CN102341501B

CN102341501B - 酮化合物的立体选择性的酶促还原的方法

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Publication number: CN102341501B
Application number: CN201080010291.2A
Authority: CN
Inventors: A.古普塔; M.博布科瓦; A.辰切尔
Original assignee: IEP GmbH
Current assignee: Cambrex IEP GmbH
Priority date: 2009-03-05
Filing date: 2010-03-03
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2030-03-03
Also published as: PL2403953T3; IL214972A; EP2403953A1; WO2010100195A1; KR101780510B1; JP5852885B2; US9045780B2; IL214972A0; EP2403953B1; KR20110134890A; DK2403953T3; TWI589696B; HUE033100T2; CA2753634A1; EP2226386A1; TW201043696A; PT2403953T; CA2753634C; SI2403953T1; JP2012519473A

Abstract

在酮化合物至对应的手性羟基化合物的立体选择性的、尤其是对映选择性的酶促还原方法中，其中用对映选择性的、NADH-特异性的氧化还原酶还原酮化合物，为了还原酮化合物，使用这样的多肽，其在位置204-208处表现出R-ADH-标签 H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R，且它们整体表现出下述其它结构特征：(i) N-端Rossmann卷曲GxxxGxG，(ii) 在位置87处的NAG-基序，(iii) 由S 139、Y 152和K 156组成的催化三联体，(iv) 在位置37处的带负电荷的氨基酸基团，(v) 在二聚化结构域中的2个C-端基序：[A; S]-S-F和[V; I]-DG-[G; A]-Y-[T; C; L]-[A; T; S]-[Q; V; R; L; P]，(vi) 在位置159 (在K 156下游4个位置)处的Val或Leu，(vii) 在位置178处的Asn，和(viii) 在位置188处的脯氨酸基团。

Description

酮化合物的立体选择性的酶促还原的方法

本发明涉及酮化合物至对应的手性羟基化合物的立体选择性的、尤其是对映选择性的酶促还原的方法，其中用对映选择性的、NADH-特异性的氧化还原酶还原酮化合物。本发明具体地涉及选出的氧化还原酶在该方法中的应用。

光学活性的羟基化合物是有价值的手性结构单元，被广泛地用于合成药理学活性的化合物、芳族物质、信息素、农用化学品和酶抑制剂。因此，在制药领域中可以特别地发现对手性化合物、和因而对手性合成技术的日益增加的需要，因为在将来，外消旋的化合物难以用作药品。

前手性的酮化合物的不对称还原是立体选择性的催化的一个领域，其中与化学催化相比，生物催化构成有力的竞争技术。不对称的化学氢化需要使用高毒性的且环境有害的重金属催化剂、极端的且因而能源密集的反应条件、以及大量有机溶剂。此外，这些方法经常以副反应和不足的对映体过量为特征。

在自然界，前手性的酮化合物至羟基化合物的还原和逆转进行的氧化发生在许多生化途径中，在初级代谢中和在次级代谢中，在每个生物体中，且由不同类型的仲醇脱氢酶(ADH)和氧化还原酶催化。一般而言，这些酶是辅因子依赖性的。

在不同的测序计划中，在每种情况下，已经鉴别出不同生物体的许多氨基酸序列，其中它们大抵涉及未知活性、功能和对映选择性和化学选择性的氧化还原酶。最近，基于许多实例，可以证实氧化还原酶用于工业过程的原则适用性。

最近，已经能够证实，分离的氧化还原酶在含有有机溶剂的含水/有机两相***中的应用，也是非常有效的、经济的和即使在高浓度(> 5%)也是可行的。在描述的***中，通常难溶于水的要还原的酮化合物因而与有机溶剂一起形成有机相。另外，可以部分地省掉有机溶剂本身。在该情况下，有机相由要还原的酮化合物形成(EP 1 383 899)。通过同时进行的仲醇氧化，实现辅酶再生，为此，在大多数情况下，使用廉价的水混溶的2-丙醇 (WO 2006/087235)。2-甲基-4-戊醇或2-辛醇用于再生辅因子NADH或NADPH同样是有利的(WO 2007/036257)。

在近年来的专利文献中，可以发现许多具有不同特异性和选择性的氧化还原酶。已经发现S-特异性的氧化还原酶和具有高对映选择性的脱氢酶的不同实例，它们几乎毫无例外地使用NADH作为辅因子，因而可以非常经济地用于上述工艺条件下。这样的S-特异性的氧化还原酶的实例是：来自***滑念珠菌（Candida parapsilosis）(CPCR) (US 5,523,223和US 5,763,236; Enzyme Microb. Technol. 1993年11月; 15(11):950-8)和荚膜毕赤酵母（Pichia capsulata）(DE 10327454.4) 的羰基还原酶，来自红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）(RECR) (US 5,523,223)、褐色诺卡氏菌（Norcardia fusca）(Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10) (1999), 第1721-1729页; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003年9月; 62(4):380-6; 2003年4月26日电子出版物)和赤红球菌（Rhodococcus ruber）(J. Org. Chem. 2003年1月24日; 68(2):402-6)的羰基还原酶。此外，描述了来自Rhodotorula mucillaginosa、微杆菌属（Microbacterium spec.）、Gordonia rubripertincta、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和Pichia trehalophila 的S-特异性的羰基还原酶(WO 2007/012428)。

从乳杆菌属（Lactobacillus）的生物体中鉴别出R-特异性的仲醇脱氢酶的实例：高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefir）(US 5,200,335)、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）(DE 19610984 A1; Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2000年12月; 56 Pt 12:1696-8)、稍小乳杆菌（Lactobacillus minor）(DE 10119274)和肉色明串珠菌（Leuconostoc carnosum）(WO 2007/012428)。所有这些酶具有下述缺点，即需要NADPH作为辅因子，所述NADPH实际上比NADH更昂贵，因而涉及相对高的工艺成本。

“R-特异性的”氧化还原酶是指这样的酶，其将未取代的羰基化合物（例如，2-丁酮、2-辛酮或苯乙酮）还原成对应的R-羟基化合物（即，R-2-丁醇、R-2-辛醇和R-2-苯基乙醇）。例如，R-特异性的氧化还原酶将4-卤素-3-氧代丁酸酯还原成S-4-卤素-3-羟基丁酸酯。

“S-特异性的氧化还原酶”是将未取代的羰基化合物（例如，2-丁酮、2-辛酮或苯乙酮）还原成对应的S-羟基化合物（即，S-2-丁醇、S-2-辛醇和S-2-苯基乙醇）的ADH。例如，S-特异性的氧化还原酶将4-卤素-3-氧代丁酸酯还原成R-4-卤素-3-羟基丁酸酯。

在本申请中，术语”特异性的”是指，形成的对应的对映异构体>95%。

此外，在最近的专利文献(EP 1152054 A1、WO 2007/033928、WO 2006/046455、WO 2005/033094)中，描述了来自木兰假丝酵母（Candida magnoliae）属的酵母的许多非特异性的NADPH-依赖性的酶。除了NADPH-依赖性以外，它们具有下述主要缺点，即它们不能用于具有底物偶联的辅酶再生的方法中，而是总是需要第二个酶***来进行辅酶再生。使用葡萄糖作为协同底物的葡萄糖脱氢酶优选地用于该目的。另外，这些酶具有下述缺点，即它们通常是非特异性的，即，未取代的羰基化合物（例如，2-丁酮、2-辛酮或苯乙酮）的还原通常产生外消旋的醇；仅在例外情况下，这些酶会选择性地工作。因此，使用这些酶，通常不可能对映选择性地还原底物，诸如4-卤素-3-氧代丁酸酯、3-氧代酯或脂族酮，例如，2-辛酮。

仅有非常有限数目的稳健的、NADH-依赖性的和明显R-特异性的氧化还原酶可供使用，它们可用于具有底物偶联的辅酶再生的方法中，使用仲醇、优选2-丙醇作为协同底物。

描述了例如来自芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)的NADH-依赖性的R-特异性的氧化还原酶(EP 1179 595 A1)。但是，它表现出对2-丙醇非常低的活性，因此不适用于具有底物偶联的辅酶再生的方法。

在WO 2007/012428中，描述了来自粉状毕赤酵母（Pichia farinosa）和Candida nemodendra的另外2种NADH-依赖性的R-特异性的氧化还原酶。其中已经能证实，对于来自粉状毕赤酵母的酶，使用2-丙醇的辅酶再生也是可能的，但是仅在至多15%(v/v)异丙醇的浓度。

此外，已知来自赖氏菌(Leifsonia)(US 7,172,894 B2, Biosci. Biotechnol. Biochem.,70 (2),2006, 第418-426页)和Devosia (WO 2004/027055)的NADH-依赖性的酶，其中至少来自赖氏菌的酶是R-特异性的，且据信能够实现底物偶联的辅酶再生。

但是，现在已知的氧化还原酶、尤其是明显R-特异性的酶，远远不足以用于开发酮化合物的立体选择性还原的整个市场潜力。一方面，这出于下述原因：关于底物范围、最佳pH以及温度稳定性和溶剂稳定性，各个酶具有非常不同的性质，它们经常相互补充。因此，即使相对类似的同源酶也可能对一种特定底物表现出完全不同的转化行为。另一方面，并非几乎所有描述的酶都被克隆并可在足够的程度上过表达，这意味着，这些酶不可用于工业用途。

为了尽可能宽广地开发酶促的不对称氢化的合成潜力，因此必须尽可能广泛地拥有一系列不同的工业上可利用的氧化还原酶。同时，可以清楚地限定对能有利地在工业上应用的酶的要求。

因此，本发明的目的是，鉴别和提供稳定的、NADH-依赖性的和R-特异性的氧化还原酶，它们适用于使用底物偶联的辅酶再生将酮化合物还原为手性醇的方法。

为此目的，必须提供对仲醇、尤其是对异丙醇具有尽可能高的稳定性的氧化还原酶。此外，要提供的酶应当以在大肠杆菌(Escherichia coli)中良好的表达能力(>500 单位/g大肠杆菌湿生物质) 为特征。

