CN102361988A - 具有改变的氧化还原机制和提高的产量的转基因植物 - Google Patents

具有改变的氧化还原机制和提高的产量的转基因植物 Download PDF

Info

Publication number
CN102361988A
CN102361988A CN2010800132513A CN201080013251A CN102361988A CN 102361988 A CN102361988 A CN 102361988A CN 2010800132513 A CN2010800132513 A CN 2010800132513A CN 201080013251 A CN201080013251 A CN 201080013251A CN 102361988 A CN102361988 A CN 102361988A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
seq
polynucleotide
promotor
transgenic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800132513A
Other languages
English (en)
Inventor
B·麦克尔西
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science Co GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science Co GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science Co GmbH filed Critical BASF Plant Science Co GmbH
Publication of CN102361988A publication Critical patent/CN102361988A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了多核苷酸，其能够提高经转化以包含这些多核苷酸的植物的产量。本发明还提供了使用这些多核苷酸的方法，以及包含这样的多核苷酸作为转基因的转基因植物和农产品，包括种子。

Description

具有改变的氧化还原机制和提高的产量的转基因植物
发明领域
此申请要求2009年3月23日提交的美国临时专利申请系列号61/162,427的优先权权益，在此将其全部内容引入作为参考。
发明背景
人口增加和气候变化使得全球食物、饲料和燃料短缺的可能性成为近年来的尖锐聚焦点。农业消耗70％人类所用的水，同时在世界许多地方降雨量下降。此外，随着从农田改为市区和城郊而对土地使用的改变，较少公顷的耕地可用于种植农作物。农业生物技术尝试通过可以增加作物产量的植物遗传改变来满足人类增长的需求，例如，通过赋予更好的对非生物胁迫的耐受性或通过提高生物量。
在此将作物产量定义为每英亩收获的相关农业产品(如籽粒、粮草或种子)的蒲式耳量。作物产量受到非生物胁迫的影响，如干旱、热、盐度和冷胁迫，并且受到植物大小(生物量)的影响。传统植物育种策略相对缓慢，并且通常在赋予提高的非生物胁迫耐受性中是不成功的。玉米中通过常规育种的谷粒产量提高最近达到了一个平台期。玉米的收获指数，即，收获时产量生物量与总累积生物量的比例，在过去几百年的为谷粒产量的选择性育种过程中，基本保持不变。因此，最近在玉米中发生的产量提高是每单位耕地面积提高的总生物量产生的结果。通过提高种植密度获得了这种提高的总生物量，这导致了适应性的表型变化，如叶角的减小，这可以降低下部叶的遮挡，和雄花穗的大小，这可以提高收获指数。
当土壤水分耗尽时或者如果在干旱期间不能获得水，作物产量受到限制。如果叶的蒸腾作用超过来自根部的水分供应，将产生植物水分缺乏。可用的水供给涉及土壤中保持的水量和植物用其根系获得水的能力。水从叶的蒸腾作用与通过气孔的光合作用的二氧化碳固定相关。这两个过程正相关，使得通过光合作用的高二氧化碳流入与通过蒸腾作用的水分丢失密切相关。随着水从叶蒸腾出来，叶水的势能降低，气孔在水力过程中趋于闭合，限制光合作用的量。由于作物产量取决于光合作用中的二氧化碳固定，因此水吸收和蒸腾作用是作物产量的起作用的因素。能够使用较少的水来固定相同含量的二氧化碳或在较低水势能下能够正常作用的植物具有进行更多光合作用的潜能，并因此在许多农业***中具有产生更多生物量和经济产量的潜能。
农业生物技术已经在模式植物***、作物的温室研究和田间试验中使用了试验，以尽力研发呈现出提高产量的转基因植物，通过非生物胁迫耐受性提高或通过提高的生物量。例如，水利用率(WUE)是常常与干旱耐受性相关的参数。还利用了植物对干燥、渗透压休克和温度极值的应答的研究来确定植物对非生物胁迫的耐受性或抗性。
低水可用性下的生物量的增加可能是由于相对提高的生长效率或降低的水消耗引起的。在选择用于提高作物的性状时，水使用降低，而生长没有变化将在水输入成本高的灌溉农业***中具有特别的价值。不需要相应的水使用上涨的生长提高对于所有农业***具有适用性。在许多水供给不受限制的农业***中，生长提高，即使以水使用增加为代价也提高了产量。
农业生物技术还利用表示转基因对作物产量潜在影响的其他参数的测量。对于饲料作物，如苜蓿、青贮玉米和干草，植物生物量与总产量相关。然而，对于谷类作物，已经使用其他参数来估算产量，如植物大小，如通过总植物干重、地上部分干重、地上部分鲜重、叶面积、茎干材积、植物高度、莲座(rosette)直径、叶长、根长、根量、分蘖数和叶数所测量的。早期发育阶段的植物大小通常与发育后期的植物大小相关。具有较大叶面积的较大植物通常比较小的植物可以吸收更多的光和二氧化碳，因此将很可能在相同的时间段内获得较高的重量。对于植物大小和生长速率，存在强遗传成分，因此对于许多不同的基因型，一个环境条件下的植物大小很可能与另一个环境条件下的大小相关。这样，使用标准环境来模拟农田中的作物在不同的位置和时间遇到的不同的和动态的环境。
收获指数在许多环境条件下是相对稳定的，并且因此植物大小和谷物产量之间的牢固相关性是可能的。植物大小和谷物产量内在地相关，因为大部分谷物生物量取决于植物的叶和茎当前或存储的光合作用生产力。如同非生物胁迫耐受性一样，在生长室或温室中的标准化条件下，测量早期发育的植物的大小，是测量由转基因的存在赋予的潜在产量优势的标准实践方法。
植物不能移动寻找能量来源或避免捕食或胁迫。因此，植物已进化出多种生物化学途径和网络响应其环境以在不同环境条件下维持对发育中的植物的能量供给。在这些不良条件，例如干旱、极端温度和暴露于重金属下对植物的一大挑战是有些代谢产物是具有高度毒性的。在氧化胁迫的情况下，这些毒素包括超氧化物、过氧化物、羟基自由基的高度活性氧类别(ROS)，及其有机衍生物。ROS对有机分子例如非饱和脂类，核酸和蛋白质具有高度反应性。ROS从这些有机分子中提取氢，导致还原型氧(水或还原型有机产物)和第二种有机ROS的形成，这使链反应持续从而导致对细胞成分持续的破坏直到ROS被清除。ROS的清除涉及不属于ROS类别的无活性终产物的形成。已知多种氢供体作为ROS清除剂在植物细胞中发挥功能，包括生育酚、抗坏血酸盐、谷胱甘肽和硫氧还蛋白。这些不同的ROS清除剂都有2个共同的特征；它们的氧化形式对其他有机化合物无反应性，和所述氧化形式可被细胞中的代谢反应还原以在循环反应中重生清除剂的还原形式，通过从NAD(P)H处直接或间接获得还原当量。
在不良环境条件下，当作为代谢副产物形成的ROS的产生超过植物清除***将ROS净化为稳定的终产物的能力时出现氧化胁迫。为了应对氧化胁迫，植物细胞必须含有足够量的能够失活ROS的清除剂或酶。另外，细胞也需要足够的NAD(P)H形式的还原当量的供给，以重生活化形式的清除剂。如果这二者之一不足，则ROS的滴度增加，细胞遭受脂类、核酸或蛋白质的氧化损伤。在严重的情况下，损伤将导致细胞死亡，坏死和失去生产力。
在几乎所有的植物细胞区室中都检测到谷胱甘肽，例如细胞质、叶绿体、内质网、液泡和线粒体。谷胱甘肽是植物细胞中非蛋白质硫醇的主要来源；正是硫醇基的化学反应性使谷胱甘肽参与多种生物化学功能。谷胱甘肽是水溶性且稳定的，除了使ROS脱毒外，其也保护对抗其他胁迫例如重金属、有机化学品和病原体。可溶性酶，“经典”谷胱甘肽过氧化物酶将还原型单体谷胱甘肽和H2O2转化为其氧化形式，二硫化谷胱甘肽(GSSG)和H2O。细胞的细胞氧化还原平衡指示了GSH/GSSG比率，有研究表明其涉及ROS感知和信号传导。谷胱甘肽过氧化物酶的第二种形式磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)可能为膜相关的。PHGPx与不同的功能相关，例如信号传导和细胞分化，并可能与硫氧还蛋白途径有关。PHGPx也还原酯化在膜上的脂质氢过氧化物。因此，PHGPx与膜脂质过氧化的修复相关。
谷胱甘肽也参与谷胱甘肽化(glutathionylation)，谷胱甘肽化通过保护特定半胱氨酸残基免于不可逆的氧化来修饰蛋白质，由此调节某些蛋白质的活性。通过谷胱甘肽化使异柠檬酸裂合酶去活化。异柠檬酸裂合酶催化从异柠檬酸至琥珀酸和乙醛酸的形成，这是乙醛酸循环的一部分，其中将2分子的乙酰辅酶A转化为1个琥珀酸分子。
谷胱甘肽也可通过γγ-谷氨酰转肽酶的作用被降解，γ-谷氨酰转肽酶催化谷胱甘肽的γ-谷氨酰部分至受体的转移，所述接受体可为氨基酸、肽或水。基于和动物GGT的同源性，在拟南芥中已发现了4个基因：GGT1，GGT2，GGT3和GGT4。GGT1负责80-99％的活性，除了在种子中以外，在种子中GGT2负责50％的活性。GGT2和GGT4的敲除没有显示明显的表型，但GGT1敲除在开花后不久出现过早的莲座衰老。GGT3的敲除显示降低的长角果数和降低的种子产量。
当原子在其氧化态中通过电子转移反应经历变化时发生氧化-还原(氧化还原)反应。氧化描述了通过失去氢或得到氧获得氧化态的。还原描述了通过得到氢或失去氧失去氧化态。在生物学上，许多重要的能量储存或释放途径都涉及氧化还原反应。细胞呼吸作用将葡萄糖氧化为CO2，并将O2还原为水。在光合作用中，在光***II中CO2被还原为糖，H2O被氧化为O2。在光***I中，电子梯度将辅因子NAD+还原为NADH。质子梯度产生，驱动ATP的合成，如在呼吸链中所发生的，其泵出H+；H+转运ATP合酶与H+摄取偶联以合成ATP。在非光合作用生物例如大肠杆菌中，氧化还原作用可交换电子并利用氢作为能量来源从而允许厌氧生长，这需要氢化酶的作用。
细胞的氧化还原态主要反映为NAD+/NADH或NADP+/NADPH的比率。此平衡反映在代谢物例如丙酮酸和乳酸的量中。植物生长需要碳、ATP、NADH和NADPH的供给。这些需要通过糖酵解和磷酸戊糖途径得到满足，上述途径提供了重生NADPH的氧化途径、以及从代谢中的遇到的己糖产生核糖和其他戊糖的非氧化途径。转醛酶是在非氧化磷酸戊糖途径中的酶，其催化三碳酮醇单元从景天庚酮糖-7-磷酸至甘油醛-3-磷酸以形成赤藓糖-4-磷酸和果糖-6-磷酸的可逆转移。转醛酶和转酮酶一起提供了糖酵解和磷酸戊糖途径之间的连接。
半乳糖代谢构成了细胞代谢中的一部分，其为果糖和甘露糖代谢、核苷酸糖代谢和糖酵解提供葡萄糖。半乳糖至葡萄糖-1-磷酸的转化需要3种酶通过Leloir途径的作用：半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶和UDP-半乳糖4-差向异构酶。途径的第一步中，半乳糖激酶使用ATP特异性磷酸化半乳糖以形成半乳糖-1-磷酸。
尽管在植物中已表征了一些涉及胁迫应答，水利用和/或生物量的基因，但迄今为止，培育具有提高产量的转基因作物的成就仍有限，并且这样的植物没有商业化。因此需要鉴定具有提高作物产量的能力的其他基因。
发明概述
本发明的发明人已发现改变植物中与ROS清除***相关的基因表达可提高植物产量。当如本文描述的靶向时，表1中所列的多核苷酸和多肽能够提高转基因植物的产量。
表1
Figure BDA0000093683420000061
Figure BDA0000093683420000071
