CN102348809B

CN102348809B - 用于预测无复发存活的生物学标记物

Info

Publication number: CN102348809B
Application number: CN200980151408.6A
Authority: CN
Inventors: S·卡玛拉卡兰; V·瓦拉达恩; J·B·希克斯
Original assignee: Koninklijke Philips Electronics NV; Cold Spring Harbor Laboratory
Current assignee: Koninklijke Philips NV; Cold Spring Harbor Laboratory
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2029-12-22
Also published as: EP2382325B1; US20120004855A1; CN102348809A; WO2010073218A3; EP2382325A2; JP2012513197A; WO2010073218A2

Abstract

本发明提供了包含基因座DNA的甲基化分类列表，对所述基因座，DNA甲基化状态是癌症复发可能性的指征。另外，本发明提供了用于预测诊断为患癌症的对象的无复发存活概率的方法、设备和应用。

Description

用于预测无复发存活的生物学标记物

发明领域

本发明大体上属于统计学数据处理领域。更具体来说本发明涉及临床病理学信息相关的甲基化分类，其用于指示癌症复发的可能性。

发明背景

DNA甲基化，一种可以被遗传并随后可以被去除而不改变原始DNA序列的DNA化学修饰，是基因调控中研究得最清楚的表观遗传学机制。在DNA中存在称作CpG岛的区域，其中在碱基线性序列中胞嘧啶核苷邻接鸟嘌呤核苷出现。

已知存在于启动子区的这些岛的DNA甲基化可以作为基因沉默的机制。存在实验寻找差异甲基化的方法，例如差异甲基化杂交、甲基化特异性测序、HELP测定、重亚硫酸盐测序、CpG岛阵列等等。

在正常细胞中CpG岛通常严重地甲基化。然而在肿瘤发生期间，这些岛发生低甲基化，其可能导致某些重复序列(repeat)的表达。另外，这种低甲基化也与DNA断裂和基因组不稳定性相关。这些低甲基化事件还与一些癌症的严重性相关。某些情况下，在病变(如癌症)、印记、发育、组织特异性或X染色体失活中，基因相关的岛可能被严重甲基化。特别是在癌症中，肿瘤抑制子近侧的岛的甲基化是频繁的事件，经常发生在第二等位基因由缺失而丢失时(杂合性丢失，LOH)。一些常见的具有甲基化岛的肿瘤抑制子是p16，Rassf1a和BRCA1。

存在已报道的结肠直肠癌和***癌的表观遗传学标记物。例如，Epigenomics AG(Berlin，Germany)拥有Septin 9作为在血浆中筛选结肠直肠癌的标记物。US20050021240A1已经公开了一种使用甲基化位点来预测癌症中对不同治疗的应答及推荐合适治疗的方法。然而，该方法预测的结果是有限的。

本领域已知的方法包括使用免疫组织病理学变量(例如肿瘤大小、ER/PR状态、***阴性等)来定义临床预后指数，例如Nottingham预后指数(NPI)。这种指数的问题在于其已经显示为非常保守，因此即使在低复发风险的情况下通常也导致患者接受侵略性的治疗。

本领域已知的代替方法包括测量大量(通常是大约70个)基因的表达水平，并基于所述基因的相对表达水平来计算风险得分。这些预后测试不是特别特异，而且就需要组织操作而言还非常昂贵。由于RNA降解非常快，并且需要更小心的操作，所以难以使用RNA。

因此，改进的用于获取与临床病理学信息相关的统计学处理的甲基化数据的方法会非常有益，尤其是一个提供了增加的灵活性、成本效益和/或统计学校正的预后数据的方法也会是有益的。

发明概述

因此，本发明优选寻求单独地或者以任意组合缓解、减轻或消除一种或多种本领域的上述不足和缺点，并且通过提供所附的权利要求书的方法和序列表，解决至少上面提及的问题。

根据本发明的一个方面，提供了包括基因座DNA的甲基化分类列表，对所述基因座，DNA甲基化的状态是癌症复发可能性的指征。该甲基化分类列表包括至少一种序列，所述序列是包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：252的组中的序列。