由于对在大肠杆菌中的稳定性和表达能力的高要求，在本发明中已经假定，细菌酶比来自酵母的酶更优选。

此外，本发明的目的是，鉴别氨基酸序列或基因序列，它们是重组表达稳定的NADH-依赖性的、(R)-特异性的氧化还原酶，且适用于在使用酶-偶联的辅酶再生情况下的工艺技术。

发明人已经发现，这样的序列通常表现出“短链”脱氢酶的已知特征，例如，用于辅因子结合的N-端Rossmann卷曲（Rossmann-Fold）GxxxGxG、在位置87处的NAG-基序（其用于稳定化中央的ß-折叠片结构）和在活性中心中的由S 139、Y 152和K 156组成的高度保守的催化三联体。为了本申请的目的，使用Score Matrix BLOSUM62，通过“多路蛋白比对算法(multi-way protein alignment algorithm)”，对蛋白序列中的各个同源氨基酸基团进行数字分配，并使用来自Streptomyces hydrogenans（登记代码2bhd_Strex）的3α,20β-羟基固醇脱氢酶作为参照。

由于在因特网上可得到多个具有该标签（Signatur）的氨基酸序列，需要定义其它特征，以便限制该序列库。发明人因此声明，具有所述性质的(R)-特异性的氧化还原酶必须另外表现出下述序列特征和模式：

· 在位置37处的带负电荷的氨基酸基团

· 在二聚化结构域中的2个C-端基序：[A; S]-S-F和[V; I]-DG-[G;A]-Y-[T; C; L]-[A; T; S]-[Q; V; R; L; P]

· 在位置204-208处的R-ADH-标签: H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R

· 在位置159 (在K 156下游4个位置)处的Val或Leu

· 在位置178处的Asn

· 在位置188处的脯氨酸基团。

根据该模式，从由测序计划可得到的序列库中，选择没有现有的功能分配的下述序列，克隆，并表征它们的功能。

表1

选择的蛋白的多路氨基酸序列对比。评分矩阵BLOSUM 62。以阴影形式说明：与来自Streptomyces hydrogenans的3α,20β-羟基固醇脱氢酶（登记代码2bhd_Strex）的参照序列相比，位置特异性的相同的氨基酸基团。发明人要求保护的序列基序经框出。

令人惊奇地，对于所有7个序列，已经能证实，它们是NADH-依赖性的R-ADH，它们具有足够的稳定性，尤其对于2-丙醇。此外，对于所有7种酶，已经可能证实，它们适用于具有协同底物偶联的辅酶再生的酶促还原过程。

这是令人惊奇的且意外的结果，特别是因为所述序列彼此之间表现出明显低程度的同源性(表2)，且甚至在序列对比(Pubmed/Blast)中，没有鉴别出会在该方向给出功能暗示的有关序列(表1)。

另一方面，进而能证实，本发明的酶在它们的酶性质方面十分不同，并在它们的方法适用性、尤其是特异性靶物方面彼此互补。

因而，前述氧化还原酶在根据本发明的方法中的应用，不代表与确立的现有技术等同的替代方案，而是拓宽了现有范围。

表2. 选择的氧化还原酶的逐对氨基酸序列对比。

在表2中的同源性程度被表示为相同氨基酸基团的百分比和最佳逐对比对中的移动数目。因此，通过BLAST-算法(Basic Local Alignement Search Tool)，确定最佳比对(Altschul 等人 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 87: 2264-2268)。

作为基础，使用PAM30矩阵作为评价序列相似性的评分矩阵 (Dayhoff; M.O., Schwarz, R.M., Orcutt, B.C. 1978. “A model of evolutionary change in Proteins”，于“Atlas of Protein Sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoff (编) 345-352, National Biomedical Research foundation)。

本发明的任务在于，提供酮化合物至对应的手性羟基化合物的对映选择性的酶促还原方法，其覆盖宽广底物范围，并在在工艺技术条件下提供高转化率。

根据本发明，所述任务通过最初提及的类型的方法来实现，所述方法的特征在于，为了还原酮化合物，使用这样的多肽，其在位置204-208处表现出R-ADH-标签 H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R，且它们整体表现出下述其它结构特征：

(i) N-端Rossmann卷曲GxxxGxG，

(ii) 在位置87处的NAG-基序，

(iii) 由S 139、Y 152和K 156组成的催化三联体，

(iv) 在位置37处的带负电荷的氨基酸基团，

(v) 在二聚化结构域中的2个C-端基序：[A; S]-S-F和[V; I]-DG-[G; A]-Y-[T; C; L]-[A; T; S]-[Q; V; R; L; P]，

(vi) 在位置159 (在K 156下游4个位置)处的Val或Leu，

(vii) 在位置178处的Asn，和

(viii) 在位置188处的脯氨酸基团。

根据根据本发明的方法的一个优选实施方案，使用多肽来还原酮化合物，

(a) 其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7之一，或

(b) 其中，至少70%的氨基酸与氨基酸序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7之一的氨基酸相同，或

(c) 其由选自SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:14的核酸序列编码，或

(d) 编码它的核酸序列在严格条件下与在(c)中提及的核酸序列之一杂交。

在严格条件下例如与SEQ ID NO:14杂交的核酸序列，是指通过菌落杂交方法、噬菌斑杂交方法、DNA杂交方法或相当的方法可以鉴别出的多核苷酸，其中使用SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:14的部分序列作为DNA探针。为此目的，在65℃，在0.7-1 M NaCl溶液中，使固定化在滤器上的多核苷酸例如与SEQ ID NO:14杂交。例如，如Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)的规程32所述，或如在类似的出版物中所述，进行杂交。随后，在65℃，用0.1-2倍SSC溶液洗涤滤器，其中1倍SSC溶液是指由150 mM NaCl和15 mM柠檬酸钠组成的混合物。

在上述严格条件下与多核苷酸SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14杂交的多核苷酸应当分别与多核苷酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14表现出至少68%序列同一性，优选至少80%的同一性，更优选95%的同一性。

根据另一个优选实施方案，使用通式I的酮化合物，

其中R₁、R₂和R₃彼此独立地选自：

1) -H，条件是，R₁不是H，

2) -(C₁-C₂₀)-烷基，其中烷基是直链或支链的，

3) -(C₂-C₂₀)-烯基，其中烯基是直链或支链的，且任选地含有至多4个双键，

4) -(C₂-C₂₀)-炔基，其中炔基是直链或支链的，且任选地含有至多4个叁键，

5) -(C₆-C₂₄)-芳基，

6) -(C₁-C₈)-烷基-(C₆-C₁₄)-芳基，

7) -(C₅-C₁₄)-杂环，

8) -(C₃-C₇)-环烷基，

其中上面在2)-8)下提及的基团是未取代的，或被下述取代基彼此独立地取代1、2或3次：-OH、卤素、-NO₂、-NH₂、-NHP和/或-M，其中P代表-(C₁-C₇)-烷基、-(C₂-C₇)-烯基、-(C₂-C₇)-炔基、-(C₆-C₁₄)-芳基或选自苄氧基羰基、三苯基甲基和叔丁基羰基的保护基，且M代表-(C₁-C₇)-烷基、-(C₂-C₇)-烯基、-(C₂-C₇)-炔基、-(C₆-C₁₄)-芳基或-(C₁-C₈)-烷基-(C₆-C₁₄)-芳基，其中在-(C₁-C₈)-烷基-(C₆-C₁₄)-芳基中的-(C₆-C₁₄)-芳基是未取代的，或被卤素取代1、2或3次，和

9) -CH₂-X-R，其中X代表O或S，且R选自-(C₁-C₇)-烷基、苯基和苄基，其中苯基和苄基被下述取代基取代1、2或3次：-(C₁-C₇)-烷基、-S(C₁-C₃)-烷基、-O(C₁-C₃)-烷基、-NO₂、-SCF₃、卤素、-C(O)(C₁-C₃)-烷基和/或-CN，

或者，R₁与R₂一起，R₁与R₃一起，或R₂与R₃一起，形成包含3-6个C-原子的环，所述环是未取代的，或被下述取代基彼此独立地取代1、2或3次：-OH、卤素、-NO₂、-NH₂、-NHP和/或-M，且剩余基团选自上面在1)-9)下提及的基团。

根据另一个优选实施方案，使用通式II的二酮，

其中

R₅代表(CH₂)_n（其中n = 0–20）、-(C₆-C₁₄)-芳基或-(C₅-C₁₄)-杂环，

R₄和R₆彼此独立地代表-(C₁-C₂₀)-烷基或酯基团，

其中R₄、R₅和R₆ 是未取代的，或被下述取代基彼此独立地取代1、2或3次：-(C₁-C₄)-烷基、-OH、卤素、-NO₂和/或-NH₂。

在根据本发明的方法中，进一步优选地，

- 由氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的辅因子NAD被连续再生，且

- 具有通式R_XR_YCHOH的仲醇被用于辅因子再生，其中R_X和R_Y彼此独立地是支链的或直链的C₁-C₈-烷基，且C_总数 ≥ 3。

术语”NAD”是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，术语”NADH”代表还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

在使用的氧化还原酶和NAD的辅助下，仲醇(=协同底物) 被转化成对应的酮和NADH，由此再生NADH。在该过程中，用于再生的协同底物的份额是5-95体积%，基于总体积，优选10-70%，特别优选20-50%。

特别优选地，使用2-丙醇或2-丁醇作为用于辅因子再生的仲醇。优选地，在2-丙醇的情况下，使用10-70% (v/v)，特别优选地20-50% (v/v)。

术语“芳基”是指，在一个环/在多个(稠合的和完全缀合的)环内包含6-24个碳原子的芳族碳基团。-(C₆-C₂₄)-芳基基团是，例如，苯基、萘基（例如，1-萘基、2-萘基）、联苯基（例如，2-联苯基、3-联苯基和4-联苯基）、蒽基、芴基、菲基或环戊烷并全氢菲基。联苯基基团、萘基基团、尤其是苯基基团是优选的芳基基团。

