aaatacttat
gagatttata gagga 25
<210>
140
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
140
aaatacttat
gagacttata gagga 25
<210>
141
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
141
ttcctctata
agtctcataa gtatt 25
<210>
142
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
142
ttagagctga
ctaattagat cctat 25
<210>
143
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
143
ttagagctgt
ctaattagat cctat 25
<210>
144
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
144
atctaattag
acagctctaa aacct 25
<210>
145
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
145
atctaattag
tcagctctaa aacct 25
<210>
146
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 146
aggatctaat
tagtcagctc taaaa 25
<210>
147
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
147
ataggatcta
attagtcagc tctaa 25
<210>
148
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
148
ataggatcta
attagacagc tctaa 25
<210>
149
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
149
ggttttagag
ctgactaatt agatc 25
<210>
150
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
150
ggttttagag
ctgtctaatt agatc 25
<210>
151
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
151
tagagctgac
taattagatc ctatg 25
<210>
152
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
152
tagagctgtc
taattagatc ctatg 25
<210>
153
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
153
ggatctaatt
agacagctct aaaac 25
<210>
154
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
154
ggatctaatt
agtcagctct aaaac
25
<210>
155
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
155
aggatctaat
tagacagctc taaaa 25
<210>
156
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
156
ttttagagct gtctaattag
atcct
25
<210>
157
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
157
gatctaatta
gacagctcta aaacc 25
<210>
158
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
158
gatctaatta
gtcagctcta aaacc 25
<210>
159
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
159
ttttagagct
gactaattag atcct 25
<210>
160
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
160
gaaggtttta
gagctgacta attag 25
<210>
161
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
161
gaaggtttta
gagctgtcta attag 25
<210>
162
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
162
gcaacaaata
ctatattata tacca 25
<210>
163
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
163
gcaacaaata
ccatattata tacca 25
<210>
164
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
164
gtatataata
tagtatttgt tgctc 25
<210>
165
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
165
gtatataata
tggtatttgt tgctc 25
<210>
166
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
166
tataatatag
tatttgttgc tctag 25
<210>
167
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
167
tataatatgg
tatttgttgc tctag 25
<210>
168
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
168
agagcaacaa
ataccatatt atata 25
<210>
169
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
169
agagcaacaa
atactatatt atata 25
<210>
170
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
170
taatggtata
taatatagta tttgt 25
<210>
171
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
171
taatggtata
taatatggta tttgt 25
<210>
172
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
172
ctagagcaac
aaatactata ttata 25
<210>
173
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
173
aacaaatact
atattatata ccatt 25
<210>
174
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
174
aacaaatacc
atattatata ccatt 25
<210>
175
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
175
ctagagcaac
aaataccata ttata 25
<210>
176
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
176
ggtatataat
atggtatttg ttgct 25
<210>
177
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
177
ggtatataat
atagtatttg ttgct 25
<210>
178
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 178
agcaacaaat
accatattat atacc 25
<210>
179
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
179
agcaacaaat
actatattat atacc 25
<210>
180
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
180
tggtatataa
tatagtattt gttgc 25
<210>
181
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
181
tggtatataa
tatggtattt gttgc 25
<210>
182
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
182
tgtggattaa
acttgtgcgc ttaaa 25
<210>
183
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
183
tgtggattaa
atttgtgcgc ttaaa 25
<210>
184
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
184
atttaagcgc
acaaatttaa tccac 25
<210>
185
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
185
atttaagcgc
acaagtttaa tccac 25
<210>
186
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
186
ttgtggatta
aatttgtgcg cttaa
25
<210>
187
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
187
ttgtggatta
aacttgtgcg cttaa 25
<210>
188
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
188
taagcgcaca agtttaatcc
acaac
25
<210>
189
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
189
taagcgcaca
aatttaatcc acaac 25
<210>
190
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