在一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；编码叶绿体转运肽的分离的多核苷酸；和分离的编码全长半乳糖激酶多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码全长转醛酶A多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码全长氢化酶-2辅助多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸，所述启动子能够提高叶中的基因表达；分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；和分离的编码全长异柠檬酸裂合酶多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码叶绿体转运肽的多核苷酸；分离的编码全长磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码全长γ-谷氨酰转肽酶多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；分离的编码全长ATP合酶亚基B’多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码叶绿体转运肽的多核苷酸；分离的编码全长C-22甾醇去饱和酶多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。
在进一步的实施方案中，本发明提供了由本发明的转基因植物产生的种子，其中种子对于包含上述表达载体的转基因是纯合的。源自本发明种子的植物显示了在正常和/或胁迫条件下，与植物的野生型品种相比，提高的对环境胁迫的耐受性，和/或提高的植物生长，和/或提高的产量。
在另一个方面中，本发明涉及通过本发明的转基因植物，它们的植物部分，或它们的种子产生的或来自其的产品，如食物、饲料、食品补充剂、饲料补充剂、纤维、化妆品或药物。
本发明进一步提供了表1中鉴定的特定的分离的多核苷酸，和表1中鉴定的特定的分离的多肽。本发明还包括包含本发明分离的多核苷酸的重组载体。
再另一个实施方案中，本发明涉及生产上述转基因植物的方法，其中该方法包括用包含本发明的分离的多核苷酸的表达载体转化植物细胞，并从植物细胞产生表达由多核苷酸编码的多肽的转基因植物。植物中多肽的表达导致在正常和/或胁迫条件下，与植物的野生型品种相比，提高的对环境胁迫的耐受性，和/或生长，和/或产量。
再另一个实施方案中，本发明提供了提高植物对环境胁迫的耐受性，和/或生长，和/或产量的方法。该方法包括以下步骤：用包含本发明的分离多核苷酸的表达盒转化植物细胞，并从植物细胞产生转基因植物，其中该转基因植物包含所述多核苷酸。
附图简述
图1显示了名为b0757(SEQ ID NO：2)，GM59594085(SEQ ID NO：4)，GM59708137(SEQ ID NO：6)和ZMBFb0152K10(SEQ ID NO：8)的半乳糖激酶的氨基酸序列的比对。使用Vector NTI的Align X生成比对。
图2显示了名为b2464(SEQ ID NO：10)，BN43182918(SEQ ID NO：12)和GM48926546(SEQ ID NO：14)的转醛酶A蛋白的氨基酸序列的比对。使用Vector NTI的Align X生成比对。
图3显示了名为YIR037W(SEQ ID NO：20)，BN42261838(SEQ ID NO：22)，BN43722096(SEQ ID NO：24)，BN51407729(SEQ ID NO：26)，GM50585691(SEQ ID NO：28)，GMsa56c07(SEQ ID NO：30)，GMsp82f11(SEQID NO：32)，GMs s66f03(SEQ ID NO：34)，HA03MC1446(SEQ ID NO：36)，HV03MC9784(SEQ ID NO：38)，OS34914218(SEQ ID NO：40)，ZM61990487(SEQ ID NO：42)和ZM68466470.r01(SEQ ID NO：44)的磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶的氨基酸序列的比对。使用Vector NTI的Align X生成比对。
图4显示了名为SLL1323(SEQ ID NO：48)和Gmsb 38b04(SEQ ID NO：50)的ATP合酶亚基B’蛋白质的氨基酸序列的比对。使用Vector NTI的Align X生成比对。
图5显示了名为YMR015C(SEQ ID NO：52)和GMso65h07(SEQ ID NO：54)的C-22甾醇去饱和酶的氨基酸序列的比对。使用Vector NTI的AlignX生成比对。
优选实施方案的详述
贯穿该申请，参考了各种出版物。所有这些出版物和这些出版物中引用的那些参考文献的公开内容在此全部引入本申请中作为参考，以更全面地描述本发明所述领域的状况。在此所用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，并且没有打算限制。如在此所用的，“一个(a)”或“一个(an)”可以表示一个或多个，这将取决于使用其的内容。因此，例如，提及“一个细胞(a cell)”可以表示可以使用至少一个细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了在此所述的亚细胞区室和组织中过表达表1中所示的分离的多核苷酸的转基因植物。本发明的转基因植物显示了与植物的野生型品种相比提高的产量。如在此所用的，术语“提高的产量”意思是任何测量的植物产品(如籽粒、果实或纤维)产量的任何提高。根据本发明，不同表型性状的变化可以提高产量。例如(但并非限制)，如花器官发育、发根、根生物量、种子数、种子重量、收获指数、对非生物环境胁迫的耐受性、叶形成、趋光性、顶端优势和果实发育这样的参数，都是提高产量的合适测量值。产量的任何提高是根据本发明的提高的产量。例如，产量的提高可以包含任何测量参数的0.1％、0.5％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的增加。例如，与来自在相同条件下栽培的未处理大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量相比，源自包含其对于表1的核苷酸和多肽是转基因的植物的作物的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量的增加，是根据本发明的提高的产量。
如在此限定的，“转基因植物”是使用重组DNA技术已经改变了从而含有否则不存在于植物中的分离的核酸的植物。如在此所用的，术语“植物”包括完整的植物、植物细胞和植物部分。植物部分包括，但不限于，茎、根、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子等。本发明的转基因植物可以是雄性不育或雄性可育，并且可以进一步包括其他不是包含在此所述的分离的多核苷酸的那些转基因。
如在此所用的，术语“品种”指的是物种内的一组享有共同特征的植物，这些共同特征将它们与典型形式和该物种内其他可能的品种分离出来。尽管具有至少一种区别性状，品种的特征还在于品种内的个体之间的一些变化，这主要是基于成功传代的后代中性状的孟德尔分离。如果遗传上性状的纯合子至如下程度：当纯合的品种自体授粉时，没有观察到后代中该性状明显数量的独立分离(independent segregation)，则认为品种对于该特定的性状是“纯合的”。在本发明中，性状起源于引入植物品种中的一个或多个分离多核苷酸的转基因表达。如还是在此使用的，术语“野生型品种”指的是作为对照植物为了比较目的而分析的一组植物，其中野生型品种植物与转基因植物(用根据本发明的分离的多核苷酸转化的植物)相同，除了野生型品种植物没有用本发明的分离的多核苷酸转化。如在此所用的术语“野生型”指的是未用根据本发明的分离的多核苷酸在遗传上改变了的植物细胞、种子、植物成分、植物组织、植物器官或完整的植物。
如在此所用的术语“对照植物”指的是为了鉴定转基因或遗传改变的植物中增强的表型或所需的性状的目的，用于相对转基因或遗传改变的植物进行比较的植物细胞、外植体、种子、植物成分、植物组织、植物器官或完整的植物。在一些情况中，“对照植物”可以是包含空载体或标记基因的转基因植物系，但不含有存在于待评价的转基因或遗传改变的植物中的目标重组多核苷酸。对照植物可以是与待检测的转基因或遗传改变的植物相同的种系或品种的植物，或可以是另一个种系或品种，如已知具有特定表型、特征或已知基因型的植物。合适的对照植物将包括用于产生在此的转基因植物的亲本品系的遗传未改变的或非转基因的植物。
如在此限定的，术语“核酸”和“多核苷酸”是可以互换的，并且指直链或支链、单链或双链的RNA或DNA，或其杂化物。术语还包括RNA/DNA杂化物。“分离的”核酸分子是与核酸的天然来源中存在的其他核酸分子(即，编码其他多肽的序列)基本上分离的核酸分子。例如，认为克隆的核酸是分离的。如果已经通过人为干预进行了改变，或置于不是天然位点的基因座或位置，或通过转化将其引入细胞中，也认为核酸是分离的。此外，分离的核酸分子(如cDNA分子)可以没有一些与其天然相连的其他细胞材料，或通过重组技术生产时的培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学品。尽管可以任选包括位于基因编码区的3’和5’端的未翻译序列，但优选除去天然产生的复制子中编码区两侧的天然序列。
如在此所用的，术语“环境胁迫”指的是与盐度、干旱、氮、温度、金属、化学品、致病的或氧化胁迫，或其任意组合相关的非最佳条件。如在此所用的，术语“干旱”指的是其中可用于支持植物生长或发育的水量低于最佳水量的环境条件。如在此所用的，术语“鲜重”指的是植物中所有物质，包括水。如在此所用的，术语“干重”指的是植物中除了水以外的所有物质，并且包括，例如，碳水化合物、蛋白质、油和矿物质营养素。
任何植物物种可以转化形成根据本发明的转基因植物。本发明的转基因植物可以是双子叶植物或单子叶植物。例如但并非限制，本发明的转基因植物可以源自以下双子叶植物科的任何一种：豆科，包括如豌豆、苜蓿和大豆这样的植物；伞形科，包括如胡萝卜和芹菜这样的植物；茄科，包括如西红柿、马铃薯、茄子、烟草和胡椒这样的植物；十字花科，特别是芸苔属，其包括如油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜和嫩茎花椰菜这样的植物；和拟南芥；菊科，其包括如莴苣这样的植物；锦葵科，其包括棉花；豆科，其包括花生等这样的植物。本发明的转基因植物可以源自单子叶植物，如，例如，小麦、大麦、高粱、黍、黑麦、小黑麦(triticale)、玉米、稻、燕麦和甘蔗。本发明的转基因植物还具体表现为树，如苹果、梨、温柏(quince)、李、樱桃、桃、油桃、杏、番木瓜、芒果和其他木本品种，包括松柏类和落叶类树木，如杨、松、红杉、雪松、橡树等。尤其优选的是拟南芥(A.thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、稻、油菜、卡诺拉(canola)、大豆、玉米(corn)(玉米(maize))、棉花和小麦。
在一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码叶绿体转运肽的多核苷酸；和分离的编码全长半乳糖激酶多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。如在以下实施例2中证明的，含有靶向叶绿体的大肠杆菌基因b0757(SEQ ID NO：1)的转基因拟南芥植物与对照拟南芥植物相比证明了提高的产量。b0757基因编码半乳糖激酶并以存在特征序列GHMP_激酶_C(Pfam：PF08544)和GHMP_激酶_N(PF00288)为部分特征。在图1中所列的半乳糖激酶蛋白质中举例说明了这样的特征序列。