术语“卤素”是指来自氟、氯、溴或碘系列的元素。

术语“-(C₁-C₂₀)-烷基”是指这样的烃基团，其碳链是直链或支链的，且包含1-20个碳原子，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。

术语“-(C₃-C₇)-环烷基”是指环状烃基团，诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。

术语“-(C₅-C₁₄)-杂环”代表单环的或双环的5元至14元杂环，其是部分饱和的或完全饱和的。N、O和S 是杂原子的实例。术语“-(C₅-C₁₄)-杂环”的实例是，源自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、四唑、1,2,3,5-氧杂噻二唑-2-氧化物、***酮、噁二唑酮、异噁唑酮、噁二唑烷二酮、***的基团，它们被例如下述取代基取代：F、-CN、-CF₃或-C(O)-O-(C₁-C₄)烷基；3-羟基吡咯-2,4-二酮、5-氧代-1,2,4-噻二唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吲哚、异吲哚、吲唑、酞嗪、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、咔啉，以及所述杂环的苯并稠合的、环戊-、环己-或环庚-稠合的衍生物。特别优选的是：基团2-或3-吡咯基、苯基吡咯基（诸如4-或5-苯基-2-吡咯基）、2-呋喃基、2-噻吩基、4-咪唑基、甲基咪唑基（例如，1-甲基-2-、-4-或-5-咪唑基）、1,3-噻唑-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-、3-或4-吡啶基-N-氧化物、2-吡嗪基、2-、4-或5-嘧啶基、2-、3-或5-吲哚基、经取代的2-吲哚基（例如，1-甲基-、5-甲基-、5-甲氧基-、5-苄氧基-、5-氯-或4,5-二甲基-2-吲哚基）、1-苄基-2-或-3-吲哚基、4,5,6,7-四氢-2-吲哚基、环庚[b]-5-吡咯基、2-、3-或4-喹啉基、1-、3-或4-异喹啉基、1-氧代-1,2-二氢-3-异喹啉基、2-喹喔啉基、2-苯并呋喃基、2-苯并噻吩基、2-苯并噁唑基或苯并噻唑基或二氢吡啶基、吡咯烷基（例如，2-或3-(N-甲基吡咯烷基) ）、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢噻吩基或苯并二氧戊环基。

优选的式I化合物是，例如，4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯、乙基-8-氯-6-氧代辛酸、3-氧代戊酸乙酯、4-羟基-2-丁酮、乙基-2-氧代戊酸酯、乙基-2-氧代-4-苯基丁酸、丙酮酸乙酯、乙基苯基乙醛酸酯、1-苯基-2-丙酮、2-氯-1-(3-氯苯基)乙-1-酮、苯乙酮、2-辛酮、3-辛酮、2-丁酮、1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙-1-酮、1,4-二氯-2-丁酮、乙酰氧基丙酮, 氯乙酰苯, 4-溴乙酰乙酸乙酯、1,1-二氯丙酮、1,1,3-三氯丙酮或1-氯丙酮。

通式R-CO-CH2-X的芳族或杂芳族化合物是特别优选的化合物，其中X =卤素，且R代表根据上面式I的定义的基团。

其它优选的化合物是二酮，诸如2,5-己二酮、2,4-戊二酮、2,7-辛二酮、2,7-二甲基-3,6-辛二酮或丁二酮(Diacetyl)。

在根据本发明的方法中，所述氧化还原酶可以以完全纯化的或部分纯化的状态使用，或所述方法可以用含有所述氧化还原酶的细胞来执行。在这样做时，使用的细胞可以以天然的、渗透化的或裂解的状态提供。优选地，分别使用根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7的克隆的氧化还原酶和它们的同源物。

每kg要转化的酮化合物使用5000-10,000,000 U的氧化还原酶(没有上限)。酶单位1 U对应着每分钟(min)转化1 μmol酮化合物所需的酶量。

在根据本发明的方法中，所述酮化合物的用量范围是3%-50%（基于总体积），优选5%-40%，尤其是10%-30%。

在根据本发明的方法中实现的TTN (总转化数=还原的酮化合物的摩尔数/使用的辅因子的摩尔数)通常是10²至10⁵，但是，优选地，它是≥10³。

为了再生辅因子，可以另外加入醇脱氢酶，但是，优选地，所述方法仅用氧化还原酶来实现 (底物偶联的辅酶再生)。

在其中进行酶促还原的反应混合物的含水部分优选地含有缓冲液，例如，磷酸钾、tris/HCl或三乙醇胺缓冲液，其具有5-10的pH 值，优选6-9的pH 值。另外，所述缓冲液可以含有用于稳定化或活化酶的离子，例如，锌离子或镁离子。

在执行根据本发明的方法时，温度合适地是约10℃-70℃，优选20℃-45℃。

在根据本发明的方法的另一个可能的实施方案中，在有有机溶剂存在下进行酶转化，所述有机溶剂不与水混溶，或仅在有限程度上与水混溶，且不参与辅因子再生，即不含有任何可氧化的羟基。所述溶剂可以是，例如，对称的或不对称的二(C₁-C₆)烷基醚、直链或支链烷烃或环烷烃。优选地，***、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷、甲苯、二氯甲烷、环己烷或其混合物被用作额外的有机溶剂。

辅因子NAD(H)在水相中的浓度通常是0.001 mM至1 mM，尤其是0.01 mM至0.1 mM。

在根据本发明的方法中，也可以使用氧化还原酶/脱氢酶的稳定剂。合适的稳定剂是，例如，甘油、山梨醇、1,4-DL-二硫苏糖醇 (DTT)或二甲亚砜 (DMSO)。

酶促还原自身在温和条件下进行，使得产生的醇不会进一步反应。根据本发明的方法具有长服务期限(Standzeit)、通常超过95%的产生的手性醇的对映异构纯度和高产率（基于使用的酮化合物的量）。

根据本发明的方法在例如由玻璃或金属制成的密闭反应容器中进行。为此目的，将组分单个地转移进反应容器中，并在例如氮或空气气氛下搅拌。反应时间是1小时至48小时，尤其是2小时至24小时。

随后，后处理反应混合物。为此目的，分离水相，过滤有机相。任选地，可以再萃取水相一次，并像有机相一样进一步后处理。然后，任选地从过滤的有机相中蒸发溶剂。

通过下面的实施例，更详细地解释本发明，并与现有技术相对比地，证实鉴别的氧化还原酶的特别性质。

实施例 1: 氧化还原酶 SEQ ID NO:5 的克隆和表达

A) 富养罗尔斯通氏菌（ Ralstonia eutropha ） JMP134 的培养

在细菌培养箱中，在30℃，在下述培养基(pH 7.0)中，培养富养罗尔斯通氏菌 DSM 4048细胞：0.5%蛋白胨、0.3%肉膏。在培养的第3天，通过离心，从培养基中分离出细胞，并在-80℃保存。

B) 编码选择性的氧化还原酶的基因的扩增

根据在Manniatis和Sambrook的“Molecular Cloning” (参见上面)中描述的方法，提取基因组DNA。得到的核酸用作聚合酶链式反应(PCR)的模板，其中使用特异性的引物，所述引物源自在NCBI 数据库的编号53760931下公开的基因序列。在这样做时，在引物的5’-端位置提供内切核酸酶Nde I和Xho I的限制位点，用于以后克隆进表达载体中。

使用下述温度循环，在含有500 ng基因组DNA的PCR缓冲液[10 mM Tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO₄; 1 mM dNTP混合物; 20 pMol每种引物和2.5 U 铂Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen)]中，进行扩增：

循环1: 94℃, 2 min

循环2 x 30: 94℃, 30秒

55℃, 30秒

68℃, 60秒

循环3: 68℃, 7 min

4℃, ∞ 。

通过1%琼脂糖凝胶纯化后，在内切核酸酶Nde I和Xho I辅助下，限制得到的具有约750碱基对大小的PCR产物，并连接进pET21a载体(Novagen)的主链中，该主链已经用相同的内切核酸酶处理过。在将2 μl连接批次转化进大肠杆菌Top 10 F`细胞 (Invitrogen)以后，通过使用内切核酸酶Nde I 和 Xho I进行限制酶切分析，测试氨苄西林-抗性的菌落的质粒DNA中具有750碱基对大小的***片段的存在。对来自片段阳性的克隆的质粒制品进行序列分析，随后转化进大肠杆菌 BL21 Star(Invitrogen)中。

实施例 2: 重组氧化还原酶在大肠杆菌中的表达

在200 ml含有氨苄西林 (50 µg/ml)或羧苄西林 (50 µg/ml)的 LB培养基 (1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母浸出物、1% NaCl)中，培养已经用表达构建体转化的大肠杆菌株BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, 德国)和RB791 (大肠杆菌品种, Yale, USA)，直到达到0.5的光密度（在550 nm测量）。通过加入0.1 mM浓度的异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)，诱导重组蛋白的表达。在诱导8或16小时后，在25℃和220 rpm，收获细胞，并在-20℃冷冻。对于活性实验，将10 mg细胞与500 µl 100 mM TEA缓冲液pH 7.0和500 µl 玻璃珠相混合，并使用球磨机粉碎10 min。然后将得到裂解物以稀释状态用于各种测量。活性实验由下述物质组成：870 µl 100 mM TEA缓冲液pH 7.0、160 µg NAD(P)H、10 µl稀释的细胞裂解物。通过向反应混合物中加入100 µl 100 mM底物溶液，开始反应。

本发明的氧化还原酶可以在大肠杆菌中非常有效地表达。表3显示了在表达中实现的各酶的活性。

表3。

	表达载体	表达株	参照	活性U/g
					SEQ ID NO:1	pET21a	BL21 Star	2-辛酮	2650 U/g
SEQ ID NO:2	pET21a	BL21 Star	乙酰乙酸甲酯	1570 U/g
					SEQ ID NO:3	pQE70	BL21 Star	CLAEE	3130 U/g
SEQ ID NO:4	pET21a	BL21 Star	乙基-2-氧代-4-苯基丁酸酯	400 U/g
					SEQ ID NO:5	pET21a	BL21 Star	CLAEE	2890 U/g
SEQ ID NO:6	pQE70	BL21 Star	乙酰乙酸甲酯	840 U/g
					SEQ ID NO:7	pET21a	BL21 Star	乙酰乙酸甲酯	3295 U/g

