CN102356064A - 制备阿藿烯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备阿藿烯的方法，所述方法包括加热含有蒜素的酸性溶液的步骤，并涉及可以通过该方法制备的阿藿烯。本发明还涉及制备蒜素的方法，其中(1)机械处理蒜氨酸酶植物来源，使产物受到离心力的作用并且因此使所制备的蒜氨酸酶的溶液与蒜氨酸的水溶液接触；或(2)在0℃至30℃下，在过氧单硫酸钾的存在下，氧化包含二硫化二烯丙基的溶液，并且将得到的蒜素提取至有机溶剂中。此外，本发明涉及通过冷冻水溶液来提高水溶液中蒜素的浓度的方法。

Description

制备阿藿烯的方法
发明领域
本发明涉及用于制备阿藿烯(ajoene)的方法和包含可以通过该方法得到的阿藿烯的组合物。本发明也涉及用于制备蒜素的方法和用于冷冻浓缩蒜素的方法。
背景
大蒜作为烹饪草药和食品使用已经有千年。此外，大蒜具有许多药用特性，并且其在民间作为药物使用已经有数千年。
阿藿烯是从大蒜中得到的天然存在的化合物。更具体地，阿藿烯在蒜素的降解过程中形成，所述蒜素是化学不稳定的、从无色至稻草色的油，该油被认为是大蒜的许多气味和生物活性的原因。完整无损的蒜瓣不含蒜素，而无气味的前体蒜氨酸[(+)(S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜)]含有蒜素。通过存在于大蒜植物中的称为蒜氨酸酶的C-S-裂解酶将该前体转化为蒜素。在蒜瓣的不同室中发现了蒜氨酸和蒜氨酸酶，而蒜瓣的切开或破碎释放出酶，使得蒜氨酸酶能够与蒜氨酸接触，从而将蒜氨酸转化为蒜素。蒜素具有不稳定性和挥发性，并且自然地将主要降解为二硫化二烯丙基、三硫化二烯丙基、二噻烯和阿藿烯。在WO-A-2003/004668中描述了用于制备具有高收率和大体积的蒜素的方法，其全部内容通过引用并入本文。
目前在多数研究领域中对阿藿烯感兴趣，但主要在包括人类和动物药品在内的医药领域。然而，已经缩减了出于该目的的阿藿烯的研究和使用，因为现有的制备阿藿烯的方法对阿藿烯具有低的选择性。因此，阿藿烯的制备成本昂贵而且收率相对较低。例如，US-A-5612077描述了利用食用油制备主要含有Z-阿藿烯的浸出物(macerate)的方法，但数量少且浓度低。US-A 5741932描述了采用环糊精制备阿藿烯的方法，该方法是一种复杂的多步骤方法并且生产的产量小浓度低。
此外，对大蒜和其潜在用途的许多先前的研究对于活性剂并不具体，该活性剂通常被称之为“大蒜提取物”或“大蒜油”。
因此，需要用于获得高收率、高产量并且成本合理的阿藿烯的改进的方法。还需要用于获得高收率、高产量并且成本合理的蒜素、即阿藿烯的前体的改进的方法。
发明概述
根据第一个方面，本发明涉及制备阿藿烯的方法，所述方法包括以下步骤：将含有蒜素的酸性溶液加热足够的时间，使得蒜素的至少一部分被转化为阿藿烯。
在第二个方面，提供了包含阿藿烯的组合物，所述阿藿烯的含量基于组合物的总体积计为至少约30％w/v。所述组合物可以通过本发明的第一个方面的方法获得。
在第三个方面，提供了制备蒜素的方法，所述方法包括：(i)机械处理蒜氨酸酶的天然植物来源并且同时使经机械处理的产物受到离心力的作用，从而将包含蒜氨酸酶的溶液与蒜氨酸酶的天然植物来源分离；和(i)使包含蒜氨酸酶来源的溶液与蒜氨酸的水溶液接触，由此使蒜氨酸在包含蒜氨酸酶的溶液中通过蒜氨酸酶经酶催化转化为蒜素。
在第四个方面，提供了制备蒜素的方法，该方法包括：在约0℃至约30℃的温度下，在过氧单硫酸钾的存在下氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接着将所生成的蒜素提取至有机溶剂中。
本发明的第三和第四个方面的方法可以用于提供包含蒜素的溶液，所述蒜素在本发明的第一个方面被转化为阿藿烯。
根据第五个方面，提供了提高在蒜素的水溶液中蒜素浓度的方法，所述方法包括冷冻蒜素的水溶液，从而增加蒜素的浓度。
发明详述
制备阿藿烯的方法
根据上述第一个方面，本发明涉及制备阿藿烯的方法，所述方法包括以下步骤：将包含蒜素的酸性溶液加热足够的时间，使得蒜素的至少一部分被转化为阿藿烯。
将蒜素转化为阿藿烯的步骤包括：将包含蒜素的酸性溶液温和加热足够的时间，使得蒜素的至少一部分被转化为阿藿烯。在加热步骤过程中的温度足以引起蒜素转化为阿藿烯(据信通过该方法，两个分子的蒜素缩合形成一个分子的阿藿烯，以及其他化合物例如乙烯基二噻烯(vinyldithiin))。加热步骤可以在约室温至约80℃的温度下进行。例如，加热步骤可以在约30℃至约80℃，例如约40℃至约70℃的温度下进行。加热步骤可以在约35℃至约45℃、或约40℃至约50℃、或约45℃至约55℃、或约50℃至约60℃、或约55℃至约65℃的温度下进行。在实施方案中，加热步骤可以在约30℃、或约40℃、或约50℃、或约60℃的温度下进行。一般地，在加热足够的时间直至反应完成或者已经获得需要的转化水平的过程中，缓慢搅拌包含蒜素的溶液。由蒜素转化为阿藿烯的程度，可以例如通过采用以下概述的HPLC法并通过监测蒜素和/或阿藿烯的UV吸收光谱来监测。通常，温度越高，将蒜素转化成阿藿烯所需要的时间就越短。可以进行加热步骤约1至约10小时，例如约3至约8小时的时间。在实施方案中，加热步骤进行约4小时、或约4.5小时、或约5小时、或约5.5小时、或约6小时、或约6.5小时、或约7小时。
在一个实施方案中，大部分蒜素被转化为阿藿烯。所谓大部分是指起始溶液中至少50％的蒜素被转化为阿藿烯，例如可以通过以下概述的HPLC法测定。例如，可以进行加热步骤直至起始溶液中至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的蒜素被转化为阿藿烯。