此实施方案的转基因植物可能包含编码半乳糖激酶多肽的任意多核苷酸。优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有半乳糖激酶活性的全长多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含选自GHMP_激酶_C和GHMP_激酶_N特征序列二者中的至少一个特征序列，其中GHMP_激酶_C特征序列选自SEQID NO：2的第278至362位氨基酸；SEQ ID NO：4的第378至426位氨基酸；SEQ ID NO：6的第326至404位氨基酸；和SEQ ID NO：8的第391至473位氨基酸；和其中GHMP_激酶_N特征序列选自SEQ ID NO：2的第114至182位氨基酸；SEQ ID NO：4的第152至219位氨基酸；SEQ ID NO：6的第138至205位氨基酸；和SEQ ID NO：8的第159至226位氨基酸。优选地所述多肽包含GHMP_激酶_C特征序列和GHMP_激酶_N特征序列二者。最优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有选自SEQ ID NO：2的第1至382位氨基酸；SEQ ID NO：4的第1至460位氨基酸；SEQ ID NO：6的第1至431位氨基酸；和SEQ ID NO：8的第1至504位氨基酸的序列的半乳糖激酶多肽的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码全长转醛酶A多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。如在以下实施例2中证明的，含有编码转醛酶A多肽的大肠杆菌基因b2464(SEQ ID NO：9)的转基因拟南芥植物和此实施方案的转基因植物与对照拟南芥植物相比证明了提高的产量。转醛酶A多肽以存在转醛酶(PF00923)特征序列为部分特征。在图2中所列的转醛酶A蛋白质中举例说明了这样的特征序列。
此实施方案的转基因植物可能包含编码转醛酶A蛋白质的任意多核苷酸。优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有转醛酶A活性的全长多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO：10的第12至312位氨基酸；SEQ ID NO：12的第1至275位氨基酸；和SEQ ID NO：14的第1至277位氨基酸的转醛酶特征序列。最优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有选自SEQ ID NO：10的第1至316位氨基酸；SEQ ID NO：12的第1至284位氨基酸；和SEQ ID NO：14的第1至283位氨基酸的序列的转醛酶A多肽的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码全长氢化酶-2辅助多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。如在以下实施例2中证明的，含有大肠杆菌基因b2990(SEQ ID NO：15)的转基因拟南芥植物与对照拟南芥植物相比证明了提高的产量。B2990基因编码氢化酶-2辅助蛋白。在大肠杆菌中在厌氧条件下，此蛋白质为陪伴分子样蛋白质，其是产生活性氢化酶2所必需的，氢化酶2是[NiFe]摄取氢化酶，其与氢化酶1一起将H2氧化与还原延胡索酸相偶联。氢化酶-2辅助蛋白以存在HupF-HypC(PF01455)特征序列为部分特征。
此实施方案的转基因植物可包含编码氢化酶-2辅助蛋白的任意多核苷酸。优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有氢化酶组装陪伴分子活性的全长多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含SEQ ID NO：16的第1至79个氨基酸的HupF_HypC特征序列。最优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有包含SEQ ID NO：16的第1至82个氨基酸的序列的氢化酶-2辅助蛋白的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸，所述启动子能够提高叶中的基因表达；分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；和分离的编码全长异柠檬酸裂合酶多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。如在以下实施例2中证明的，与对照拟南芥植物相比，含有靶向线粒体的编码异柠檬酸裂合酶的酿酒酵母基因YER065C(SEQ ID NO：17)的转基因拟南芥植物证明了提高的产量。异柠檬酸裂合酶以存在ICL(PF00463)特征序列为部分特征。
此实施方案的转基因植物可能包含编码异柠檬酸裂合酶的任意多核苷酸。优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有异柠檬酸裂合酶活性的全长多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含含有SEQ ID NO：18的第22至550位氨基酸的ICL特征序列。最优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有包含SEQ ID NO：18的第1至557位氨基酸的序列的异柠檬酸裂合酶的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码叶绿体转运肽的多核苷酸；分离的编码全长磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。如在以下实施例2中证明的，含有靶向叶绿体的酿酒酵母基因YIR037W(SEQ ID NO：19)的转基因拟南芥植物与对照拟南芥植物相比证明了提高的产量。YIR037W基因编码磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶蛋白，其充当细胞内过氧化物水平的传感器，和氧化还原信号至转录因子Yap1的转导物，Yap1调节酿酒酵母中的过氧化物水平。磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶以存在代表谷胱甘肽过氧化物酶家族基因的GSHPx(PF00255)特征序列为部分特征。在图3中所列的磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶中举例说明了这样的特征序列。
此实施方案的转基因植物可能包含编码磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶的任意多核苷酸。优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶活性的全长多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO：20的第4至111位氨基酸；SEQ ID NO：22的第10至118位氨基酸；SEQ ID NO：24的第37至145位氨基酸；SEQ IDNO：26的第9至117位氨基酸；SEQ ID NO：28的第9至117位氨基酸；SEQID NO：30的第9至117位氨基酸；SEQ ID NO：32的第12至120位氨基酸；SEQ ID NO：34的第12至120位氨基酸；SEQ ID NO：36的第11至119位氨基酸；SEQ ID NO：38的第12至120位氨基酸；SEQ ID NO：40的第9至117位氨基酸；SEQ ID NO：42的第12至120位氨基酸；和SEQ IDNO：44的第24至132位氨基酸的GSHPx特征序列。最优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有选自SEQ ID NO：20的第1至163位氨基酸；SEQ ID NO：22的第1至169位氨基酸；SEQ ID NO：24的第1至201位氨基酸；SEQ ID NO：26的第1至169位氨基酸；SEQ ID NO：28的第1至166位氨基酸；SEQ ID NO：3的第1至166位氨基酸0；SEQ ID NO：32的第1至170位氨基酸；SEQ ID NO：34的第1至170位氨基酸；SEQ ID NO：36的第1至185位氨基酸；SEQ ID NO：38的第1至176位氨基酸；SEQ IDNO：40的第1至166位氨基酸；SEQ ID NO：42的第1至170位氨基酸；和SEQ ID NO：44的第1至182位氨基酸的序列的磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码全长γ-谷氨酰转肽酶多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。任选地，所述表达盒还包含分离的编码叶绿体转运肽的多核苷酸，其与分离的编码启动子的多核苷酸和分离的编码全长γ-谷氨酰转肽酶多肽的多核苷酸有效相连。如在以下实施例2中证明的，含有编码γ-谷氨酰转肽酶多肽的集胞藻属基因slr1269(SEQ ID NO：45)的转基因拟南芥植物与对照拟南芥植物相比证明了提高的产量。γ-谷氨酰转肽酶以存在G_glu_transpept(PF01019)特征序列为部分特征。
此实施方案的转基因植物可能包含编码γ-谷氨酰转肽酶的任意多核苷酸。优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有γ-谷氨酰转肽酶活性的全长多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含含有SEQ ID NO：46的第21至511位氨基酸的G_glu_transpept特征序列。最优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有包含SEQ ID NO：46的第1至518位氨基酸的序列的γ-谷氨酰转肽酶的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；分离的编码全长ATP合酶亚基B’多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。如在以下实施例2中证明的，含有靶向线粒体的集胞藻属基因SLL1323(SEQ ID NO：47)的转基因拟南芥植物与对照拟南芥植物相比证明了提高的产量。SLL1323基因编码ATP合酶亚基B’蛋白。亚基B和B’来自在叶绿体中和在细菌质膜中发现的F-ATP酶中的F0复合物，并组成将F1和F0复合物连接在一起的外周轴(peripheral stalk)的一部分。ATP合酶亚基B’蛋白以存在代表ATP合酶B/B’CF(0)家族基因的ATP-synt_B(PF00430)特征序列为部分特征。在图4列出的ATP合酶亚基B’蛋白示例了这样的特征序列。
此实施方案的转基因植物可能包含编码ATP合酶亚基B’蛋白的任意多核苷酸。优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有ATP合酶亚基B’活性的全长多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO：48的第7至138位氨基酸和SEQ ID NO：50的第82至213位氨基酸的ATP-synt_B特征序列。最优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有包含SEQ ID NO：48的第1至143位氨基酸和SEQ ID NO：50的第1至215位氨基酸的序列的ATP合酶亚基B’蛋白的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码叶绿体转运肽的多核苷酸；分离的编码全长C-22甾醇去饱和酶多肽的多核苷酸；其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。基因YMR015C(SEQ ID NO：51)编码C-22甾醇去饱和酶，这是一种细胞色素P450酶(ERG5)，在酵母中催化麦角甾醇生物合成中甾醇侧链中的C-22(23)双键的形成。C-22甾醇去饱和酶以靠近C-端的原卟啉IX亚铁血红素半胱氨酸配体周围的K-螺旋基序(xExxR)，PERF共有序列(PxRx)和FGRCG基序的存在为部分特征。在图5中列出的C-22甾醇去饱和酶多肽中举例说明了这样的保守基序。