实施例 3: 重组氧化还原酶 SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:7 的表征

3a: 最佳 pH

制备在表4中列出的缓冲液。在每种情况下，各种缓冲液组分的浓度是50 mM。

表4。

pH-值	缓冲液***	pH-值	缓冲液***
				4	乙酸钠/乙酸	7.5	KH₂PO₄/K₂PO₄
4.5	乙酸钠/乙酸	8	KH₂PO₄/K₂PO₄
				5	乙酸钠/乙酸	8.5	KH₂PO₄/K₂PO₄
5.5	KH₂PO₄/K₂PO₄	9	甘氨酸/NaOH
				6	KH₂PO₄/K₂PO₄	9.5	甘氨酸/NaOH
6.5	KH₂PO₄/K₂PO₄	10	甘氨酸/NaOH
				7	KH₂PO₄/K₂PO₄	11	甘氨酸/NaOH

测量批次(30℃)-最佳pH还原：

870 µl 在表3中提及的每种缓冲液***

20 µl NADH 10 mM

10 µl 稀释的酶

在温育约2-3 min后，加入

100 µl 底物溶液 (100mM)。

使用各种参照底物(表3)作为每种氧化还原酶的底物。在340 nm，跟踪反应物1 min。为了确定最佳pH，测定了在表4中列出的各种缓冲液中的酶反应。为了确定氧化反应的最佳pH，使用NAD作为辅因子，使用2-丙醇或2-辛醇作为底物。

在表5中，列出了氧化还原酶SEQ ID NO:1 – SEQ ID NO:7的结果。

表5。

SEQ ID NO	还原最佳pH	氧化最佳pH
			SEQ ID NO:1	5.5-6.5	9.0-9.5
SEQ ID NO:2	5.0-5.5	9-10
			SEQ ID NO:3	5.5	10-11
SEQ ID NO:4	5.5	9-10
			SEQ ID NO:5	7.0-7.5	9.5-10
SEQ ID NO:6	5.5-6.5	7.5
			SEQ ID NO:7	5.5	10-11

3b: pH 稳定性

通过将它们储存在表4中提及的缓冲液***中，检查重组氧化还原酶的稳定性。为此目的，制备在pH 4-11范围内的不同缓冲液(50mM)，并用它们稀释根据实施例4制备的氧化还原酶。在温育30、60和120分钟以后，从批次中取出10 µl，并用于根据实施例3a的活性实验中。

在此情况下，初始值是在磷酸钾缓冲液（50 mM，pH = 7.0）中稀释(1:20)酶以后立即得到的测量值。在给定的条件下，所述值对应着约0.70 /min的消失变化，并设定为100%值。所有以后测量的值与该值建立关系。

在表6中，为指定的氧化还原酶列出了所述酶在温育120 min时表现出不小于初始活性的50%的pH范围。

表6。

SEQ ID NO	pH-范围稳定性
		SEQ ID NO:1	4.5-9.5
SEQ ID NO:2	7.0-10
		SEQ ID NO:3	5.5-11
SEQ ID NO:4	5.5-9.5
		SEQ ID NO:5	7.5-11
SEQ ID NO:6	6-11
		SEQ ID NO:7	5-11

3c: 最佳温度

为了确定最佳实验温度，在15℃-70℃的温度范围，在标准测量批次中，测量了根据本发明使用的氧化还原酶的酶活性。

在表7中列出了测得的最佳温度:

表7

。

3d: 温度稳定性

以与在实施例3c下所述类似的方式，测定在15℃-70℃范围内的温度稳定性。为此目的，在每种情况下，在各个温度，温育根据本发明使用的氧化还原酶的稀释物60 min和180 min，并随后使用上述实验批次在30℃测量。在表8中，为氧化还原酶列出了所述酶在温育120 min时表现出不小于初始活性的50%的温度范围。

表8。

SEQ ID NO	温度范围
		SEQ ID NO:1	15-45℃
SEQ ID NO:2	15-35℃
		SEQ ID NO:3	n.b
SEQ ID NO:4	n.b
		SEQ ID NO:5	15-35℃
SEQ ID NO:6	15-35℃
		SEQ ID NO:7	15-45℃

3e: 相对于 2- 丙醇的稳定性

通过在含有对应百分比份额的2-丙醇 (约10 单位/ml缓冲液)的缓冲液(KPP 100 mM, pH=7.0)中稀释在实施例2中得到的裂解物(来自重组表达)，测试要检查的氧化还原酶相对于2-丙醇的稳定性。在恒定彻底混合下(热混合器在170 rpm)，在室温温育该批次。温育24 h后，从水相取出各10 µl，并用于在标准实验批次 (磷酸钾缓冲液(KPP) 100 mM, pH = 7.0, 0.2 mM NADH, 10 mM底物)中测定酶活性。也在该情况下，在缓冲液中稀释后立即得到的初始值设定为100%，所有其它值与它建立关系。

表9: 用含有2-丙醇的混合物温育24 h后的酶活性。

SEQ ID NO	缓冲液	10% 2-丙醇	20% 2-丙醇	30% 2-丙醇	40% 2-丙醇
						SEQ ID NO:1	100%	100%	100%	100%	30%
SEQ ID NO:2	100%	100%	100%	100%	30%
						SEQ ID NO:3	100%	80-100%	50-75%	25-30%	0%
SEQ ID NO:4	100%	80-100%	50-75%	0%	0%
						SEQ ID NO:5	100%	100%	100%	100%	0%
SEQ ID NO:6	100%	80-100%	50-75%	50-75%	50-75%
						SEQ ID NO:7	100%	80-100%	50-75%	25-30%	25-30%

从表9可以看出，所有检查的序列在2-丙醇中表现出令人惊讶的稳定性，即，所有氧化还原酶在20%异丙醇中会稳定至少24 h，但是大多数酶甚至在40% (v/v)时24 h以后仍然表现出多达75%的大量残余活性。

这表明，序列SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:7特别适用于使用2-丙醇的底物偶联的方法。

3f: 氧化还原酶 SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:7 的底物范围对比

通过测量所述酶对一系列酮和醇的还原和氧化活性，可以确定要表征的序列的底物范围。为此目的，使用不同的底物，使用根据实施例2的标准测量批次。

将所有酶对乙酰乙酸甲酯的活性设定为100%，所有其它底物与它建立关系。

表10: 底物范围/还原。

底物	SEQ ID NO:1	SEQ ID NO:2	SEQ ID NO:3	SEQ ID NO:4	SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:6	SEQ ID NO:7
								1-苯基-2-丙酮	15%	7%	70%	37%	<1%	<1%	16%
氯乙酰苯	3.4%	1%	50%	<1%	<1%	15%	10%
								苯乙酮	3.5%	6%	30%	<1%	<1%	3.5%	32%
萘乙酮	3%	9%	30%	7%	<1%	25%	17%
								丁酰酮	3%	1%	<%	<1%	<1%	<1%	<1%
2-辛酮	92%	2%	33%	70%	26%	23%	49%
								3-辛酮	22%	2%	15%	5%	13%	2%	15%
2-丁酮	8.5%	4.5%	30%	5%	<1%	7%	6%
								乙基-2-氧代戊酸酯	3%	60%	70%	17%	<1%	15%	<1%
乙基-2-氧代-4-苯基丁酸	3%	50%	118%	35%	45%	18%	10%
								丙酮酸乙酯	140%	70%	100%	64%	13%	116%	160%
乙基苯基乙醛酸酯	4.8%	53%	7.5%	3%	<1%	<1%	<1%
								乙基-4-氯-乙酰乙酸酯	12.5%	20%	21%	100%	50%	10%	<1%
甲基-乙酰乙酸酯	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%
								乙基-3-氧代戊酸酯	3.5%	30%	76%	11%	<1%	10%	12%
丙酮	4.5%	16%	38%	5%	<1%	3.5%	8%

测定选择的底物的对映体过量。为此使用下述反应批次：

● 160 µl 缓冲液

● 100 µl NAD (0.4 mg/ml)

● 20-50 µl 2-丙醇

● 50 µl 酶溶液

● 2 mg 底物

● 反应条件: 28℃, 24h。

在温育阶段结束后，根据底物，使用溶剂萃取样品，并离心。取出1个等分试样，任选地，完全去除萃取剂，随后，将样品溶解于合适的溶剂中，并通过气相色谱法（GC）测定对映体过量。

表11: 选择的底物的对映选择性

底物

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

SEQ ID NO:3

SEQ ID NO:4

SEQ ID NO:5

SEQ ID NO:6

SEQ ID NO:7

氯乙酰苯

≥99.9% S

97.5% S

60-80% S

≥99.9% S

苯乙酮

99.0% R

98.5% R

99.0% R

98.5% R

2-戊酮

≥99.9% R

98% R

95% R

99.0% R

97% R

99.5% R

2-辛酮

≥99.9% R

2-丁酮

≥96.0% R

n.b

rac

50% R

丙酮酸乙酯

98.0% R

≥99.9% R

乙基-4-氯-乙酰乙酸酯

99.0% S

≥99.9% S

乙酰乙酸甲酯

≥99.9% R

98.5% R

≥99.9% R

“rac”: 非选择性还原，即，两种对映异构体以大致相同的比例形成

n.b = 未测定，无转化。

如下计算对映体过量:

ee(%) = ((R-醇- S-醇)/(R-醇+ S-醇)) x 100。

通过采用下述的活性实验，对比了上述氧化还原酶的氧化潜力以及对于再生的适用性：870 µl 100 mM TEA缓冲液，pH 8.0，160 µg NAD，10 µl稀释的细胞裂解物。通过向反应混合物中加入100 µl 100 mM底物溶液，开始反应。