有利地，大体上所有的蒜素被转化为阿藿烯。所谓大体上所有的是指加热步骤持续至采用以下概述的HPLC法检测不到阿藿烯为止。
在加热步骤过程中温和搅拌溶液，例如通过缓慢搅拌使成分混合。优选地，控制搅拌的程度以防止乳液的形成。例如，如果乳液开始形成，则可能降低搅拌的程度(即降低至缓和的搅拌程度)或者甚至停止搅拌直到任何乳液澄清为止。
所述方法还可以包括例如在真空下去除有机溶剂从而得到包含阿藿烯的油馏分，阿藿烯的量基于油馏分的总体积计为至少约30％w/v(即油馏分中每升液体中阿藿烯的克数)。
可以在去除溶剂之前过滤包含阿藿烯的溶液以去除任何残留固体物质。例如，可以通过30cm 13 Whatman纸滤器过滤包含阿藿烯的溶液。
在一个实施方案中，采用醇水溶液和非极性烷烃溶剂例如戊烷，按体积计以1∶1或2∶1的比例分割刚刚转化的包含阿藿烯的溶液。该处理去除了任何非极性蒜素代谢物，例如聚硫化物和乙烯基二噻烯(vinylditihins)。
在一个实施方案中，在真空下，在约40至80℃，优选地在约50℃的温度下来减少溶剂。这生成了水溶液和不溶性的浆。在转化步骤中使用的酸可以通过逐滴加入碱，例如，诸如氢氧化钠等强碱进行中和。然后，用醚例如甲基叔丁基醚(TBME)，按体积计以约2∶1至约1∶1的比例提取所述的溶液和浆。提取可以最多进行三次以确保完全提取。
包含蒜素的溶液可以含有至少约2000ppm的蒜素，例如至少约5000ppm的蒜素，例如至少约7000ppm的蒜素，例如至少约10000ppm的蒜素。有利地，包含蒜素的溶液可以含有至少约15000ppm的蒜素，例如至少约17000ppm，或者例如至少约20000ppm的蒜素。所述的溶液通常包含小于约25000ppm的蒜素，例如小于约22000ppm的蒜素。
如下所述，在包含蒜素的溶液中的蒜素可以得自大蒜，所述的大蒜可以是硬颈(hard-necked)或软颈(soft-necked)大蒜。硬颈大蒜的品种包括胡蒜(Rocambole)、瓷蒜(Porcelain)、紫纹蒜(Purple Stripe)(有时称之为紫条蒜“Purple Streak”)、大理石紫纹蒜(Marbled Purple Stripe)、釉紫纹蒜(GlazedPurple Stripe)、纯白大蒜(Pure White)和珍珠白大蒜(Pearl white)。软颈大蒜的品种包括洋蓟蒜(Artichoke)、亚洲蒜(Asiatic)、扁大蒜(Turban)、银皮蒜(Silverskin)和克利奥尔银皮蒜(Silverskin Creole)。有利地，蒜素得自硬颈大蒜，例如纯白大蒜(Pure White)或珍珠白大蒜(Pearl white)(例如，得自中国的Tiashan地区的纯白大蒜或珍珠白大蒜)。与在非酸性溶液中的转化相比，在对其加热并将其转化为阿藿烯的蒜素的酸性溶液中的，当蒜素得自硬颈大蒜时，已经发现阿藿烯的收率得到显著改善(收率增加大约20-25％)。
包含被转化为阿藿烯的蒜素的溶液是酸性溶液。包含蒜素的溶液的pH可以为约5或更小，或者小于5。
有利地，包含蒜素的溶液的pH为约3至约5，或者约3至小于5，或者约3至约4。所述溶液的pH可以大于约2。在实施方案中，包含蒜素的溶液的pH为约3，或者约4，或者约5。
可以通过添加适量的适合酸使包含蒜素的溶液酸化为期望的pH。溶液中的蒜素通常具有弱酸的pH。因此，酸的适量是引起包含蒜素的溶液的pH降低至期望的pH的量。
酸可以是任何适合的有机酸或无机酸。在一个实施方案中，所述的酸为具有小于约5的pKa的强酸。所述的酸可以是选自乙酸、磷酸、硫酸和盐酸中的一种或多种酸。溶液中酸的量可以为约0.1％至5％(v/v)。在一个实施方案中，溶液中酸的量可以为约1％(v/v)。有利地，所述酸为乙酸，例如冰醋酸。该酸具有相对的挥发性，并且因此在完成转化步骤之后可以容易地从溶液中去除。
在特别有利的实施方案中，蒜素的溶液包含乙酸，优选地冰醋酸，其含量为1份冰醋酸/100份溶液并且具有的pH为约4。所述溶液还包含丙酮和水。
在不希望受理论的束缚的同时，据信酸作为质子供体促进蒜素转化为阿藿烯。有利地，在约3至约5，或者约3至小于5的pH下的酸性条件得到更加干净的阿藿烯产品，该产品包含较少的杂质例如二硫化二烯丙基，以及更高的聚硫化物。
包含蒜素的溶液有利地包含适合于将阿藿烯溶剂化的溶剂。适合的溶剂是醇、醚和酮。优选的醇包括甲醇、乙醇和丙醇。在一个实施方案中，所述溶剂是丙酮。在另一个实施方案中，所述溶剂是丁醇。在再一个实施方案中，所述溶剂是丁酮。在又一个实施方案中，所述有机溶剂的沸点小于约100℃，例如小于约90℃、例如小于约80℃、例如小于约70℃、例如小于约60℃。有机溶剂的量可以为约40％至70％(v/v)，且余量为水和酸。
阿藿烯以两种同分异构体形式(顺式(Z)和反式(E))存在，并且将通常作为两种同分异构体的混合物被分离。然而，可以根据需要的阿藿烯的Z∶E比例来选择溶剂。丙酮通常得到包含约1∶3比例的Z和E同分异构体的产品，而作为溶剂的丁醇可以用于获得具有大于约4∶1的Z.E比例的产品。
包含蒜素和酸的溶液可以包含蒜素、酸、有机溶剂和水、由它们组成或者大体上由它们组成。
在一个实施方案中，本发明的第一个方面的方法的加热步骤在不存在油，例如食用油的条件下进行。
本发明的第一个方面的方法使得以高收率制备和分离阿藿烯成为可能，并且其量最高至采用现有的生产方法可以单独由大蒜产生的量的约8倍。最大理论收率为两分子的蒜素得到一分子的阿藿烯。通过本发明的方法或得到的一般收率为每四分子的蒜素得到大约一分子的阿藿烯。
本发明的方法也使得以相对高的量制备和分离阿藿烯成为可能。此外，本发明的方法使得以相对高浓度和纯度制备和分离阿藿烯成为可能。
所谓的高纯度，我们是指在去除溶剂之后产生的油馏分包含，按溶液中液体的重量/体积(w/v)计，至少约30％的量的阿藿烯。在实施方案中，油馏分包含35％w/v阿藿烯，例如至少约40％w/v阿藿烯，例如至少约45％w/v阿藿烯，例如至少约50％w/v阿藿烯。