所述甲基化分类列表的一个优点是它使得可以提供可在临床实践中广泛使用的临床预后测试。

另一方面，本发明提供了一种用于获得甲基化分类列表的方法，所述甲基化分类列表包括临床病理学信息相关的统计学处理的甲基化数据。该方法至少包括提供已知临床病理学历史的癌症患者的肿瘤DNA的步骤。然后，分析肿瘤DNA的甲基化状态，得到甲基化分类列表。该列表包括对统计学处理的甲基化数据的选择，其中该选择适于预测对象的无复发存活概率。这是有利的，由于相比于如基因表达数据，在临床场合中DNA甲基化可能更容易测量，从而使高度有用的临床预后测试成为可能。另一个好处是临床医生能够用发现的DNA甲基化标记物强大地(robustly)将患者分成好或差的预后组并因此作出适当的治疗选择。

另一方面，本发明提供了一种预测被诊断为患有癌症的对象的无复发存活概率的方法。该方法包括建立包括来自甲基化分类列表的至少一项(post)的标记物组(panel)，提供来自对象的DNA，分析所述来自对象的DNA对应于标记物组的部分的甲基化状态。其结果是包括统计学处理的甲基化数据的局部甲基化分类列表。对局部甲基化分类列表进行统计学分析，给出对象无复发存活的预测的概率。

另一方面，本发明提供了预测被诊断为患有癌症的对象的无复发存活概率的设备。该设备包括第一单元，其建立包括来自甲基化分类列表的至少一项的标记物组。该设备也包括第二单元，其提供来自对象的DNA和第三单元，其分析来自对象的DNA中对应于标记物组的部分的甲基化状态。输出是包括统计学处理的甲基化数据的局部甲基化分类列表。该设备还包括第四单元，其对局部甲基化分类列表进行统计学分析，提供对象无复发存活的预测的概率。所述单元可操作地彼此连接。

另一方面，本发明公开了使用甲基化分类列表来预测被诊断为患有癌症的对象的无复发存活概率的方法。

本发明进一步的实施方案在从属权利要求和实施方案描述中定义。

附图简述

下面的本发明实施方案描述中，本发明所能够达到的这些和其他方面的特征和优势将会明确和阐明，参考附图如下：

图1是根据一个实施方案的方法的图示概述；

图2是根据另一个实施方案的方法的图示概述；

图3是根据一个实施方案的设备的方框图；和

图4展示了一个实施方案所使用的Kaplan-Meier曲线的例图。

具体实施方式

为了使本领域技术人员能够实施本发明，以下将参考附图更详细地描述本发明的几个实施方案。但是，本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被局限于本文所述的实施方案内。相反，提供这些实施方案使得这项公开是彻底的和完整的，也能向本领域的技术人员完全传达本发明的范围。实施方案并不限制本发明，本发明仅受限于所附权利要求。此外，附图阐述的特定实施方案的详细描述中所使用的术语并不旨在限定本发明。

以下描述集中于本发明的一个实施方案，适用于一种获取甲基化分类列表方法，所述甲基化分类列表包括与临床病理学信息相关的统计学处理的甲基化数据。

在一个实施方案中，根据图1，提供了获取甲基化分类列表(12)的方法(10)，所述甲基化分类列表(12)包括与临床病理学信息相关的统计学处理的甲基化数据。该方法包括建立甲基化分类列表(12)，其基于对从已知临床病理学史的癌症患者的肿瘤提供(110)的DNA(11)进行的统计学分析(120)。所述肿瘤可以是例如89个肿瘤，其中83个具有长期(如10年)的相关临床病理学记录(如复发偶发(relapse incidental)或存活数据)。该方法将进一步详细描述如下。

在一个根据图2的实施方案中，提供了预测一个被诊断为患有癌症的对象无复发存活概率的方法(20)。该方法包括如下步骤。首先，建立(230)标记物组(23)。标记物组(23)包括来自甲基化分类列表(12)的至少一项。然后，提供(240)来自对象的DNA(24)。分析(250)来自对象的DNA(24)中对应于标记物组(23)部分的甲基化状态，得到包括统计学处理的甲基化数据的局部甲基化分类列表(25)。其次，对局部甲基化分类列表(25)进行统计学分析(260)，由此给出对象无复发存活的预测的概率(26)。

基于所述甲基化分类列表，通过从所述甲基化分类列表选择至少一项建立标记物组。用于分类的基因座的选择基于如下详述的Kaplan-Meier存活估计。为了从该表中选择特定的基因座进行测试，使用多种标准，如甲基化状态和复发可能性之间的差异的P-值。优选性能最佳的(Topeperforming)基因座；