此实施方案的转基因植物可能包含编码C-22甾醇去饱和酶的任意多核苷酸。优选地，此实施方案的转基因植物包含编码具有C-22甾醇去饱和酶活性的全长多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含含有K-螺旋基序、PERF共有序列和FGRCG基序的结构域，其中K-螺旋基序具有选自SEQ ID NO：52的第395至398位氨基酸和SEQ ID NO：54的第365至368位氨基酸的序列；PERF基序具有选自SEQ ID NO：52的第450至453位氨基酸和SEQ IDNO：54的第418至421位氨基酸的序列；和FGRCG基序具有选自SEQ ID NO：52的第469至478位氨基酸和SEQ ID NO：54的第438至447位氨基酸的序列。更优选地，所述多核苷酸编码具有C-22甾醇去饱和酶活性的全长多肽，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO：52的第61至529位氨基酸和SEQ ID NO：54的第27至498位氨基酸的结构域。最优选地，此实施方案的转基因植物包含编码C-22甾醇去饱和酶的多核苷酸，所述C-22甾醇去饱和酶包含SEQ ID NO：52的第1至538位氨基酸和SEQ ID NO：54的第1至513位氨基酸。
本发明进一步提供了对于在此所述的表达盒(在此也称为“转基因”)是纯合的种子，其中从所述种子种植得到的转基因植物与野生型品种的植物相比显示了提高的产量。本发明还提供了由表达多核苷酸的转基因植物、其植物部分或其种子产生的或从表达多核苷酸的转基因植物、其植物部分或其种子产生的产物。可以使用本领域公知的各种方法来获得产物。如在此所用的，词语“产物”包括，但不限于，食物、饲料、食品补充剂、饲料补充剂、纤维、化妆品或药物。将食物认为是用于提供营养或用于补充营养的组合物。特别地，将动物饲料和动物饲料补充剂认为是食物。本发明进一步提供了通过任一种转基因植物、植物部分和植物种子产生的农产品。农产品包括，但不限于，植物提取物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂肪、油、聚合物、维生素等。
本发明还提供了分离的多核苷酸，其具有选自SEQ ID NO：3；SEQ IDNO：5；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：29；SEQ IDNO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：49；和SEQ ID NO：53的序列。本发明分离的多核苷酸还包括编码多肽的分离多核苷酸，多肽具有选自SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：12；SEQ IDNO：14；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：36；SEQ IDNO：38；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：42；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：50；和SEQ ID NO：54的氨基酸序列。可以使用标准分子生物技术和在此提供的序列信息，例如，使用自动化DNA合成仪，来分离本发明的多核苷酸。
本发明的分离的多核苷酸包括表1的多核苷酸的同系物。在此将“同系物”限定为各自具有相似的或基本上相同的核苷酸或氨基酸序列的两个核酸或多肽。同系物包括等位基因变体、类似物或直向同源物，如以下限定的。如在此所用的，术语“类似物”指的是具有相同或相似功能的两个核酸，但已经在不相关的生物体中分开进化。如在此所用的，术语“直向同源物”指的是来自不同物种的两个核酸，但已经通过物种形成从共有的祖先基因进化而来。术语同系物进一步包括不同于表1中显示的核苷酸序列之一但由于遗传密码简并性而因此编码相同多肽的核酸分子。
为了测定两个氨基酸序列(例如，表1的核苷酸序列之一及其同系物)百分比序列同一性，为了最佳比较目的比对了序列(例如，可以将缺口引入一个多肽的序列中，用于与其他多肽或核酸的最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸残基。当一个序列中的位置由另一个序列中相应位置的相同氨基酸占据时，则分子在该位置是相同的。可以在两个核酸序列之间进行相同类型的比较。
优选，分离的氨基酸同系物、类似物和直向同源物与表1中鉴定的整条氨基酸序列具有至少约50-60％，优选至少约60-70％，更优选至少约70-75％，75-80％，80-85％，85-90％或90-95％，最优选至少约96％，97％，98％，99％或更高同一性。在另一个优选实施方案中，本发明的分离的核酸同系物包含与表1中显示的核苷酸序列具有至少约40-60％，优选至少约60-70％，更优选至少约70-75％，75-80％，80-85％，85-90％或90-95％，甚至更优选至少约95％，96％，97％，98％，99％或更高同一性的核苷酸序列。
对于本发明的目的，使用Align 2.0(Myer s和Miller，CABIOS(1989)4：11-17)使用缺省情况的所有参数设定，或Vector NTI 9.0(PC)软件包(Introgen，1600 Faraday Ave.，Carl sbad，CA92008)测定了两个核酸或多肽序列之间的百分比序列同一性。对于用Vector NTI计算的百分比同一性，使用15的缺口开放惩罚和6.66的缺口延伸惩罚，测定两个核酸的百分比同一性。使用10的缺口开放惩罚和0.1的缺口延伸惩罚，用于测定两个多肽的百分比同一性。所有其他参数设定为缺省设定。对于多个比对的目的(Clustal W算法)，缺口开放惩罚为10，并且缺口延伸惩罚为0.05，使用blosum62矩阵。应理解当DNA序列与RNA序列相比较时，为了测定序列同一性的目的，胸腺嘧啶核苷酸与尿嘧啶核苷酸是等价的。
可以基于它们与所述多肽的同一性，使用编码各自多肽的或基于其的引物的多核苷酸，作为根据标准杂交技术在严谨杂交条件下的杂交探针，来分离对应于表1中所列的多肽的同系物、类似物和直向同源物的核酸分子。如在此所用的，对于DNA与DNA印迹的杂交，术语“严谨条件”指的是在10×Denhart’s溶液，6×SSC，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑鱼***DNA中杂交过夜。将印迹按序在62℃下洗涤30分钟，每次在3×SSC/0.1％SDS中，接着1×SSC/0.1％SDS，并且最后0.1×SSC/0.1％SDS。在优选实施方案中，如在此还使用的，短语“严谨条件”指的是在65℃下在6×SSC溶液中杂交。在另一个实施方案中，“高严谨条件”指的是在10×Denhart’s溶液，6×SSC，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑鱼***DNA中杂交过夜。将印迹按序在65℃下洗涤30分钟，每次在3×SSC/0.1％SDS中，接着1×SSC/0.1％SDS，并且最后0.1×SSC/0.1％SDS。用于进行核酸杂交的方法是本领域公知的。
可以优化本发明中所用的分离的多核苷酸，即，遗传工程化来提高其在给定的植物或动物中的表达。为了提供植物优化的核酸，可以将基因的DNA序列改变成：1)包含由高表达的植物基因优选的密码子；2)包含基本上在植物中发现的核苷酸碱基组成的A+T含量；3)形成植物起始序列；4)消除引起RNA不稳定、不适当的多腺苷酸化、降解和终止的序列，或形成二级发夹结构或RNA剪接位点的序列；或5)消除反义开放阅读框。可以通过利用一般植物或特定植物中的密码子使用分布频率来实现植物中提高的核酸表达。优化植物中核酸表达的方法可以在EPA0359472；EPA0385962；PCT申请No.WO91/16432；U.S.专利No.5,380,831；U.S.专利No.5,436,391；Perlack等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.；USA88：3324-3328；和Murray等，1989，Nucleic Acids Res.17：477-498。
本发明还提供了重组表达载体，其包含选自下述的表达盒：a)表达盒，其包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码叶绿体转运肽的多核苷酸；和分离的编码全长半乳糖激酶多肽的多核苷酸；b)表达盒，其包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；和分离的编码全长转醛酶A多肽的多核苷酸；c)表达盒，其包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；和分离的编码全长氢化酶2辅助多肽的多核苷酸；d)表达盒，其包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；和分离的编码全长异柠檬酸裂合酶多肽的多核苷酸；e)表达盒，其包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码叶绿体转运肽的多核苷酸；和分离的编码全长磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶多肽的多核苷酸；f)表达盒，其包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；和分离的编码全长γ-谷氨酰转肽酶多肽的多核苷酸；g)表达盒，其包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；和分离的编码全长ATP合酶亚基B’多肽的多核苷酸；和h)表达盒，其包含有效地相连的分离的编码启动子的多核苷酸；分离的编码叶绿体转运肽的多核苷酸；和分离的编码全长C-22甾醇去饱和酶多肽的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明的重组表达载体包含分离的多核苷酸，其具有选自SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：25；SEQ IDNO：27；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：43；SEQ IDNO：49；和SEQ ID NO：53的序列。另外，本发明的重组表达载体包含分离的多核苷酸，其编码具有选自SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQID NO：26；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：42；SEQID NO：44；SEQ ID NO：50；和SEQ ID NO：54的氨基酸序列的多肽。
本发明的重组表达载体也包括一个或多个调控序列，基于用于表达的宿主细胞来选择，其与分离的待表达的多核苷酸有效地相连。如在此所用的，关于重组表达载体，“有效地连接”或“有效地相连”意思是目标多核苷酸以载体引入宿主细胞(例如，细菌或植物宿主细胞)时允许该目标多核苷酸表达的方式与调控序列相连。术语“调控序列”用来包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。
如上所示，本发明的特定实施方案使用能够增强叶中的基因表达的启动子。在一些实施方案中，启动子是叶特异性启动子。在本发明的这些实施方案中，可以使用任何叶特异性启动子。许多这样的启动子是已知的，例如，来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Baeumlein等，(1991)，Mol.Gen.Genet.225，459-67)，光诱导型基因如核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶的启动子(rbcS启动子)，编码叶绿素a/b-结合蛋白(Cab)、核酮糖激活酶、来自拟南芥的叶绿体甘油醛3-磷酸脱氢酶的B-亚基的基因的启动子(Kwon等，(1994)，Plant Physiol.105，357-67)和其他叶特异性启动子，如Aleman，I.中鉴定的那些，(2001)，Isolation andcharacterization of leaf-specific promoters from alfalfa(Medicagosativa)，Master thesis，New Mexico State University，Los Cruces，NM。