所述方法还可以包括，例如使用硫酸镁干燥包含阿藿烯的油馏分和将干燥的油残留物悬浮于食用油中以形成食用油浸出物(macerate)，所述的食用油浸出物基于油浸出物的总体积以重量/体积计包含高达约5％的阿藿烯。在一个实施方案中，以重量/体积计油浸出物包含高达约4％的阿藿烯。食用油可以是植物油、动物油或脂肪、氢化植物油或动物脂肪或者合成油或脂肪。优选使用液态油，例如橄榄油。在一个实施方案中，可使用的是橄榄油并且油浸出物包含高达约4％的阿藿烯(w/v)。
依据最终使用者和应用，可以利用适合于使用的油将食用油浸出物进一步稀释至100ppm到500ppm的阿藿烯。当进行适当包装并且例如作为健康补品使用或其他应用时，该产品可以稳定至少2年。
可以通过以下另外的步骤实现所得到的阿藿烯的进一步纯化：将油残留物悬浮在有机极性溶剂中，例如二***，以及与水分离，引起通常以聚硫化物形式存在的非极性化合物的去除。
可以通过加入(例如，逐滴加入)适量的碱例如氢氧化钠来中和任何残留酸。
在所述方法中的任何阶段，可以过滤和/或离心各种溶液以去除固体沉积物，例如在原始蒜素溶液中包含的植物碎屑。
制备蒜素的方法
在本发明的第一个方面的实施方案中，并根据本发明的第三个方面，通过包括以下步骤的方法提供了包含蒜素的溶液：i)机械处理蒜氨酸酶的天然植物来源并且同时使经机械处理的产物受到离心力的作用，由此将包含蒜氨酸酶的溶液与蒜氨酸酶的天然植物来源分离；和ii)使包含蒜氨酸酶来源的溶液与蒜氨酸的水溶液接触，从而使蒜氨酸在包含蒜氨酸酶的溶液中通过蒜氨酸酶经酶催化转化为蒜素。
在一个实施方案中，步骤(i)在离心式榨汁机中进行，而步骤(ii)可以同时伴随至少部分步骤(i)进行。离心式榨汁机也称为离心式汁液榨取器，通常包括可以以高速率旋转的篮。所述篮具有将蒜氨酸酶的天然植物来源(例如蒜瓣，可以对其去皮或不去皮)研磨为软块或浆料的齿。由于篮以高速度旋转，因此使浆料在篮的相反方向抛出。篮的侧面是多孔的，因此允许使用离心力使浆料中的液体与浆分离。收集液体溶液(包含蒜氨酸酶)并随后使其与蒜氨酸溶液接触。适合的离心式榨汁机的例子是JE700Proline(RTM)Domestic Juicer。本领域的技术人员将理解，一些固体物质在分离过程中可以穿过孔。可以通过任何适当的方法例如过滤和/或离心从蒜氨酸酶溶液中去除任何固体物质。出人意料地发现，使用离心式榨汁机提供了超过现有方法的益处。首先，固体植物材料与蒜氨酸酶的天然植物来源的液体成分的快速分离使得在其转化为蒜素之前和其转化为蒜素的过程中蒜氨酸酶的较大温度控制成为可能，而且也意味着液体成分中的蒜氨酸酶能够与水性蒜氨酸溶液很快接触，所述很快通常在约5-30秒的机械处理时间内，例如在约10-20秒，或者在约10秒内的机械处理时间。现有技术中，WO-A-2003/004668中的共混方法，虽然在那时能够生成之前不能实现水平的蒜素，但共混的原材料(即大蒜)在相对较长的时间被共混(即大约数分钟)，这引起温度升高(通常使包含蒜氨酸酶的溶液的温度升至约35℃)。相比之下，使用离心式榨汁机较快地处理原材料意味着温度有少许或者没有升高。因此，在生成的溶液中的蒜氨酸酶很少会降解，而且将蒜氨酸酶溶液加入到蒜氨酸溶液中一般将不引起任何显著性的温度升高，其反过来意味着形成的蒜素也将很少会降解。此外，在生成蒜氨酸酶溶液和与蒜氨酸溶液接触之间的时间减少意味着对于蒜氨酸酶来说具有较少的时间在处理步骤期间引起自然产生的蒜氨酸的转化。该结果是更加有效的方法，该方法导致制备的蒜素在产量和纯度方面至少与WO-A-2003/004668中描述的方法一样好并且优选地大于WO-A-2003/004668中描述的方法，并且具有由于蒜氨酸酶溶液与天然来源的蒜氨酸酶的快速分离而引起大量减少的反应次数的另外优点。
在优选的实施方案中，蒜氨酸酶的天然植物来源按照步骤(i)和步骤(ii)处理并且同时与蒜氨酸的水溶液接触。因此，该方法连续地进行，蒜氨酸酶的新鲜天然植物来源被榨汁，同时包含蒜氨酸酶的溶液被进料至包含蒜氨酸的水溶液的反应器中。
用于本发明方法中的蒜氨酸酶的天然植物来源可以得自葱属植物，通常是其鳞茎部分。最优选地，葱属植物是大蒜(Allium Sativum)，大蒜容易获得且价格便宜，同时具有相对高浓度的蒜氨酸酶。大蒜可以是硬颈大蒜或软颈大蒜。硬颈大蒜的品种包括胡蒜(Rocambole)、瓷蒜(Porcelain)、紫纹蒜(Purple Stripe)(有时称之为“紫条蒜”(Purple Streak))、大理石紫纹蒜(Marbled Purple Stripe)、釉紫纹蒜(Glazed Purple Stripe)、纯白大蒜(PureWhite)和珍珠白大蒜(Pearl white)。软颈大蒜的品种包括洋蓟蒜(Artichoke)、亚洲蒜(Asiatic)、扁大蒜(Turban)、银皮蒜(Silverskin)和克利奥尔银皮蒜(Silverskin Creole)。有利地，蒜素得自硬颈大蒜，例如纯白大蒜(Pure White)或珍珠白大蒜(Pearl white)(例如，得自中国的Tiashan地区的纯白大蒜或珍珠白大蒜)。与在非酸性溶液中的转化相比，在对其加热并将其转化为阿藿烯的蒜素的酸性溶液中，当蒜素得自硬颈大蒜时，已经发现阿藿烯的收率得到显著改善(收率增加大约20-25％)。
如本领域的技术人员所理解的，就蒜氨酸酶而言，大蒜的品质可以随着年限和生成大蒜的当地环境的变化而变化。技术人员将因此能够直接进行初级测试以建立任何给定来源的大蒜的品质并确定其对于根据本发明进行处理来制备蒜素和阿藿烯的适用性。
生大蒜通常是以可以以未去皮或去皮状态处理的鳞茎和/或蒜瓣形式。优选地，在离心式榨汁机中进行机械处理之前对生大蒜进行去皮和清洗。
