CN102349445A - 一种低成本流水化生产组培苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低成本流水化生产组培苗的方法：包括培养基的配制、培养基的分装与灭菌、无菌操作进行外植体的分离与接种、组织培养等步骤，采用了聚丙烯薄膜袋代替传统玻璃容器，并改善了组织培养的照明光源。本发明中所使用的聚丙烯薄膜袋培养容器透光透气性好、成本低、重量轻、有效重量大、搬运更简单。通过本发明的改进，使得组培苗生产的成本降低，生产效率显著提高。

Description

一种低成本流水化生产组培苗的方法

技术领域

本发明涉及一种生产组培苗的方法，特别涉及一种低成本规模化生产组培苗的方法。

背景技术

植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。

但是，传统生产组培苗所使用的玻璃培养容器透光透气性差、成本高、重量大、有效重量小、搬运困难，易损坏。生产成本较高，生产效率较低，可以有更进一步低成本规模化生产组培苗技术的改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种易于推广的低成本组织培养容器，建立一种简便、低成本、流水化的组织培养方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明包括以下步骤：

（一）培养基的配制：

  （1） 称取以下重量分数的药品分别置于烧杯中：

KH₂PO₄  3.75

NH₄NO₃   36.43

KNO₃   41.94

CaCl₂·2H₂O  9.71

MgSO₄·7H₂O  8.17

在各烧杯中分别加入药品总重量33-34倍重的纯净水溶解后，按照所列各药品先后顺序将溶液缓慢混合入更大的烧杯中，同时不断搅拌，待用；

（2）称取以下重量分数的药品，药品总质量为（1）中药品总质量的1/22：

MnSO₄·4H₂O   10.8            ZnSO₄·7H₂O    4.17

H₃BO₃                 3.00            KI            0.40

Na₂MoO₄·2H₂O  0.12           CoCl₂·6H₂O     0.012

CuSO₄·5H₂O   0.012           FeSO₄·7H₂O    13.47

Na₂—EDTA     18.07          烟酸           0.24

维生素B6     0.24           维生素B1       0.05

甘氨酸        0.97           其余为肌醇

将以上药品置于烧杯中，加药品总重量1000倍重的纯净水溶解，

缓慢倒入（1）中配制好的溶液中，搅拌混匀后，待用；

（3）配制浓度为0.2mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）溶液；

（4）称取（2）中药品总重量30倍的琼脂、150倍的蔗糖倒入（1）步骤中的溶液中搅拌，加热沸腾后，根据不同植物的试管苗加入不同体积的（3）配制的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）溶液，最后按（1）中药品总重量计，每4.53g定容到1000mL，再逐滴滴入氢氧化钾溶液（1N）调节培养基的PH值到5.8；

（二） 分装与灭菌：  

将配制好的培养基趁热分装入聚丙烯薄膜袋中，用小夹子固定在一个用铁丝做成的简易框架上使其直立，然后放入高压灭菌锅消毒，灭菌时间在121℃保持18～20min即可；

  （三）无菌操作：

（1）无菌操作实验器具和材料的准备：包括超净工作台的无菌处理，消毒双手及切割刀和镊子等操作工具；

（2）灭菌结束后，将简易架子放在超净工作台上，整理薄膜袋使其能够直立，用塑料袋封口机封住袋口，薄膜袋静置至培养基凝固，待用；

（3）流水作业进行外植体的分离与接种：装有试管苗的培养袋、操作器具、培养皿及塑料袋封口机等用新洁尔灭或75%酒精擦拭消毒后放入超净工作台内；1号组培技术工人在超净工作台内将试管苗从培养袋中取出，置无菌滤纸上，用切割刀按照不同试管苗的繁殖要求对待繁殖的试管苗进行切割；同时2号技术工人剪开已灌装培养基且培养基已凝固的薄膜袋封口处，用消毒过并冷却的镊子将1号组培技术工人切割的繁殖的试管苗夹入薄膜袋内；3号组培技术工人将2号组培技术工人放入的块茎或茎段微***培养基中，若是叶柄水平放置；4号组培技术工人将3号组培技术工人做好的薄膜袋，用塑料袋封口机将其薄膜袋封口并编号，放置于培养室中的培养架上；