在该情况下，将具有最高活性的底物设定为100%。

表12: 底物范围/氧化

底物	SEQ ID NO:1	SEQ ID NO:2	SEQ ID NO:3	SEQ ID NO:4	SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:6*	SEQ ID NO:7
								S-2-辛醇	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
R-2-辛醇	100%	31%	100%	100%	100%	100%	100%
								S-2-丁醇	1%	20%	30%	2%	2.5%	<2%	0%
R-2-丁醇	3%	100%	58%	18%	14%	60%	50%
								S-苯基-2-丙醇	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
R-苯基-2-丙醇	<1%	20%	50%	2%	25%	0%	50%
								2-甲基-4-戊醇	<1%	20%	10%	1%	2.5%	0%	0%
2-丙醇	1.6%	20%	100%	7%	7%	60%	20%
								环己醇	0%	20%	0%	0%	0%	0%	0%

*几乎不能检测到氧化。

从表10-12可以看出，所有7个序列都是明显R-特异性的氧化还原酶。但是，检查的酶的明显差别在于优选底物的范围以及氧化行为。差异出现在短链的偏好，低分子底物胜过长链羰基化合物方面，类似地，在不同程度上良好耐受不同的芳族***或不同的取代基(诸如卤素)。

尽管人们已经选择出原则上确实催化类似的反应的酶，已经发现，对于各底物，人们在这些酶中发现有非常有效地催化目标反应的酶和根本不催化目标反应的酶。

此外，也观察到对映选择性的差异，其初看起来的确显得较小，但是对于各个酶用于特异性还原过程（目前对于制药用途而言是常见的特异性ee>99.0-99.9%）的适用性可能是绝对决定性的。

另外，检查的酶之间以及与现有技术相比的差异在于氧化性质以及因而在具有底物偶联的辅酶再生的不同方法中的适用性。

因而，提及的氧化还原酶在根据本发明的方法中的应用，不代表与确立的现有技术等同的替代方案，而是拓宽了现有范围。

实施例 4: 氧化还原酶 SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:7 在特异性方法中的对比

基于下面列出的实施例，现在将证实，对于少数具体的方法，酶SEQ ID NO:1-7可以为具体问题提供特殊的解决方案，其也明显胜过已经存在的现有技术。

4.a 3,6- 辛二酮至 R,R-3,6- 辛二醇的还原

为了筛选适用于开发具有底物偶联的辅酶再生的方法（用于将3,6-辛二酮还原为R,R-3,6-辛二醇）的酶的目的，在下述反应批次中检查所有酶：

450 µl缓冲液, pH =7.0

0.05 mg NAD

50 µl 2-丙醇

10 mg 3,6-辛二酮

在25℃温育24 h后，用二氯甲烷萃取样品，并通过气相色谱法进行分析。

在表13中，列出了所得的转化氯和反应产物。

表13。

SEQ ID NO	3,6-辛二酮	还原一次的产物(S)	还原一次的产物(R)	S,S-3,6-辛二醇	R,R-3,6-辛二醇
						SEQ ID NO:1	95%	0%	5%	0%	0%
SEQ ID NO:2	3%	0%	17%	0%	80%
						SEQ ID NO:3	10%	0%	45%	0%	45%
SEQ ID NO:4	76%	0%	24%	0%	0%
						SEQ ID NO:5	95%	0%	5%	0%	0%
SEQ ID NO:6	24%	0%	59%	0%	17%
						SEQ ID NO:7	43%	0	47%	0	10%
WO 2007/012428粉状毕赤酵母	85%	0%	15%	0%	0%
						WO 2007/012428 Candida nemodendra	95%	0%	5%	0%	0%
EP 1179 595 A1芬兰毕赤酵母	3%	0%	17%	0%	80%
						WO 2004/027055 Devosia	40%	0%	50%	0%	10%

从表13可以看出，在可得到的酶中，可以找到这样的酶：在上述反应条件下能够非常好地将3,6-辛二酮还原为希望的R,R-辛二醇的酶(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和芬兰毕赤酵母)，实际上根本不接受底物的酶(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和C. nemodendra)，以及如果希望生产还原一次的化合物优选地必须使用的酶(SEQ ID NO:4)。

4.b 2,7- 二甲基 -3,6- 辛二酮至 (S,S)-2,7- 二甲基辛 -3,6- 二醇的还原

为了筛选适用于具有底物偶联的辅酶再生的方法（用于将2,7-二甲基-3,6-辛二酮还原为(S,S)-2,7-二甲基辛-3,6-二醇）的酶的目的，在下述反应批次中检查酶：

450 µl缓冲液, pH =7.0

0.05 mg NAD

50 µl 2-丙醇

10 mg 2,7-二甲基-3,6-辛二酮

在表14中，列出了所得的转化率和反应产物。

表14。

SEQ ID NO	2,7-二甲基-3,6-辛二酮	内消旋	(S,S)-2,7-二甲基辛-3,6-二醇	(R,R)-2,7-二甲基-3,6-辛二醇
					SEQ ID NO:1	100%	0%	0%	0%
SEQ ID NO:2	23%	0	77%	0%
					SEQ ID NO:3	100%	0%	0%	0%
SEQ ID NO:4	100%	0%	0%	0%
					SEQ ID NO:5	100%	0%	0%	0%
SEQ ID NO:6	100%	0%	0%	0%
					SEQ ID NO:7	100%	0%	0%	0%
WO 2007/012428粉状毕赤酵母	100%	0%	0%	0%
					WO 2007/012428 Candida nemodendra	100%	0%	0%	0%
EP 1179 595 A1 芬兰毕赤酵母	100%	0%	0%	0%
					WO 2004/027055 Devosia	100%	0%	0%	0%

从表14可以看出，SEQ ID NO:2为该具体问题提供了解决方案，相反，没有来自现有技术的酶能够催化目标反应。

4.c 2,4- 戊二酮至 R,R-2,4- 戊二醇的还原

为了筛选适用于具有底物偶联的辅酶再生的方法（用于将2,4-戊二酮还原为R,R-2,4-戊二醇）的酶的目的，在下述反应批次中检查酶：

450 µl缓冲液, pH =7.0

0.05 mg NAD

50 µl 2-丙醇

10 mg 2,4-戊二酮

在表15中，列出了所得的转化率和反应产物。

表15。

SEQ ID NO	2,4-戊二酮	还原一次的化合物(R)	(S,S)-2,4-戊二醇	(R,R)-2,4-戊二醇
					SEQ ID NO:1	0%	70%	0%	30%
SEQ ID NO:2	0%	19%	0%	81%
					SEQ ID NO:3	2%	95%	0%	3%
SEQ ID NO:4	6%	93%	0%	1%
					SEQ ID NO:5	60%	40%	0%	0%
SEQ ID NO:6	100%	0%	0%	0%
					SEQ ID NO:7	7%	91%	0%	2%
WO 2007/012428粉状毕赤酵母	100%	0%	0%	0%
					WO 2007/012428 Candida nemodendra	55%	45%	0%	0%
EP 1179 595 A1芬兰毕赤酵母	30%	70%	0%	0%
					WO 2004/027055 Devosia	43%	57%	0%	0%

从表15可以看出，使用氧化还原酶SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，可以将2,4-戊二酮转化成R,R-2,4-戊二醇。大多数酶仅将该底物转化至单还原的化合物的程度。现有技术也没有提供该问题的解决方案。

另一方面，为了有效地回收单还原的化合物，氧化还原酶SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7甚至比现有技术更值得推荐。

4.e 1,1,1- 三氟丙酮至 R-1,1,1- 三氟丙醇的还原

为了筛选适用于具有底物偶联的辅酶再生的方法（用于将1,1,1-三氟丙酮还原为R-1,1,1-三氟丙醇）的酶的目的，在下述反应批次中检查酶。

在这样做时，根据该高度挥发性底物的后处理和转化的具体要求，制备反应批次。在该情况下，使用异丙醇的再生是不可能的，实际上，甲基戊醇的使用是优选的，一方面，为了防止挥发性的底物 (沸点= 22℃)在反应过程中逃逸，另一方面，为了实现反应产物R-1,1,1-三氟丙醇 (沸点=80℃)的后处理(因为相同的沸点，不可能分离2-丙醇)。

450 µl缓冲液, pH =7.0

0.05 mg NAD

500 µl 2-甲基-4-戊醇

20 µl 1,1,1-三氟丙酮

在25℃温育24 h后，通过气相色谱法分析样品。

在表16中，列出了所得的转化率和反应产物。

表16。

SEQ ID NO	1,1,1-三氟丙酮	R-1,1,1-三氟丙醇	S-1,1,1-三氟丙醇
				SEQ ID NO:1	0%	99%	1%
SEQ ID NO:2	20%	60%	40%
				SEQ ID NO:3	2%	70%	30%
SEQ ID NO:4	15%	80%	20%
				SEQ ID NO:5	50%	85%	15%
SEQ ID NO:6	n.b	n.b	n.b
				SEQ ID NO:7	n.b	n.b	n.b
WO 2007/012428粉状毕赤酵母	0%	97%	3%
				WO 2007/012428 Candida nemodendra	50%	99%	1%
EP 1179 595 A1芬兰毕赤酵母	50%	99%	1%
				WO 2004/027055 Devosia	n.b	n.b	n.b

从表16可以看出，在该情况下，氧化还原酶SEQ ID NO:1会提供转化和选择性之间的最佳折中。令人惊异地，大多数酶根本不能以令人满意的对映选择性还原该底物，因此再次突出了所述酶的多样性（尽管具有基本上相同的功能）。

4.f 2- 氯 -1-(3- 羟基苯基 ) 乙 -1- 酮至 (1S)-2- 氯 -1-(3- 羟基苯基 ) 乙 -1- 醇的还原

为了筛选适用于具有底物偶联的辅酶再生的方法（用于将2-氯-1-(3-羟基苯基)乙-1-酮还原为(1S)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙-1-醇）的酶的目的，在下述反应批次中检查酶：