在接触步骤之后，对包含蒜氨酸酶和蒜氨酸的溶液搅拌约1至6小时，例如约2-4小时，或者直到已经实现蒜氨酸酶和蒜氨酸转化为蒜素的期望水平。在搅拌过程中的温度优选地保持在约30℃。可以例如采用以下概述的方法通过HPLC并通过监测蒜素的UV吸收光谱来监测转化为蒜素的程度。本领域的技术人员将意识到，蒜素的最终浓度可以依据生大蒜的量和类型而变化。最终溶液可以包含至少约2000ppm蒜素，例如至少约5000ppm的蒜素，例如至少约10000ppm的蒜素，或者至少约12000ppm的蒜素，或者至少约15000ppm的蒜素，或者至少约17000ppm的蒜素，或者至少约20000ppm的蒜素。
所产生的富含蒜素的溶液通常包含约10000ppm至22000ppm的蒜素，优选地在转化为阿藿烯之前澄清该溶液。澄清方法可以包含低温沉淀、离心、过滤和/或添加盐，或者它们的组合，从而从溶液中沉淀并去除任何蛋白质、纤维和其他植物碎屑。该澄清方法一般改进了将蒜素转化为阿藿烯和任何随后的纯化步骤的总体过程。
例如，可以使富含蒜素的溶液在低温下例如在5℃以下静止沉淀足够的时间，例如约1-3天或例如约2天。之后，例如通过倾析去除清澈的上清液体。可以通过离心去除沉淀中的任何残留液体并在随后将该残留液体与上清液体结合。优选地，将整个处理过程中的温度保持在5℃以下。可以过滤包含蒜素的澄清的上清溶液。
在转化为阿藿烯之前，将澄清的蒜素溶液提取到有机溶剂例如丙酮中。优选地，使有机溶剂冷冻至小于0℃的温度。搅拌两种液体一段时间以确保均化。优选地始终将温度保持在5℃或5℃以下。然后可以将丙酮水溶液在5℃以下，例如0℃以下或-5℃以下或者约-10℃以下的温度静止沉淀另外的一段时间，例如24小时并去除沉淀。然后可以通过添加适合的盐例如氯化钠使溶液成为盐溶液，接着搅拌混合物，之后，允许溶液在低于10℃的温度下静止足够的时间，从而使包含蒜素的有机溶剂层与盐水层分离。优选地，控制搅拌的程度以防止乳液的形成。例如，如果乳液开始形成，则降低搅拌的程度(即降低至缓和的搅拌程度)或者甚至停止搅拌直到任何乳液澄清为止。供选择地，可以去除乳液并离心至使两相分离为两层，随后将该两层倾析并返回至母液中。
提取步骤可以重复两次或三次。例如从水相中提取蒜素至溶剂相中，水相与溶剂相的比例为约1∶1至约2∶1(v/v)是合适的。在本发明的第一个方面的方法的加热步骤中可以使用的是包含蒜素的有机层。
所述的盐可以是无机盐，例如氯化钠、氯化铵或硫酸铵。在一个实施方案中，所述的盐是氯化钠。
在优选的实施方案中，所述的盐是氯化钠，而所述的有机溶剂是丙酮。
在所述过程中的任何阶段，在用于将蒜素转化为阿藿烯的加热步骤之前，可以通过干燥、沉淀、过滤和/或冷冻处理进一步纯化富含蒜素的溶剂层以去除任何剩余的植物物质。
例如，在用于将蒜素转化为阿藿烯的加热步骤之前，可以例如采用硫酸镁干燥和例如通过硅藻土过滤包含蒜素的有机溶剂层。
之后，可以通过进一步添加一种或一种以上溶剂来改进蒜素溶剂提取物的组成以优化用于将蒜素转化为阿藿烯的条件。适合的溶剂是以上所述的溶剂。随后，按照以上所描述的过程将蒜素提取物与酸和任选地水混合并且之后进行加热以使蒜素转化为阿藿烯。
如上所述，所述的一种或一种以上溶剂可以根据需要的阿藿烯的Z∶E比进行选择。丙酮通常使产生包含Z和E同分异构体的产物，所述Z和E同分异构体的比例为约1∶3，同时作为溶剂的丁醇可以用于得到Z.E比例大于约4∶1的产物。
因此，根据本发明制备的高量和纯度的阿藿烯是至少部分地基于上述的生产蒜素的改进方法。
作为另外一种选择，可以出于其他目的储存蒜素。在约5000ppm以上的浓度时，蒜素在水中极其不稳定。然而，假设已经过滤溶液以去除杂质的条件下，在-40℃下，蒜素在高达约5000ppm浓度的浓度下稳定。此外，在弱酸性溶液的存在下可以增加蒜素的稳定性。在采用溶剂例如二***提取之后，并在不稀释的条件下，蒜素必须保持在-70℃或-70℃以下，因为蒜素产物会立即开始分解。因此根据蒜素的最终溶液的浓度，可以进行用于稀释蒜素溶液以便储存的步骤。因此，为了增加其稳定性，优选的是尽快稀释蒜素。例如，可以将所述溶液稀释至小于约500ppm，例如小于约150ppm。可以通过使用适当的缓冲液例如柠檬酸调节pH来进一步稳定稀释的溶液。
可以通过大体上去除所有的蛋白质、大蒜碎屑和其他固体物质进一步增加蒜素的稳定性。采用这种方式，可以在约0℃或0℃以下的低温下，在相对高浓度水平下长时间储存蒜素。因此提供了在至少5000ppm的浓度下处理和储存蒜素的方法，所述方法包括：处理具有至少约5000ppm的浓度的蒜素的水溶液以大体上去除所有的蛋白质、大蒜碎屑和任何其他固体物质；和将蒜素的水溶液储存在约0℃或0℃以下的温度。经过处理的蒜素的水溶液在-10℃可以储存长达约2个月的时间不发生蒜素的降解。可以根据以上所述的本发明的第三个方面制备蒜素的水溶液。
根据第五个方面，提供了用于增加蒜素的水溶液中的蒜素浓度的方法，所述方法包括冷冻蒜素的水溶液，从而增加蒜素的浓度。可以根据以上所述的本发明的第三个方面制备蒜素的水溶液。优选地，在冷冻之前，根据以上所述的方法澄清蒜素的水溶液。例如，在低温，例如5℃以下，可以将富含蒜素的溶液的水溶液静止沉淀充足的时间，例如约1-3天，或者例如约2天。然后，例如通过倾析去除澄清的上清液体。可以通过离心去除沉淀中的任何残留液体并在随后将该残留液体与上清液体结合。优选地，将整个处理过程中的温度保持在5℃以下。可以过滤包含蒜素的澄清的上清溶液。
可以在约1至约3天，例如约2的时间，将蒜素的水溶液慢慢冷却至-10℃或-10℃以下来实现冷冻。缓慢冷却的意思是溶液从溶液的外部朝向中心逐渐冷冻。有利地，冷冻过程持续直至按体积计约50％的蒜素的溶液被冷冻。该过程具有增加剩余液体部分中蒜素的浓度的效果。