通过考虑两个基因座之间在实现比单独一个基因座更好的复发预测中的协同作用，可以组合两个基因座；

在选择一个基因座而不是其它基因座时将考虑到甲基化测定的性能和容易性；以及

其它的信息如肿瘤级别或大小也可以被放进分类方案中，但不存在于表中。

其次，例如通过从对象(如从血液、组织、尿、唾液等)中进行提取而提供DNA。提取根据本领域技术人员熟知的方法进行，如乙醇沉淀或使用Qiagen的DNeasy Blood & Tissue试剂盒。结果得到对象DNA。

然后，分析对象DNA对应于标记物组序列的每一序列的甲基化状态，使用的是本领域技术人员熟知的方法，如差异甲基化杂交、甲基化特异性测序、HELP测定、重亚硫酸盐测序或使用CpG岛微阵列。结果是甲基化表。

在一个实施方案中，比对甲基化列表和标记物组，选择与标记物组中的项所匹配的甲基化列表中的项。使用一个下面进一步描述的局部甲基化分类来检查被选择项(即DNA序列)的甲基化状态，以此建立局部甲基化分类列表。然后对该局部甲基化分类列表进行下面进一步描述的诊断多变量分析。多变量分析的结果是该对象无复发存活的预测的概率。

甲基化分类

为了找到具有最高预后潜力的基因座，以下列方式构建甲基化分类列表。DNA提取根据本领域技术人员熟知的方法进行，如乙醇沉淀或使用Qiagen的DNeasy Blood & Tissue试剂盒。结果得到分类DNA。

使用本领域技术人员熟知的方法确定分类DNA的每一序列、每一基因座的甲基化状态，例如差异甲基化杂交、甲基化特异性测序、HELP测定、重亚硫酸盐测序或者使用CpG岛微阵列。将得出的基于分类DNA的甲基化列表用于甲基化分类。

甲基化分类由存活函数的Kaplan-Meier估计量进行，如以下所描述。

把从89个肿瘤得到的159,436个基因座中的每个基因座进行二元(binary)分类，即与一个好或坏的预后相关。这首先通过将特异基因座的甲基化状态分为非甲基化、部分甲基化和甲基化来实现。所述基因座的这3种可能的状态对应对象的三种可能分组。

本领域技术人员熟知的Kaplan-Meier估计量使用上述分组中的每个患者的复发时间并计算存活概率，S(t)，即是该组内的患者在给定的时间长度能无复发存活的概率。假设在一个特定的分组中有N个患者，并且N个样本中每个的观察到的复发时间为：

t₁≤t₂≤t₃...≤t_N。

对应于每个时间t_i，n_i是在时间t_i之前处于复发风险下的患者数量，而d_i是在时间t_i时经历了复发的患者数量。Kaplan-Meier存活函数定义为：

S (t) = \underset{t_{i} \leq t}{Π} \frac{n_{i} - d_{i}}{n_{i}}

对由每个甲基化基因座限定的三种分组中的每一种，用该Kaplan-Meier估计量导出无复发存活函数。当对时间绘图时，这些存活函数向我们给出存活曲线。存活曲线以时间为X轴，无复发存活概率为Y轴。因此，对于用特定基因座的甲基化状态产生的每个分组绘出一存活曲线。

图4展示了Kaplan-Meier曲线的例图。图4A是Topol 144777的图的例子，图4B是JMJD2C 67675的图的例子，图4C是DLGl 31375的图的例子，而图4D是Goosecoid 103370的图的例子。每幅图的顶部曲线代表甲基化状态0，底部曲线代表甲基化状态-1。Kaplan-Meier存活曲线以月份测量的时间做X轴和无复发存活概率做Y轴。每个患者分层(stratification)组由一Kaplan-Meier存活曲线代表，该曲线斜率记录了该组中的患者的复发倾向。因此，由急剧下降的曲线所代表的患者组提示该组中的患者处于高复发风险中，而拥有相对平缓的曲线的组中的患者处于较低复发风险。给定任意两条Kaplan-Meier曲线，我们可以了解这些曲线中在任意给定时间的差异来估计这两组中患者的复发风险差异。再一次，在任意给定的时间点，Kaplan-Meier曲线的值越低，提示属于该曲线所代表的组的患者有越高的复发风险。