（四）按(三)所述步骤进行无菌操作，将薄膜袋封装的试管苗放置于培养室中的培养架上进行组织培养，组织培养的照明光源采用节能灯，优选为11瓦的节能灯。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、采用聚丙烯薄膜袋作为培养容器，其具较玻璃好的透光透气性，培养物较传统玻璃容器的青绿、健壮。聚丙烯薄膜传热良好，有利于培养物提早炼苗，使之更适应自然温度，移栽成活率高。

2、传统玻璃容器重量大而有效重量小，一般空瓶重约240克左右，而苗及培养基只有55克左右，有效重量是空瓶重量的23%左右，玻璃瓶的搬运成了一项比较繁重的体力劳动，若要将组培苗运入温室移栽，运输成本增加，且玻璃瓶所占体积较大，放入培养室培养，增加了存放费用。而聚丙烯薄膜袋重量轻，不仅降低了运输成本，而且减轻了工人的劳动强度，移栽时也方便。

3、传统玻璃容器成本高，一个350ml的玻璃容器需0.8～1.0元左右，而且容易破损，需要不断进行补充，而薄膜袋成本低，仅约0.035元/个。除此之外，使用传统玻璃容器清洗与消毒费用高，而聚丙烯薄膜袋作为容器免去了清洗费用且消毒费也降低了。

4、薄膜袋透光性好，再加上改进光源，使用节能灯，在培养室中若放置在1.0m×2.0m培养架上，仅需共44瓦的节能灯，培养物即可正常生长。

5、本发明建立的组培技术简便且易于掌握。流水化的接种步骤，提高了工作效率，采用此种方法不仅降低了组培苗的生产成本，而且提高了组培苗的生产效率，与传统方法相比起到了事半功倍的效果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

实施例1  

本实施例为培养基的配制：

  （1） 称取KH₂PO₄ 170mg，NH₄NO₃ 1650mg，KNO₃ 1900mg，CaCl₂·2H₂O 440mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，分别置于200mL的烧杯中，加纯净水150 mL溶解后，按照所列各药品先后顺序将溶液缓慢混合入2000mL的烧杯中，同时不断搅拌，待用。

（2） 称取MnSO₄·4H₂O 22.3 mg， ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg, H₃BO₃  6.2 mg ,  KI 0.83 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg，FeSO₄·7H₂O 27.8 mg，Na₂—EDTA 37.3 mg，烟酸 0.5 mg，维生素B6 0.5mg，维生素B1 0.1mg， 甘氨酸2.0 mg，肌醇100 mg于500mL的烧杯中，加纯净水200 mL溶解后，缓慢倒入1中的2000mL的烧杯中，搅拌混匀后，待用。

（3）配制浓度为0.2mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）溶液；

（4）准确称取琼脂6g、蔗糖30g倒入1步骤中的2000mL的烧杯中搅拌，加热沸腾后，根据不同植物的试管苗加入不同体积的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）溶液，最后加纯净水至烧杯刻度1000mL处，再逐滴滴入氢氧化钾溶液调节培养基的PH值到5.8。

实施例2  

本实施例为分装与灭菌  

将配制好的培养基趁热分装入聚丙烯薄膜袋中。用小夹子固定在一个用铁丝做成的简易框架上使其直立，然后放入高压灭菌锅消毒，灭菌121℃保持20min。

实施例3  

本实施例为无菌操作

（1）无菌操作实验器具和材料的准备：用新洁尔灭或75%酒精擦拭超净工作台，开超净工作台和室内紫外灯，杀菌20～30min。工作台面上的用品不能放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果；用新洁尔灭或75%酒精擦台面并消毒双手及试验用具，打开接种消毒器，温度达290℃～300℃时把操作工具（切割刀和镊子）放入消毒约2分钟，取出，放在工具架上冷却。