所述方法还可以包括机械处理冰冻的水性蒜素以生成液体/浆体(slush)，以及在小于约15℃的温度下，在真空下过滤液态浆体以生成具有增加的蒜素浓度的相对粘的蒜素溶液(相对于在冷冻之前蒜素的水溶液的粘度)。可以在过滤过程中搅拌液体/浆体以促进过滤过程。与在冷冻之前蒜素的水溶液中的蒜素的浓度相比，可以将粘性溶液中蒜素的浓度增加高达约50％。与在冷冻之前蒜素的水溶液中的蒜素的浓度相比，可以将粘性溶液中蒜素的浓度增加至少约10％。
蒜素的粘性溶液或其至少一部分可以根据本发明的第一个方面处理并将其转化为阿藿烯。
根据本发明的第一个方面的替代实施方案并且根据本发明的第四个方面，通过包括以下步骤的方法提供了包含蒜素的溶液：在约0℃至约30℃的温度下，在过氧单硫酸钾的存在下氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接着将所生成的蒜素提取至有机溶剂中。在一个实施方案中，所述温度等于或小于约10℃，例如约5℃。
二硫化二烯丙基和过氧单硫酸钾的量可以足以生成具有约2000至约22000ppm的浓度的蒜素的水溶液。例如，二硫化二烯丙基和过氧单硫酸钾的量可以足以生成具有约5000ppm、或约7000ppm、或约100000ppm、或约12000ppm、或约15000ppm、或约17000ppm、或约20000ppm的浓度的蒜素的水溶液。
有利地，在一段时间例如约2小时内，在搅拌下将全部的过氧单硫酸钾逐渐添加至二硫化二烯丙基的溶液中。
由二硫化二烯丙基合成制备蒜素的方法是已知的[例如，Cavallito.C.J..Bailey，J.H.，J.Am.Chem.Soc.66，(1944).1950-1951；Small，L.V.D.，Bailey，J.H.，Cavallito C.J.，J.Am.Chem.Soc.69，(1947)，1710-1713)]。在这些方法中，过氧化氢是氧化剂。这些方法也需要使用挥发性的和低沸点溶剂，例如醚，而使用大量的此种溶剂存在安全性问题，本发明要解决的是这些安全性问题。
阿藿烯
本发明涉及包含阿藿烯的组合物，所述阿藿烯的量基于组合物中液体的重量/体积(w/v)计为至少约30％。所述组合物可以通过按照本发明的第一个方面的方法获得。在实施方案中，所述组合物包含35％w/v的阿藿烯，例如至少约40％w/v的阿藿烯，例如至少约45％w/v的阿藿烯，例如至少约50％w/v的阿藿烯。
本发明涉及食用油浸出物，所述食用油浸出物基于所生成的油浸出物的总体积以w/v计包含高达约5％的阿藿烯。通过将充足的阿藿烯浓缩物悬浮在油中以生成需要的浓度获得油浸出物。在一个实施方案中，以重量/体积计所述油浸出物包含高达约4％的阿藿烯。食用油可以是任何适合的植物油。食用油可以是植物油、动物油或脂肪、氢化植物油或动物脂肪或者合成油或脂肪。优选使用液态油，例如橄榄油。在实施方案中，食用油可以是橄榄油。
本发明因此使得通过商业上可行的方法大批量制备阿藿烯成为可能。例如，所述方法使得制备千克量的阿藿烯成为可能。因此，本发明也涉及以千克规模制备的阿藿烯。
根据本发明的方法提供了药理活性物质阿藿烯，所述阿藿烯的量使其有可能制备包含标准化量的阿藿烯的商品。
根据本发明制备的阿藿烯适合于任何已知和建议的应用。阿藿烯的稳定性使其能够用于制备标准化的药品、食品、动物饲料添加剂，以及用于化妆品应用。特别是用于心血管疾病，例如动脉硬化、血栓事件、尤其是高血压，以及用于各种细菌感染、真菌感染和对于一些器官紊乱和代谢紊乱的补救。作为预防性健康补救，阿藿烯也可以用于食品添加剂行业。
为了避免疑义，本申请涉及在以下编号的段落中描述的主题：
1.一种制备阿藿烯的方法，所述方法包括：(a)提供包含蒜素的溶液；(b)增加包含蒜素的溶液的盐浓度并将蒜素提取至有机溶剂中，从而形成包含蒜素的溶剂层和盐水层；(c)任选地，分离溶剂层和盐水层；和(d)将蒜素转化为阿藿烯。
2.根据第1段的方法，其中，步骤(d)包括：在室温至有机溶剂的沸点之间的温度下，加热蒜素约1至约5小时的时间，所述蒜素被提取到所述有机溶剂中。
3.根据第1或2段的方法，所述方法还包括：如果在加热步骤(d)之前未进行权利要求1的步骤(c)，则分离溶剂层和盐水层；和去除有机溶剂以生成包含阿藿烯的油馏分，所述阿藿烯的量基于油馏分的总体积计为至少约30％w/v。
4.根据第3段的方法，其中，所述油馏分采用有机极性溶剂提取以去除残留有机溶剂，并干燥以去除残留水分。
5.根据第3或4段的方法，所述方法还包括将所述油馏分悬浮在食用油中以形成油浸出物，所述油浸出物包含基于油浸出物的总体积计约4％-5％w/v的阿藿烯。
6.根据前述任一段的方法，其中，所述步骤(b)中的有机溶剂选自醇、醚和酮。
7.根据第6段的方法，其中，所述溶剂是丙酮、丁醇或丁酮。
8.根据前述任一段的方法，其中，所述盐是氯化钠。
9.根据第4段的方法，其中，所述有机极性溶剂是二***。
10.根据前述任一段的方法，其中，在步骤(d)之前，过滤和/或离心包含蒜素的溶剂层。
11.根据前述任一段的方法，其中，步骤b)包括：在最长达约2小时的时间内添加盐，接着在最长达约2小时的时间内添加有机溶剂，并且其中将所述溶液的温度保持在约0℃至50℃。
12.根据第1-10段中任一段的方法，其中，步骤b)包括：在最长达约2小时的时间内添加有机溶剂，接着在最长达约2小时的时间内添加盐，并且其中将所述溶液的温度保持在约0℃至50℃。
13.根据前述任一段的方法，其中，在搅拌下将所述盐和有机溶剂加至包含蒜素的溶液中，并且其中防止在添加所述盐和有机溶剂过程中乳液的形成。
14.根据第11-12段中任一段的方法，其中，所述盐是氯化钠而所述有机溶剂是丙酮，并且其中步骤d)包括在约50-55℃的温度下加热蒜素约3-5小时的时间，优选地约4小时。
15.根据前述任一段的方法，其中，步骤a)包括：