在本发明的其他实施方案中，使用了根或苗特异性启动子。例如，超级启动子提供了根和苗中的高水平表达(Ni等，(1995)，Plant J.7：661-676)。其他根特异性启动子包括，但不限于，TobRB7启动子(Yamamoto等，(1991)，Plant Cell 3，371-382)，rolD启动子(Leach等，(1991)，Plant Science 79，69-76)；CaMV 35S结构域A(Benfey等，(1989)，Science 244，174-181)等。
在其他实施方案中，使用了组成型启动子。组成型启动子在大部分条件下是有活性的。适用于这些实施方案中的组成型启动子的实例包括WO2003/102198中所述的欧芹泛素启动子、CaMV 19S和35S启动子、sX CaMV35S启动子、Sep1启动子、稻肌动蛋白启动子、拟南芥肌动蛋白启动子、玉米泛素启动子、pEmu、玄参花叶病毒35S启动子、Smas启动子、超级启动子(U.S.专利No.5,955,646)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(U.S.专利No.5,683,439)、来自农杆菌属的T-DNA的启动子，如甘露氨酸合酶、胭脂碱合酶和章鱼碱合酶，二磷酸核酮糖羧化酶的小亚基(ssuRUBISCO)启动子等。
依照本发明，叶绿体转运序列指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。叶绿体转运肽的实例包括叶绿素a/b结合蛋白转运肽，核酮糖二磷酸羧化酶转运肽小亚基，EPSPS转运肽和二氢吡啶二羧酸合酶转运肽。如此处定义的，线粒体转运序列指编码线粒体前序列并引导蛋白质至线粒体的核苷酸序列。线粒体前序列的实例包括ATP酶亚基，ATP合酶亚基，Rieske-FeS蛋白，Hsp60，苹果酸脱氢酶，柠檬酸合酶，顺乌头酸酶，异柠檬酸脱氢酶，丙酮酸脱氢酶，苹果酸酶，甘氨酸脱羧酶，丝氨酸羟甲基转移酶和超氧化物歧化酶。
这样的转运肽是本领域已知的。见，例如Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。叶绿体靶向序列是本领域已知的并包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell等人(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-(enolpyruvyl)shikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS)(Archer等人(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao等人(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；和捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。又见Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。
在本发明的优选实施方案中，表1中所列的多核苷酸在来自高等植物(例如，种子植物，如作物)的植物细胞中表达。可以通过任何方式，包括转染、转化或转导、电穿孔、颗粒轰击、农杆菌感染法等，将多核苷酸“引入”植物细胞中。例如，使用U.S.专利No.4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,302,523；5,464,765；5,120,657；6,084,154等中所列的颗粒轰击，公开了转化或转染植物细胞的合适方法。更优选，按照U.S.专利No.5,591,616；5,731,179；5,981,840；5,990,387；6,162,965；6,420,630，U.S.专利申请公开号2002/0104132等中所述的，使用土壤杆菌转化形成了本发明的转基因玉米种子。可以使用例如欧洲专利No.EP0424047，U.S.专利No.5,322,783，欧洲专利No.EP0397687，U.S.专利No.5,376,543或U.S.专利No.5,169,770中描述的任一种技术来进行大豆的转化。小麦转化的特定实例可以在PCT申请No.WO93/07256中找到。可以使用U.S.专利No.5,004,863；5,159,135；5,846,797等中公开的方法来转化棉花。可以使用U.S.专利No.4,666,844；5,350,688；6,153,813；6,333,449；6,288,312；6,365,807；6,329,571等中公开的方法来转化稻。例如，使用如U.S.专利No.5,188,958；5,463,174；5,750,871；EP1566443；WO02/00900等中公开的那些方法来转化卡诺拉。其他植物转化方法公开于，例如，U.S.专利No.5,932,782；6,153,811；6,140,553；5,969,213；6,020,539等。根据本发明可以使用适用于将转基因***特定植物的任何植物转化方法。
根据本发明，如果并入非染色体自主复制子或整合至植物染色体中，则可以将引入的多核苷酸稳定地维持于植物细胞中。或者，引入的多核苷酸可以存在于染色体外的非复制载体上并可以短暂表达或是短暂有活性。
本发明还体现为生产包含表1中所列的至少一个多核苷酸的转基因植物的方法，其中植物中多核苷酸的表达导致与植物的野生型品种相比，植物在正常或缺水条件下提高的生长和/或产量和/或提高的对环境胁迫的耐受性，该方法包括步骤：(a)将以上所述的表达盒引入植物细胞中，(b)从转化的植物细胞再生转基因植物；并且从再生的植物细胞中选择产量较高的植物。植物细胞可以是，但不限于，原生质体、配子产生细胞和再生成完整植物的细胞。如在此所用的，术语“转基因”指的是含有上述表达盒的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。根据本发明，表达盒稳定地整合至染色体中或稳定的染色体外元件中，使其可以成功传代。
可以通过在正常和/或不太合适的条件下种植修饰的植物，并分析植物的生长特征和/或代谢来评估遗传修饰对植物生长和/或产量和/或胁迫耐受性的作用。这样的分析技术是本领域技术人员公知的，并且包括干重、湿重、种子重量、种子数量、多肽合成、碳水化合物合成、脂质合成、蒸发蒸腾率、一般植物和/或作物产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸率、光合作用率、代谢物组成等的测量。
通过以下实施例来进一步说明本发明，这些实施例没有解释为以任何方式强加限制于本发明的范围。
实施例1
基因的表征
使用标准重组技术克隆带头(lead)基因b0757(SEQ ID NO：1)，b2464(SEQ ID NO：9)，b2990(SEQ ID NO：15)，SLL1323(SEQ ID NO：47)，slr1269(SEQ ID NO：45)，YER065C(SEQ ID NO：17)，YIR037W(SEQ ID NO：19)，和YMR015C(SEQ ID NO：51)。通过比较基因和其他已知功能基因所编码的氨基酸序列预测每个带头基因的功能。使用已知方法从各自物种的专有文库中分离同系物cDNA。使用生物信息学分析处理和注释序列。
来自大肠杆菌的b0757基因(SEQ ID NO：1)编码半乳糖激酶。将b0757的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：2)对专有cDNA数据库以e-10的e值进行BLAST比对(Altschul等人，见上)。鉴定出来自大豆的2个同系物和来自玉米的一个同系物。在图1中显示的比对中指示了这些序列的氨基酸相关性。
来自大肠杆菌的b2464基因(SEQ ID NO：9)编码转醛酶A。将b2464的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：10)对专有cDNA数据库以e-10的e值进行BLAST比对(Altschul等人，见上)。鉴定出来自卡诺拉的1个同系物和来自大豆的一个同系物。在图2中显示的比对中指示了这些序列的氨基酸相关性。
来自酿酒酵母的YIR037W基因(SEQ ID NO：19)编码磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶。将YIR037W的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：20)对专有cDNA数据库以e-10的e值进行BLAST比对(Altschul等人，见上)。鉴定出来自卡诺拉的3个同系物，来自大豆的4个同系物，来自向日葵的1个同系物，来自大麦的1个同系物，来自稻的1个同系物和来自玉米的2个同系物。在图3中显示的比对中指示了这些序列的氨基酸相关性。
来自集胞藻属的SLL1323基因(SEQ ID NO：47)编码ATP合酶亚基B’。将SLL1323的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：48)对专有cDNA数据库以e-10的e值进行BLAST比对(Altschul等人，见上)。鉴定出来自大豆的1个同系物。在图4中显示的比对中指示了这些序列的氨基酸相关性。
来自酿酒酵母的YMR015C基因(SEQ ID NO：51)编码C-22甾醇去饱和酶。将YMR015C的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：52)对专有cDNA数据库以e-10的e值进行BLAST比对(Altschul等人，见上)。鉴定出来自大豆的1个同系物。在图5中显示的比对中指示了这些序列的氨基酸相关性。
实施例2
带头基因在植物中的过表达
使用已知方法将表1的多核苷酸连接至表达盒。使用了3种不同的启动子控制转基因在拟南芥中的表达：来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(“USP”)(SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62)；超级启动子(“超级”；SEQ ID NO：63)；和欧芹泛素启动子(“PCUbi”；SEQ ID NO：64)。为了靶向表达，使用线粒体转运肽(SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：58；在表2-9中称为“线粒体”)或叶绿体转运肽(SEQ ID NO：60；在表2-10中称为“质体”)。
使用已知方法用包含实施例1中描述的带头基因的构建体转化拟南芥生态型C24。基于驱动表达的启动子、基因来源物种和靶向类型(叶绿体、线粒体或无靶向)合并T2转化植物的种子。将种子库用于在充分灌溉的和水限制的生长条件下的生物量初次筛选。从种子库中选择在初次筛选中的击中，进行分子分析并收集种子。然后将收集的种子用于在第二次筛选中的分析，其中分析了每个转基因事件的更多个体。如果来自构建体的植物在第二次筛选中被鉴定为与对照相比具有提高的生物量，则其进入第三次筛选。在此筛选中，在充分灌溉和干旱的生长条件下测量来自该构建体的所有转基因事件的超过100株植物。使用标准统计学程序将来自转基因植物的数据与野生型拟南芥植物或从随机选择的转基因拟南芥种子库生长的植物相比较。
在充分灌溉条件下培养的植物每周2次接受灌溉至土壤饱和。使用商业成像***在第17和21天获取转基因植物的图像。或者，在水受限的生长条件下培养植物，通过很少灌溉至土壤饱和，这使土壤在灌溉处理之间变得干燥。在这些实验中，在播种后第0、8和19天灌溉。使用商业成像***在第20和27天获取转基因植物的图像。
使用图像分析软件来比较在相同实验中生长的转基因植物和对照植物的图像。使用图像的像素测定植物的相对大小或生物量，使用深绿色比总面积的比例测定植物的颜色。后一个比例被称为健康指数，其是叶中叶绿素相对量的度量，并因此是叶衰老或黄化的相对量的度量，且仅在第27天时记录。在含有不同带头基因的转基因植物中存在变化，这是由于DNA***的不同位点和其他影响基因表达水平和模式的因素。为了显示此效应数据表指示了有关性状的阳性和阴性植物的数目。
表2至9显示了拟南芥植物测量值的比较。“CD”指示植物在周期干旱条件下生长；“WW”指示充分灌溉的条件。缩写后的数字指示在相同条件下的多次独立实验。百分比差异指示相对于对照植物的转基因的测量，以对照非转基因植物的百分比表示；p-值是转基因和对照植物之间差异的统计学显著性，基于所有独立事件的T-检验比较，其中NS表示在5％的概率水平下，没有显著性。事件数指示在实验中检测的独立转基因事件总数；阳性事件数指示在实验中比对照大的独立转基因事件总数；阴性事件数指示在实验中比对照小的独立转基因事件总数。