然后使用Kaplan-Meier存活曲线差异的时间等级检验(log-rank)或Mantel-Haenszel检验，我们检查了每个基因座3种Kaplan-Meier存活曲线之间的统计学显著差异。在每一观察到的事件时间，时间等级检验统计学比对了任意两组存活函数的估计。其建立是通过计算在每一个观察到的事件时间，其中一组的观察与期望的事件数目，然后将这些相加以获得对发生事件的所有时间点的总体概括。令j＝1，..，.J为在任何组中观察到的癌症复发的不同时间。对每一时间j，令N_1j和N_zj分别为每一组中处于复发风险的患者数目。令N_j＝N_1j+N_zj。令O_1j和O_zj分别为在时间j的组中复发的数目，而且O_j＝O_1j+O_zj。假定O_j事件在时间j在2个组中都发生，分组为纯粹随机的无效假设将有一个超几何分布：

平均值等于

方差

V_{j} = \frac{O_{j} (N_{1 j} / N_{j}) (1 - N_{1 j} / N_{j}) (N_{j} - O_{j})}{N_{j} - 1}

然后时间等级检验统计对每个O_j与其在无效假设下的预期值进行比对，并定义为：

Z = \frac{Σ_{j = 1}^{J} (O_{j} - E_{j})}{\sqrt{Σ_{j = 1}^{J} V_{j}}}

通过使用卡方统计，上述Z值然后可转换为P值，即存活函数不同完全是偶然的概率：

p＝Pr(χ²(1)≥Z)

上述计算出的该P值给出了观察到的两条存活曲线的差异完全是偶然的概率。本领域技术人员熟知0.05或更低的P值可以解释为提示实际上可以确定，观察到的两条曲线的不同绝对不是由于完全偶然引起的。这将暗示任意达到0.05或更低的P值(统计学显著性)的基因座，是潜在的将患者分为好或差的预后组的好的生物学标记物。我们以上述方式评估了全部159436个基因座。具有至少0.05或更低的统计学显著性的基因座被存入一列表，示于表1，伴随着它们使对象区分为好或差的预后组的能力。获得的甲基化分类列表按照SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：252提供。虽然P值被用作将基因座包括在列表中的方法，但是一旦特定基因座被包括在内，关键元素是与该基因座相关的存活曲线。这些存活曲线提供了在初始诊断后确定患者在任意给定的点的复发风险的方法，并因此将用于诊断实施方案，如在下面诊断多变量分析部分所描述。

表1.能单独地区分患者为好和坏的预后组的统计学显著的甲基化基因座列表。

发明人已发现SEQ ID NO：135、78、230、82、120、60、75、63和173是有益的。所述序列的基因座令人吃惊地是用于将患者区分为好或差的预后组的好的生物学标记物。

局部甲基化分类

根据以下可以从甲基化分类列表(12)获得局部甲基化分类列表(25)。甲基化状态通过本领域内任意已知方法确定。DNA提取通过本领域技术人员熟知的方法进行，如乙醇沉淀或使用Qiagen的DNeasy Blood & Tissue试剂盒。从提取的DNA中，用技术人员熟知的方法测定分类DNA的每一序列、每个基因座的甲基化状态，例如差异甲基化杂交、甲基化特异性测序、HELP测定、重亚硫酸盐测序。由此得到的结果将是以二元变量0或1形式给出的每个测定基因座的甲基化状态。

在一个实施方案中，从甲基化分类列表中选出标记物1、2、5和10。然后评估患者样本的DNA并确定这些对应于标记物1、2、5和10的基因座每个的甲基化状态。结果示于表2。

表2.对应于标记物1、2、5和10的基因座每个的甲基化状态。

标记物	甲基化值
		标记物1	0
标记物2	1
		标记物5	1
标记物10	1

然后甲基化状态值输入至在“诊断多变量分析”部分详述的风险模型中，并最终得到输出，其基于在这些基因座的甲基化测量而给出患者的复发风险概率。

可以从SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：252中选出任意种类的标记物。然后，可以测定那些标记物每种的甲基化状态并输入分类模型中，该模型会给出与示于表2的列表类似的输出。

诊断多变量分析

在本发明的一个实施方案中，诊断测定可以仅包括来自提交的基因座列表的项中的一种，因此使其成为一个单变量诊断测定。而本实施方案中，在诊断乳腺癌时，给定的患者会立即进行如上所述的诊断测试，并对特异基因座的甲基化水平进行评估。依据甲基化水平是非甲基化、部分甲基化或全甲基化，将该患者放入合适的分组，因此提示该患者的无复发存活函数与对该特定分组和上述列表中特异基因座导出的函数是相似的。