i)机械处理蒜氨酸酶的天然植物来源并且同时使经机械处理的产物受到离心力的作用，从而将包含蒜氨酸酶的溶液与蒜氨酸酶的天然植物来源分离；和
ii)使包含蒜氨酸酶来源的溶液与蒜氨酸的水溶液接触，由此使蒜氨酸在包含蒜氨酸酶的溶液中通过蒜氨酸酶经酶催化转化为蒜素。
16.根据第15段的方法，其中，步骤(i)在离心式榨汁机中进行。
17.根据第15或16段的方法，其中，步骤(ii)与步骤(i)的至少一部分同时进行。
18.根据第15-17段中任一段的方法，其中，在接触步骤之后，搅拌包含蒜氨酸、蒜氨酸酶和蒜素的溶液约1-3小时。
19.一种制备蒜素的方法，所述方法包括：(a)机械处理蒜氨酸酶的天然植物来源并且同时使经机械处理的产物受到离心力的作用，从而将包含蒜氨酸酶的溶液与蒜氨酸酶的天然植物来源分离；和(b)使包含蒜氨酸酶来源的溶液与蒜氨酸的水溶液接触，由此使蒜氨酸在包含蒜氨酸酶的溶液中通过蒜氨酸酶经酶催化转化为蒜素。
20.根据第19段的方法，其中，步骤(i)在离心式榨汁机中进行。
21.根据前述任一段的方法，其中，所述蒜氨酸酶的天然植物来源是生大蒜。
22.根据第21段的方法，其中，所述生大蒜为优选地已经去皮并清洗的蒜瓣的鳞茎形式。
23.根据前述任一段的方法，其中，所述包含蒜素的溶液包含至少约5000ppm的蒜素。
24.根据前述任一段的方法，其中，所述包含蒜素的溶液包含至少约10000ppm的蒜素。
25.根据前述任一段的方法，其中，所述包含蒜素的溶液包含至少约12000ppm的蒜素。
26.根据前述任一段的方法，其中，所述包含蒜素的溶液包含至少约15000ppm的蒜素。
27.根据第1-14段中任一段的方法，其中，步骤a)包括：在约0℃至约30℃的温度下，在过氧单硫酸钾的存在下，氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接着将所生成的蒜素提取至有机溶剂中。
28.一种制备蒜素的方法，所述方法包括：在约0℃至约30℃的温度下，在过氧单硫酸钾的存在下，氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接着将所生成的蒜素提取至有机溶剂中。
29.根据第27或28段的方法，其中二硫化二烯丙基和过氧单硫酸钾的量足以生成具有约5000ppm至约20000ppm浓度的蒜素的水溶液。
30.根据第27-29段中任一段的方法，其中，所述温度等于或小于约10℃。
31.根据第27-30段中任一段的方法，其中，在约2小时的时间内，将全部量的过氧单硫酸钾逐渐添加至二硫化二烯丙基的溶液中。
32.一种通过根据第1-17、20-26和28-30中任一段的方法可以获得的组合物，所述组合物包含基于组合物的总体积计至少约30％w/v的阿藿烯。
33.根据第31段的组合物，所述组合物包含至少约35％w/v的阿藿烯。
34.根据第32段的组合物，所述组合物包含至少约40％w/v的阿藿烯。
35.根据第33段的组合物，所述组合物包含至少约45％w/v的阿藿烯。
36.根据第34段的组合物，所述组合物包含至少约50％w/v的阿藿烯。
现结合以下实施例，将仅通过实施例的方式并且在不限制本发明范围的情况下描述本发明。
实施例
反相HPLC法
-蒜素浓度的测定(通过标准蒜素溶液校正)
峰鉴定：蒜素9.5分钟
柱：Ace 5 C18；尺寸：250×4.6mm
保护柱：Ace 5 C18
流动相：50％甲醇-50％水
温度：30℃
检测波长：210nm(UV)
样品体积：20μL
样品溶剂：水
流速：1.0ml/min
-阿藿烯浓度的测定(通过标准阿藿烯溶液校正)
峰鉴定：阿藿烯(一起洗脱的E/Z)11.1分钟
使用的柱：ACE 5 C18；尺寸：250×4.6mm
保护柱：Ace 5 C18
流动相：溶剂A水-溶剂B甲醇
流速：1.0ml/min
梯度：
分钟％    溶剂B
0         50
15        100
20        100
20.0      150
25        50
温度：30℃
检测波长：254nm*UV)
样品体积：20μL
样品溶剂：甲醇
-确定阿藿烯E和Z同分异构体的正相法(通过标准阿藿烯溶液校正)
峰鉴定：Z阿藿烯14分钟；E阿藿烯17分钟
使用的柱：二氧化硅；尺寸：250×4.6mm，由NN Scientific Ltd.制造
保护柱：Ace 5C18
流动相：92％己烷-8％2-丙醇
温度：30℃
检测波长：240nm(UV)
样品体积：20μL
样品溶剂：2-丙醇
流速：1.0ml/min
实施例1
将采用离心式榨汁机(JE700 Proline(RTM)Domestic Juicer extractor)制备的5升富含蒜氨酸酶的大蒜汁液提取物与35升10％的蒜氨酸溶液在反应器中共混并搅拌3小时。大蒜是得自当地市场的预先去皮的西班牙白蒜品种(Spanish white variety)。用水套使反应温度保持在30℃。通过使用上述的HPLC法确定反应完成。测定所生成的40升溶液具有15000ppm的蒜素浓度。将40升蒜素溶液在4℃下静止沉淀48小时。除去澄清的上清液。通过在0℃下，以3000rpm的转速离心30分钟去除剩余沉淀中的液体，并将去除的液体与上清液组合。通过Whatman 113滤纸过滤澄清的溶液，然后置于100升反应器中。将40升冰冷丙酮加入到反应器中并搅拌两种液体2小时以确保完全同质化。使温度始终保持在5℃以下。之后，将丙酮水溶液在-10℃下静止沉淀24小时。除去任何沉淀。向澄清的溶液中添加15kg的氯化钠并在隔板式反应器中搅拌混合物3小时。允许该溶液静止12小时并使其冷却至小于10℃，该时间足以使不溶混丙酮层从盐水层中分离。测定上部丙酮层和底部盐水层的蒜素浓度分别为3％(w/v)和0.1％(w/v)。