A.半乳糖激酶
在拟南芥中表达处于超级启动子控制下并靶向叶绿体的半乳糖激酶基因b0757(SEQ ID NO：1)。表2列出了在充分灌溉和周期干旱条件下检测的用这些构建体转化的拟南芥植物得到的生物量和健康指数。
表2
Figure BDA0000093683420000281
Figure BDA0000093683420000291
表2显示表达靶向叶绿体的b0757基因的拟南芥植物导致在水受限条件下更大的植物，但在充分灌溉条件下不导致。在这些实验中，表达b0757基因的所有独立转基因事件都比对照大，指示对胁迫环境的更好适应。
B.转醛酶A
在拟南芥中表达处于USP或超级启动子控制下的没有亚细胞靶向的转醛酶A基因b2464(SEQ ID NO：9)。表3列出了在充分灌溉和周期干旱条件下检测的用这些构建体转化的拟南芥植物得到的生物量和健康指数。
表3
Figure BDA0000093683420000292
表3显示在水受限条件下，表达处于超级启动子控制下的b2464基因的拟南芥植物更大。在含有b2464基因的转基因植物之间的确存在由于DNA***的不同位点和其他影响基因表达水平或模式的因素而导致的差异。在这些实验中，大部分表达b2464基因的独立转基因事件比对照大，指示对胁迫环境的更好适应。另外，处于USP启动子控制下的b2464基因的表达导致在充分灌溉条件下更大的植物。在这些实验中，表达b2464基因的所有转基因事件都比对照大。
C.氢化酶-2辅助蛋白
在拟南芥中表达处于超级启动子控制下的没有亚细胞靶向的氢化酶-2辅助蛋白b2990(SEQ ID NO：15)。表4列出了在充分灌溉和周期干旱条件下检测的用这些构建体转化的拟南芥植物得到的生物量和健康指数。
表4
Figure BDA0000093683420000311
表4显示表达b2990基因的拟南芥植物在充分灌溉和水受限条件下都更大。在含有b2990基因的转基因植物之间的确存在由于DNA***的不同位点和其他影响基因表达水平或模式的因素而导致的差异。在这些实验中，大部分表达b2990基因的独立转基因事件比对照大，指示对胁迫环境的更好适应。在充分灌溉条件下，b2990基因的表达导致健康指数降低的植物；此效应在水受限条件下未发现。
D.异柠檬酸裂合酶
在拟南芥中表达处于USP启动子控制下并靶向线粒体的异柠檬酸裂合酶基因YER065C(SEQ ID NO：17)。表5列出了在充分灌溉条件下检测的用这些构建体转化的拟南芥植物得到的生物量和健康指数。
表5
Figure BDA0000093683420000321
表5显示表达YER065C基因的拟南芥植物在充分灌溉条件下较大。在含有YER065C基因的转基因植物之间的确存在由于DNA***的不同位点和其他影响基因表达水平或模式的因素而导致的差异。在这些实验中，大部分表达YER065C基因的独立转基因事件比对照大。
E.脂质氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶
在拟南芥中表达处于USP或PCUbi启动子控制下并靶向叶绿体或线粒体的脂质氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶基因YIR037W(SEQ ID NO：19)。表6列出了在充分灌溉和水受限条件下检测的用这些构建体转化的拟南芥植物得到的生物量和健康指数。
表6
Figure BDA0000093683420000331
Figure BDA0000093683420000341
表6显示表达处于PCUbi启动子控制下的YIR037W基因的拟南芥植物当靶向叶绿体时在水受限条件下比对照大，指示对胁迫环境的更好适应。另外，在充分灌溉和水受限条件下表达YIR037W的转基因植物在颜色上比对照绿得更深，如提高的健康指数所显示。这提示YIR037W转基因植物与对照植物相比产生较多的叶绿素或具有较少的叶绿素降解。
当YIR037W基因的表达受USP启动子控制并靶向叶绿体时，YIR037W转基因植物在充分灌溉和水受限条件下都比对照植物小。另外，在充分灌溉条件下YIR037W转基因植物比对照植物绿得浅，如降低的健康指数所显示。这提示具有此特定构建体的YIR037W转基因植物与对照植物相比产生较少的叶绿素或具有较多的叶绿素降解。如果将YIR037W基因靶向线粒体并受USP启动子控制，则当比较YIR037W转基因和对照植物时没有观察到在生物量或健康指数中的显著差异。
H.γ-谷氨酰转肽酶
在拟南芥中表达处于PCUbi启动子控制下并靶向叶绿体、线粒体或不靶向亚细胞的γ-谷氨酰转肽酶基因slr1269(SEQ ID NO：45)。表7列出了在充分灌溉和周期干旱条件下检测的用这些构建体转化的拟南芥植物得到的生物量和健康指数。
表7
Figure BDA0000093683420000361
Figure BDA0000093683420000371
表7显示表达靶向线粒体的slr1269基因的拟南芥植物在水受限条件下比对照小。另外，在充分灌溉和水受限条件下slr1269转基因植物都比对照植物绿得浅，如降低的健康指数所显示。这提示靶向线粒体的slr1269转基因植物与对照植物相比产生较少的叶绿素或具有较多的叶绿素降解。当slr1269基因的表达靶向叶绿体时观察到类似的结果。在水受限条件下，slr1269转基因植物比对照小。在充分灌溉条件下，slr1269转基因植物比对照绿得浅，如降低的健康指数所显示。
当slr1269基因的表达没有亚细胞靶向时，slr1269转基因植物在水受限条件下比对照植物大，指示对胁迫环境的更好适应。另外，表达slr1269的转基因植物在水受限条件下在颜色上比对照绿得更深，如提高的健康指数显示。这提示靶向线粒体的slr1269转基因植物与对照植物相比产生较多的叶绿素或具有较少的叶绿素降解。
G.ATP合酶亚基B’
在拟南芥中表达处于PCUbi启动子控制下并靶向线粒体的ATP合酶亚基B’基因SLL1323(SEQ ID NO：47)。表8列出了在充分灌溉和周期干旱条件下检测的用这些构建体转化的拟南芥植物得到的生物量和健康指数。
表8
Figure BDA0000093683420000372
Figure BDA0000093683420000381
表8显示表达SLL1323基因的拟南芥植物导致在充分灌溉和水受限条件下植物都更大。在含有SLL1323基因的转基因植物之间的确存在由于DNA***的不同位点和其他影响基因表达水平或模式的因素而导致的差异。在这些实验中，大部分表达SLL1323基因的独立转基因事件比对照大，指示对胁迫环境的更好适应。另外，表达SLL1323的转基因植物在水受限条件下在颜色上比对照绿得更深，如提高的健康指数显示。这提示所述植物与对照植物相比产生较多的叶绿素或具有较少的叶绿素降解。
H.C-22甾醇去饱和酶
在拟南芥中表达编码C-22甾醇去饱和酶的YMR015C基因(SEQ ID NO：51)并靶向叶绿体，使用3种构建体。在一种构建体中，转录受PCUbi启动子控制。在另一种中，转录受超级启动子控制。在第三种构建体中YMR015C的转录受USP启动子控制。表9列出了在充分灌溉和水受限条件下检测的用这些构建体转化的拟南芥植物得到的生物量和健康指数。
表9
Figure BDA0000093683420000391
Figure BDA0000093683420000401
表9显示具有PCUbi启动子控制的YMR015C表达的拟南芥当蛋白质也靶向叶绿体时比对照植物显著地大。另外，这些转基因植物和具有超级启动子控制的YMR015C表达的转基因植物比对照在颜色上绿得更深。这些数据指示所述植物在胁迫中比对照植物产生更多的叶绿素或具有更少的叶绿素降解。表9也显示大部分独立转基因事件比对照大。
表9显示具有PCUbi启动子或超级启动子控制的YMR015C表达的拟南芥当蛋白质也靶向叶绿体时在充分灌溉条件下比对照植物显著地小。表9也显示大部分独立转基因事件比对照小。另外，当在充分灌溉条件下生长时这2种构建体都显著降低植物的绿色量。
Figure IDA0000093683470000011
Figure IDA0000093683470000031
Figure IDA0000093683470000041
Figure IDA0000093683470000051
Figure IDA0000093683470000061
Figure IDA0000093683470000071
Figure IDA0000093683470000081
Figure IDA0000093683470000091
Figure IDA0000093683470000101
Figure IDA0000093683470000111
Figure IDA0000093683470000121
Figure IDA0000093683470000131
Figure IDA0000093683470000151
Figure IDA0000093683470000171
Figure IDA0000093683470000201
Figure IDA0000093683470000221
Figure IDA0000093683470000231
Figure IDA0000093683470000241
Figure IDA0000093683470000251
Figure IDA0000093683470000261
Figure IDA0000093683470000271
Figure IDA0000093683470000291
Figure IDA0000093683470000301
Figure IDA0000093683470000311
Figure IDA0000093683470000321
Figure IDA0000093683470000341
Figure IDA0000093683470000361
Figure IDA0000093683470000371
Figure IDA0000093683470000381
Figure IDA0000093683470000391
Figure IDA0000093683470000401
Figure IDA0000093683470000411
Figure IDA0000093683470000421
Figure IDA0000093683470000441
Figure IDA0000093683470000451
Figure IDA0000093683470000461
Figure IDA0000093683470000471
Figure IDA0000093683470000481
Figure IDA0000093683470000491
Figure IDA0000093683470000501
Figure IDA0000093683470000511
Figure IDA0000093683470000521
Figure IDA0000093683470000531
Figure IDA0000093683470000541
Figure IDA0000093683470000551
Figure IDA0000093683470000561
Figure IDA0000093683470000581
Figure IDA0000093683470000591
Figure IDA0000093683470000601
Figure IDA0000093683470000611
Figure IDA0000093683470000631
Figure IDA0000093683470000641
Figure IDA0000093683470000651
Figure IDA0000093683470000661
Figure IDA0000093683470000671
Figure IDA0000093683470000681
Figure IDA0000093683470000691
Figure IDA0000093683470000701
Figure IDA0000093683470000711
Figure IDA0000093683470000721
Figure IDA0000093683470000731
Figure IDA0000093683470000741
Figure IDA0000093683470000751
Figure IDA0000093683470000761