例如，在甲基化状态下，基因座i的存活函数为S_{i＝Methylated}(t)。具有该甲基化状态的患者的复发风险可以从上面的存活函数估计为：

R(t)＝S_{i＝Methylated}(t)

因此，如果希望给出患者5年内的复发风险，上述风险函数将对t＝5年进行计算。

在另一个实施方案中，诊断测定可包括列表中几个基因座作为独立的风险因子。这些独立的风险因子将如上述方法测量，并且确定其各自的甲基化水平。然后，与前述实施方案描述的例子相似地推导出每个因子的风险函数。这些独立的风险然后可以使用任意数目的方法来组合，其中一个方法可能如下。

在含有K个基因座的诊断测试中，令R_i为基于基因座i的甲基化水平m_j的给定患者的5年内复发概率。该患者的总复发风险可以如下计算：

R (m_{1}, m_{2}, . . . m_{K}) = \frac{R_{1} R_{2} . . . R_{K}}{R_{1} R_{2} . . . R_{K} + (1 - R_{1}) (1 - R_{2}) . . . (1 - R_{K})}

在另一个实施方案中，在诊断测定中从单独基因座的风险评估可以进一步与其它风险因子如年龄、肿瘤大小、激素状态等组合。假定为相互独立的，来自这些单独因子的风险可以仅如上述一样进行组合，或者根据进一步的分析，所述因子可以以其它方式组合以鉴定不同风险因子的协同效应，因此将其包含进多变量诊断。

在一个实施方案中，根据图3，提供了用于预测已被诊断患癌症的对象无复发存活概率的设备(30)。该设备包括第一单元(330)，其建立包含来自权利要求1-3任一项的甲基分类列表的至少一项的标记物组(23)。该设备还包括第二单元(340)，其提供对象DNA(24)，和第三单元(350)，其分析对象DNA(24)中对应于标记物组(23)部分的甲基化状态，得到包括统计学处理的甲基化数据的局部甲基分类列表(25)。该设备还包括第四单元(360)，其对局部甲基化列表(25)进行统计学分析，由此获得对象无复发存活的预测的概率(26)。这些单元可操作地互相连接。

尽管本发明参考具体实施方案在上面做了描述，但不意味着限于本文指出的具体形式。相反，该发明仅受限于附上的权利要求，并且上述具体实施方案外的实施方案等同地可能在附上的权利要求的范围之内。

在权利要求中，术语“包括(comprises/comprising)”不排除其它元素或步骤的存在。此外，尽管单独地列出，多种方法、元素或方法步骤可以被例如单个单元或处理器实施。另外，尽管单独的特征可以包括在不同的权利要求中，这些特征可能有利地组合起来，并且包含在不同的权利要求中不意味着这些特征的组合不可行和/或不利。另外，单数的引用不排除复数。词语“一(a)”“一(an)”“第一”“第二”等不排除复数。权利要求中的参考标志仅提供为阐述的例子，而并不应被用来以任何方式来限制权利要求的范围。

Claims

1.用于预测已被诊断患有乳腺癌的对象无复发存活概率的设备(30)，所述设备包括：

第一单元(330)，其建立包括序列SEQ ID NO:135的甲基化分类列表的标记物组(23)；

第二单元(340)，其提供来自对象的DNA(24)；

第三单元(350)，其分析来自对象的DNA(24)中相应于标记物组(23)的部分的甲基化状态，得到包括统计学处理的甲基化数据的局部甲基化分类列表(25)；

第四单元(360)，其对局部甲基化列表(25)进行统计学分析(260)，由此获得对象无复发存活的预测的概率(26)。

2.如权利要求1的设备，其中所述甲基化分类列表进一步包括序列SEQ ID NO:78、230、82、120、60、75、63和173的至少一项。

3.如权利要求1的设备，其中所述甲基化分类列表包括序列SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:252。

4.如序列SEQ ID NO:135、78、230、82、120、60、75、63和173所述的多核苷酸序列在制备用于预测被诊断为患有乳腺癌的对象的无复发存活概率的甲基化分类列表中的用途。

5.如序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:252所述的多核苷酸序列在制备用于预测被诊断为患有乳腺癌的对象的无复发存活概率的甲基化分类列表中的用途。