丙酮层采用硫酸镁干燥并通过硅藻土过滤。该过程剩余25升丙酮。然后使丙酮层与25升的丙酮/水/乙酸(65/34/1(v/v))的溶液在100升反应器中混合。然后，在60℃下加热溶液5小时。通过以上所描述的HPLC阿藿烯法来监测反应。然后，使反应混合物通过30cm 113Whatman滤纸进行纸虑。之后在50℃，真空下减少滤液以去除溶剂。以2000ppm离心残留物5分钟。将沉淀液体放置在分离漏斗中并去除底部的油。在80℃，真空下减少油以去除任何残留溶剂。共得到275g的油，其中通过HPLC法确定阿藿烯的含量为35％(w/v)，并确定E/Z比例为3∶1(如上所述)。
实施例2
采用实施例1中所描述的步骤，生成30升15000ppm的蒜素溶液。使液体静止沉淀48小时后，在真空下通过硅藻土过滤。然后将澄清的溶液与11Kg的氯化钠在100升反应器中混合。在-10℃下冷却反应器24小时。然后通过纸过滤液体以去除蛋白质、纤维和过量的盐。将液体转移到100升反应器中。向反应器中加入30升冰冷的丙酮，用设计用于确保充足涡流的叶轮缓慢搅拌液体，从而在不生成过量乳液的情况下使蒜素从水层转移到有机层。允许溶液静止12小时并冷却至小于10℃；该时间足以使不溶混丙酮层从盐水层中分离。在双层的界面生成大约10升的乳液。以3000rpm的转速离心5分钟来破坏该乳液。测定上部丙酮层和底部盐水层的蒜素浓度分别为2％(w/v)和0.08％(w/v)。
然后使丙酮层与25升的丙酮/水/乙酸(65/34/1)的溶液在100升反应器中混合。然后，在40℃下加热溶液6.5小时。通过以上所描述的HPLC阿藿烯法监测反应。随后，使反应混合物通过30cm 113Whatman滤纸进行纸虑。之后将液体相对2×10升的戊烷分离以去除非极性的蒜素代谢物，例如聚硫化物和乙烯基二噻烯(vinyl dithiins)。然后在50℃，真空下减少滤液以去除溶剂。通过搅拌，使残留物和油均质化。通过逐滴添加浓缩的氢氧化钠溶液中和液体中残留的乙酸。
然后，用2×5升的甲基叔丁基醚提取水性液体。接着，将甲基叔丁基醚与硫酸镁结合。随后，在50℃，在真空下减少干燥的甲基叔丁基醚。得到总计210g的油，并且测定阿藿烯含量为50％(w/v)，测定E/Z比例为3∶1。
实施例3
采用实施例2中所描述的步骤，生成30升15000ppm的蒜素溶液。通过以3000rpm的转速离心45分钟来澄清该液体。然后，用13Kg的硫酸铵使该液体饱和。搅拌所述溶液以确保饱和；通过过滤去除任何未溶解的盐。之后，用15升冰冷丙酮提取该溶液。将丙酮溶液转移至隔绝容器中；通过添加干冰使反应器的温度降至-70℃。之后，使冰***液在真空下通过纸滤器上的硅藻土过滤。然后，用硫酸镁干燥滤液并再次经硅藻土过滤。
然后使丙酮层与15升的丙酮/水/乙酸(65/34/1)的溶液在100升反应器中混合。随后，在50℃下加热溶液4小时。通过HPLC阿藿烯法来监测反应。然后，使反应混合物通过30cm 113Whatman滤纸进行纸虑。然后在60℃，在真空下减少滤液以去除溶剂。用10升50％的甲醇溶液溶解残留物。该溶液随后针对2×5升的己烷清洗。接着，用2.5升的二氯甲烷提取水层。用硫酸镁干燥DCM，然后减少DCM。
生成258ml液体，阿藿烯的含量为40％。
实施例4
使用实施例1中描述的步骤生产15升15000ppm的蒜素溶液。通过在4℃下沉淀24小时使蒜素溶液澄清。然后，在-10℃下使所述溶液冰冻48小时。接着，用锤子打碎冰冻的块，并用家用搅拌机使冰冻的块粉碎至精细的浆体。通过粗糙级筛过滤所述的浆体以去除大冰粒。真空下过滤所述的浆体3小时。始终搅拌所述的液体/浆体从而帮助过滤。使温度保持在10℃以下。收集6升滤液并采用以上所描述的HPLC蒜素法测定其具有30000ppm的蒜素含量。该滤液为粘性溶液。将剩余的固体浆体/冰放置在室温下解冻12小时，得到9升的液体，蒜素含量为5000ppm。
然后，采用与实施例1中详细描述的转化和提取步骤处理6升蒜素溶液。共得到250g的油，通过以上所描述的HPLC法测定阿藿烯的含量为30％并测定E/Z比例为3∶1
实施例5
如实施例1所述生成阿藿烯。将所生成的阿藿烯进一步在硫酸镁上干燥并悬浮在橄榄油中以得到包含约4％阿藿烯的油浸出物。根据最终使用者和应用，采用任何适合的食用油进一步稀释该浓缩物，用于在100ppm至500ppm的浓度使用。当进行适当包装并且作为健康补品使用或其他已知的应用时，该产品可以稳定最少2年。
实施例6
将10ml的二硫化二烯丙基(DADS)搅拌至100ml乙醇/水(1∶1)中。在2小时内缓慢添加20g过氧单硫酸钾，并在10℃以下搅拌直至观察不到进一步的反应。然后，过滤所生成的溶液，之后用二***(2×50ml)提取该溶液。将二***层结合并用10％盐水溶液2×50ml清洗。采用硫酸镁干燥该醚层，然后真空下减少。去除溶剂，产生了大于90％的纯蒜素黄色油状物(表达为纯物质的a％)。然后，根据实施例1所述处理该纯的蒜素，以使其转化为阿藿烯。

Claims (44)

1.一种制备阿藿烯的方法，所述方法包括以下步骤：将包含蒜素的酸性溶液加热足够的时间，使得至少一部分蒜素被转化为阿藿烯。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述溶液包含有机溶剂和水。
3.根据权利要求2的方法，其中，步骤中的所述有机溶剂选自醇、醚和酮。
4.根据权利要求3的方法，其中，所述有机溶剂是丙酮、丁醇或丁酮。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中，所述酸性溶液包含有机酸或无机酸。
6.根据权利要求5的方法，其中，所述酸具有小于约5的pKa。
7.根据权利要求5或6的方法，其中，所述酸是选自乙酸、磷酸、硫酸和盐酸中的一种或多种酸。
8.根据前述任一项权利要求的方法，其中，在所述溶液中所述酸的量为约0.1％至5％(v/v)。