Claims (3)

1.用表达盒转化的转基因植物，所述表达盒包含有效相连的
a)分离的编码启动子的多核苷酸，所述启动子能够提高叶中的基因表达；
b)分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；和
c)分离的编码包含SEQ ID NO：18的第22至550位氨基酸的全长异柠檬酸裂合酶多肽的多核苷酸，其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。
2.对转基因是纯种的种子，所述转基因包含有效相连的
a)分离的编码启动子的多核苷酸，所述启动子能够提高叶中的基因表达；
b)分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；和
c)分离的编码包含SEQ ID NO：18的第22至550位氨基酸的全长异柠檬酸裂合酶多肽的多核苷酸，其中由所述种子生长得到的转基因植物与相同品种的不含有所述转基因的野生型植物相比显示了提高的产量。
3.提高植物产量的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用表达盒转化植物细胞，所述表达盒包含有效相连的
i)分离的编码启动子的多核苷酸，所述启动子能够提高叶中的基因表达；
ii)分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；和
iii)分离的编码包含SEQ ID NO：18的第22至550位氨基酸的全长异柠檬酸裂合酶多肽的多核苷酸；
b)从转化的植物细胞再生转基因植物；和
c)选择与相同品种的不含有所述表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量的转基因植物。
CN2010800132513A 2009-03-23 2010-03-17 具有改变的氧化还原机制和提高的产量的转基因植物 Pending CN102361988A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16242709P 2009-03-23 2009-03-23
US61/162,427 2009-03-23
EP09160826 2009-05-20
EP09160826.5 2009-05-20
PCT/EP2010/053470 WO2010108836A1 (en) 2009-03-23 2010-03-17 Transgenic plants with altered redox mechanisms and increased yield