（2）灭菌结束后，立即将简易架子放在超净工作台上，整理薄膜袋使其能够直立，用塑料袋封口机封住袋口，薄膜袋静置至培养基凝固，待用。

（3）流水作业进行外植体的分离与接种：装有试管苗的培养袋、操作器具、培养皿及塑料袋封口机等用新洁尔灭或75%酒精擦拭消毒后放入超净工作台内。1号组培技术工人在超净工作台内将试管苗从培养袋中取出，置无菌滤纸上，用切割刀按照不同试管苗的繁殖要求对待繁殖的试管苗进行切割：若是茎段切为1cm，若是块茎纵切为1cm³，若是叶柄切段1～1.2cm，若是叶片切成1cm×1cm的方块；同时2号技术工人剪开已灌装培养基且培养基已凝固的薄膜袋封口处，用消毒过并冷却的镊子将1号组培技术工人切割的繁殖的试管苗夹入薄膜袋内；3号组培技术工人将2号组培技术工人放入的块茎或茎段微***培养基中，若是叶柄水平放置；4号组培技术工人将3号组培技术工人做好的薄膜袋（袋内有繁殖的试管苗），用塑料袋封口机将其薄膜袋封口，写上培养的试管苗编号，放置于置培养室中的培养架上。

实施例4  

本实施例为组织培养

按照实施例3介绍的无菌操作方法进行组织培养，将薄膜袋封装的试管苗放置于培养室中的培养架上进行组织培养， 对照明光源进行改进：照明光源采用11瓦的节能灯替代原40瓦的日光灯管。

实施例5

本实施例是对实施例1-4所述的技术的经济效果评价：

（1）配制1万瓶（传统玻璃容器250ml）培养基需500升，以培养基成分成本3元/升计算，需1500元。

配制1万袋（聚丙烯薄膜袋）培养基需400L，以培养基成分成本3元/升计算，需1200元。

（2）配制1万瓶（传统玻璃容器350ml）培养基，以50ml/瓶计算，需500升，一个工人一天可以配制15升，人工费40元/天，总共需1340元。

配制1万袋（聚丙烯薄膜袋）培养基，以40ml/袋计算，需400升，一个工人一天可以配制15升，人工费40元/天，总共需1070元。

（3）120L立式压力蒸汽灭菌锅一次可消毒150个玻璃瓶，而袋子可消毒200袋。同样一次灭菌需12度电，一度电一元钱，共计12元。一个工人一天可以消毒15升的培养基，人工费40元/天。消毒1万玻璃瓶，人工费1340元，电费消耗800元，共计2140元；消毒1万薄膜袋，人工费1070元，电费消耗600元，共计1670元。

（4）玻璃瓶封口膜0.10元/个，1万瓶培养基需1000元。聚丙烯薄膜袋0.035元/个，1万个薄膜袋350元。

（5）接种：每袋（瓶）接种18苗，一个工人工资40元/天，使用玻璃瓶，一人一天接种120瓶，使用薄膜袋，可接种200袋，接种1万瓶试管苗需人工费3334元。接1万袋试管苗需人工费2000元。

（6）若使用玻璃瓶，则需清洗瓶子。一个工人一天洗300个玻璃瓶，工资40元/天，1万瓶需1340元。

（7）光照培养电费核算：1.0m×2.0m培养架可放325袋培养基，由于薄膜袋透光性好，使用4个功率不同的节能灯共计44瓦，组培苗即可正常培养，照此计算，1万袋组培苗光照培养30天，一天照明时间10小时，耗电410度，电费 410元（1度电按1元计算）；同样，1.0m×2.0m培养架放置160瓶培养基，需三支40瓦日光灯管，耗电2268度，电费2668元。

（8）总成本：采用薄膜袋做培养容器，生产18万试管苗的成本是6700元，平均每苗成本0.0372元，采用玻璃瓶做培养容器，生产18万试管苗的成本是13322元，平均每苗成本0.0744元。采用薄膜袋做培养容器，节约生产成本6622元，试管苗每苗成本是玻璃瓶做培养容器的二分之一。