400 µl缓冲液, pH =7.0

0.02 mg NAD

100 µl 2-丙醇

25 mg 2-氯-1-(3-羟基苯基)乙-1-酮

在25℃温育24 h后，萃取样品，并通过气相色谱法进行分析。

在表17中，列出了所得的转化率和反应产物。

表17。

SEQ ID NO	2-氯-1-(3-羟基苯基)乙-1-酮	(1R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙-1-醇	(1S)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙-1-醇
				SEQ ID NO:1	100%	n.b	n.b
SEQ ID NO:2	55%	0%	45%
				SEQ ID NO:3	40%	0%	60%
SEQ ID NO:4	99%	n.b	n.b
				SEQ ID NO:5	100%	n.b	n.b
SEQ ID NO:6	25%	0%	75%
				SEQ ID NO:7	83%	0%	17%
WO 2007/012428粉状毕赤酵母	100%	n.b	n.b
				WO 2007/012428 Candida nemodendra	100%	n.b	n.b
EP 1179 595 A1芬兰毕赤酵母	98%	n.b	n.b
				WO 2004/027055 Devosia	100%	n.b	n.b

从表17可以看出，使用氧化还原酶SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，原则上能将2-氯-1-(3-羟基苯基)乙-1-酮转化为(1S)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙-1-醇，这些酶绝对选择性地转化底物。没有来自现有技术的酶能够还原该具体底物。

4.g 乙基 -4- 氯乙酰乙酸酯至 (S)- 乙基 -4- 氯 -3- 羟基丁酸酯的还原

在下面，在将乙基-4-氯乙酰乙酸酯还原为(S)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸酯的工业方法中，测试要检查的酶SEQ ID NO:1-7，并与现有技术相对比。

为此目的，根据现有技术 (WO 2006/087235)，使用在高浓度(200 g/l)的底物乙基-4-氯乙酰乙酸酯，并对比所述酶在使用2-丙醇的具有底物偶联的再生的方法中的效率。

600 µl缓冲液, pH =8.0

0.2 mg NAD

200 µl 2-丙醇

200 µl 乙基-4-氯乙酰乙酸酯

240 µl 来自大肠杆菌的重组酶(20-60 单位)

在25℃温育24 h后，萃取样品，并通过气相色谱法进行分析。

在表18中，列出了所得的转化率和反应产物。

表18。

SEQ ID NO	乙基-4-氯乙酰乙酸酯	(S)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸酯	(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸酯
				SEQ ID NO:1	90%	10%	0%
SEQ ID NO:2	0%	100%	0%
				SEQ ID NO:3	0%	100%	0%
SEQ ID NO:4	70%	30%	0%
				SEQ ID NO:5	85%	15%	0%
SEQ ID NO:6	60%	40%	0%
				SEQ ID NO:7	75%	25%	0%
WO 2007/012428粉状毕赤酵母	100%	n.b	n.b
				WO 2007/012428 Candida nemodendra	100%	n.b	n.b
EP 1179 595 A1 芬兰毕赤酵母	80%	20%	0%
				WO 2004/027055 Devosia	75%	25%	0%

从表18可以看出，特别地，酶SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3会为现有的、通常NADPH-依赖性的方法提供NADH-依赖性的有吸引力的替代方法，所述替代方法将乙基-4-氯乙酰乙酸酯还原为(S)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸酯。相反，来自现有技术的酶是不适合的，因为它们在方法条件下，仅表现出不充分的转化或根本不转化。

序列表

<110> IEP GmbH

<120> 酮化合物的立体选择性的酶促还原的方法

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> 蜡状芽孢杆菌

<400> 1

Met Lys Leu Lys Asp Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Ala Ser Gly

1 5 10 15

Ile Gly Glu Ser Thr Val Arg Leu Phe Ile Glu Glu Gly Ala Lys Val

20 25 30

Val Ile Ala Asp Phe Ser Glu Arg Gly Lys Glu Leu Ser Asp Glu Leu

35 40 45

Asn Ala His Gly Tyr Asn Thr Leu Phe Ile Lys Thr Asp Val Thr Lys

50 55 60

Glu Ala Asp Ile Lys Gln Leu Ile His Glu Thr Val Ser Thr Tyr Gly

65 70 75 80

Lys Leu Asp Ile Met Tyr Ala Asn Ala Gly Val Ala Asp Asp Ala Pro

85 90 95

Ala Asn Glu Leu Ser Tyr Glu Lys Trp Lys Arg Thr Ile Asp Ile Asn

100 105 110

Leu Ser Gly Val Phe Leu Ser Asp Lys Tyr Ser Ile Glu Gln Phe Leu

115 120 125

Lys Gln Gly Thr Gly Gly Val Ile Val Asn Ala Gly Ser Ile His Ser

130 135 140

Phe Val Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ala Tyr Ser Ser Ala Lys Gly Gly

145 150 155 160

Val Lys Leu Leu Thr Gln Asn Leu Cys Thr Ala Tyr Ala Lys Tyr Gly

165 170 175

Ile Arg Ile Asn Ala Val Cys Pro Gly Tyr Ile Asp Thr Pro Leu Leu

180 185 190

Gly Ser Val Asn Pro Gln Gln Lys Glu Tyr Leu Ala Ser Leu His Pro

195 200 205

Gln Gly Arg Leu Gly Thr Pro Glu Glu Val Ala Lys Ala Val Leu Phe

210 215 220

Leu Ala Ser Asp Asp Ala Ser Phe Val Asn Gly Thr Thr Leu Leu Val

225 230 235 240

Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Arg

245

<210> 2

<211> 257

<212> PRT

<213> Methylibium petroleiphilum

<400> 2

Met Gly Arg Val Asp Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Ala Lys

1 5 10 15

Gly Ile Gly Arg Ala Ser Ala Leu Met Leu Ala Arg Glu Gly Ala Arg

20 25 30

Val Val Leu Thr Asp Val Glu Glu Ala Gln Gly Ser Ala Val Ala Lys

35 40 45

Glu Ile Glu Arg Ala Gly Gly Lys Ala Leu Phe Leu Thr Gln Asp Val

50 55 60

Thr Asp Glu Ser Arg Trp Val Glu Val Val Glu Lys Ala Arg Ala Gln

65 70 75 80

Phe Gly Gly Leu Asn Ile Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Thr Ala

85 90 95

Gly Ser Ala Glu Asp Glu Thr Leu Glu Ala Trp Arg Arg Leu Met Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Lys His Ala Ile Arg Ala

115 120 125

Met Lys Asn Gly Pro Gly Thr Gly Ser Ile Ile Asn Ile Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Ile Val Ala Asp Pro Lys Leu Ala Ser Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Gly Val Arg Ile Phe Ser Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Gln

165 170 175

Ala Gly Tyr Arg Ile Arg Val Asn Thr Ile His Pro Gly Tyr Ile Trp

180 185 190

Thr Pro Met Val Glu Gly Tyr Leu Thr Ser Leu Gly Asp Val Glu Gly

195 200 205

Gly Arg Gln Val Ile Ser Lys Met His Pro Ile Gly Arg Met Gly Glu

210 215 220

Pro Asp Asp Ile Ala Tyr Gly Val Leu Tyr Leu Gly Ser Asp Glu Ser

225 230 235 240

Ser Phe Met Thr Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala

245 250 255

Gln

<210> 3

<211> 251

<212> PRT

<213> 中间根瘤菌属

<400> 3

Met Thr Gly Glu Phe Lys Asp Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ile Gly Ala Ala Ile Ala Arg Glu Leu Ala Thr Gly Gly Ala

20 25 30

Glu Leu Val Val Ala Asp Leu Glu Arg Glu Ser Ala Asn Arg Ile Val

35 40 45

Glu Gly Ile Arg Ala Ser Gly Gly Arg Ala His Ala Phe Ala Val Asp

50 55 60

Val Ala Asp Ala Glu Ala Val Glu Arg Met Val Asp Phe Ala Val Arg

65 70 75 80

Thr Cys Gly Asp Leu His Leu Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Pro Ser Glu Pro Thr Ala Asp Tyr Pro Leu Asp Gly Trp Arg Lys Val

100 105 110

Ile Asp Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Tyr Gly Met Lys Tyr Glu Ile

115 120 125

Ala Ala Ile Leu Lys Ser Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Ala Cys Ala Tyr Val Ser Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys Thr Ala Ala Met Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Gln Gly Val Arg Ile Asn Ala Val Gly Pro Ala Phe Ile Asp Thr

180 185 190

Pro Leu Leu Ser Lys Asn Leu Asp Asp Gln Val Leu Gly Gln Leu Ala

195 200 205

Gly Leu His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Thr Pro Glu Glu Val Ser Ala

210 215 220

Leu Thr Cys Phe Leu Leu Ser Gly Arg Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser

225 230 235 240

Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Thr Arg

245 250

<210> 4

<211> 263

<212> PRT

<213> 天蓝色链霉菌

<400> 4

Met Ser Thr Thr Gly Thr Thr Pro Ala Thr Thr Gly Tyr Ala Ala Glu

1 5 10 15

Phe Ala Gly Arg Thr Ala Leu Val Thr Gly Ala Ala Ser Gly Ile Gly

20 25 30

Leu Ala Thr Ala Arg Arg Leu Gly Ala Gly Gly Ala Arg Val Val Val

35 40 45

Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Ala Glu Lys Ala Ala Ala Glu Leu Arg

50 55 60

Ala Gly Gly Val Glu Ala Ala Ala Val Glu Leu Asp Val Thr Arg Pro

65 70 75 80

Glu Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Phe Ala Val Asp Thr Phe Gly Ser

85 90 95

Leu Asp Leu Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly Pro Ser Ala Pro

100 105 110

Thr Gly Glu Tyr Asp Val Ala Ala Tyr Gln Arg Val Val Arg Thr Asn

115 120 125

Leu Asp Gly Val Phe Tyr Ser Met Arg Tyr Glu Leu Pro Ala Ile Glu

130 135 140

Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ser Ile Val Asn Val Ala Ser Ile Leu Gly

145 150 155 160

Ser Val Gly Phe Ala Gly Ser Pro Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly

165 170 175

Val Val Gly Leu Thr Lys Ala Ala Ala Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Gly