9.根据权利要求8的方法，其中，在所述溶液中所述酸的量为约0.1％至约1％(v/v)。
10.根据权利要求2-9中任一项的方法，其中，所述有机溶剂的量为约50％至70％(v/v)，且余量为水。
11.根据权利要求10的方法，其中所述酸是乙酸，而所述有机溶剂是丙酮，溶液的余量为水。
12.根据前述任一项权利要求的方法，其中，所述加热步骤在约30℃至约80℃的温度下进行。
13.根据权利要求12的方法，其中，所述温度为约40℃或约50℃或约60℃。
14.根据前述任一项权利要求的方法，其中，大量的蒜素被转化为阿藿烯。
15.根据前述任一项权利要求的方法，其中，基本上所有的蒜素被转化为阿藿烯。
16.根据前述任一项权利要求的方法，其中，所述蒜素的酸性溶液具有约3至约5的pH，或者约3至小于5的pH。
17.根据前述任一项权利要求的方法，所述方法还包括：去除有机溶剂以得到包含阿藿烯的油馏分，所述阿藿烯的量基于油馏分的总体积计为至少约30％w/v。
18.根据权利要求17的方法，其中，所述油馏分采用有机极性溶剂提取以去除残留有机溶剂，并干燥以去除残留水分。
19.根据权利要求14-18中任一项的方法，所述方法还包括：将所述油馏分悬浮在食用油中以形成油浸出物，所述油浸出物包含基于油浸出物的总体积计约4％-5％w/v的阿藿烯，其中所述食用油任选地为橄榄油。
20.根据前述任一项权利要求的方法，其中，所述包含蒜素的溶液通过包括以下步骤的方法制备：
i)机械处理蒜氨酸酶的天然植物来源并且同时使经机械处理的产物受到离心力的作用，从而将包含蒜氨酸酶的溶液与蒜氨酸酶的天然植物来源分离；和
ii)使包含蒜氨酸酶来源的溶液与蒜氨酸的水溶液接触，由此使蒜氨酸通过所述的蒜氨酸酶经酶催化转化为蒜素，从而生成包含蒜氨酸的水溶液。
21.根据权利要求20的方法，其中，在离心式榨汁机中进行步骤i)。
22.根据权利要求20或21的方法，其中，所述步骤ii)与步骤i)的至少一部分同时进行。
23.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中，在所述接触步骤之后，搅拌包含蒜氨酸、蒜氨酸酶和蒜素的溶液约1至4小时，其中任选地，将搅拌过程中的温度保持在约30℃。
24.根据权利要求20-23中任一项的方法，其中，在转化之后将所述蒜素提取至有机溶剂中。
25.根据权利要求24的方法，其中，所述有机溶剂选自醇、醚和酮。
26.根据权利要求25的方法，其中，所述溶剂是丙酮、丁醇或丁酮。
27.根据权利要求22的方法，其中，所述有机溶剂与根据权利要求2-16中任一项所述的方法中使用的有机溶剂相同。
28.根据权利要求24-27中任一项的方法，其中，在盐例如氯化钠的存在下进行提取。
29.根据权利要求24-28中任一项的方法，其中，在搅拌下将所述盐和有机溶剂加至包含蒜素的溶液中，并且其中在加入所述盐和有机溶剂过程中防止乳液的形成或者至少将乳液的形成最小化。
30.一种制备蒜素的方法，所述方法包括：
(a)机械处理蒜氨酸酶的天然植物来源并且同时使经机械处理的产物受到离心力的作用，从而将包含蒜氨酸酶的溶液与蒜氨酸酶的天然植物来源分离；和
(b)使包含蒜氨酸酶来源的溶液与蒜氨酸的水溶液接触，由此使蒜氨酸在包含蒜氨酸酶的溶液中通过蒜氨酸酶经酶催化转化为蒜素。
31.根据权利要求30的方法，其中，所述方法为权利要求20-29中任一项中所限定的方法。
32.根据权利要求20-31中任一项的方法，其中，所述蒜氨酸酶的天然植物来源是生大蒜。
33.根据权利要求32的方法，其中，所述生大蒜为优选地已经去皮并清洗的蒜瓣的鳞茎形式。
34.根据前述任一项权利要求的方法，其中，所述包含蒜素的溶液包含至少约5000ppm的蒜素。
35.根据权利要求31的方法，其中，所述包含蒜素的溶液含有至少约10000ppm的蒜素，或者其中所述包含蒜素的溶液含有至少约15000ppm的蒜素，或者其中所述包含蒜素的溶液含有至少约20000ppm的蒜素，或者其中所述包含蒜素的溶液含有至少约22000ppm的蒜素。
36.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中，所述包含蒜素的溶液通过包括以下步骤的方法制备：在约0℃至约30℃的温度下，在过氧单硫酸钾的存在下，氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接着将所生成的蒜素提取至有机溶剂中。
37.一种制备蒜素的方法，所述方法包括：在约0℃至约30℃的温度下，在过氧单硫酸钾的存在下，氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接着将所生成的蒜素提取至有机溶剂中。
38.根据权利要求36或37的方法，其中，所述二硫化二烯丙基和过氧单硫酸钾的量足以生成具有约5000ppm至约22000ppm浓度的蒜素水溶液。
39.根据权利要求36至38中任一项的方法，其中，所述温度等于或小于约10℃。
40.一种组合物，所述组合物包含基于组合物的总体积计至少约30％w/v的阿藿烯。
41.根据权利要求40的组合物，所述组合物可通过根据权利要求1-29、34-36和38-39中任一项的方法获得。
42.根据权利要求40或41的组合物，所述组合物包含至少约35％w/v阿藿烯，或者包含至少约40％w/v阿藿烯，或者包含至少约45％w/v阿藿烯，或者包含至少约50％w/v阿藿烯。
43.以千克规模制备的并且通过根据权利要求1-29、34-36和38-39中任一项的方法获得的阿藿烯。
44.一种提高蒜素水溶液中的蒜素浓度的方法，所述方法包括冷冻蒜素的水溶液，从而增加蒜素的浓度。
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