190
gtgttgtgga
ttaaacttgt gcgct 25
<210>
191
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
191
gtgttgtgga
ttaaatttgt gcgct 25
<210>
192
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
192
gcgcacaagt
ttaatccaca acaca 25
<210>
193
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
193
gcgcacaaat
ttaatccaca acaca 25
<210>
194
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
194
ttatttaagc
gcacaagttt aatcc 25
<210>
195
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
195
ttatttaagc
gcacaaattt aatcc 25
<210>
196
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
196
tttaagcgca
caagtttaat ccaca 25
<210>
197
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
197
tttaagcgca
caaatttaat ccaca 25
<210>
198
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
198
gtggattaaa
tttgtgcgct taaat 25
<210>
199
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
199
gtggattaaa
cttgtgcgct taaat 25
<210>
200
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
200
tgtgttgtgg
attaaatttg tgcgc 25
<210>
201
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
201
tgtgttgtgg
attaaacttg tgcgc 25
<210>
202
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
202
cacaaatgat
agcagtaaga taaat 25
<210>
203
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
203
tttatcttac
tgctaccatt tgtgt 25
<210>
204
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
204
aaaacacaaa
tgatagcagt aagat 25
<210>
205
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
205
aaaacacaaa
tggtagcagt aagat 25
<210>
206
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
206
aaacacaaat
ggtagcagta agata 25
<210>
207
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
207
aaacacaaat
gatagcagta agata 25
<210>
208
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
208
atcttactgc
taccatttgt gtttt 25
<210>
209
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
209
atcttactgc
tatcatttgt gtttt 25
<210>
210
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 210
attgaaaaca
caaatggtag cagta 25
<210>
211
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
211
tttatcttac
tgctatcatt tgtgt 25
<210>
212
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
212
gaaaacacaa
atggtagcag taaga 25
<210>
213
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
213
gaaaacacaa
atgatagcag taaga 25
<210>
214
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
214
cacaaatggt
agcagtaaga taaat 25
<210>
215
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
215
atttatctta
ctgctatcat ttgtg 25
<210>
216
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
216
tgaaaacaca
aatggtagca gtaag 25
<210>
217
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
217
atttatctta
ctgctaccat ttgtg 25
<210>
218
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
218
tgaaaacaca
aatgatagca gtaag
25
<210>
219
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
219
cttactgcta
ccatttgtgt tttca 25
<210>
220
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
220
cttactgcta tcatttgtgt
tttca
25
<210>
221
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
221
attgaaaaca
caaatgatag cagta 25
<210>
222
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
222
acctgcaaat
ccgtaaagtg tacta 25
<210>
223
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
223
acctgcaaat
ctgtaaagtg tacta 25
<210>
224
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
224
agtacacttt
acagatttgc aggtt 25
<210>
225
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
225
agtacacttt
acggatttgc aggtt 25
<210>
226
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
226
acactttacg
gatttgcagg ttttg 25
<210>
227
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
227
aacctgcaaa
tctgtaaagt gtact 25
<210>
228
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
228
aacctgcaaa
tccgtaaagt gtact 25
<210>
229
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
229
tagtacactt
tacggatttg caggt 25
<210>
230
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
230
tagtacactt
tacagatttg caggt 25
<210>
231
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
231
atatagtaca
ctttacggat ttgca 25
<210>
232
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
232
atatagtaca
ctttacagat ttgca 25
<210>
233
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
233
atagtacact
ttacggattt gcagg 25
<210>
234
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
234
aaacctgcaa
atccgtaaag tgtac 25
<210>
235
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
235
aaacctgcaa
atctgtaaag tgtac 25
<210>
236
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
236
gcaaaacctg
caaatctgta aagtg 25
<210>
237
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
237
gcaaaacctg
caaatccgta aagtg 25
<210>
238
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
238
cctgcaaatc
cgtaaagtgt actat 25
<210>
239
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
239
acactttaca
gatttgcagg ttttg 25
<210>
240
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
240
cctgcaaatc
tgtaaagtgt actat 25
<210>
241