180 185 190

Ile Arg Ile Asn Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Asp Thr Pro Leu Leu

195 200 205

Lys Thr Met Asp Glu Ala Ala Tyr Lys Gly Leu Val Ala Leu His Pro

210 215 220

Ala Gly Arg Leu Gly Arg Ser Glu Glu Val Ala Glu Leu Ile Ala Phe

225 230 235 240

Leu Leu Ser Asp Arg Ala Ser Phe Val Ala Gly Ser Tyr His Leu Val

245 250 255

Asp Gly Ala Tyr Thr Ala Val

260

<210> 5

<211> 253

<212> PRT

<213> 富养产碱菌

<400> 5

Met Glu Tyr Ile Asp Met Lys Leu Lys Asp Lys Val Ala Ile Val Thr

1 5 10 15

Gly Gly Ala Ser Gly Ile Gly Glu Ala Thr Val Arg Leu Phe Ala Ser

20 25 30

Gln Gly Ala Ser Val Val Ile Ala Asp Arg Ser Ala Leu Gly Glu Lys

35 40 45

Leu Ala Arg Glu Leu Ser Glu Ser Ser Leu Ala Ala His Tyr Ser Glu

50 55 60

Val Asp Val Ser Arg Glu Asp Asp Thr Arg Arg Leu Ile Asp Asp Thr

65 70 75 80

Val Ser Arg Phe Gly Arg Leu Asp Ile Met Val Ala Asn Ala Gly Ile

85 90 95

Ala His Pro Ser Ala Pro Val Glu Asp Val Ser Val Glu Gln Trp Gln

100 105 110

Gln Met Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Val Phe Leu Ser Asn Lys Leu

115 120 125

Ala Ile Val Gln Met Lys Lys Gln Gly Thr Gly Gly Ala Ile Val Asn

130 135 140

Met Ala Ser Ile Leu Gly His Val Gly Met Pro Gly Ala Ala Ser Tyr

145 150 155 160

Asn Ala Ala Lys Gly Gly Val Val Asn Leu Thr Arg Ser Leu Gly Val

165 170 175

Ser His Ala Gln Asp Gly Ile Arg Val Asn Ala Val Cys Pro Gly Phe

180 185 190

Val Ala Thr Pro Leu Ile Glu Arg Ala Thr Glu Glu Ala Arg Ala Arg

195 200 205

Leu Val Ala Ala His Pro Ile Gly Arg Leu Gly His Ala Asp Glu Val

210 215 220

Ala Lys Ala Val Leu Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ala Ser Phe Ile Val

225 230 235 240

Gly Thr Ser Leu Met Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ala Gln

245 250

<210> 6

<211> 252

<212> PRT

<213> 橙色滑柱菌

<400> 6

Met Asn Gln Tyr Asp Phe Arg Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ala Ser Gly Ile Gly Ala Ala Cys Val His Thr Phe Ala Arg Gly Gly

20 25 30

Ala Lys Val Ala Ile Val Asp Arg Asn Gln Asp Leu Gly Ala Gln Thr

35 40 45

Val Ala Ala Val Arg Glu Ala Gly Gly Asp Ala Ile Phe Leu Pro Val

50 55 60

Asp Val Ala Gln Ser Gly Ala Val Glu Ala Met Val Thr Asp Thr Ile

65 70 75 80

Thr Ala Phe Gly Gln Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly

85 90 95

Gly Glu Ser Asn Pro Thr Gly Thr Tyr Ser Ile Glu Gly Trp Gln Thr

100 105 110

Val Ile Asp Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Tyr Cys Met Arg Tyr Glu

115 120 125

Ile Pro Ala Met Leu Ala Gln Gly Gly Gly Val Ile Val Asn Met Ala

130 135 140

Ser Ile Leu Gly Thr Val Gly Phe Ala Ser Ser Pro Ala Tyr Val Ala

145 150 155 160

Ala Lys His Ala Val Val Gly Leu Thr Lys Ala Ala Ala Leu Asp Tyr

165 170 175

Gly Arg Gln Gly Leu Arg Ile Asn Ser Val Gly Pro Gly Phe Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Leu Asp Gly Gly Leu Asp Asp Gln Thr Gln Thr Tyr Leu

195 200 205

Ser Gly Leu His Ala Val Gly Arg Met Gly Glu Ser Ala Glu Val Ala

210 215 220

Ala Leu Val Ala Phe Leu Cys Ser Ala Glu Ala Ser Phe Leu Thr Gly

225 230 235 240

Gly Tyr Tyr Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 7

<211> 249

<212> PRT

<213> 脱氮副球菌

<400> 7

Met Asp Ile Arg Phe Asp Asn Lys Ile Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly

1 5 10 15

Ser Gly Leu Gly Glu Ala Ile Ala Leu Glu Leu Ala Ala Ser Gly Ala

20 25 30

Thr Val Val Ala Ala Asp Leu His Glu Ala Thr Ala Arg Ala Thr Ala

35 40 45

Asp Arg Ile Val Ala Ala Gly Gly Lys Ala Lys Ala Val Ala Gly Asp

50 55 60

Val Ser Asp Pro Asp Ala Val Arg Lys Ala Val Glu Val Ala Lys Gly

65 70 75 80

Leu Gly Gly Leu His Leu Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly Pro

85 90 95

Ser Ala Pro Val Gly Asp Tyr Pro Leu Asp Gly Trp Lys Lys Val Ile

100 105 110

Asp Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Arg Tyr Gly Ile Pro

115 120 125

Ala Met Leu Asp Ala Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser Ile

130 135 140

Leu Gly Ser Val Gly Phe Asn Gly Ala Gly Ala Tyr Val Ser Ala Lys

145 150 155 160

His Ala Val Val Gly Met Thr Lys Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala Gln

165 170 175

Lys Gly Ile Arg Val Asn Ser Val Gly Pro Ala Phe Ile Asp Thr Pro

180 185 190

Leu Leu Asp Gln Leu Asp Ser Asp Thr Arg Gln Ala Leu Val Gly Arg

195 200 205

His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Arg Ala Asp Glu Val Ala Gly Leu Val

210 215 220

Val Phe Leu Leu Ser Asp Arg Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser Tyr His