（9）运输费：载重1.0L的货车，平均2元/公里，一车可装20000袋，而若采用玻璃瓶，一车仅装7200瓶。按使用1.0L货车运输一公里计算，5万袋试管苗运输费5元钱，而5万瓶试管苗则需14元，节约9元，采用薄膜袋做培养容器的运输成本是采用玻璃瓶做培养容器运输成本的35.7%。

综上所述，本发明中所使用的聚丙烯薄膜袋培养容器透光透气性好、成本低、重量轻、有效重量大、搬运更简单。通过本发明的技术，使得组培苗生产的成本降低，生产效率显著提高。

Claims (2)

1.一种低成本流水化生产组培苗的方法，包括以下步骤：

（一）培养基的配制：

  （1） 称取以下重量分数的药品分别置于烧杯中：

KH₂PO₄  3.75

NH₄NO₃   36.43

KNO₃   41.94

CaCl₂·2H₂O  9.71

MgSO₄·7H₂O  8.17

在各烧杯中分别加入药品总重量33-34倍重的纯净水溶解后，按照所列各药品先后顺序将溶液缓慢混合入更大的烧杯中，同时不断搅拌，待用；

（2）称取以下重量分数的药品，药品总质量为（1）中药品总质量的1/22：

MnSO₄·4H₂O   10.8            ZnSO₄·7H₂O    4.17

H₃BO₃                 3.00            KI            0.40

Na₂MoO₄·2H₂O  0.12           CoCl₂·6H₂O     0.012

CuSO₄·5H₂O   0.012           FeSO₄·7H₂O    13.47

Na₂—EDTA     18.07          烟酸           0.24

维生素B6     0.24           维生素B1       0.05

甘氨酸        0.97           其余为肌醇

将以上药品置于烧杯中，加药品总重量1000倍重的纯净水溶解，

缓慢倒入（1）中配制好的溶液中，搅拌混匀后，待用；

（3） 配制浓度为0.2mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）溶液；

（4）称取（2）中药品总重量30倍的琼脂、150倍的蔗糖倒入（1）步骤中的溶液中搅拌，加热沸腾后，根据不同植物的试管苗加入不同体积的（3）配制的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）溶液，最后按（1）中药品总重量计，每4.53g定容到1000mL，再逐滴滴入氢氧化钾溶液（1N）调节培养基的PH值到5.8；

（二） 分装与灭菌：  

将配制好的培养基趁热分装入聚丙烯薄膜袋中，用小夹子固定在一个用铁丝做成的简易框架上使其直立，然后放入高压灭菌锅消毒，灭菌时间在121℃保持18～20min即可；

  （三）无菌操作：

（1）无菌操作实验器具和材料的准备：包括超净工作台的无菌处理，消毒双手及切割刀和镊子等操作工具；

（2）灭菌结束后，将简易架子放在超净工作台上，整理薄膜袋使其能够直立，用塑料袋封口机封住袋口，薄膜袋静置至培养基凝固，待用；

（3）流水作业进行外植体的分离与接种：装有试管苗的培养袋、操作器具、培养皿及塑料袋封口机等用新洁尔灭或75%酒精擦拭消毒后放入超净工作台内；1号组培技术工人在超净工作台内将试管苗从培养袋中取出，置无菌滤纸上，用切割刀按照不同试管苗的繁殖要求对待繁殖的试管苗进行切割；同时2号技术工人剪开已灌装培养基且培养基已凝固的薄膜袋封口处，用消毒过并冷却的镊子将1号组培技术工人切割的繁殖的试管苗夹入薄膜袋内；3号组培技术工人将2号组培技术工人放入的块茎或茎段微***培养基中，若是叶柄水平放置；4号组培技术工人将3号组培技术工人做好的薄膜袋，用塑料袋封口机将其薄膜袋封口并编号，放置于培养室中的培养架上；

（四）按(三)所述步骤进行无菌操作，将薄膜袋封装的试管苗放置于培养室中的培养架上进行组织培养，组织培养的照明光源采用节能灯。

2.根据权利要求1所述的一种低成本流水化生产组培苗的方法，其特征在于：组织培养的照明光源采用11瓦的节能灯。