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
241
atagtacact
ttacagattt gcagg 25
<210>
242
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 242
ttctttaatg
ggtacaaaat gtcaa 25
<210>
243
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
243
tttgacatta
tgtacccatt aaaga 25
<210>
244
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
244
tttgacattt
tgtacccatt aaaga 25
<210>
245
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
245
taatgggtac
ataatgtcaa aaata 25
<210>
246
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
246
ttgacatttt
gtacccatta aagaa 25
<210>
247
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
247
ttctttaatg
ggtacataat gtcaa 25
<210>
248
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
248
tatttttgac
attatgtacc catta 25
<210>
249
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
249
atatttttga
cattatgtac ccatt 25
<210>
250
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
250
tttaatgggt
acaaaatgtc aaaaa
25
<210>
251
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
251
tttaatgggt
acataatgtc aaaaa 25
<210>
252
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
252
atatttttga cattttgtac
ccatt
25
<210>
253
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
253
ttgacattat
gtacccatta aagaa 25
<210>
254
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
254
ttaatgggta
cataatgtca aaaat 25
<210>
255
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
255
ttaatgggta
caaaatgtca aaaat 25
<210>
256
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
256
tatttttgac
attttgtacc catta 25
<210>
257
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
257
tgggtacata
atgtcaaaaa tattt 25
<210>
258
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
258
atttttgaca
ttatgtaccc attaa 25
<210>
259
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
259
atttttgaca
ttttgtaccc attaa 25
<210>
260
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
260
tgggtacaaa
atgtcaaaaa tattt 25
<210>
261
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
261
taatgggtac
aaaatgtcaa aaata 25
<210>
262
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
262
ttctttaatg
cagagtagga cacag 25
<210>
263
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
263
tcctactctg
cgttaaagaa gcctg 25
<210>
264
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
264
tgtgtcctac
tctgcattaa agaag 25
<210>
265
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
265
caggcttctt
taacgcagag tagga 25
<210>
266
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
266
tactctgcat
taaagaagcc tgcat 25
<210>
267
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
267
ctgtgtccta
ctctgcatta aagaa 25
<210>
268
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
268
aggcttcttt
aatgcagagt aggac 25
<210>
269
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
269
aggcttcttt
aacgcagagt aggac 25
<210>
270
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
270
ctgtgtccta
ctctgcgtta aagaa 25
<210>
271
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
271
atgcaggctt
ctttaatgca gagta 25
<210>
272
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
272
tgtgtcctac
tctgcgttaa agaag 25
<210>
273
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
273
ggcttcttta
acgcagagta ggaca 25
<210>
274
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 274
gcaggcttct
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<210>
275
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
275
tcctactctg
cattaaagaa gcctg 25
<210>
276
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
276
ttctttaacg
cagagtagga cacag 25
<210>
277
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
277
ggcttcttta
atgcagagta ggaca 25
<210>
278
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
278
tactctgcgt
taaagaagcc tgcat 25
<210>
279
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
279
caggcttctt
taatgcagag tagga 25
<210>
280
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
280
atgcaggctt
ctttaacgca gagta 25
<210>
281
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
281
gcaggcttct
ttaatgcaga gtagg 25
<210>
282
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
282
atttttcctg
catggcaaga gttta
25
<210>
283
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
283
atttttcctg
catagcaaga gttta 25
<210>
284
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
284
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gaaaa
25
<210>
285
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
285
tcctaaactc
ttgctatgca ggaaa 25
<210>
286
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
286
tcctaaactc
ttgccatgca ggaaa 25
<210>
287
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
287
taatttttcc
tgcatggcaa gagtt 25
<210>
288
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
288
tttcctgcat
ggcaagagtt tagga 25
<210>
289
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
289
taatttttcc
tgcatagcaa gagtt 25
<210>
290
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
290
ttttcctgca
tggcaagagt ttagg 25
<210>
291