225 230 235 240

Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Leu

245

<210> 8

<211> 744

<212> DNA

<213> 蜡状芽孢杆菌

<400> 8

atgaaattaa aagacaaagt agcaatcata actggtggtg caagtggaat tggcgaatct 60

actgttcgtc tttttatcga agaaggtgca aaagtagtta ttgctgactt ttctgaacgt 120

ggaaaagaac tatcagatga attgaatgca catggatata atacgttatt tattaaaacc 180

gatgtaacaa aagaggcaga tattaaacag ctaattcatg agacagtaag tacatacggt 240

aaattagata ttatgtatgc caatgccggc gttgctgatg atgcaccggc aaacgaatta 300

tcctatgaaa agtggaaaag aactattgat attaatttgt ctggggtatt cctttctgat 360

aaatattcga ttgaacaatt tcttaaacaa ggtacaggtg gtgtcatcgt taacgctggt 420

tcgattcata gttttgtttc attacctaca ccaacagcat actcctctgc aaaaggtggt 480

gtgaaactat taactcaaaa tttatgtact gcctacgcta aatatggaat acgtattaac 540

gcggtgtgcc ctggttatat tgacacccct ttactaggta gtgttaatcc tcaacagaaa 600

gaatatttag cttcacttca tccacaaggc agacttggaa caccagaaga agtcgctaaa 660

gctgtcttat ttttagcaag tgatgatgct agttttgtta acggcacaac acttcttgtt 720

gatggaggct atactgcacg ttaa 744

<210> 9

<211> 774

<212> DNA

<213> Methylibium petroleiphilum

<400> 9

atgggacgtg tggacaacaa ggtggcgctg gtgaccggtg gtgccaaggg catcggccgg 60

gccagcgcac tgatgctggc gcgcgaaggt gcccgcgtgg tgctgaccga cgtggaagag 120

gcgcagggca gcgcggtggc gaaggagatc gagcgcgccg gcggcaaggc gctgttcctc 180

acgcaggacg tgaccgacga gagccgctgg gtcgaggtgg tcgagaaggc ccgcgcgcag 240

ttcggcggcc tgaacatcgt cgtcaacaac gccggcatcg gcaccgctgg cagcgccgag 300

gacgagacgc tggaggcctg gcgccgcctg atgtccgtca acctcgacgg cgtcttcctc 360

ggcaccaagc acgcgatccg ggcgatgaag aacgggcccg gcacgggctc gatcatcaac 420

atctcgtcga tcgagggcat cgtcgccgac cccaagctcg cgtcctacaa cgccagcaag 480

ggcggcgtgc gcatcttctc gaagtcggcg gcactgcatt gcgcgcaggc gggctaccgc 540

atccgggtta acaccatcca tccgggctac atctggacgc cgatggtcga aggctatctg 600

accagcctcg gcgatgtcga gggtgggcgc caggtcatct cgaagatgca cccgatcggg 660

cggatgggtg agcccgacga catcgcctac ggtgtgctct acctgggctc cgacgagtcc 720

tcgttcatga cgggcagcga gctggtcatc gacggcggct acaccgcgca atag 774

<210> 10

<211> 756

<212> DNA

<213> 中间根瘤菌属

<400> 10

atgactggtg aattcaagga caaggttgcg ctcgtcacag gagccggctc ggggataggg 60

gccgcaatcg ctcgcgaact ggccacagga ggcgccgagc tggtcgtcgc cgacctggag 120

cgggagtctg cgaacaggat cgtggaagga atccgagcga gtggaggccg agcccacgcc 180

tttgccgtgg atgtagccga cgccgaggcg gtcgagcgca tggtggattt tgccgttcgc 240

acgtgcggtg accttcatct ggcggtcaat aatgctggga tcggcggccc aagcgaaccg 300

accgccgact atccgctcga cggctggcgc aaggtgatcg atgtcaatct gaatggcgtc 360

ttctatggca tgaaatatga gatcgcagcg atactgaaat ccggcggcgg cgccatcgtg 420

aacatggcat ccatcctcgg ttcagtggga tttgcgaatg cctgcgccta tgtctccgcg 480

aaacacgcgc tgctgggact gacaaaaacg gcggcgatgg agtatgcggc acaaggcgtg 540

cgcatcaatg cggtcgggcc agctttcatc gacacgccgc ttctgtcgaa aaacctcgac 600

gaccaagtcc tcggccagct cgcgggactt catcccatcg gccggctcgg cacgcctgag 660

gaggtctcgg cgctcacctg tttcttgctt tccggacgcg cgagcttcat caccggcagt 720

tatcatctcg tcgatggcgg ctacaccacc cggtaa 756

<210> 11

<211> 792

<212> DNA

<213> 天蓝色链霉菌

<400> 11

atgagcacca ccggaaccac ccccgccacc accgggtacg ccgccgagtt cgccggccgt 60

accgccctcg tcaccggtgc cgcctccggt atcggcctgg ccaccgcccg ccggctcggc 120

gccggcggcg cccgggtcgt cgtcgccgac ttcaacgccg agggcgccga gaaggccgcc 180

gccgagctgc gggccggtgg cgtcgaggcc gccgcggtcg agctggacgt cacccgtccg 240

gagtccgtcg aggcggccgt cgggttcgcc gtcgacacgt tcggctcgct ggacctcgcc 300

gtcaacaacg ccggcatcgg cggccccagc gccccgaccg gcgagtacga cgtggcggcc 360

taccagcgcg tcgtgcgcac caacctcgac ggcgtcttct actcgatgcg ctacgaactg 420

cccgccatcg aggcggccgg caagggcggc tcgatcgtga acgtcgcctc catcctcggc 480

tcggtcggct tcgccggctc ccccgcctac gtcgccgcca agcacggcgt ggtcgggctg 540

acgaaggcgg ccgccgccga gtacgccgcc cgcggcatcc ggatcaacgc ggtcggtccg 600

ggcttcatcg acacccccct gctcaagacc atggacgagg ccgcctacaa ggggctggtc 660

gccctgcacc cggccggccg cctcgggcgc tccgaggagg tcgcggagct gatcgccttc 720

ctgctgtccg accgcgcgtc cttcgtcgcg ggcagctatc acctggtcga cggcgcctac 780

accgccgtct ga 792

<210> 12

<211> 762

<212> DNA

<213> 富养罗尔斯通氏菌

<400> 12

atggagtaca tcgacatgaa gctcaaggac aaggtcgcca tcgtaacggg cggtgccagc 60

ggtattggcg aggcaacggt tcggctgttc gcttcccaag gtgccagcgt cgtcattgcc 120

gaccgctcgg cactcggcga gaagctcgcg cgtgaactga gcgaaagcag cttggccgcg 180

cactacagcg aagtcgatgt gtcgcgcgag gacgacacgc gcaggctcat cgatgacacc 240

gtgagccgct tcgggcggct cgacatcatg gtcgccaatg ccggcattgc gcatccgtct 300

gcaccagtcg aggatgtcag tgtcgagcaa tggcagcaga tgatcgacgt caacctgacc 360

ggcgtcttcc tgagcaacaa gcttgccatt gtgcagatga agaagcaggg caccggcggc 420

gcgatcgtca acatggcatc gatactcggg catgtcggga tgccgggcgc ggcgtcctac 480

aacgcggcaa agggcggcgt ggtcaacctc acgcgctctc tcggcgtctc gcatgcacag 540

gacggcatac gcgtcaacgc ggtatgtccg ggtttcgtgg caacaccgct gatcgaacgt 600

gccactgagg aagcccgtgc gcgcctggtg gcggcgcatc cgattggccg cctgggtcac 660

gccgatgagg tcgcgaaggc cgtgctgttt ctcgcgagcg acgatgcatc gttcatcgtc 720

ggtacgagcc tgatggtcga tggagggtat tgcgcgcaat ga 762

<210> 13

<211> 759

<212> DNA

<213> 橙色滑柱菌

<400> 13

atgaaccagt atgactttcg tggaaaagtg gcgcttgtca ccggcggcgc ctcggggatt 60

ggtgcggcgt gcgtgcatac ctttgcgcgt ggcggcgcga aggtcgcgat tgttgatcgc 120

aatcaggatc tgggcgcaca aaccgtggcg gcggtccgcg aggccggcgg cgatgcgatc 180

tttctcccgg tggatgtcgc ccaatcaggg gccgttgagg cgatggttac cgacaccatc 240

acggcctttg gacagctgga tattgcggtc aataatgccg ggatcggcgg cgagtctaat 300

cctaccggca cctacagcat tgaaggttgg cagacggtca ttgatgtgaa cctcaacggt 360

gtcttctatt gcatgcgcta cgaaattcca gccatgctgg cgcagggcgg cggcgtgatc 420

gtgaatatgg cctcgatcct agggactgtc ggatttgcgt cctccccagc ctatgtcgcc 480

gccaagcacg cggtggttgg tctcaccaag gccgccgccc tggactatgg gcgccaaggg 540

ctgcggatca actcggtcgg gccgggcttt atcaaaacac cactgcttga cggtggcctg 600

gacgatcaga cccaaaccta tctgagcggg ctccacgccg tcggacgcat gggcgagtca 660

gcggaagtcg cggcgctggt cgcctttctc tgctccgctg aggcctcatt cctgacgggt 720

ggctattatc tggtcgatgg tggatacacg gcgcaataa 759

<210> 14

<211> 750

<212> DNA

<213> 脱氮副球菌

<400> 14

atggacattc gtttcgacaa caagatcgcc cttgtgaccg gcgccggctc ggggctgggc 60

gaggcgatag cgctggagct tgccgcctcg ggcgccacgg tggtggccgc cgacctgcat 120

gaagcgacag cccgcgccac cgccgacagg atcgtcgcgg cgggcggcaa ggccaaggcc 180

gtggcgggcg atgtctccga tcctgatgcg gtgcgcaagg ccgtcgaggt cgccaagggg 240

ctgggcgggc tgcacctgct ggtgaacaat gccggcatcg gcggccccag cgcgccggtc 300

ggggactatc cgctggacgg ctggaaaaag gtcatcgacg tcaacctgaa cgcggtcttc 360

tacggcatgc gctacgggat tccggcgatg ctggacgcgg gcggcggggc gatcgtgaac 420

atggcctcga tcctgggctc ggtcgggttc aacggcgcgg gcgcctatgt ctcggccaag 480

catgccgtgg tgggcatgac caagaacgcg gcgctggaat atgcgcaaaa gggcatccgg 540

gtgaactcgg tcggcccggc cttcatcgac acgccgctgc tcgaccagtt ggacagcgac 600

accaggcagg cgctggtcgg ccgccatccc atcggccggc tgggccgggc ggacgaggtt 660

gcggggcttg tcgtgttcct gctttcggac cgcgccagct tcatcaccgg cagctatcac 720

ctggtggatg gcggctatac ggcgctgtga 750

Claims

1.酮化合物至对应的手性羟基化合物的立体选择性的酶促还原方法，其中用对映选择性的、NADH-特异性的氧化还原酶还原酮化合物，该方法包括：使用这样的多肽还原该酮化合物，该多肽在位置205-209处表现出R-ADH-标签H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R，且该多肽整体具有下述其它结构特征：

(i) N-端Rossmann卷曲GxxxGxG，

(ii) 在位置87处的NAG-基序，

(iii) 由S 139、Y 152和K 156组成的催化三联体，

(iv) 在位置37处的带负电荷的氨基酸基团，

(vi) 在位置159即在K 156下游4个位置处的Val或Leu，

(vii) 在位置178处的Asn，和

(viii) 在位置188处的脯氨酸基团，

其中R-ADH-标签H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R的位置和结构特征(i)～(viii)指的是通过多路氨基酸序列对比的2bhd_Strex；

和其中使用这样的多肽来还原酮化合物，

(a) 该多肽由氨基酸序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7之一组成，或

(c) 该多肽由选自SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:14的核酸序列编码，或

(d) 编码该多肽的核酸序列在严格条件下与在(c)中提及的核酸序列之一杂交，其中严格条件指的是在65℃，在0.7-1 M NaCl溶液中杂交，并随后，在65℃，用0.1-2倍SSC溶液洗涤滤器，和1倍SSC溶液是由150 mM NaCl和15 mM柠檬酸钠组成的混合物;

并且其中使用通式I的酮化合物或通式II的二酮：

其中R₁、R₂和R₃彼此独立地选自：

1) -H，条件是，R₁不是H，

2) -(C₁-C₂₀)-烷基，其中烷基是直链或支链的，

5) -(C₆-C₂₄)-芳基，

6) -(C₁-C₈)-烷基-(C₆-C₁₄)-芳基，

7) -(C₅-C₁₄)-杂环，

8) -(C₃-C₇)-环烷基，

或者，R₁与R₂一起，R₁与R₃一起，或R₂与R₃一起，形成包含3-6个C-原子的环，所述环是未取代的，或被下述取代基彼此独立地取代1、2或3次：-OH、卤素、-NO₂、-NH₂、-NHP和/或-M，且剩余基团选自上面在1)-9)下提及的基团；

其中

R₅代表(CH₂)_n，其中n = 0–20；-(C₆-C₁₄)-芳基或-(C₅-C₁₄)-杂环，

R₄和R₆彼此独立地代表-(C₁-C₂₀)-烷基或酯基团，

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

3.根据权利要求2所述的方法，其中，选自2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇和2-辛醇的醇分别被用作协同底物或仲醇。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，基于总体积，所述酮化合物以3%-50%的量使用。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，基于总体积，所述酮化合物以5%-40%的量使用。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，基于总体积，所述酮化合物以10%-30%的量使用。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，总转化数，即酮化合物的摩尔数/使用的辅因子的摩尔数，是≥10³。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，该方法是在含水有机两相***中进行。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，另外使用选自***、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷和环己烷的有机溶剂。