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102361988A true CN102361988A (zh) 2012-02-22

Family

ID=42244199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800132513A Pending CN102361988A (zh) 2009-03-23 2010-03-17 具有改变的氧化还原机制和提高的产量的转基因植物

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP2411524A1 (zh)
CN (1) CN102361988A (zh)
AR (1) AR075918A1 (zh)
AU (1) AU2010227625A1 (zh)
BR (1) BRPI1006259A2 (zh)
CA (1) CA2754916A1 (zh)
DE (1) DE112010001241T5 (zh)
MX (1) MX2011009550A (zh)
WO (1) WO2010108836A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013175321A1 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 Basf Plant Science Company Gmbh Plants having one or more enhanced yield-related traits and method for making same
WO2013190399A1 (en) * 2012-06-22 2013-12-27 Basf Plant Science Company Gmbh Plants having enhanced yield-related traits and method for making same
CN104988157A (zh) * 2015-06-19 2015-10-21 扬州大学 植物株高和籽粒大小相关的OsTAL基因及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11174467B2 (en) 2015-04-08 2021-11-16 Yield10 Bioscience, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1187219A (zh) * 1995-04-06 1998-07-08 塞迷尼思蔬菜种子公司 选择转基因植物细胞的方法
US6365798B1 (en) * 1997-05-30 2002-04-02 Mcgill University Method for enhancement of naturally occurring cytoplasmic male sterility and for restoration of male fertility and uses thereof in hybrid crop production
WO2003014376A2 (en) * 2001-08-10 2003-02-20 Basf Plant Science Gmbh Sugar and lipid metabolism regulators in plants iii

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4666844A (en) 1984-09-07 1987-05-19 Sungene Technologies Corporation Process for regenerating cereals
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5750871A (en) 1986-05-29 1998-05-12 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in Brassica species
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5187073A (en) 1986-06-30 1993-02-16 The University Of Toledo Process for transforming gramineae and the products thereof
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US5120657A (en) 1986-12-05 1992-06-09 Agracetus, Inc. Apparatus for genetic transformation
KR0154872B1 (ko) 1987-12-21 1998-10-15 로버트 에이. 아미테이지 발아하는 식물종자의 아크로박테리움 매개된 형질전환
US5350688A (en) 1988-03-31 1994-09-27 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for regeneration of rice plants
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
NZ230375A (en) 1988-09-09 1991-07-26 Lubrizol Genetics Inc Synthetic gene encoding b. thuringiensis insecticidal protein
DE69033816T2 (de) 1989-02-24 2002-08-08 Monsanto Technology Llc Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
WO1991016432A1 (en) 1990-04-18 1991-10-31 Plant Genetic Systems N.V. Modified bacillus thuringiensis insecticidal-crystal protein genes and their expression in plant cells
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
EP0539563B2 (en) 1991-05-15 2008-01-23 Monsanto Technology LLC Method of creating a transformed rice plant
WO1993007256A1 (en) 1991-10-07 1993-04-15 Ciba-Geigy Ag Particle gun for introducing dna into intact cells
TW261517B (zh) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
US5470353A (en) 1993-10-20 1995-11-28 Hollister Incorporated Post-operative thermal blanket
BR9408093A (pt) 1993-11-19 1997-08-12 Biotechnology Res & Dev Região reguladora quimérica para expressar genes em plantas cassete para expressão de um gene cassete para expressão induzível de um gene estranho processo para expressar um gene em uma planta plasmideo processo para expressão induzível de um gene estranho em uma planta processo para expressão induzível de um gene estranho em uma planta plasmídeo e planta transgênica
DE69434972T2 (de) 1993-12-08 2008-01-24 Japan Tobacco Inc. Verfahren zur transformation von pflanzen und ein vektor dafür
US5846797A (en) 1995-10-04 1998-12-08 Calgene, Inc. Cotton transformation
JPH10117776A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Tobacco Inc インディカイネの形質転換方法
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
DK0900279T3 (da) 1997-02-20 2005-01-31 Bayer Bioscience Nv Forbedret fremgangsmåde til transformation af planter
US6162965A (en) 1997-06-02 2000-12-19 Novartis Ag Plant transformation methods
US6153813A (en) 1997-12-11 2000-11-28 Mississippi State University Methods for genotype-independent nuclear and plastid transformation coupled with clonal regeneration utilizing mature zygotic embryos in rice (Oryza sativa) seeds
US6153811A (en) 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
US6333449B1 (en) 1998-11-03 2001-12-25 Plant Genetic Systems, N.V. Glufosinate tolerant rice
US6420630B1 (en) 1998-12-01 2002-07-16 Stine Biotechnology Methods for tissue culturing and transforming elite inbreds of Zea mays L.
US7303909B2 (en) 2000-06-28 2007-12-04 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Binary vectors for the improved transformation of plants systems
DE10224889A1 (de) 2002-06-04 2003-12-18 Metanomics Gmbh & Co Kgaa Verfahren zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen
EP1566443A1 (en) 2004-02-23 2005-08-24 SunGene GmbH & Co.KgaA Improved transformation of brassica species
EP2158323A4 (en) * 2007-05-18 2011-06-22 Microbia Prec Engineering Inc PRODUCTION OF ORGANIC ACID BY PILZ CELLS

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1187219A (zh) * 1995-04-06 1998-07-08 塞迷尼思蔬菜种子公司 选择转基因植物细胞的方法
US6365798B1 (en) * 1997-05-30 2002-04-02 Mcgill University Method for enhancement of naturally occurring cytoplasmic male sterility and for restoration of male fertility and uses thereof in hybrid crop production
WO2003014376A2 (en) * 2001-08-10 2003-02-20 Basf Plant Science Gmbh Sugar and lipid metabolism regulators in plants iii

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.SCHOLER等: "Structure and regulation of the isocitrate lyase gene ICL1 from the yeast Saccharomyces cerevisiae", 《CURR GENET》 *
FERNANDEZ E.等: "P28240", 《UNIPROT》 *
KANEKO,T.等: "NP_440058", 《NCBI REFERENCE SEQUENCE》 *
崔杰等: "甜菜ATP合酶β 亚基基因atpB的克隆、序列分析及进化", 《植物研究》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013175321A1 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 Basf Plant Science Company Gmbh Plants having one or more enhanced yield-related traits and method for making same
WO2013190399A1 (en) * 2012-06-22 2013-12-27 Basf Plant Science Company Gmbh Plants having enhanced yield-related traits and method for making same
CN104379747A (zh) * 2012-06-22 2015-02-25 巴斯夫植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法
CN104988157A (zh) * 2015-06-19 2015-10-21 扬州大学 植物株高和籽粒大小相关的OsTAL基因及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
AR075918A1 (es) 2011-05-04
EP2411524A1 (en) 2012-02-01
MX2011009550A (es) 2011-10-12
BRPI1006259A2 (pt) 2015-08-25
AU2010227625A2 (en) 2012-02-02
CA2754916A1 (en) 2010-09-30
WO2010108836A1 (en) 2010-09-30
DE112010001241T5 (de) 2012-05-16
AU2010227625A1 (en) 2011-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101889089B (zh) 具有增加的胁迫耐受性和产率的转基因植物
US20110302673A1 (en) Transgenic Plants with Increased Yield
CN101743314A (zh) 具有增加的胁迫耐受性和产量的转基因植物
CN102300992A (zh) 为增强转基因植物的干旱抗性和提高其产量而工程化nf-yb转录因子
CN102482681B (zh) 胁迫耐受植物
CN102186979A (zh) 包含作为转基因的磷脂酸胞苷酰转移酶的转基因植物
CN102361988A (zh) 具有改变的氧化还原机制和提高的产量的转基因植物
CN110256545A (zh) ZmAER蛋白及其编码基因和应用
US20110283418A1 (en) Transgenic Plants Having Altered Nitrogen Metabolism
US20120198588A1 (en) Transgenic plants with altered redox mechanisms and increased yield
AU2013203427A1 (en) Transgenic plants with altered redox mechanisms and increased yield
AU2013203387A1 (en) Engineering NF-YB transcription factors for enhanced drought resistance and increased yield in transgenic plants
AU2013203388A1 (en) Transgenic plants comprising as transgene a phosphatidate cytidylyltransferase

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120222