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
291
tttcctgcat
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<210>
292
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
292
cctaaactct
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<210>
293
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
293
ataatttttc
ctgcatggca agagt 25
<210>
294
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
294
ataatttttc
ctgcatagca agagt 25
<210>
295
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
295
tcctgcatgg
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<210>
296
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
296
tcctgcatag
caagagttta ggaga 25
<210>
297
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
297
aactcttgcc
atgcaggaaa aatta 25
<210>
298
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
298
aactcttgct
atgcaggaaa aatta 25
<210>
299
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
299
ttttcctgca
tagcaagagt ttagg 25
<210>
300
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
300
ctaaactctt
gctatgcagg aaaaa 25
<210>
301
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
301
ctaaactctt
gccatgcagg aaaaa 25
<210>
302
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
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303
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<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
303
tggaaacatg
gttagtccga atgtt 25
<210>
304
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
304
ggaaacatgg
ttagtccgaa tgtta 25
<210>
305
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
305
ggaaacatgg
ttggtccgaa tgtta 25
<210>
306
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400> 306
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tggttagtcc gaatg 25
<210>
307
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
307
agtggaaaca
tggttggtcc gaatg 25
<210>
308
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
308
attaacattc
ggaccaacca tgttt 25
<210>
309
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
309
attaacattc
ggactaacca tgttt 25
<210>
310
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
310
gaaacatggt
tggtccgaat gttaa 25
<210>
311
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
311
gaaacatggt
tagtccgaat gttaa 25
<210>
312
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
312
aacattcgga
ccaaccatgt ttcca 25
<210>
313
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
313
aacattcgga
ctaaccatgt ttcca 25
<210>
314
<211> 25
<212>
DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的探针
<400>
314
acatggttag
tccgaatgtt aatct
25
<210>
315
<211> 25
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Claims (11)
1.测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在的试剂在制备用于对于用Aurora激酶B抑制剂的治疗的合格性分类患者的方法中的试剂盒中的用途，所述方法包括步骤：
a）提供来自患者的测试样品；
b）测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在；和
c）基于关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在，将所述患者分类为对于接受用Aurora激酶B抑制剂的治疗是合格的，
其中关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在将所述患者分类为对于接受用Aurora激酶B抑制剂的治疗以用于治疗癌症是不合格的，其中所述癌症是结肠直肠癌或胰癌。
2.测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在的试剂在制备用于监控患有癌症且用Aurora激酶B抑制剂治疗的患者的方法中的试剂盒中的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌或胰癌，所述方法包括步骤：
a）提供来自患有结肠直肠癌或胰癌且目前用至少一种Aurora激酶B抑制剂治疗的患者的测试样品；
b）测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在；
c）针对基线水平或预定水平比较所述测试样品中所述ABCB1基因的拷贝数，其中所述基线水平指在Aurora激酶B抑制剂治疗起始时得自患者的样品中ABCB1基因的拷贝数，且其中所述预定水平指与结肠直肠癌或胰癌进展相关的测定截止值；和
d）基于步骤c）中的比较，决定所述患者是否应继续用Aurora激酶B抑制剂治疗，
其中如果所述测试样品具有的关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益小于所述基线水平或预定水平，或如果未检测到拷贝数，那么继续用Aurora激酶B抑制剂对患者的治疗，且其中如果所述测试样品具有的关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益与所述基线水平或预定水平相同或高于所述基线水平或预定水平，那么中断用Aurora激酶B抑制剂对患者的治疗，或者将用Aurora激酶B抑制剂对患者的治疗与至少第二种疗法组合作为组合疗法。
3.测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在的试剂在制备用于分类具有对于用Aurora激酶B抑制剂治疗是抗性的癌症的患者的方法中的试剂盒中的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌或胰癌，所述方法包括步骤：
a）提供来自患者的测试样品；
b）测定关于在染色体基因座7q21.1的ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在；
c）针对基线水平或预定水平比较所述测试样品中关于所述ABCB1基因的拷贝数增益的存在或不存在，其中所述基线水平指在Aurora激酶B抑制剂治疗起始时得自患者的样品中ABCB1基因的拷贝数，且其中所述预定水平指与对Aurora激酶B抑制剂治疗的抗性相关的测定截止值；和
d）基于（i）在染色体基因座7q21.1上所述ABCB1基因的拷贝数增益的存在；和（ii）所述测试样品中拷贝数增益高于基线水平或预定水平，将所述患者分类为具有对于Aurora激酶B抑制剂治疗是抗性的癌症，其中所述癌症是结肠直肠癌或胰癌。
4.权利要求1、2或3的用途，其中所述Aurora激酶B抑制剂是AZD1152、ZM447439、VX-680/MK0457或Hersperadin。
5.权利要求1、2或3的用途，其中所述测试样品包括组织样品。
6.权利要求5的用途，其中所述组织样品包括外周血样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、骨髓样品、***样品、尿样品、腹水样品、灌洗样品、食管刷洗样品、膀胱或肺洗涤样品、脊髓液样品、脑液体样品、导管抽吸物样品、***排出物样品、胸膜积液样品、新鲜冷冻组织样品、石蜡包埋的组织样品，或由外周血样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、骨髓样品、尿样品、腹水样品、灌洗样品、食管刷洗样品、膀胱或肺洗涤样品、脊髓液样品、脑液体样品、导管抽吸物样品、***排出物样品、胸膜积液样品、新鲜冷冻组织样品或石蜡包埋的组织样品中的任何一种产生的提取物或加工的样品。
7.权利要求1、2或3的用途，其中所述测定步骤（b）通过原位杂交执行。
8.权利要求7的用途，其中所述原位杂交用（a）荧光标记的核酸探针、（b）至少2种核酸探针或（c）肽核酸探针执行。
9.权利要求1、2或3的用途，其中所述测定步骤（b）通过聚合酶链反应或核酸微阵列测定执行。
10.权利要求1、2或3的用途，其中所述ABCB1基因中拷贝数增益的存在与MDR1多肽表达中的增加相关。
11.权利要求1、2或3的用途，其中所述患者还用化学疗法、放射或其组合进行治疗。
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